Summary
Este artículo describe los protocolos experimentales para el estudio ex vivo las contracciones del miometrio humano y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos. Esta técnica se utiliza para mejorar la comprensión de la fisiología myometrial y Fisiopatología, así como a validar los datos farmacológicos de sondas nuevas investigaciones o drogas conduce.
Abstract
Descubrimiento y caracterización de nuevos compuestos farmacéuticos o sondas bioquímicas dependen de sistemas de ensayo robusto y fisiológicamente relevante. Se describen métodos para medir la contractilidad del miometrio ex vivo . Este ensayo puede utilizarse para investigar factores y moléculas implicadas en la modulación de la contracción miometrial y a determinar sus acciones excitatorias o inhibitorias y por lo tanto su potencial terapéutico en vivo. Las biopsias se obtienen de las mujeres sometidas a cesárea con consentimiento informado. Tiras finas de miometrio son disecadas, recortadas y conectadas a un transductor de fuerza en baños de órgano 1 mL sobrefundidos con solución de suero fisiológico a 37 ° C. Desarrollar contracciones espontáneas dentro de 2-3 h bajo tensión set y permanecer estable durante muchas horas (> 6 h). Las tiras también pueden ser estimuladas a contratar como por las hormonas endógenas, la oxitocina y la vasopresina, que causan la modulación dependiente de la concentración de la frecuencia de contracción, fuerza y duración, más parecidos a las contracciones de parto. Por lo tanto, el efecto de drogas conocidos y nuevos conductores puede ser probado en las contracciones espontáneas e inducidas por agonistas.
Este protocolo detalla específicamente cómo se pueden utilizar este análisis para determinar la potencia de agentes conocidos y novedosos mediante la medición de sus efectos sobre diversos parámetros de la contracción miometrial humana. Usamos la oxitocina y V1a antagonistas de los receptores, atosiban y SR49059 como ejemplos de los compuestos conocidos que inhiben las contracciones inducidas por la oxitocina y la vasopresina y demuestran cómo este método puede utilizarse para complementar y validar datos farmacológicos obtenidos de ensayos celulares para facilitar el desarrollo de fármacos. También se pueden caracterizar los efectos de los agonistas novedosos en comparación con la oxitocina y la vasopresina. Mientras que utilizamos el ejemplo de la oxitocina sistema vasopresina, este método también puede ser utilizado para el estudio de otros receptores y canales iónicos que juegan un papel en la contracción uterina y la relajación para avanzar en la comprensión de la fisiología uterina humana y Fisiopatología.
Introduction
El objetivo de descubrimiento de fármacos es producir novela, potente y ligandos altamente selectivos que generan una respuesta terapéutica por activación o inhibición de vías de señalización celulares. Esto requiere un sistema de ensayo apropiado en el que probar compuestos con resultados confiables, robustas y relevantes1. Técnicas farmacológicas como Unión ligando-receptor y ensayos funcionales a menudo emplean sistemas de basadas en células heterólogos, dirigidos a receptores sobrexpresan que de otra manera no sería presente2. Mientras que estas técnicas proporcionan información valiosa para la farmacología del receptor y desarrollo temprano de drogas, los datos obtenidos no pueden reflejar un escenario cierto en vivo . Por lo tanto es importante que datos farmacológicos de ensayos de célula también se validan en modelos fisiológicamente relevantes.
Uterina del músculo liso (miometrio) constituye la capa muscular del útero que es responsable de las contracciones durante el parto que borrar y dilatan el cuello uterino y entregan el feto3. Contracción del miometrio es espontánea; no requieren el aporte hormonal o nervioso a contrato4. Las contracciones son provocadas por la despolarización espontánea de la membrana de la célula miometrial que conduce a la apertura de voltaje funcionado Ca2 +-canales (tipo L) y el influjo de Ca2 + en la célula5. Complejos de calcio con la calmodulina y activa la quinasa de cadena ligera de miosina que a su vez fosforila la miosina que permite la formación de ciclo puente cruzado con actina y contracción. Relajación por lo general está mediada por la fosforilación de la miosina por miosina fosfatasa y una reducción en la concentración de Ca2 + por medio de la extrusión de la célula o el secuestro en el retículo sarcoplásmico (SR)5,6 ,7.
Varios métodos se han desarrollado para estudiar la función miometrial y la disfunción, de catéteres de presión intrauterina y en vivo tocography internas y externas a la generación de células transformadas o inmortalizadas de origen miometrial8 ,9,10,11,12. Mientras que los sistemas de cultivo celular pueden detectar si una sustancia puede actuar a nivel celular, las tiras de tejidos en baños de órgano pueden utilizarse como herramientas para medir respuestas funcionales de tejidos todo farmacológicas reactivos. El baño de órgano tradicional suele ser una cámara de cristal climatizada grande que es capaz de sostener entre 5 y 50 mL de suero fisiológico (PSS). Las tiras dentro de estas grandes cámaras normalmente requieren aireación con oxígeno y grandes volúmenes de PSS. Tiras de tejido disecadas y suspendidas dentro de la cámara de baño y conectadas a un transductor de fuerza que mide los cambios en la tensión, tales como durante una contracción. Tiras de miometrio de seres humanos y animales como, conejillo de Indias13, ratón14, rata15, conejo16y otros17,18, se han utilizado por un número de grupos de investigación para examinar muchas preguntas relativas a myometrial fisiología y patología, incluyendo labores prematuras y disfuncionales. Por ejemplo, tiras de myometrial se han utilizado para identificar los factores que regulan y modificar actividad miógena19,20,21, determinan la función de organelas como el SR22, así como investigación de moduladores de ion canales23,24,25,26, bombas e intercambiadores de27 para determinar su papel en la fisiología miometrial.
Esta técnica ex vivo permite la evaluación del rendimiento de la contracción del tejido y el efecto directo de los diferentes agentes sobre los parámetros de la contracción para medirse entre ellos, fuerza de contracción (fuerza), frecuencia y duración, así como integración de estos valores, para generar un índice del trabajo total realizado (fuerza media integral o área bajo la curva, AUC). Como la preparación de la tira de tejido aislado constituye un modelo de más de un tipo de célula, se puede medir la respuesta fisiológica del tejido entero. El baño de órgano y la tira de tejido aislado por lo tanto son una herramienta útil en la prestación del puente entre el trabajo de la cultura de célula y animal enteroen vivo trabajo. Por lo tanto, en el campo del descubrimiento de fármacos, los efectos de agentes novedosos en términos de su excitatorios (es decir, estimulante) o inhibitorio (es decir, relajación) potencial en vivo pueden ser evaluadas más de cerca. Esta técnica fue utilizada con éxito en el desarrollo de la oxitocina - V y1a-atosiban de antagonista del receptor (1aR de OTR y V) como agente tocolítico para inhibir las contracciones de parto prematuro y retrasar el parto prematuro. In vitro pruebas de atosiban en tiras myometrial encontraron el antagonista capaz de reducir significativamente la oxitocina (OT)-inducida por las contracciones28,29,30. Lo importante es que estos estudios ayudaron a validar el valor traslacional de atosiban y generaron los datos de prueba de concepto es necesario tomar hacia adelante ensayos clínicos31,32,33,34 . Atosiban ahora es ampliamente utilizado como el fármaco de elección para retrasar el trabajo en Europa. Se realizaron estudios similares de prueba de concepto para que la oxitocina carbetocina analógico mostrar su potencial terapéutico en la prevención de la hemorragia de postparto35,36,37. Otros compuestos de plomo actualmente en desarrollo con este análisis incluyen retosiban (GSK221149A)38 y nolasiban (datos no publicados). Estos métodos también se han utilizado con éxito para comparar entre grupos de pacientes39,40,41,42,43,44, 4546,de,47 y examinar las diferencias intra-especies.
Aquí describimos el uso de aislado ex vivo tiras de tejido del miometrio humano embarazada dentro de baños de pequeños (1 mL) por encargo del órgano para ilustrar cómo este método puede utilizarse para complementar y validar los datos farmacológicos obtenidos de ensayos de célula . Las biopsias fueron obtenidas en gran parte de las mujeres sometidas a parto electivo a cesárea (CS) la mano de obra como son cirugía prevista y por lo tanto son más fáciles de programar colección biopsia, tienen fácil acceso al miometrio y tejidos no han sido expuestos a uterotónico estimulantes o relajantes antes de la cirugía. Sin embargo, también pueden obtenerse biopsias de las mujeres que recibían no planificados (emergencia) entrega de CS en el trabajo siempre que haya tiempo suficiente para totalmente el consentimiento del paciente. La mayoría de las biopsias se obtienen durante la cirugía del segmento uterino inferior en el sitio de la incisión quirúrgica, sin embargo también es posible obtener muestras de los segmento superior48,49. En algunos casos después del parto vaginal, las biopsias del sacador de la cama placentaria también se han obtenido50. Sin embargo, esta no es la ruta más convencional y la cantidad de tejido miometrial obtenido es pequeña. Miometrio no embarazadas puede obtenerse en mujeres previas o posmenopáusicas sometidas a histerectomia para condiciones ginecológicas benignas. Una biopsia de grosor completo es muestreado examen de la patología, del corpus inferior del cuello uterino, y miometrio se toma desde el centro de la pared uterina evitando las superficies serosas y endometriales.
Protocol
Aprobación Junta y seguridad Informe institucional, ético apropiado para experimentos con tejidos humanos debe estar en lugar antes de trabajar con cualquier tejido humano. Todo el trabajo descrito aquí recibió aprobación del Comité de ética de investigación Local (East Liverpool, REC Ref 10/H1002/49) y juntas de revisión institucional de investigación y desarrollo, Liverpool mujeres Hospital y Universidad de Liverpool.
Nota: Todas las biopsias que se describe en este protocolo se obtuvieron de mujeres sometidas a trabajo pre parto electivo a CS en el Hospital de la mujer de Liverpool y cada mujer dio consentimiento informado por escrito para participar.
1. las soluciones
- Preparar solución de salina fisiológica de Krebs modificado (PSS) con la siguiente composición: NaCl de 154 mM, 5,6 mM KCl, 1,2 mM de MgSO4, 7,8 mM de glucosa, 10,9 mM HEPES y 2,0 mM CaCl2.
Nota: El volumen a realizar se determina según el número de baños tejidos en funcionamiento, el caudal del sistema (1 mL/min) y estima la longitud del experimento, incluyendo el tiempo de equilibrado y el lavado. - Ajustar el pH a 7,4 con 4 M NaOH.
2. tejido baño establecido
- Precaliente el depósito de sistema de baño tejido a ~ 45 ° C utilizando un baño de agua recirculando en 55-60 ° C.
Nota: El depósito de agua en la base del aparato se calienta a ~ 45 ° C, que después de lo que permite el intercambio de calor con el PSS en el tubo peristáltico por, asegura el PSS en el baño del tejido está a 37 ° C. Algunos ajustes para establecer las temperaturas pueden ser necesario para asegurar que la temperatura de la PSS en el baño del tejido alcanza los 37 ° C. Esto variará dependiendo del aparato utilizado y fijar las tasas de flujo. - Cambiar manualmente en cualquier otro equipo necesario incluyendo el amplificador, adquisición de datos y sistema de grabación y bombas de succión.
- Posición de cada tubo de alimentación peristáltica (un tubo por baño) alrededor de los rodillos de la bomba peristáltica. Asegure con los topes de retención y apretando las levas de compresión y bloqueo de teclas alrededor de los tubos. Coloque los extremos libres de los tubos de alimentación peristáltica en un recipiente de 1 L de PSS y encienda la bomba para permitir que el PSS a inundar continuamente en los baños de tejido.
- Asegúrese de que las bombas de succión funcionan correctamente y que el nivel de solución en el baño es constante tal que la velocidad de flujo en el baño es igual a la tasa de eliminación. El nivel de PSS en el baño de tejido se puede ajustar manipulando la profundidad del tubo de succión en el baño con arcilla de modeler.
- Calibrar los transductores de fuerza colocando un peso conocido (equivalente a 1 millinewton (mN, unidad de fuerza)) en el gancho del transductor y la desviación detectada por el software de adquisición de la grabación.
Nota: Valores pueden ajustarse en el software de tal forma que los valores registrados se convierten automáticamente a mN negando la necesidad de realizar ninguna conversión más durante el análisis. Calibración de transductores de fuerza debe realizarse antes del montaje del tejido.
3. tejido preparación y disección de las tiras
- Recoger las biopsias del miometrio humano embarazada (1-2 cm3) en CS después de la entrega de la bebé y la placenta. Obtener biopsias de espesor completo (típico) en el cual están presentes el perimetrium (capa externa serosa del útero) y la decidua (capa más interna del útero). Utilice sólo del tejido miometrial (capa central del músculo). Véase la figura 1A-B.
- Retirar decidua (esencial) y cualquier adherente de membranas fetales (si presente) como estos tejidos se saben que producen sustancias que pueden alterar la contractilidad miometrial.
Nota: En cirugía, las muestras se coloca en Hanks equilibrada sal solución (HBSS) o PSS fresco y almacenadas a 4 ° C. Idealmente los tejidos deben utilizarse dentro de 12-16 h de la cirugía, sin embargo los estudios no han demostrado detrimento a la contractilidad después de 18 h de colección con almacenamiento a 4 ° C51. Los controles adecuados se deben realizar para confirmar la viabilidad del tejido y la función después de un almacenamiento prolongado a 4 ° C. Aquí las muestras se toman desde el borde superior de la incisión de segmento uterino inferior y no desde el segmento superior. Los segmentos superiores e inferiores del útero se ha demostrado igualmente contratar48, por lo tanto, las biopsias de segmento inferiores se consideran un buen reflejo de la actividad miometrial de segmento superior.
- Retirar decidua (esencial) y cualquier adherente de membranas fetales (si presente) como estos tejidos se saben que producen sustancias que pueden alterar la contractilidad miometrial.
- Preparar el área de disección y requiere instrumentos incluyendo: tijeras de disección grande, pequeñas tijeras de disección de Vannas, dos pinzas de disección, alfileres de disección y pinzas de tejido de aluminio, alrededor de un microscopio de disección con ambos fijos y zoom Ampliación.
- Lugar la muestra de biopsia en un plato de disección clara base de silastic (véase Tabla de materiales) con PSS y cuidadosamente orientar la biopsia se identifican los bordes de la serosa y decidua figura 1B.
- Utilice pernos para fijar la biopsia a la base del plato. Asegúrese de que el tejido permanece hidratado con PSS en todo el proceso de disección.
- Manualmente encienda la fuente de luz del microscopio y examinar el tejido al microscopio con 10 aumentos para identificar regiones del myometrium libre de cicatrices, serosa, decidua y cualquier adherente de membranas fetales si está presente.
- Realizar disección Roma con tijeras de disección grande para separar dos capas de tejido adyacente, revelando dos planos o láminas de músculo.
Nota: A menudo es más fácil encontrar un pequeño bolsillo entre capas de tejido para iniciar la separación, pero debe tenerse cuidado para evitar pequeños vasos en el borde de la biopsia ya que se pueden confundir con 'bolsillos'. - Lugar disección de alfileres en cada esquina del tejido para asegurarlo. Revise las hojas del músculo en busca de regiones de músculo con fibras en paralelo.
Nota: Identificación de la región puede ser ayudado por la dirección de pequeños capilares perfundiendo a través del tejido. Tracción suave en el borde del tejido también puede ayudar a identificar la dirección en que viajan las fibras. - Corte tiras de tejido ~ 2 mm ancho x 8 mm de largo x 1 mm de espesor a lo largo del eje longitudinal alineado con la dirección de las fibras musculares con tijeras de disección pequeño.
Nota: Debe tenerse cuidado para mantener sólo el tejido por el borde de corte inicial para evitar daños. - Repita el proceso para disecar el número de tiras requeridas para el experimento.
- Prender cada tira de ambos extremos para alisar y garantizar al plato, teniendo cuidado de no sobre estirar el tejido.
- Fije los ganchos de tejido de aluminio en cada extremo para que el tejido entre ellos es ~ 5 mm largo y cuidadosamente corte cualquier exceso de tejido (figura 1).
- Transferir a un plato limpio con PSS listo para el montaje.
4. montaje de los tejidos en los baños
- Transferencia de las tiras a los baños de tejido experimental. Montar las tiras horizontalmente en lugar de verticalmente (como en baños de órgano tradicional) (figura 2B).
- Acople un extremo de cada tira por el clip para el transductor de fuerza, que mide la contracción del tejido, y el otro fijo a la cámara de tejido gancho.
Nota: La capacidad de la bañera de tejido es ~ 1 mL que es lo suficientemente grande como para asegurar que las tiras estén completamente sumergidas en el baño. - Sean las tiras en la base de cada gancho en el baño.
- Abra el software de grabación haciendo doble clic sobre el icono del software.
- Ajustar la grabación para cada canal que está a la vista en la ventana del canal.
- Ajustar la escala del eje Y leer entre 0-10 V (equivalente a 0-10 mN post calibración) haciendo clic derecho sobre el eje Y, seleccionar 'scale' e introducir mínimo y máximos valores de 0 y 10, respectivamente. Seleccione 'OK'. Repita para cada canal de grabación.
- Presione 'grabar' en el software para comenzar la grabación en vivo.
Nota: Si las tiras no se aseguran a la base de cada gancho, podría deslizarse durante la contracción que aparecerá como una 'muesca' en la grabación. La tensión del sistema va a cambiar y por lo tanto puede diferir deslizamiento después de las contracciones. - Estire el tejido en cada baño girando manualmente el micromanipuladores adjunta a cada transductor. Siga el movimiento del tejido hacia arriba desde el inicio de la pantalla y continúe girando los micromanipuladores hasta que la tensión de línea de base llega a 0,2 g (~ 2 minutos).
Nota: El tejido inmediatamente comenzará a relajarse (conocido por la caída en la tensión de línea de base), suelen llegar a una tensión constante de entre 0,5 a 1 mN. Esta tensión definida ha sido optimizada para las tiras de tejido de este tamaño en nuestras condiciones experimentales. Si se utilizan otros tejidos tamaño, es esencial que se realizan las investigaciones de relación longitud-tensión apropiada para optimizar la fuerza descansa a aplicarse. - Permitir que los tejidos se equilibren para ~ 2 h hasta que se presentan contracciones espontáneas.
Nota: una pequeña elevación en la tensión de línea de base generalmente se observa y es un buen indicador de la viabilidad del tejido y que será contráctil.
5. desafiando el tejido con potasio de 40 mM (alto K+)
- Si no hay contracciones espontáneas se producen después de 2 h de montaje, desafiar las tiras con una solución de sal de potasio alto en que potasio se eleva a 40 mM por sustitución isosmóticas de NaCl por KCl. Para el alto K+, agregar lo siguiente (en mM): NaCl 119,6, 40 KCl, 1,2 MgSO4, 7,8 glucosa, 10,9 HEPES y 2.0 CaCl2.
Nota: En el músculo liso como el miometrio, aplicación de alta K+ causa contracción indirectamente abriendo los canales de calcio voltaje funcionado hacia la máxima afluencia de Ca2 + en las células del tejido. Alto K+ por lo tanto puede utilizarse como una medida para poner a prueba el índice general de la integridad del tejido así como lograr una medida de la respuesta máxima del tejido.- Coloque el tubo de alimentación para el baño que contiene la tira a ser desafiado en una botella de laboratorio de vidrio que contiene alta K+ 1-2 minutos.
- Devuelva el tubo de alimentación en el contenedor de PSS.
- Donde se logra una respuesta al alto K+ , continuar la vigilancia de la franja de un 1 h más. Si no obtiene respuesta contráctil a alta K+ o ninguna actividad espontánea sacaron post respuesta K+ , deseche la tira.
Nota: El experimentador también tiene que ser consciente del espacio muerto (tiempo de solución para alcanzar el baño de tejido) en el tubo alimentador antes de evaluar la respuesta a la alta K+. Esto puede tomar 2-3 minutos y dependerá de la velocidad de flujo. - Para asegurar el lavado completo del alto K+ de los tubos de baño y alimentador, que pueden afectar maniobras posteriores, esperar las contracciones espontáneas vuelta en pre alta K+ amplitud antes de continuar con el experimento.
6. pruebas de los efectos de los compuestos conocidos y novedosos en la contracción miometrial
Nota: Pueden realizarse experimentos para probar el efecto de nuevos medicamentos y reactivos en función miometrial en espontáneo (Figura 3A) o agonista estimula contracciones (figura 3B-C). Para el agonista estimula contracciones, OT o arginina vasopresina (VP) se agrega al PSS para obtener una concentración de 0, 5 nM y se utiliza durante todo el experimento (figura 3B-C). La concentración de OT ha sido optimizada para este ensayo ya que proporciona las contracciones que son fásicas en naturaleza40,52. Concentraciones de agonistas mayores que esto puede conducir a las contracciones (tónico) duraderas y sostenidas (ver Ref41,44 por ejemplo) en que es difícil evaluar el efecto de varios agentes y el marco de tiempo experimental necesita ampliarse considerablemente para dar cabida a la mayor duración de las contracciones individuales y reducción en la frecuencia. En este experimento ejemplo, OT o VP se agrega a estimular las contracciones así que antagonismo por OTR conocido V1aR antagonistas, atosiban y SR49059, o por nuestro novedoso compuesto [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]), puede ser evaluada.
- Preparar concentraciones de la prueba, establecidos en PSS (con o sin 0.5 nM OT/VP) diluido en un mínimo de dilución 1/1.000, garantizando una amplia gama de concentraciones son como aquellos que no provocan una respuesta a concentraciones que excedan la máxima respuesta.
- Preparar un conjunto equivalente de diluciones que volúmenes iguales de vehículo (por ejemplo, dimetil sulfóxido, acetonitrilo o agua destilada).
Nota: A menudo es más fácil preparar la concentración más alta, es decir, 10-6 M (a partir de un stock de 10-3 M) y luego realizar diluciones seriadas a lo largo de una escala logarítmica (p. ej., 10-6–10-10 M). El volumen a preparar depende el tiempo de aplicación, caudal del aparato y número de tiras que se examinará, por ejemplo, para una aplicación de 25 min de reactivo y un caudal de 1 mL/min, un mínimo de 25 mL de cada concentración por baño de tejido es requisito Ed. - Aplicar la primera concentración del compuesto en el tejido mediante la colocación de la tubería de alimentación para el baño de tejido en un frasco de laboratorio de vidrio que contiene el reactivo a la concentración deseada.
Nota: Esto se debe hacer una vez que se logre una base estable de contracciones espontáneas o OT/VP-estimulado. - Aplique la solución de control correspondiente de vehículo de la misma manera a un segundo baño.
- Registrar el tiempo de aplicación (es decir, cuando se cambió la tubería de alimentación).
- Repita el proceso para cada concentración colocando secuencialmente el tubo alimentador en la botella de laboratorio de vidrio que contiene la concentración siguiente en la serie y repita hasta que todas las concentraciones se han aplicado.
La aplicación de cada concentración puede ser entre 15 y 30 min pero debe ser constante para cada concentración aplicada y entre experimentos. Los con OT o VP-estimula las contracciones tienden a requerir los períodos de aplicación (por ejemplo, 25 min) para tener en cuenta la reducción en la frecuencia de la contracción observada bajo estimulación. Experimentos preliminares para determinar el tiempo óptimo de la aplicación se deben realizar previamente con cualquier reactivo nuevo probando. - Devuelva el tubo de alimentación a PSS (con o sin OT/VP) para lavado.
- Haga clic en 'stop' para terminar la grabación en vivo. Inmediatamente guardar los datos en una carpeta adecuada y una versión de la exportación como un archivo 'Mat'.
7. Análisis de datos
Nota: Captura de datos y análisis pueden realizarse por cualquier número de paquetes de software de adquisición de datos disponibles en el mercado. Véase Tabla de materiales para los detalles de software utilizado en este protocolo. Para una evaluación precisa de la actividad contráctil, los parámetros de las contracciones a medir incluyen: i) la amplitud de la contracción, ii) frecuencia de la contracción, iii) duración de la contracción y fuerza iv) media integral (figura 4). Fuerza media integral equivale al área bajo la curva de contracción y por lo tanto es un índice del trabajo total realizado por la tira de tejido en un momento dado. Algunos o todos los parámetros pueden ser analizadas. Como mínimo, se recomienda que la fuerza integral media y amplitud de la contracción son analizados53. En los experimentos descritos aquí medimos cambios en la amplitud de la contracción y el área bajo la curva.
- Importar archivo de the.mat en el software de análisis.
- Ajustar la columna correspondiente al eje X para reflejar el tiempo experimental, teniendo en cuenta la frecuencia del intervalo de muestreo. Experimentos normalmente se registran de 10 Hz correspondiente a 10 muestras/s o muestras de 600/min.
- Parcela los datos como un uso de gráfico X-Y coordinar "parcela | Función de línea".
- Cero la base de la contracción mediante la función 'traducir vertical' en el software.
- Seleccione un periodo de control adecuado.
Nota: Este es el período de tiempo inmediatamente anterior a la aplicación de la primera concentración del regente pero igual a la duración de la aplicación del reactivo (Figura 4A). Por ejemplo, si la aplicación del fármaco X es por 25 min, utilizar 25 min antes de la primera aplicación del medicamento X como el control. - Leer el eje Y registrar la amplitud (fuerza) de la contracción en el pico máximo de cada contracción que ocurre en el período seleccionado y calcular un valor medio.
- Medir la duración de la contracción en el 50% de este pico máximo por lectura el eje X al comienzo y al final de cada contracción y registrar un valor medio.
- Contar el número de contracciones que se producen en el marco de tiempo para generar un valor para la frecuencia.
- Utilice la función de 'integración' para calcular el AUC (en unidades arbitrarias, a.u.) durante el período de tiempo seleccionado.
Nota: Para grabar con precisión las AUC, es esencial que la base de las contracciones se establece en cero en el eje Y. - Secuencialmente mover a través de cada una de las concentraciones y registrar los diferentes parámetros de la contracción.
- Establecer los datos de control como 100% y expresa los valores obtenidos en cada concentración del reactivo como un porcentaje de este controlan , es decir, valores de estimulación deben ser > 100% mientras que la relajación debe ser < 100%.
Nota: La normalización de los datos de esta manera debe permitir al usuario comparar resultados a través de las tiras y tratamientos farmacológicos. - Repita para cada experimento y transferir los datos a un paquete de gráficos.
Representative Results
Usando este modelo, la respuesta a diversos agonistas y antagonistas de la contracción, así como nuevos agentes de la función conocida o desconocida puede ser examinada y cuantificada. Parámetros farmacológicos estándar como valores de IC50 EC50 pueden calcularse cuando los reactivos se utilizan en una amplia gama de concentraciones, por ejemplo, 10-5– 10-9 M y añadidos en el aumento de las concentraciones a lo largo de un escala logarítmica.
Experimentos de concentración respuesta de oxitocina Receptor Antagonista
En este experimento, tiras emparejadas de miometrio humano se cortaron como se describe anteriormente y se muestra en la figura 1, montado en los baños de tejido como se muestra en la figura 2y permitió a equilibrar para producir contracciones estables de igual amplitud y frecuencia. Las tiras fueron expuestas al agonista endógeno de OTR, OT (0,5 nM) para estimular las contracciones. Después de un período de actividad estable en OT (típicamente 45 min), atosiban fue aplicado a una tira en el aumento de las concentraciones a lo largo de una escala logarítmica (10-9-10-6 M). La segunda franja quedó en OT solo como control de tiempo. Un ejemplo de la respuesta a atosiban puede verse en la figura 5A. Teniendo las contracciones inmediatamente anterior a la primera concentración de atosiban como control (100%), la amplitud y la AUC para cada concentración aplicada se calculó como se muestra en la figura 4. Experimentos de control de tiempo, se midió el tiempo equivalente de maniobras experimentales. Los datos luego se trazaron y curvas equipado con la función de regresión no lineal en un paquete de software gráfico (figura 5B-C). En términos de calcular el efecto inhibitorio, la potencia relativa del atosiban se calculó midiendo la IC50 que es la concentración que causa la mitad (50%) inhibitoria respuesta máxima. Lo mismo puede hacerse para agonistas o estimuladores de la contracción. En este caso la potencia del compuesto se calcula de la EC50 (la concentración que causa la respuesta estimuladora máxima media).
Investigar la respuesta de nuevos compuestos y prueba su selectividad del Receptor
Utilizamos este modelo fisiológico relevante de ex vivo humano myometrial contracciones para examinar los efectos antagónicos de un compuesto recién sintetizado, [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]) sobre las contracciones estimuladas con ya sea el nativo V1a Agonista de R, VP o el agonista nativo de OTR, OT. Se utilizó este ensayo para validar la selectividad del receptor de INT [D-Arg8], que había sido previamente determinado por métodos farmacológicos basados en la célula a ser un antagonista en el V1aR pero no en la OTR54.
En este experimento, tiras myometrial humana fueron expuestas a 0.5 nM VP o 0,5 nM OT por alrededor de 1 h para estimular las contracciones, como se muestra en la figura 3, antes de agregar nuestro nuevo INT de [D-Arg8] compuesto en el aumento de las concentraciones (figura 6A y figura 6 C). esto fue entonces comparado con el disponible en el mercado, conocido V1aR antagonista, SR49059 (Figura 6B). La figura 6A muestra disminuciones dependientes de concentración en contracciones myometrial humano VP-estimulado con el aumento de las concentraciones de [D-Arg8] INT. Los datos de amplitud de la contracción y AUC para cada concentración se resumen en la figura 6Aii-iii. El efecto es similar al mostrado para aumentar concentraciones del conocido V1aR inhibidor, SR49059, que se muestra en la figura 6Bi-iii. La selectividad de INT [D-Arg8] hacia el V1aR pero no hacia el OTR se demuestra por el hecho de que [D-Arg8] INT no no disminuir contracciones myometrial humana que han sido estimuladas con OT (figura 6) como amplitud y AUC permanecido estable (figura 6Cii-iii).
Figura 1: disección de la biopsia miometrial humana. (A) A diagrama del útero humano mostrando las capas de tejido de tres que conforman la pared uterina. La capa más interna es el endometrio (decidua en flecha embarazo, rojo), la capa media es el miometrio (flecha de la capa muscular, negro) que genera las contracciones y la capa más externa es el perimetrium (o membrana serosal, flecha azul) que forma un capa protectora en el útero. La región de interés para tomar muestras de biopsia es representada por el rectángulo negro. Una biopsia de ejemplo de una mujer embarazada tomada durante la cesárea se muestra en (B) con la decidua y myometrial capas resaltadas (serosa no visible). Es esencial que las capas de tejido diferentes son identificadas para que las tiras del myometrium se disecan correctamente para la experimentación. En (C) se muestra una tira de ejemplo del miometrio que ha sido disecado y recortada. Por lo general, 2 – 6 tiras se cortan y recortadas como se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: múltiples órganos baño conjunto experimental hasta utilizado para medir las contracciones del miometrio humano. (A) tiras del myometrium se colocan en órganos pequeños (1 mL) baño cámaras colocados encima de un depósito caliente (i) y son sobrefundido con solución salina fisiológica (PSS) mediante una bomba peristáltica (ii). El depósito se mantiene a una temperatura de ajuste por medio de un baño circulante de agua (iii). Cada tira está conectado a un transductor de fuerza (iv), que registra los cambios en tensión durante la contracción. Esta es amplificada por un amplificador transbridge (v) y convertida en una señal digital (vi), que se registra en un sistema informático (vii) ejecuta el software de adquisición asociado. (B) imagen ampliada de una sala de baño de órgano con una tira de miometrio humano en situ (flecha roja), bañada en PSS con un extremo conectado a un transductor de fuerza y el otro un gancho fijo. ()C) Descripción esquemática de la puesta en marcha. Cámaras de tejido llenados de PSS son continuamente inundadas con PSS calentado a 37 ° C que es mediante el intercambio de calor con un depósito de agua caliente debajo de los baños (mantenidos a 45 ° C) y una bomba de circulación de agua a 55 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: espontáneas y agonista estimula contracciones del miometrio humano en vitro. En condiciones libres de agonista, contracciones espontáneas permanecen estables durante más de 3 horas de grabación sin pérdida significativa de la amplitud o área bajo la curva (AUC) (Aii, Aiii), demostrando la robustez de este modelo para la investigación de la aplicación de varios agentes en la contracción espontánea. Después de establecer las contracciones espontáneas, estables, 0,5 nM oxitocina (B, OT) o vasopresina (C, VP) fue agregado a la solución salina fisiológica (PSS). Contracciones bajo estimulación también permanecen estables por un número de horas sin pérdida significativa de la amplitud de la contracción (Bii, Cii) o AUC (Biii, Ciii) que permite el efecto de varios agentes contráctiles que investigado en presencia de agonistas miometrial. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Nota, para el agonista estimula las contracciones (B, C), el período de control (100%) se toma después de los primeros 45 minutos de aplicación de agonista, una vez que las contracciones se han estabilizado. En todos los casos, las tiras fueron sobrefundidas con PSS a 37 ° C, pH 7,4 (reproducido de Arrowsmith et al. 40 con permiso de Ciencias reproductivas y Di Giglio et al. 54 con el permiso de Informes científicos bajo la licencia Creative común acceso abierto). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de datos. (A) Un período de control apropiado se muestra en rojo se determinó seleccionando las contracciones inmediatamente anterior a la aplicación de la sustancia de ensayo (droga X). Este período de control también es igual en tiempo a la aplicación de la droga X (p. ej., 40 min en este ejemplo). Una vez medidos los valores para el período de control se establecen como 100%. Todas medidas entonces se expresan como un porcentaje de control. (B) hay 4 diferentes parámetros de la contracción que se puede medir: i la amplitud de la contracción que mide la fuerza de contracción (fuerza, mN), (ii) frecuencia de la contracción que mide el ritmo de contracción, (iii) duración de la contracción que se mide en el medio pico máxima de contracción y (iv) área bajo la curva (también conocido como integral, arbitrario unidades de fuerza) que da una medida del trabajo total realizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: grabar el efecto antagónico del atosiban sobre las contracciones inducidas por la oxitocina en el miometrio humano. Una vez que se establecieron las contracciones espontáneas, las contracciones fueron estimuladas con el agonista del receptor de oxitocina, la oxitocina (OT). Las contracciones fueron permitidas para estabilizar bajo estímulo para otros 45 min (A) el V1a y antagonista del receptor de OT, atosiban se aplicó luego en el aumento de las concentraciones a lo largo de una escala logarítmica (10-9-10-5M). Las contracciones durante el período anterior a la primera concentración de atosiban se midieron y se toma como control (100%). La actividad en cada concentración posterior fue medida y expresada como un porcentaje de control. La misma fue realizada para las tiras expuestas a OT solo con el tiempo equivalente de maniobras experimentales. Datos se trazaron en software grafico: (B, C) muestran las curvas de concentración-respuesta para el efecto antagónico de atosiban (azul) y dilución del vehículo (gris, control de tiempo) en la amplitud de la contracción miometrial inducida por OT y área bajo la curva (AUC), respectivamente. Datos se presentan como el error de estándar de la media ± del media (SEM) porcentaje de la amplitud y el AUC de la actividad de control (antes de la aplicación del atosiban). Valores de IC50 se calcularon entonces que dan la concentración en la que la media máxima inhibitorio (50%) respuesta amplitud de contracción y fuerza integral (AUC) es alcanzado (reproducido de Arrowsmith et al. 40 con permiso de Ciencias de la reproducción). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: prueba de la selectividad efecto y receptor de una novela compuesta en la contracción miometrial humana. Después se establecieron las contracciones espontáneas del miometrio humano, las contracciones fueron estimuladas con el agonista del receptor de vasopresina, vasopresina (VP) (Ai, Bi) o el agonista del receptor de oxitocina, la oxitocina (OT) (Ci). El efecto de la [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]) y el antagonista disponible en el mercado de1aR V, SR49059 en contracciones estimuladas por el Vicepresidente fue evaluado mediante la aplicación de aumento de las concentraciones de los compuestos. Las respuestas típicas se muestran en (Ai, Bi). Los asociados, analizaron datos de amplitud y área bajo la curva (AUC) se muestran en (ii) y (iii), respectivamente donde el efecto ha sido expresado como porcentaje del control de la actividad (100%). INT [D-Arg8] y el conocido antagonista de1aR V SR49059 causó una disminución dependiente de la dosis en amplitud y AUC, apoyando la función de INT [D-Arg8] como un antagonista de los receptores1aR V en miometrio humano. Por el contrario, INT [D-Arg8] no afectó las contracciones estimuladas por OT (Ci-iii), por lo tanto semejantemente a nuestros resultados de análisis de base de la célula, INT [D-Arg8] también muestra selectividad hacia el V1aR en miometrio humano (datos reproducidos de Di Giglio et al. 54 con el permiso de Informes científicos bajo la licencia Creative común acceso abierto). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Mientras más desarrollo de fármacos está diseñado para el tratamiento de enfermedades humanas, la investigación más básica se realiza principalmente en los tejidos animales. Aquí, describimos los métodos para investigar ex vivo las contracciones del miometrio humano Obtenido de la cirugía que se puede utilizar para tratar una serie de preguntas importantes relacionados con uterino fisiología y patología, así como para validar las respuestas funcionales a conocidos y nuevos agentes farmacológicos para ayudar el desarrollo de fármacos. En particular, destacamos el uso de este ensayo para investigar la respuesta antagónica de un conocido OTR y V1aR antagonista competitivo, atosiban en contracciones myometrial embarazada OT-inducida, así como determinar la respuesta y el receptor selectividad de un desarrollado recientemente V1aR antagonista selectivo, [D-Arg8] INT. Demostramos que pueden calcularse los parámetros farmacocinéticos importantes como IC50 EC50 , que se alinean bien con los datos de Farmacología celular.
Con múltiples tiras al mismo tiempo permite la comparación directa de múltiples efectos de agente, experimentos de competencia con los antagonistas y los controles adecuados de tiempo y el vehículo. Como las tiras están preparadas a menudo en grupos de 2, 4 o 8, esta técnica proporciona un rendimiento moderado, permitiendo la prueba de compuestos de 2 – 4 6 – 8 (acumulativo) concentraciones (por biopsia). Este método también proporciona datos en tiempo real para que los efectos pueden valorarse rápidamente y protocolos pueden ser ajustados. Además, esta técnica puede usarse para probar cualquier compuesto de interés y se ha utilizado con éxito por un número de grupos de investigación que se centró en fisiología miometrial y en descubrimiento de fármacos. Además de analizar compuestos puros como se describe en este documento, el modelo de contractilidad uterina también ha sido y puede ser utilizado con éxito para pantalla de uterotónicos novela compuestos de mezclas, tales como preparaciones herbarias de la medicina tradicional7 , 55 , 56.
Aunque este modelo es técnicamente sólido y muestra buena reproducibilidad, tienen algunas limitaciones: la disección puede ser difícil para quien no esté familiarizado con el tejido o use equipos de disección, por lo tanto nuevos usuarios requerirá algún tiempo para optimizar el tejido preparación y protocolos. Debe señalarse también que miometrio humano difiere considerablemente en apariencia a otros modelos como la rata y el ratón. Úteros de roedores la mayoría están compuestos por dos cuernos uterinos de forma de tubo, cada uno con un ovario en un extremo y Unido en el cuello uterino. Cada cuerno ha definido claramente las capas musculares longitudinal y circular, que pueden ser fácilmente separadas en la disección, mientras que los tipos de fibras diferentes en miometrio humano a menudo se entrelazan formando una 'malla'. Además, los perfiles de la contracción del miometrio humano son muy diferentes a los roedores. En particular, las contracciones en el miometrio humano son menos frecuentes pero más duración. Marcos de tiempo experimentales para trabajar con miometrio humano por lo tanto son a menudo mucho más que modelos de roedores. Diferencias en la expresión del receptor entre especies también pueden contribuir a diferencias muy marcadas en las respuestas a los agonistas y esto debe tenerse en cuenta si la extrapolación de resultados a través de especies.
Hay también número de pasos que necesitan consideración para maximizar la salida de este sistema. Pasos críticos incluyen la preservación de la viabilidad del tejido como teniendo cuidado al manipular los tejidos para evitar cualquier daño innecesario durante la disección o al montaje. Un ojo experto es necesario diseccionar tiras finas del músculo uterino, garantizando que la orientación de las fibras musculares está en la dirección longitudinal y el plano del tejido, así como evitar los tejidos de la cicatriz, decidua y vasos pequeños. Para fines de orientación una vez que el espécimen en el laboratorio, es posible añadir una etiqueta (como pequeñas puntadas quirúrgicas) en el momento de recogida a un lado de la biopsia para delinear el borde serosal del borde decidual.
Los tejidos se deben mantener en un constante 36 – 37 ° C durante la experimentación como función del tejido está sujeto a las fluctuaciones de temperatura. Esto puede lograrse con una unidad de aire acondicionado robusto dentro del laboratorio. Perfusión constante de PSS caliente asegura que la temperatura se mantiene así como la descarga de productos de desecho de la contracción. Temperatura dentro de los baños de órgano puede modificarse cambiando la velocidad de flujo o ajustando la temperatura del baño de agua directamente. El tamaño de baño pequeño en comparación con los baños tradicionales 5-50 mL asegura una rotación relativamente rápida de PSS y lavado de los reactivos. El baño de órgano miniaturizados como se describe aquí, también reduce el volumen de PSS y reactivos de interés necesitada, minimizando así los costos y ahorrar preciosos, desarrollado recientemente productos químicos. Además, debido al tamaño del baño y usando un tampón HEPES base, este sistema no requiere oxigenación p. ej., por los burbujeantes PSS con carbogen. También es importante la normalización de la tensión aplicada a las tiras. Para las tiras de este tamaño (5 x 2 x 1 mm), esto debe ser aproximadamente 2 minutos (equivalente a ~0.2 g). Métodos alternativos incluyen la aplicación de una solución de alto potasio para inducir la contracción máxima y que se extiende hasta la mitad de esta contracción máxima. Debe ser observado sin embargo, esa tensión aplicada en vivo pueden diferir.
Los desafíos principales incluyen la obtención de tejidos de seres humanos, pero aunque gravar, tejidos humanos claramente representan lo más fisiológicamente relevante (y gratificante) modelo para el estudio de la contracción uterina en el descubrimiento humano de la enfermedad y de la droga. El tejido aislado tiras sin embargo, no necesariamente equivalen a tejido en vivo como por ejemplo, de hormonal y nervioso de entrada que, aunque no es esencial para la contracción, modula las contracciones en vivo. Este ensayo sin embargo brinda la oportunidad de analizar myometrial contracciones de forma controlada, separada de tales influencias. También permite el efecto de factores tales como el control hormonal de la contracción (por ejemplo, a través de OT, VP, prostaglandinas, etc.) para ser investigado, proporcionando claves para la regulación de la función miometrial. Ya que los tejidos se obtienen de diferentes mujeres, naturalmente hay alguna variación en los perfiles contráctiles espontáneos entre muestras. Por lo tanto, a menudo es necesario realizar experimentos en un gran número (~ n = 10) de muestras para reducir al mínimo la variación en algunos conjuntos de datos53. Esto es muy importante al comparar la actividad contráctil entre diferentes grupos de pacientes. Normalización de la respuesta de agonistas y antagonistas para el control de la actividad (es decir, expresar como un porcentaje de actividad de control o alta K+) reduce la parte de esta variación. Además, para reducir la variación inter-tira, datos pueden normalizarse para área seccional transversal midiendo su longitud y peso post experimentación41. Esto es particularmente útil cuando se comparan patrones de contracción entre los diferentes grupos de pacientes.
Limitaciones de esta técnica también incluyen acceso a tejidos frescos que requiere buenas relaciones de trabajo con personal del hospital, especialmente personal de teatro y los involucrados en el proceso de consentimiento. Permisos de éticos de la Junta de revisión de Comité de ética de investigación e Instituto u hospital local también necesitan estar en su lugar. Colección de miometrio humano es probablemente realizada durante la entrega de la CS, cuando el donante es sometidos a cirugía. La biopsia se toma del mismo sitio de la incisión uterina para entregar al bebé y por lo tanto el paciente no necesita someterse a algún procedimiento más adicional. Personal del teatro y el cirujano realizar la biopsia es necesario conocer el uso posterior de los tejidos y que no deben colocarse en soluciones de fijación tal como para enviar a un servicio de anatomía patológica. El plazo largo experimental es otra consideración. Experimentos con tejidos humanos tardan muchas horas (típicamente > 6 h) (a diferencia de 2-3 h para un experimento similar en útero de rata o ratón), debido a la frecuencia más lenta de la contracción y el tiempo 2-3 h entre montaje de tejidos y creación de espontánea contracciones. Sin embargo, como hemos demostrado, las contracciones del tejido humano son robustas y cuando puede contratar durante muchas horas sin cansancio significativo40.
Este sistema también permite otros retos de trabajo en vivo que superar incluyendo la posibilidad de probar farmacéuticos reactivos en tejido embarazado. Esta técnica puede extrapolarse fácilmente a otras especies como el ratón por el que se pueden confirmar resultados iniciales antes de proceder más lejos en los estudios en animales enteros. Cambios controlados en temperatura, composición de la superfusate (PSS) y el pH se puede hacer fácilmente para simular diferentes escenarios en vivo y analizar el efecto de estos cambios en el comportamiento del compuesto. Los principios básicos de medición de la tensión isométrica en tiras miometrial pueden ampliarse también a medir cambios simultáneos en la concentración de calcio intracelular o pH por el uso de fluorescente Ca o indicadores de pH (H+) y equipo para detectar y registro de la fluorescencia57,58,59,60.
En general, el miometrio humano representa un modelo robusto y fisiológicamente relevante caracterizar y validar nuevos compuestos terapéuticos en descubrimiento de fármacos, compuestos puros y mezclas. Hemos dado ejemplos de su uso en el descubrimiento de medicamentos con respecto al sistema de OT y Vicepresidente y se centró en OTR y V1unaR antagonistas para mostrar cómo este modelo puede utilizarse para determinar la eficacia compuesto y la potencia en objetivos definidos y validar la selectividad del ligando. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que esta técnica puede utilizarse para el estudio de cualquier objetivo de interés o camino que lleva a la contracción miometrial (o relajación), así como para facilitar el descubrimiento de medicamentos nuevos objetivos y caminos y avanzar en nuestra comprensión de myometrial Fisiología y Fisiopatología.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación ha sido apoyada por el fondo austriaco de ciencia (FWF) a través del proyecto I3243 y el Consejo Europeo de investigación (CEI) bajo programa de innovación e investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo Nº 714366 de la concesión). CWG ha sido apoyado por una beca del futuro del Consejo de investigación australiano (ARC) (FT140100730) y MM por una beca de arco descubrimiento precoz carrera investigador (DECRAN) (DE150100784). SA es apoyado por un bienestar de Harris prematuro nacimiento centro de beca de investigación administrado por bienestar de la mujer, UK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
| Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
| GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
| LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
| Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
| BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
| Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
| Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
| Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
| Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
| Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
| Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
| Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
| Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
| Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
| Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
| Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
| Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
| Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
| Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
| Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
| Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
| HBSS | SIGMA | H9269 | |
| Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
| Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
| [Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |
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