Summary
توضح هذه المقالة البروتوكولات التجريبية لدراسة السابقين فيفو تقلصات ميوميتريوم البشرية وتطبيقها في اكتشاف الأدوية. يتم استخدام هذا الأسلوب لتحسين فهم ميوميتريال فسيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية، وكذلك فيما يتعلق بالتحقق من صحة البيانات الدوائية من تحقيقات البحث رواية أو يؤدي المخدرات.
Abstract
اكتشاف ووصف رواية المركبات الصيدلانية أو المسابر البيوكيميائية تعتمد على نظم المقايسة قوية وفسيولوجيا ذات الصلة. يصف لنا أساليب لقياس السابقين فيفو كونتراكتيليتي ميوميتريوم. يمكن استخدام هذا الفحص للتحقيق في العوامل والجزيئات التي تكتنف تحوير انكماش ميوميتريال وتحديد الإجراءات التي تتخذها ضادات أو المثبطة، ومن ثم بهم العلاجية المحتملة في فيفو. يتم الحصول على خزعات من النساء تمر بالولادة القيصرية مع الموافقة المستنيرة. شرائط غرامة من myometrium يتم تشريح وقص وتعلق على محول قوة داخل 1 مل الجهاز الحمامات سوبيرفوسيد بحل المحلول الملحي الفيزيولوجي عند 37 درجة مئوية. شرائط تطوير تقلصات عفوية ضمن ح 2-3 ضمن مجموعة التوتر وتبقى مستقرة لعدة ساعات (> ح 6). ويمكن أيضا حفز شرائط العقد كقوة الهرمونات الذاتية، الاوكسيتوسين وفاسوبريسين، مما يسبب التعديل تعتمد على تركيز من وتيرة الانكماش، والمدة، أكثر شبهاً تقلصات في العمل. ومن ثم، يمكن اختبار تأثير المخدرات المعروفة، ورواية العملاء المتوقعين في تقلصات عفوية وفعل مؤثر.
تفاصيل هذا البروتوكول على وجه التحديد كيف يمكن استخدام هذا التحليل لتحديد فاعلية عناصر جديدة وغير معروفة من خلال قياس آثارها على معلمات مختلفة من انكماش ميوميتريال البشرية. يمكننا استخدام الاوكسيتوسين-والخامس1a مستقبلات الخصوم، ال atosiban و SR49059 كأمثلة للمركبات المعروفة التي تكبح تقلصات الناجمين عن الاوكسيتوسين وفاسوبريسين، وتبين كيف يمكن استخدام هذا الأسلوب لتكملة والتحقق من صحة الدوائي البيانات المتحصل عليها من الاختبارات المستندة إلى خلية للمساعدة في تطوير العقاقير. ويمكن أيضا وصف آثار يضع الرواية بالمقارنة مع الاوكسيتوسين وفاسوبريسين. حين نستخدم مثال الاوكسيتوسين نظام فاسوبريسين، وهذا الأسلوب يمكن أيضا استخدامها لدراسة مستقبلات وقنوات أيون التي تلعب دوراً في تقلص الرحم واسترخاء للنهوض بفهم الفسيولوجيا البشرية الرحم والفيزيولوجيا المرضية الأخرى.
Introduction
اكتشاف المخدرات يهدف إلى إنتاج الرواية، وقوية، وانتقائية للغاية يغاندس التي تولد استجابة علاجية بتنشيط أو تثبيط مسارات الإشارات الخلوية. وهذا يتطلب نظام تحليل مناسب لاختبار مركبات الرصاص مع نتائج موثوق بها وقوية وذات الصلة1. غالباً ما تستخدم تقنيات الدوائية مثل ربط مستقبلات يجند والاختبارات الوظيفية مغايرة النظم المستندة إلى الخلية، إجراء هندسة عكسية لمستقبلات أوفيريكسبريس الذي خلاف ذلك لن يكون هذا2. بينما هذه التقنيات توفر أفكاراً قيمة للصيدلة مستقبلات والإسراع بتطوير العقاقير، قد لا تعكس البيانات المتحصل عليها سيناريو صحيح في فيفو . ولذلك من المهم أن يتم أيضا التحقق من صحة البيانات الدوائية من فحوصات يستند إلى الخلية في النماذج ذات الصلة فسيولوجيا.
العضلات الملساء الرحم (ميوميتريوم) تشكل طبقة العضلات الرحم التي المسؤولة عن تقلصات أثناء المخاض تذويبها وتمدد عنق الرحم وتسليم الجنين3. تقلص myometrium عفوية؛ أنها لا تتطلب مدخلات هرمونية أو عصبية للتعاقد4. تقلصات التي أحدثتها depolarization عفوية من غشاء الخلية ميوميتريال الأمر الذي يؤدي إلى فتح تعمل بالجهد Ca2 +-قنوات (L-نوع القنوات) وتدفق من Ca2 + في الخلية5. المجمعات الكالسيوم مع كالمودولين وينشط كيناز سلسلة الخفيفة الميوسين الذي بدوره فوسفوريلاتيس الميوسين تمكين جسر عبر دورة تشكيل مع الأكتين والانكماش. الاسترخاء هو عادة بوساطة من الفسفرة دي الفوسفاتيز الميوسين من الميوسين وانخفاضا في تركيز Ca2 + عن طريق قذف به من الخلية و/أو عزل في الشبكة شبكية (SR)5،6 ،7.
وضعت عدة طرق لدراسة الدالة ميوميتريال والخلل، في فيفو الداخلية والخارجية توكوجرافي والضغط داخل الرحم بالقسطرة، إلى توليد الخلايا المحولة أو مخلدة من أصل ميوميتريال8 ،،من910،،من1112. بينما نظم الثقافة خلية يمكن الكشف عن ما إذا كانت مادة يمكن أن تعمل على المستوى الخلوي، يمكن استخدام شرائط من الأنسجة داخل حمامات الجهاز كأدوات لقياس الردود الفنية من الأنسجة كلها على الكواشف الدوائي. حمام الجهاز التقليدي هو عادة حجرة زجاجية مدفأة كبيرة وقادر على عقد بين 5 و 50 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي (PSS). وعادة ما تحتاج شرائط داخل هذه الدوائر الكبيرة التهوية بالأكسجين وكميات كبيرة من PSS. شرائط من النسيج يتم تشريح وعلقت داخل قاعة الاستحمام وتعلق على محول قوة الذي يقيس التغيرات في التوتر، كما هو الحال خلال انكماش. شرائط17،18من ميوميتريوم من البشر والحيوانات بما في ذلك، خنزير غينيا13، الماوس14، الفئران15، أرنب16وغيرها، وقد استخدمت عدد من مجموعات بحثية لدراسة العديد من الأسئلة المتعلقة ميوميتريال علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض، بما في ذلك العمال قبل الأوان واختلال. على سبيل المثال، استخدمت شرائط ميوميتريال لتحديد العوامل التي تنظم وتعديل النشاط شذوذ19،،من2021، تحديد دالة عضية مثل ريال22، فضلا التحقيق المغيرون أيون القنوات23،24،25،26، والمضخات، ومبادلات27 لتحديد دورها في الفسيولوجيا ميوميتريال.
تسمح هذه التقنية السابقين فيفو لتقييم أداء انكماش الأنسجة والتأثير المباشر للعوامل المختلفة على معلمات الانكماش التي تقاس بما في ذلك، وتقلص القوة (قوة)، وتواتر ومدة، فضلا عن دمج هذه القيم لإنشاء فهرس إجمالي العمل المنجز (يعني القوة لا يتجزأ أو المنطقة تحت المنحنى، أوك). إعداد قطاع الأنسجة المعزولة يشكل نموذجا لنوع واحد أو أكثر من الخلايا، ويمكن قياس الاستجابة الفسيولوجية النسيج كله. حمام الجهاز وقطاع الأنسجة المعزولة بالتالي أداة مفيدة في توفير الجسر بين خلية ثقافة العمل والحيوان كله وفي فيفو العمل. ومن ثم، في مجال اكتشاف الأدوية، آثار وكلاء الرواية من حيث ما عليه (أي، تحفيز) أو المثبطة (أي، الاسترخاء) المحتملة في فيفو يمكن تقييمها على نحو أوثق. استخدمت هذه التقنية بنجاح في وضع الاوكسيتوسين-والخامس1a-مستقبلات (OTR والخامس1aR) خصم atosiban كعامل حال للمخاض تمنع تقلصات العمل قبل الأوان، وتأخير الولادة قبل الأوان. في المختبر اختبار الاتوسيبان على شرائط ميوميتريال العثور على خصم قادرة على الحد كثيرا من الاوكسيتوسين (OT)-الناجم عن تقلصات28،،من2930. الأهم من هذه الدراسات ساعدت على التحقق من صحة قيمة متعدية ال atosiban وإنشاء البيانات من مفهوم الإثبات اللازمة لاتخاذ إلى الأمام للتجارب السريرية31،،من3233،34 . Atosiban الآن يستخدم على نطاق واسع كالعقار المفضل لتأخير العمل في أوروبا. أجريت دراسات من بين مفهوم الإثبات مماثلة كاربيتوسين الاوكسيتوسين التناظرية لإظهار إمكانياتها العلاجية في منع الولادة النزف35،،من3637. وتشمل مركبات الرصاص الأخرى قيد التطوير مع هذا التحليل حاليا38 من ريتوسيبان (GSK221149A) ونولاسيبان (بيانات غير منشورة). هذه الأساليب أيضا قد استخدمت بنجاح لمقارنة بين مجموعات المرضى39،،من4041،42،،من4344، 45،،من4647 ودراسة الاختلافات داخل الأنواع.
هنا يصف لنا استخدام معزولة السابقين فيفو شرائح الأنسجة من الحوامل myometrium البشرية داخل الحمامات الصغيرة (1 مل) الجهاز مصنوعة خصيصا لتوضيح كيف يمكن استخدام هذا الأسلوب لتكملة والتحقق من صحة البيانات الدوائية التي تم الحصول عليها من الاختبارات المستندة إلى الخلية . تم إلى حد كبير الحصول على خزعات من النساء تمر بحزب العمل قبل الولادة القيصرية (CS) الاختيارية كجراحة المخططة وهم وبالتالي أسهل لجدولة جمع خزعة، والوصول بسهولة إلى myometrium، والأنسجة سوف لا يتعرض لأي المنشطات مقو أو إرخاء قبل الجراحة. ومع ذلك، يمكن أيضا الحصول على خزعات من النساء تمر بتسليم CS (الطارئة) غير المخطط لها في العمل توفير هناك وقت كاف موافقة المريض تماما. يتم الحصول على معظم خزعات أثناء الجراحة من الجزء السفلي الرحم في موقع الشق الجراحي، ولكن من الممكن أيضا الحصول على عينات من ال48،الجزء العلوي49. وفي بعض الحالات بعد الولادة المهبلية، حصل خزعات لكمه من السرير المشيمة أيضا50. ومع ذلك، ليس هذا هو الطريق الأكثر تقليدية وكمية الأنسجة ميوميتريال استرداد صغيرة. يمكن الحصول على ميوميتريوم عدم الحوامل من النساء قبل أو بعد انقطاع الطمث تمر استئصال الرحم لظروف أمراض حميدة. سمك كامل خزعة عينات أمراض ما بعد الفحص، من مجموعة أقل بعيداً عن عنق الرحم، و myometrium مأخوذ من منتصف جدار الرحم تجنب السطوح سيرسال وبطانة الرحم.
Protocol
يجب أن تكون موافقة المجلس وسلامة الاستعراض المؤسسي، والأخلاقية المناسبة للتجارب مع الأنسجة البشرية في المكان قبل العمل مع أي من الأنسجة البشرية. وصف عمل جميع هذه الوثيقة تمت الموافقة من لجنة "أخلاقيات البحوث المحلية" (الشرق ليفربول، وتفصيل المرجع 10/H1002/49) ومجالس المراجعة المؤسسية للبحث وإدارة التنمية، ومستشفى ليفربول "النساء" وجامعة ليفربول.
ملاحظة: تم الحصول على جميع خزعات الموصوفة في هذا البروتوكول من النساء تمر بالعمل قبل تسليم CS الاختيارية في مستشفى ليفربول "النساء"، وكل امرأة أعطت كتب الموافقة المستنيرة للمشاركة.
1-الحلول
- إعداد تعديل حل المحلول الملحي الفسيولوجي كريبس (PSS) على النحو التالي: 154 كلوريد الصوديوم، 5.6 ملم بوكل، 1.2 مم MgSO4، الجلوكوز 7.8 مم، 10.9 ملم حبيس، و 2.0 ملم كاكل2.
ملاحظة: وحدة التخزين التي تتحدد وفقا لعدد الحمامات الأنسجة في العملية، أن معدل التدفق للنظام (1 مل/دقيقة)، ويقدر طول التجربة بما في ذلك الوقت الموازنة وتبييض. - ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 استخدام 4 M هيدروكسيد الصوديوم.
2-الأنسجة حمام إعداد
- يسخن الأنسجة حمام نظام الخزان إلى ~ 45 درجة مئوية باستخدام حمام مائي مغلق في 55-60 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم تسخين خزان المياه في قاعدة الجهاز إلى ~ 45 درجة مئوية، وبعد السماح لتبادل الحرارة مع PSS في أنابيب تحوي يمر، يضمن PSS في حمام الأنسجة في 37 درجة مئوية. قد يلزم إدخال بعض التعديلات لضبط درجات الحرارة لضمان درجة حرارة PSS في حمام الأنسجة تصل إلى 37 درجة مئوية. هذا وسوف تختلف اعتماداً على جهاز المستخدم وتعيين معدلات التدفق. - التبديل يدوياً على أي معدات أخرى ضرورية بما في ذلك مكبر للصوت، والحصول على البيانات ونظام التسجيل، ومضخات الشفط.
- ضع كل أنبوبة تغذية تمعجية (أنبوب واحد كل حمام) حول بكرات الرأس مضخة تمعجية. تأمين مع توقف الاحتفاظ وتشديد الضغط الحدب وتأمين مفاتيح حول الأنابيب. وضع نهايات أنابيب تغذية تحوي مجاناً في حاوية 1 لتر من PSS وبدء تشغيل المضخة للسماح PSS نتخلل باستمرار في الحمامات الأنسجة.
- ضمان مضخات الشفط تعمل بشكل صحيح، وأن مستوى الحل في الحمام ثابت أن معدل التدفق في الحمام يساوي معدل الإزالة. يمكن ضبط مستوى PSS في حمام الأنسجة عن طريق التلاعب في عمق أنبوب الشفط في الحمام باستخدام الطين للتماثيل.
- معايرة محولات القوة بوضع وزن معروفة (ما يعادل 1 ميللي نيوتن (mN، وحدة القوة)) على ربط محول طاقة وتسجيل انحراف الكشف عنها بواسطة برامج اكتساب.
ملاحظة: يمكن تعديل القيم في البرنامج أن القيم المسجلة يتم تحويلها تلقائياً إلى مينيسوتا يلغي الحاجة إلى إجراء أي تحويلات أخرى أثناء التحليل. يجب أن تتم معايرة محولات القوة قبل تركيب الأنسجة.
3-إعداد الأنسجة والتشريح من شرائط
- جمع خزعات myometrium البشرية الحوامل (1 – 2 سم3) في خدمات العملاء بعد ولادة الطفل والمشيمة. الحصول على خزعات سمك كامل (بشكل نموذجي) موجودة فيه كل من بيريميتريوم (serosa الخارجي طبقة من الرحم) وأوروبية (الطبقة الأعمق من الرحم). استخدام أنسجة ميوميتريال فقط (طبقة العضلات الوسطى). انظر الشكل 1 ألف-باء.
- إزالة أوروبية (أساسي) وأي الأغشية الجنينية ملتصقة (إذا كان موجوداً) كما هي معروفة هذه الأنسجة لإنتاج المواد التي يمكن أن تغير من كونتراكتيليتي ميوميتريال.
ملاحظة: في الجراحة، وعينات يتم وضعها في هانكس متوازن الملح الحل (حبس) أو PSS الطازجة والمخزنة في 4 درجات مئوية. ومن الناحية المثالية ينبغي أن تستخدم الأنسجة ضمن ح 12-16 من الجراحة، لكن الدراسات أظهرت لا يضر ب contractility بعد 18 ساعة جمع مع التخزين في 4 درجات مئوية51. يجب أن يتم تنفيذ ضوابط مناسبة لتأكيد صلاحية الأنسجة ووظيفة بعد التخزين المطول في 4 درجات مئوية. وتؤخذ عينات هنا من الحافة العلوية من الموقع شق الرحم الجزء السفلي وليس من الجزء العلوي. وتبين أن العقود وبالمثل48الجزء السفلي والعلوي من الرحم، ومن ثم خزعات الجزء السفلي تعتبر أن انعكاس جيد للنشاط ميوميتريال الجزء العلوي.
- إزالة أوروبية (أساسي) وأي الأغشية الجنينية ملتصقة (إذا كان موجوداً) كما هي معروفة هذه الأنسجة لإنتاج المواد التي يمكن أن تغير من كونتراكتيليتي ميوميتريال.
- تعد منطقة التشريح والأدوات المطلوبة بما في ذلك: مقص تشريح الكبيرة والصغيرة Vannas مقص تشريح وملقط تشريح اثنين، دبابيس تشريح ومقاطع الأنسجة الألومنيوم، وحولها مجهر تشريح مع كل ثابت والتكبير التكبير.
- المكان (انظر الجدول للمواد) يملأ عينة خزعة في طبق تشريح واضحة تستند إلى سيلاستيك مع PSS وعناية توجيه الخزعة حتى أن يتم تحديد حواف serosa وأوروبية الشكل 1B.
- استخدام دبابيس لتأمين خزعة لقاعدة للطبق. ضمان يبقى رطب مع PSS طوال عملية تشريح الأنسجة.
- يدوياً التبديل على مصدر الضوء مجهر وفحص الأنسجة تحت المجهر بتكبير x 10 لتحديد مناطق myometrium خالية من ندبا، سيروسا، وأوروبية، وأي الأغشية الجنينية ملتصقة إذا كان حاضرا.
- إجراء التشريح صراحة استخدام مقص تشريح كبيرة لفصل اثنين من طبقات النسيج المجاور، الكشف عن اثنين من الطائرات أو أوراق للعضلات.
ملاحظة: غالباً أسهل للعثور على جيب صغير بين طبقات الأنسجة ليبدأ الفصل ولكن يجب الحرص على تجنب السفن الصغيرة على حافة خزعة كما أنها يمكن أن يكون مخطئا ل 'جيوب'. - مكان تشريح دبابيس في كل زاوية من الأنسجة لضمان الحصول عليها. فحص الأوراق للعضلات التي تبحث عن مناطق العضلات مع ألياف تعمل على التوازي.
ملاحظة: يمكن أن يساعد تحديد المنطقة باتباع اتجاه الشعيرات الدموية الصغيرة بيرفوسينج عن طريق الأنسجة. سحب رقيقة عند الحافة الأنسجة يمكن أن يساعد تحديد الاتجاه الذي مسافراً الألياف. - قطع شرائط من النسيج ~ 2 مم x 8 واسعة طويلة مم x 1 مم سميكة على طول المحور الطولي تتماشى مع اتجاه ألياف العضلات باستخدام مقص تشريح الصغيرة.
ملاحظة: يجب الحرص على تعقد فقط الأنسجة على حافة قطع الأولية لتجنب الأضرار. - كرر عملية تشريح عدد الشرائط المطلوبة للتجربة.
- دبوس كل قطاع في كلا طرفي تصويب وتأمين للطبق، مع الحرص على عدم على امتداد الأنسجة.
- إرفاق مقاطع الأنسجة الألومنيوم في نهاية كل حيث يكون النسيج بينهما ~ 5 مم طويل وعناية قص بعيداً أي الأنسجة الزائدة (الشكل 1).
- نقل إلى طبق نظيفة مليئة PSS جاهزة للتركيب.
4-تركيب الأنسجة في الحمامات
- نقل الشرائط للحمامات الأنسجة التجريبية. جبل الشرائط أفقياً بدلاً من عمودياً (كما هو الحال في حمامات الجهاز التقليدية) (الشكل 2).
- إرفاق واحدة من نهاية كل قطاع بالقصاصة إلى محول القوة، الذي يقيس انكماش الأنسجة، والأخرى إلى ثابت هوك سواء داخل قاعة الأنسجة.
ملاحظة: هو قدرة حمام الأنسجة ~ 1 مل وكبيرة بما يكفي لضمان الشرائط مغمورة تماما في الحمام. - ضمان الشرائط في الأساس لكل ربط في الحمام.
- قم بفتح برنامج التسجيل بالنقر المزدوج على أيقونة البرنامج.
- ضبط التسجيل لكل قناة بحيث أنها في العرض في نافذة القناة.
- ضبط مقياس المحور ص قراءة ما بين 0-10 الخامس (ما يعادل mN 0-10 وظيفة المعايرة) طريق الحق النقر على المحور Y، وتحديد 'جدول'، وإدخال الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم 0 و 10، على التوالي. حدد 'موافق'. كرر هذه العملية لكل تسجيل القناة.
- اضغط 'سجل' في البرنامج إلى بدء التسجيل مباشرة.
ملاحظة: إذا لم يتم تأمينها شرائط لقاعدة لكل هوك، أنها يمكن أن تنزلق خلال الانكماش الذي سوف تظهر ك 'خدش' في التسجيل. سيتم تغيير تعيين التوتر وذلك قد تختلف تقلصات ما بعد انزلاق. - تمتد الأنسجة في كل حمام عن طريق تحويل يدوياً ميكرومانيبولاتورس المرفقة لكل محول. متابعة حركة الأنسجة إلى أعلى من خط الأساس على الشاشة ويواصل دورة في ميكرومانيبولاتورس حتى التوتر خط الأساس يبلغ 0.2 ز (mN ~ 2).
ملاحظة: سوف تبدأ الأنسجة فورا بالاسترخاء (لاحظ انخفاض التوتر الأساس)، عادة ما تصل إلى توتر مستمر بين 0.5 – 1 mN. تم تحسين هذا التوتر محددة لشرائح الأنسجة بهذا الحجم في ظروفنا التجريبية. إذا الأخرى الأنسجة الحجم لاستخدامها، فمن الضروري أن تتم التحقيقات علاقة التوتر الطول المناسب لتحسين القوة يستريح تطبيقها. - تسمح الأنسجة حجته ل ~ ح 2 حتى تنشأ تقلصات عفوية.
ملاحظة: عادة ما يحتفل ارتفاع صغير في الأساس التوتر وهو مؤشر جيد لسلامة الأنسجة وذلك أنه سوف يكون الهوس.
5-الطعن في الأنسجة مع البوتاسيوم 40 مم (ارتفاع ك+)
- في حالة حدوث لا تقلصات عفوية في أعقاب ح 2 من تصاعد، تحدي الشرائط مع حل ملح بوتاسيوم عالية فيها هو ارتفاع البوتاسيوم إلى 40 مم باستبدال كلوريد الصوديوم إيسوسموتيك بوكل. كعاليه+، أضف الأمر التالي (في مم): 119.6 كلوريد الصوديوم، 40 بوكل 1.2 MgSO4، الجلوكوز 7.8، حبيس 10.9 و 2.0 كاكل2.
ملاحظة: يؤدي التطبيق عالية ك+ في العضلات الملساء مثل myometrium، تقلص بشكل غير مباشر فتح قنوات الكالسيوم الجهد تشغيلها مما أدى إلى تدفق القصوى من Ca2 + في خلايا الأنسجة. ذلك يمكن استخدامها ك عالية+ كمقياس لاختبار الفهرس العام لسلامة الأنسجة، فضلا عن تحقيق قدر من استجابة الأنسجة القصوى.- وضع أنبوب التغذية للحمام الذي يحتوي على القطاع الطعن في زجاجة معمل زجاج تحتوي على ارتفاع ك+ لمدة 1-2 دقيقة.
- إعادة أنبوب التغذية إلى الحاوية PSS.
- حيث يتم تحقيق استجابة لارتفاع ك+ ، مواصلة رصد القطاع ح 1 مزيد. إذا لم يكن هناك الهوس استجابة لارتفاع ك+ أو نشر أي نشاط عفوية أثارت استجابة ك+ عالية أو تجاهل قطاع غزة.
ملاحظة: المجرب كما يجب أن يكون علم الفضاء الميت (الوقت المستغرق لحل للوصول إلى حمام الأنسجة) في أنابيب تغذية قبل تقييم الاستجابة لارتفاع ك+. وهذا قد يستغرق 2-3 دقيقة ويعتمد على معدل التدفق. - لضمان تبييض كاملة كعاليه+ من أنابيب الحمام والتغذية، التي يمكن أن تؤثر على مناورات اللاحقة، انتظر حتى تقلصات عفوية العودة إلى ما قبل عالية السعة ك+ قبل الشروع بالتجربة.
6-اختبار تأثيرات مركبات معروفة ورواية على انكماش ميوميتريال
ملاحظة: يمكن إجراء تجارب لاختبار تأثير أدوية جديدة والمواد الكاشفة على دالة ميوميتريال على عفوية (الشكل 3A) أو حفز مؤثر تقلصات (الشكل 3B-ج). لمؤثر تحفز تقلصات، بعد التمديد أو ارجينين فاسوبريسين (نائب الرئيس) إضافة إلى PSS لإعطاء تركيز 0.5 نانومتر ويتم استخدامه في جميع أنحاء هذه التجربة (الشكل 3B-ج). تم تحسين تركيز بعد التمديد لهذا الفحص حيث أنه يوفر تقلصات وطوريه في الطبيعة40،52. تركيزات يضع أكبر من هذا يمكن أن يؤدي إلى انكماش (منشط) طويلة الأمد ومستدامة (انظر المرجع41،44 للحصول على أمثلة) تحت التي من الصعب تقييم تأثير مختلف العوامل والإطار الزمني التجريبي يحتاج إلى تمدد إلى حد كبير لاستيعاب زيادة مدة الانقباضات الفردية والحد في التردد. في هذه التجربة مثال، إضافة إلى تحفيز الانقباضات حتى بعد التمديد أو نائب الرئيس أن العداء OTR المعروفة والخصوم1aR V وال atosiban و SR49059، أو بواسطة لدينا مجمع رواية [د-Arg8]-إينوتوسين (INT [د-Arg8])، ويمكن تقييم.
- إعداد تركيزات compound(s) الاختبار في PSS (مع أو بدون 0.5 نانومتر OT/نائب الرئيس) المخفف كحد أدنى لتمييع 1/1,000، يكفل طائفة واسعة من تركيزات يتم تضمين مثل تلك التي لا تحظى باستجابة للتركيزات التي تتجاوز في الأعلى استجابة.
- تعد مجموعة مكافئة لتخفيف التي تنطوي على كميات متساوية من المركبة (مثلاً، ثنائي ميثيل سلفوكسيد، الاسيتو الانيتريل، أو ماء مقطر).
ملاحظة: من الأسهل كثيرا ما تعد أعلى تركيز، أي10-6 M (من مخزون من 10-3 م) ثم قم بإجراء تخفيف المسلسل على طول مقياس لوغاريتمي (مثلاً، 10-6–10-10 M). وحدة التخزين ليتم إعدادها يعتمد على وقت تقديم الطلب، معدل التدفق للجهاز، وعدد من الشرائط التي سينظر فيها، مثلاً، لتطبيق 25 دقيقة من كاشف ومعدل تدفق من 1 مل/دقيقة، والحد أدنى 25 مل من كل تركيز كل حمام الأنسجة اشتراطات اد. - تطبيق تركيز أول مجمع للأنسجة عن طريق وضع الأنابيب المغذية لحمام الأنسجة في زجاجة معمل زجاج الذي يحتوي على الكاشف في التركيز المطلوب.
ملاحظة: ينبغي أن يتم هذا حالما يتحقق أساس ثابت تقلصات عفوية أو OT/نائب الرئيس-حفز. - تطبيق الحل مراقبة المركبات المقابلة بنفس الطريقة لحمام ثانية.
- تسجيل وقت تقديم الطلب (أي، عندما تم تغيير أنابيب التغذية).
- كرر العملية لكل تركيز بالتتابع وضع أنابيب التغذية إلى مختبر زجاجة تحتوي على تركيز القادمة في هذه السلسلة، وكرر حتى طبقت جميع التركيزات.
تطبيق كل تركيز يمكن أن يكون بين 15 و 30 دقيقة، لكن ينبغي أن تكون متسقة لتركيز كل تطبيق وبين التجارب. تلك التي تنطوي على بعد التمديد أو تقلصات نائب الرئيس-وحفز تميل إلى تتطلب فترات التطبيق (مثلاً، 25 دقيقة) لحساب خفض وتيرة انكماش لاحظ تحت التحفيز. ينبغي إجراء تجارب أولية لتحديد وقت التطبيق الأمثل مسبقاً مع أي كاشف الجديدة التي يجري اختبارها. - العودة أنبوب التغذية إلى PSS (مع أو بدون OT/VP) لتبييض.
- انقر فوق 'إيقاف' لإنهاء التسجيل مباشرة. فورا حفظ البيانات إلى مجلد مناسبة وتصدير نسخة كملف '.mat'.
7-بيانات التحليل
ملاحظة: التقاط البيانات والتحليل يمكن أن يؤديها أي عدد من مجموعات البرمجيات اقتناء البيانات المتاحة تجارياً. انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل من البرمجيات المستخدمة في هذا البروتوكول. للحصول على تقييم دقيق لنشاط الهوس، تشمل المعلمات تقلصات قياس: ط) سعة انكماش، وثانيا) التردد من الانكماش، ثالثا) المدة من الانكماش، ورابعاً) يعني قوة متكاملة (الشكل 4). يعني القوة لا يتجزأ هو المكافئ للمنطقة تحت المنحنى الانكماش وبالتالي مؤشر إجمالي العمل الذي قام به قطاع النسيج في وقت معين. يمكن تحليل بعض أو كافة المعلمات. كحد أدنى، من المستحسن أن القوة لا يتجزأ يعني والسعة من انكماش هي تحليل53. في هذه التجارب الموضحة هنا قمنا بقياس التغيرات في السعة من الانكماش والمنطقة تحت المنحنى.
- استيراد ملف the.mat في تحليل البرمجيات.
- ضبط العمود المقابل للمحور X تعكس الوقت التجريبي، مع مراعاة تواتر الفاصل الزمني أخذ العينات. وتسجل التجارب عادة في 10 هرتز الموافق 10 عينات/s أو 600 العينات الدقيقة.
- رسم البيانات باستخدام الرسم البياني تنسيق س-ص "مؤامرة | دالة مضمنة ".
- صفر خط الأساس لتقلص استخدام الدالة 'ترجمة عمودي' على البرنامج.
- حدد فترة مراقبة مناسبة.
ملاحظة: هذه هي الفترة الزمنية التي تسبق مباشرة تطبيق التركيز الأولى للحاكمين ولكن تساوي مدة تطبيق كاشف (الشكل 4 أ). على سبيل المثال، إذا كان تطبيق المخدرات X لمدة 25 دقيقة، استخدم 25 دقيقة تسبق التطبيق الأول للمخدرات X كعنصر التحكم. - قراءة خارج المحور Y وتسجيل السعة (القوة) من الانكماش في ذروة كحد أقصى لكل الانكماش التي تحدث في الإطار الزمني المحدد وحساب قيمة متوسط.
- قياس مدة الانكماش في 50% من هذه الذروة القصوى بالقراءة خارج المحور X في بداية ونهاية كل تقلص وتسجيل قيمة يعني.
- حساب عدد الانقباضات التي تحدث في الإطار الزمني لتوليد قيمة للتردد.
- استخدم الدالة 'التكامل' لحساب أوك (في وحدات التعسفي، a.u.) للفترة الزمنية المحددة.
ملاحظة: لتسجيل أوك بدقة، من الضروري أن يتم تعيين خط الأساس تقلصات في صفر على المحور ص. - التسلسل الانتقال عن طريق كل من التركيزات وسجل معلمات مختلفة من الانكماش.
- تعيين عنصر تحكم البيانات بنسبة 100% والتعبير عن القيم التي يتم الحصول عليها بكل تركيز الكاشف كنسبة مئوية من هذا التحكم أي، يجب أن تكون القيم لتحفيز > 100% في حين ينبغي أن يكون الاسترخاء < 100%.
ملاحظة: تطبيع البيانات بهذه الطريقة ينبغي أن تسمح للمستخدم لمقارنة النتائج عبر الشرائط والعلاجات الدوائية. - كرر لكل تجربة، ونقل البيانات إلى مجموعة رسومية.
Representative Results
باستخدام هذا النموذج، يمكن دراسة الاستجابة لمختلف يضع والخصوم انكماش وكذلك وكلاء رواية دالة معروفة أو غير معروفة وتقديرها كمياً. يمكن حساب معلمات الدوائية القياسية مثل المفوضية الأوروبية50 و50 IC القيم عند الكواشف تستخدم في طائفة واسعة من التركيزات، مثلاً، 10-5–10-9 م وأضيف في زيادة تركيزات على طول مقياس لوغاريتمي.
تجارب الاستجابة لتركيز خصم مستقبلات الاوكسيتوسين
قطع كما هو موضح أعلاه في هذه التجربة، مقترن بشرائط ميوميتريوم البشرية وهو مبين في الشكل 1، التي شنت في الحمامات النسيج كما هو مبين في الشكل 2، ويسمح لحجته لإنتاج تقلصات مستقرة لتساوي السعة و التردد. شرائط ثم تعرض لمؤثر OTR الذاتية، بعد التمديد (0.5 nM) لتحفيز الانقباضات. بعد فترة من النشاط مستقرة تحت OT (عادة 45 دقيقة)، طبق الاتوسيبان على قطاع واحد في زيادة تركيزات على طول مقياس لوغاريتمي (10-9–10-6 م). وتركت قطاع غزة الثانية في الأراضي المحتلة وحدها عنصر تحكم وقت. مثال الاستجابة لل atosiban يتبين في الشكل 5A. ومع انكماش السابقة مباشرة لتركيز atosiban الأولى كعنصر تحكم (100%)، السعة واوك لتركيز كل تطبيق حسبت كما هو مبين في الشكل 4. لعنصر تحكم وقت إجراء التجارب، وتم قياس الوقت-أي ما يعادل مناورات تجريبية. ثم تم رسم البيانات وتركيبها المنحنيات باستخدام دالة الانحدار غير الخطي في مجموعة من برامج رسومية (الشكل 5B-ج). فيما يتعلق بحساب تأثير المثبطة، حسب قوتها النسبية لل atosiban بقياس IC50 وهو تركيز تسبب نصف القصوى (50 ٪) المثبطة الاستجابة. يمكن أن يتم نفسه ليضع أو المنبهات من الانكماش. في هذه الحالة يتم حساب فاعلية المجمع من المفوضية الأوروبية50 (تركيز تسبب نصف استجابة تنشيطية القصوى).
التحقيق الاستجابة لمركبات جديدة واختبار تلك الانتقائية مستقبلات
استخدمنا هذا النموذج ذات الصلة فسيولوجيا من السابقين فيفو انكماش ميوميتريال البشرية إلى دراسة آثار معادية لمركب المركب حديثا، [د-Arg8]-إينوتوسين (INT [د-Arg8]) في تقلصات وحفز مع أما الخامس الأصلي1a آر مؤثر، نائب الرئيس، أو مؤثر OTR الأصلية، بعد التمديد. قمنا باستخدام هذا الفحص للتحقق من صحة انتقائية مستقبلات INT [د-Arg8]، التي تم تحديدها سابقا بالأساليب الدوائية يستند إلى الخلية لتكون خصم في الخامس1aR ولكن ليس على OTR54.
في هذه التجربة، تعرضت شرائط ميوميتريال البشرية إلى 0.5 نانومتر VP أو 0.5 نانومتر OT لحوالي 1 ح لتحفيز تقلصات كما هو موضح في الشكل 3، قبل إضافة INT [د-Arg8] لدينا رواية المركب في زيادة تركيزات (الشكل 6 ألف و الشكل ج 6). وهذا كان ثم مقارنة المتاحة تجارياً، والمعروفة الخامس1aR الخصم، SR49059 (الشكل 6B). ويوضح الشكل 6A نقصان تركيز تعتمد في انكماش ميوميتريال البشرية التي حفزت نائب الرئيس مع التركيزات المتزايدة لعدد صحيح [د-Arg8] ويرد في 6Aii الشكلالثالثبيانات سعة انكماش واوك لكل تركيز. التأثير مشابه للذي سيظهر للتركيزات المتزايدة لمعروفه الخامس1aR المانع، SR49059، هو مبين في الشكل 6Biالثالث. انتقائية INT [د-Arg8] نحو الخامس1aR إنما لا نحو OTR يتضح من حقيقة أن INT [د-Arg8] لا لا انكماش ميوميتريال البشرية النقصان التي حفزت مع أوراسكوم تليكوم (الشكل 6) كالسعة واوك ظل مستقرا (6Cii الشكلالثالث).
رقم 1: ميوميتريال البشرية خزعة التشريح. (أ) بالرسم التخطيطي الرحم البشرية تظهر طبقات الأنسجة الثلاث التي تتألف منها جدار الرحم. الطبقة الأعمق هو بطانة الرحم (أوروبية في الحمل، أحمر سهم) وطبقة وسطى هو myometrium (سهم إلى طبقة العضلات، والأسود) الذي يولد تقلصات والطبقة الأبعد هو بيريميتريوم (أو الغشاء سيرسال، السهم الأزرق) الذي يشكل طبقة واقية حول الرحم. يتم تصوير منطقة الفائدة لأخذ عينات خزعة بالمستطيل الأسود. يرد خزعة مثال من المرأة حامل أثناء القيصرية في (ب) مع أوروبية وميوميتريال الطبقات المميزة (serosa غير مرئي). فمن الضروري أن يتم تحديد طبقات الأنسجة المختلفة حيث أن يجرد من myometrium يتم تشريح بشكل صحيح للتجريب. ويرد قطاع مثال من ميوميتريوم التي تم تشريح وقص في (ج). بشكل عام، شرائط 2 – 6 قطع وقص كما هو موضح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الجهاز متعدد حمام مجموعة تجريبية تستخدم لقياس تقلصات myometrium البشرية. وتوضع شرائط (A) من myometrium إلى الجهاز الصغيرة (1 مل) حمام الدوائر وضعت على رأس خزان مياه دافئة (ط) وهي سوبيرفوسيد بحل المحلول الملحي الفسيولوجي (PSS) عن طريق مضخة تمعجية (ثانيا). الخزان هو الحفاظ على درجة حرارة محددة عن طريق حمام مائي المتداولة (ثالثا). يتم إرفاق كل قطاع إلى قوة محول (الرابع)، الذي يسجل التغييرات في التوتر خلال الانكماش. هذا هو تضخيمه بمكبر للصوت ترانسبريدجي (v) وتحويلها إلى إشارة رقمية (سادسا)، التي يتم تسجيلها على نظام كمبيوتر (السابع) تشغيل برنامج اقتناء المرتبطة بها. (ب) صورة الموسع دائرة حمام الجهاز مع قطاع من myometrium البشرية في الموقع (السهم الأحمر)، حمم في PSS مع نهاية واحدة تعلق على محول قوة وأخرى لربط ثابتة. (C) نظرة عامة التخطيطي لتعيين لأعلى. يتم باستمرار perfused الدوائر الأنسجة مليئة PSS مع حرارة PSS عند 37 درجة مئوية وعن طريق تبادل الحرارة مع خزان مياه ساخنة تحت الحمامات (أبقى في 45 درجة مئوية) ومضخة مياه المتداولة في 55 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تقلصات عفوية وحفز مؤثر من myometrium البشرية في المختبر. في ظروف خالية من مؤثر، تقلصات عفوية تبقى مستقرة لأكثر من 3 ح لتسجيل دون خسارة كبيرة السعة أو منطقة-تحت--المنحنى (AUC) (أخي، أييي)، مما يدل على متانة من هذا الطراز للتحقيق تطبيق عوامل مختلفة على الانكماش عفوية. بعد إنشاء تقلصات مستقرة والعفوية، تمت إضافة 0.5 نانومتر الاوكسيتوسين (ب، ت) أو فاسوبريسين (ج، نائب الرئيس) بحل المحلول الملحي الفسيولوجي (PSS). تقلصات تحت التحفيز أيضا تظل مستقرة لعدة ساعات دون خسارة كبيرة السعة الانكماش (Bii، الاتحاد) أو أوك (بيي، سيي) تمكين تأثير مختلف العوامل الهوس أن التحقيق في حضور يضع ميوميتريال. وترد البيانات الخطأ القياسي ± يعني كما يعني (SEM). ملاحظة، لحفز مؤثر تقلصات (ب، ج)، يتم أخذ فترة الرقابة (100%) بعد 45 دقيقة الأولى من تطبيق مؤثر، تستقر تقلصات. وفي جميع الحالات، كانت شرائط سوبيرفوسيد مع PSS في 37 درجة مئوية، ودرجة الحموضة 7.4 (ريبرودوسيد من اروسميث et al. 40 بإذن من العلوم الإنجابية و Di Giglio et al. 54 بإذن من التقارير العلمية تحت رخصة الإبداعي المشتركة مفتوحة للجميع). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تحليل البيانات- (A) فترة مراقبة مناسبة يظهر باللون الأحمر مصممة عن طريق تحديد تقلصات السابقة مباشرة لتطبيق المجمع الاختبار (X المخدرات). فترة المراقبة هذه أيضا متساوية في الوقت المناسب للتطبيق ل X المخدرات (مثلاً، 40 دقيقة في هذا المثال). وبمجرد قياس القيم ليتم تعيين فترة الرقابة بنسبة 100%. ثم يعبر عن جميع القياسات اللاحقة كنسبة مئوية من عنصر التحكم. (ب) هناك 4 معلمات مختلفة من الانكماش الذي يمكن قياسه: (ط) سعة انكماش الذي يقيس انكماش القوة (القوة، مينيسوتا)، (ثانيا) تردد انكماش الذي يقيس معدل انكماش، (ثالثا) مدة الانكماش الذي يقاس في نصف الذروة القصوى من الانكماش، ومنطقة (رابعا) تحت المنحنى (يعرف أيضا باسم التعسفي لا يتجزأ، ووحدات القوة) الذي يعطي قدرا من العمل العام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تسجيل أثر atosiban معادية على تقلصات المستحثة الاوكسيتوسين في ميوميتريوم البشرية- متى أنشئت تقلصات عفوية، قد حفزت تقلصات مع مؤثر مستقبلات الاوكسيتوسين، الاوكسيتوسين (OT). تقلصات سمح بتحقيق الاستقرار في ظل التحفيز لزيادة 45 دقيقة (A) "الخامس في"1a وخصم مستقبلات بعد التمديد، ثم طبق ال atosiban في زيادة تركيزات على طول مقياس لوغاريتمي (10-9-10-5م). قياس الانكماش خلال الفترة التي تسبق أول تركيز atosiban واتخاذها كعنصر تحكم (100%). قياس النشاط تحت كل تركيز اللاحقة ومعبرا عنه بنسبة مئوية من عنصر التحكم. تم إجراء نفس لشرائح تتعرض للأراضي المحتلة وحدها استخدام الوقت-أي ما يعادل مناورات تجريبية. وقد رسم البيانات في البرامج الرسومية: (ب، ج) إظهار المنحنيات تركيز-استجابة لتأثير معادية لل atosiban (أزرق) والاقتضاء تمييع مركبة (رمادي، الوقت التحكم) على السعة انكماش ميوميتريال المستحثة بالتمديد و المنطقة تحت المنحنى (AUC)، على التوالي. وتعرض البيانات يعني ± الخطأ المعياري للنسبة المئوية يعني (SEM) من السعة واوك لمراقبة أنشطة (قبل تطبيق atosiban). ثم حسبت IC50 القيم التي تعطي تركيز الذي يتم الاستجابة (50 ٪) المثبطة القصوى نصف السعة للانكماش وقوة متكاملة (AUC) المحققة (ريبرودوسيد من اروسميث et al. 40 بإذن من العلوم الإنجابية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: اختبار الانتقائية تأثير ومستقبلات لرواية مجمع على انكماش ميوميتريال البشرية. بعد أن أنشئت تقلصات عفوية من myometrium البشرية، كانت تحفز تقلصات مع مؤثر مستقبلات فاسوبريسين، فاسوبريسين (نائب الرئيس) (منظمة العفو الدولية، وثنائية) أو مؤثر مستقبلات الاوكسيتوسين، الاوكسيتوسين (OT) (Ci). الأثر [د-Arg8]-إينوتوسين (INT [د-Arg8]) وتم تقييم خصم1aR V المتاحة تجارياً، SR49059 في تقلصات تحفزها نائب الرئيس عن طريق تطبيق التركيزات المتزايدة من المركبات. تظهر الاستجابات النمطية في (منظمة العفو الدولية، ثنائية). المقترنة بتحليل البيانات على السعة والمساحة تحت المنحنى (AUC) ترد في (ثانيا) و (ثالثا)، على التوالي حيث الأثر قد أبديت كنسبة مئوية من مراقبة النشاط (100%). INT [د-Arg8] وخصم1aR V المعروفة، SR49059 بسبب انخفاض جرعة تعتمد السعة واوك، دعم دور الباحث [د-Arg8] كخصم مستقبلات1aR V في ميوميتريوم البشرية. في المقابل، INT [د-Arg8] لا تؤثر على تقلصات تحفزها OT (Ci-الثالث)، ومن ثم كذلك إلى النتائج التي توصلنا إليها من الخلية على أساس فحوصات، INT [د-Arg8] أيضا يظهر انتقائية تجاه الخامس1aR في البشرية myometrium (البيانات الواردة من دي Giglio et al. 54 بإذن من التقارير العلمية تحت رخصة الإبداعي المشتركة مفتوحة للجميع). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
بينما معظم المخدرات التنمية يهدف لمعالجة الاضطرابات البشرية، يتم إجراء البحوث الأساسية أساسا في الأنسجة الحيوانية. وهنا، يمكننا وصف أساليب التحقيق السابقين فيفو تقلصات ميوميتريوم البشرية التي تم الحصول عليها من الجراحة التي يمكن استخدامها لمعالجة عدد من المسائل الهامة المتصلة بالرحم علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض، فضلا عن التحقق من صحة الردود الفنية إلى وكلاء الدوائية المعروفة، ورواية للمساعدة في تطوير العقاقير. على وجه الخصوص، نسلط الضوء على استخدام هذا الفحص للتحقيق استجابة معادية المعروفة OTR والخامس1aR تنافسية خصم، الاتوسيبان على انكماش ميوميتريال الحوامل المستحثة بالتمديد، كذلك فيما يتعلق بتحديد استجابة ومستقبلات انتقائية المطورة حديثا انتقائية الخامس1aR خصم، INT. [د-Arg8] ونحن تثبت أنه يمكن أن يحسب معلمات الحرائك الدوائية الهامة مثل المفوضية الأوروبية50 و IC50 ، التي تتلاءم جيدا مع البيانات المستندة إلى الخلية الصيدلة.
استخدام شرائح متعددة في وقت واحد يسمح للمقارنة المباشرة لآثار وكيل متعددة، وتجارب المنافسة مع الخصوم، وضوابط ملائمة الوقت والمركبات. غالباً ما يتم إعداد شرائط في مجموعات من 2 أو 4 أو 8، هذا الأسلوب يوفر إنتاجية معتدلة، تمكين اختبار المركبات 2 – 4 تركيزات (تراكمية) 6-8 (لكل عينة). هذا الأسلوب أيضا توفر البيانات في الوقت الحقيقي بحيث يمكن تقييم الآثار بسرعة ويمكن تعديل البروتوكولات. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يمكن استخدامها لاختبار أي مجمع الفائدة وقد استخدمت بنجاح عدد من المجموعات البحثية التي تركز على ميوميتريال علم وظائف الأعضاء، وفي اكتشاف الأدوية. إلى جانب تحليل مركبات نقية كما هو موضح في هذه الورقة، وقد تم أيضا نموذج contractility الرحم ويمكن أن تستخدم بنجاح الشاشة للمركبات المقوية رواية من الخلائط، مثل المستحضرات العشبية من الطب التقليدي7 , 55 , 56.
على الرغم من أن هذا النموذج هو قوي من الناحية الفنية، ويبين إمكانية تكرار نتائج جيدة، فإن لديها بعض القيود: تشريح يمكن أن يكون صعباً لأولئك غير مألوف مع الأنسجة أو استخدام معدات التشريح، ومن ثم المستخدمين الجدد سوف يتطلب بعض الوقت لتحسين الأنسجة إعداد والبروتوكولات. كما تجدر الإشارة إلى أن ميوميتريوم البشرية تختلف اختلافاً كبيرا في المظهر لنماذج أخرى مثل الجرذ والفأر. معظم القوارض التي تتألف من قرنان مثل أنبوب الرحم، كل كاملة مع مبيض في نهاية واحدة، وانضم في عنق الرحم. كل القرن حددت بوضوح طبقات العضلات الطولية والدائرية، والتي يمكن بسهولة فصل في تشريح حين تتشابك أنواع مختلفة من الألياف في ميوميتريوم البشرية غالباً ما تشكل 'شبكة'. وباﻹضافة إلى ذلك، ملامح انكماش myometrium البشرية مختلفة جداً للقوارض. وأبرزها تقلصات في ميوميتريوم البشرية أقل تواترا ولكن أطول في المدة. التجريبية أطر زمنية للعمل مع ميوميتريوم البشرية غالباً ولذلك الكثير أطول من نماذج القوارض. الاختلافات في التعبير مستقبلات بين الأنواع يمكن أن يسهم أيضا في فروق كبيرة جداً في الاستجابات ليضع، وهذا ينبغي أن يوضع في الاعتبار إذا كان استقراء النتائج عبر الأنواع.
وهناك أيضا عدد من الخطوات التي تحتاج إلى النظر فيها تحقيق أقصى قدر من المخرجات من هذا النظام. وتشمل الخطوات الحاسمة المحافظة على بقاء الأنسجة مثل العناية عند التعامل مع الأنسجة لتجنب أية أضرار لا داعي لها خلال التشريح أو عند تركيب. مطلوب عين ماهرة بتشريح شرائط غرامة لعضلة الرحم، ضمان اتجاه ألياف العضلات في الاتجاه الطولي وعقب طائرة الأنسجة، فضلا عن تجنب ندبة الأنسجة، وأوروبية، والسفن الصغيرة. للمساعدة في أغراض التوجيه مرة واحدة العينة في المختبر، من الممكن إضافة علامة (مثل الإبرة الجراحية الصغيرة) في وقت جمع إلى جانب واحد من خزعة لتحديد حافة سيرسال من الحافة ديسيدوال.
يجب أن يبقى الأنسجة على ج 36-37 درجة مئوية ثابتة خلال التجريب كوظيفة الأنسجة يخضع لتقلبات درجة الحرارة. هذا يمكن أن يتحقق مع وحدة لتكييف الهواء قوي داخل المختبر. نضح المستمر من PSS المعالجون يضمن الحفاظ على درجة الحرارة فضلا عن التنظيف من منتجات النفايات من الانكماش. ويمكن تغيير درجة الحرارة داخل الحمامات الجهاز بتغيير معدل التدفق أو ضبط درجة حرارة حمام الماء مباشرة. يضمن حمام صغير الحجم مقارنة بالحمامات التقليدية 5-50 مل من دوران سريع نسبيا من PSS وتبييض من الكواشف. حمام المنمنمة الجهاز كما هو موضح هنا، كما يقلل من حجم PSS والكواشف ذات الأهمية اللازمة، وبالتالي التقليل إلى أدنى حد من التكاليف وتجنيب الثمينة، وضعت حديثا المواد الكيميائية. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لحجم حمام الصغيرة واستخدام المخزن مؤقت على أساس حبيس، هذا النظام لا تتطلب الأوكسجين مثلاً، بالسطح الوقائي مع كاربوجين. توحيد التوتر المطبق على الشرائط مهم أيضا. ليجرد من هذا الحجم (5 مم × 2 مم × 1 مم)، هذا ينبغي أن يكون حوالي 2 مينيسوتا (ما يعادل ~0.2 ز). وتشمل أساليب بديلة تطبيق حل البوتاسيوم عالية للحث على انكماش القصوى وتمتد إلى نصف هذا الانكماش كحد أقصى. فإنه يجب أن يلاحظ، أن التوتر المطبق في فيفو قد تختلف.
التحديات الرئيسية تشمل الحصول على أنسجة من البشر، ولكن على الرغم من أن فرض ضرائب على، الأنسجة البشرية تمثل وضوح أكثر فسيولوجيا ذات الصلة (ومجزية) نموذج لدراسة تقلص الرحم في اكتشاف المخدرات والأمراض البشرية. وسوف تعدل الأنسجة المعزولة شرائط ومع ذلك، لا يعني بالضرورة للأنسجة في فيفو كما أنهم معفون، على سبيل المثال، من الهرموني والعصبي الإدخال، رغم أن ذلك ليس ضروريا للانكماش، تقلصات في فيفو. لكن هذا الفحص يوفر الفرصة لتحليل انكماش ميوميتريال بطريقة يمكن التحكم بها، فصل من هذه التأثيرات. كما أنه يسمح لتأثير عوامل مثل التحكم الهرموني للانكماش (مثلاً، عن طريق التمديد، نائب الرئيس، البروستاغلاندينات، إلخ) يتعين التحقيق فيها، تقديم أدلة على تنظيم وظيفة ميوميتريال. كما يتم الحصول على أنسجة من النساء مختلفة، وبطبيعة الحال هناك بعض الاختلاف في الملامح الهوس عفوية بين العينات. ومن ثم من الضروري غالباً لإجراء تجارب على عدد كبير (~ n = 10) عينات للتقليل من التباين في بعض مجموعات البيانات53. وهذا أهم عند مقارنة النشاط القلوصي بين مختلف مجموعات المرضى. تطبيع استجابة يضع والخصوم للتحكم في النشاط (أي، معربا عن كنسبة مئوية من مراقبة النشاط أو عالية ك+) يقلل من بعض من هذا الاختلاف. وبالإضافة إلى ذلك، لتقليل التباين بين قطاع، يمكن تطبيع البيانات الشريط عبر مساحة مقطعية عن طريق قياس الطول والوزن بعد التجريب41. وهذا مفيد بشكل خاص عند مقارنة أنماط الانكماش بين مختلف مجموعات المرضى.
وتشمل القيود لهذا الأسلوب أيضا الوصول إلى أنسجة جديدة مما يتطلب علاقات عمل جيدة مع موظفي المستشفى، لا سيما مسرح الموظفين والمتورطين في عملية الموافقة. كما تحتاج إلى أن تكون في مكان الأذونات الأخلاقية من المجلس المحلي لاستعراض لجنة أخلاقيات البحوث ومعهد أو مستشفى. مجموعة من ميوميتريوم البشرية الأكثر احتمالاً تنفيذها أثناء تقديم خدمات العملاء، عند الجهة المانحة خضوعه لعملية جراحية. يتم أخذ الخزعة من نفس الموقع شق الرحم لتسليم الطفل و ولذلك لا يحتاج المريض الخضوع لأي إجراءات إضافية أخرى. حاجة موظفي المسرح والجراح إجراء الخزعة توعيتهم باستخدام اللاحقة من الأنسجة بأنها لم توضع في مثبت الحلول هذه أما بالنسبة لإرسال إلى قسم علم أمراض. الإطار الزمني الطويل التجريبية اعتبار آخر. تجارب على الأنسجة البشرية يستغرق عدة ساعات (عادة > ح 6) (بدلاً من 2-3 ح لتجربة مماثلة في الرحم الفئران أو الماوس)، نظراً لتواتر أبطأ من الانكماش والمدة ح 2 – 3 بين تصاعد الأنسجة وإنشاء من تلقاء أنفسهم تقلصات. ومع ذلك، كما أننا أظهرنا، تقلصات الأنسجة البشرية قوية، وعندما أنشأ يمكن التعاقد لساعات طويلة دون إرهاق كبير40.
يسمح هذا النظام أيضا التحديات الأخرى في فيفو العمل التي يجب التغلب عليها بما في ذلك القدرة على اختبار الكواشف الصيدلانية على أنسجة الحامل. ويمكن استقراء هذه التقنية بسهولة إلى الأنواع الأخرى بما في ذلك الماوس حيث يمكن تأكيد النتائج الأولية قبل الشروع في الدراسات الحيوانية كلياً. الخاضعة للرقابة في درجة الحرارة, تكوين سوبيرفوساتي (PSS)، ودرجة الحموضة يمكن إجراء تغييرات بسهولة لمحاكاة السيناريوهات المختلفة في فيفو وتحليل تأثير هذه التغييرات على سلوك مركب. يمكن أيضا توسيع المبادئ الأساسية لقياس التوتر متساوي القياس في شرائط ميوميتريال لقياس التغيرات المتزامنة في تركيز الكالسيوم داخل الخلية أو الأس الهيدروجيني باستخدام Ca الفلورسنت أو مؤشرات الأس الهيدروجيني (ح+) ومعدات للكشف عن و سجل fluorescence57،،من5859،60.
عموما، ميوميتريوم البشرية يمثل نموذجا قوية وذات الصلة فسيولوجيا تميز والتحقق من صحة رواية المركبات العلاجية في اكتشاف الأدوية – مركبات نقية والخلائط. لقد قدمت أمثلة لاستخدامه في اكتشاف المخدرات فيما يتعلق بنظام OT/نائب الرئيس وركزت على OTR و V1 الخصومالبحث والتطوير لإظهار كيف يمكن استخدام هذا النموذج لتحديد مجمع نجاعة وفاعلية على أهداف محددة والتحقق من صحة الانتقائية يجند. غير، فإنه ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة أي هدف من الفائدة أو مسار يؤدي إلى انكماش ميوميتريال (أو الاسترخاء)، فضلا عن المساعدة في اكتشاف الأدوية الجديدة أهدافا ومسارات، والنهوض بفهمنا ميوميتريال علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا البحث أيده صندوق العلوم النمساوية (FWF) من خلال مشروع I3243 ومجلس البحوث الأوروبي (المنسق) ضمن الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 برنامج البحوث والابتكار (منح اتفاق لا 714366). وقد دعمت CWG الزمالة مستقبل مجلس البحوث الأسترالية (ARC) (FT140100730)، وملم زمالة قوس اكتشاف مبكر الوظيفي باحث (ديكرا) (DE150100784). SA معتمد بالعافية هاريس "الخدج البحوث المركز منحة ولادة" يديرها "رفاهية المرأة"، المملكة المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
| Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
| GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
| LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
| Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
| BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
| Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
| Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
| Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
| Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
| Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
| Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
| Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
| Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
| Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
| Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
| Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
| Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
| Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
| Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
| Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
| Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
| HBSS | SIGMA | H9269 | |
| Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
| Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
| [Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398 (1), 227-238 (2010).
- Wray, S. Insights into the uterus. Exp Physiol. 92 (4), 621-631 (2007).
- Wray, S., Kupittayanant, S., Shmygol, A., Smith, R. D., Burdyga, T. The physiological basis of uterine contractility: a short review. Exp Physiol. 86 (2), 239-246 (2001).
- Matthew, A., Shmygol, A., Wray, S. Ca2+ entry, efflux and release in smooth muscle. Biol Res. 37 (4), 617-624 (2004).
- Wray, S., et al. Calcium signaling and uterine contractility. J Soc Gynecol Investig. 10 (5), 252-264 (2003).
- Gruber, C. W., O'Brien, M. Uterotonic plants and their bioactive constituents. Planta medica. 77 (3), 207-220 (2011).
- Maul, H., Maner, W. L., Olson, G., Saade, G. R., Garfield, R. E. Non-invasive transabdominal uterine electromyography correlates with the strength of intrauterine pressure and is predictive of labor and delivery. J Matern Fetal Neonatal Med. 15 (5), 297-301 (2004).
- Newman, R. B. Uterine contraction assessment. Obstet Gynecol Clin North Am. 32 (3), 341-367 (2005).
- Haran, G., Elbaz, M., Fejgin, M. D., Biron-Shental, T. A comparison of surface acquired uterine electromyography and intrauterine pressure catheter to assess uterine activity. Am J Obstet Gynecol. 206 (5), 412-e415 (2012).
- Condon, J., et al. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biol Reprod. 67 (2), 506-514 (2002).
- Soloff, M. S., et al. Immortalization and characterization of human myometrial cells from term-pregnant patients using a telomerase expression vector. Mol Hum Reprod. 10 (9), 685-695 (2004).
- Buxton, I. L., Vittori, J. C. Cholesterol depletion enhances both spontaneous and agonist-evoked uterine smooth muscle contractions in a reversible manner. Proc West Pharmacol Soc. 48, 126-128 (2005).
- Matthew, A., Kupittayanant, S., Burdyga, T., Wray, S. Characterization of contractile activity and intracellular Ca2+ signalling in mouse myometrium. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11 (4), 207-212 (2004).
- Heaton, R. C., Taggart, M. J., Wray, S. The effects of intracellular and extracellular alkalinization on contractions of the isolated rat uterus. Pflugers Arch. 422 (1), 24-30 (1992).
- Hutchings, G., Deprest, J., Nilius, B., Roskams, T., De Ridder, D. The effect of imatinib mesylate on the contractility of isolated rabbit myometrial strips. Gynecol Obstet Invest. 62 (2), 79-83 (2006).
- Wilson, R. J., Allen, M. J., Nandi, M., Giles, H., Thornton, S. Spontaneous contractions of myometrium from humans, non-human primate and rodents are sensitive to selective oxytocin receptor antagonism in vitro. BJOG. 108 (9), 960-966 (2001).
- Choudhury, S., Garg, S. K., Singh, T. U., Mishra, S. K. Functional and molecular characterization of maxi K+ -channels (BK(Ca)) in buffalo myometrium. Anim Reprod Sci. 126 (3-4), 173-178 (2011).
- Smith, R. C., McClure, M. C., Smith, M. A., Abel, P. W., Bradley, M. E. The role of voltage-gated potassium channels in the regulation of mouse uterine contractility. Reprod Biol Endocrinol. 5, 41 (2007).
- Jones, K., Shmygol, A., Kupittayanant, S., Wray, S. Electrophysiological characterization and functional importance of calcium-activated chloride channel in rat uterine myocytes. Pflugers Arch. 448 (1), 36-43 (2004).
- Popescu, L. M., et al. Imatinib inhibits spontaneous rhythmic contractions of human uterus and intestine. Eur J Pharmacol. 546 (1-3), 177-181 (2006).
- Taggart, M. J., Wray, S. Contribution of sarcoplasmic reticular calcium to smooth muscle contractile activation: gestational dependence in isolated rat uterus. J Physiol. 511 (Pt 1), 133-144 (1998).
- McCallum, L. A., Pierce, S. L., England, S. K., Greenwood, I. A., Tribe, R. M. The contribution of Kv7 channels to pregnant mouse and human myometrial contractility. J Cell Mol Med. 15 (3), 577-586 (2011).
- Bernstein, K., et al. Calcium-activated chloride channels anoctamin 1 and 2 promote murine uterine smooth muscle contractility. Am J Obstet Gynecol. , (2014).
- Khan, R. N., Morrison, J. J., Smith, S. K., Ashford, M. L. Activation of large-conductance potassium channels in pregnant human myometrium by pinacidil. Am J Obstet Gynecol. 178 (5), 1027-1034 (1998).
- Phillippe, M., Basa, A. Effects of sodium and calcium channel blockade on cytosolic calcium oscillations and phasic contractions of myometrial tissue. J Soc Gynecol Investig. 4 (2), 72-77 (1997).
- Ausina, P., et al. Effect of inhibition of the electrogenic Na+/K+ pump on the mechanical activity in the rat uterus. Fundam Clin Pharmacol. 10 (1), 38-46 (1996).
- Melin, P., Trojnar, J., Johansson, B., Vilhardt, H., Akerlund, M. Synthetic antagonists of the myometrial response to vasopressin and oxytocin. J Endocrinol. 111 (1), 125-131 (1986).
- Hahn, D. W., et al. Evaluation of 1-deamino-[D-Tyr(Oethyl)2, Thr4, Orn8] vasotocin, an oxytocin antagonist, in animal models of uterine contractility and preterm labor: a new tocolytic agent. Am J Obstet Gynecol. 157 (4 Pt 1), 977-982 (1987).
- Demarest, K. T., et al. Profile of an oxytocin antagonist, RWJ 22164 for treatment of preterm labor in laboratory models of uterine contractility. American journal of perinatology. 6 (2), 200-204 (1989).
- Goodwin, T. M., et al. The pharmacokinetics of the oxytocin antagonist atosiban in pregnant women with preterm uterine contractions. Am J Obstet Gynecol. 173 (3 Pt 1), 913-917 (1995).
- Goodwin, T. M., et al. The effect of the oxytocin antagonist atosiban on preterm uterine activity in the human. Am J Obstet Gynecol. 170 (2), 474-478 (1994).
- Goodwin, T. M., et al. Treatment of preterm labor with the oxytocin antagonist atosiban. American journal of perinatology. 13 (3), 143-146 (1996).
- Romero, R., et al. An oxytocin receptor antagonist (atosiban) in the treatment of preterm labor: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with tocolytic rescue. Am J Obstet Gynecol. 182 (5), 1173-1183 (2000).
- Norstrom, A., Andersson, A., Vilhardt, H. Contractile effect of oxytocin and 1-deamino-1-carba-2-tyrosine (0-methyl)-oxytocin in myometrial tissue from non-pregnant and term pregnant women. Acta Endocrinol (Copenh). 122 (5), 566-568 (1990).
- Atke, A., Vilhardt, H. Uterotonic activity and myometrial receptor affinity of 1-deamino-1-carba-2-tyrosine(O-methyl)-oxytocin. Acta Endocrinol (Copenh). 115 (1), 155-160 (1987).
- Hunter, D. J., Schulz, P., Wassenaar, W. Effect of carbetocin, a long-acting oxytocin analog on the postpartum uterus. Clin Pharmacol Ther. 52 (1), 60-67 (1992).
- Moraitis, A. A., Cordeaux, Y., Charnock-Jones, D. S., Smith, G. C. The Effect of an Oxytocin Receptor Antagonist (Retosiban, GSK221149A) on the Response of Human Myometrial Explants to Prolonged Mechanical Stretch. Endocrinology. 156 (10), 3511-3516 (2015).
- Al-Qahtani, S., et al. Diabetes is associated with impairment of uterine contractility and high Caesarean section rate. Diabetologia. 55 (2), 489-498 (2012).
- Arrowsmith, S., Neilson, J., Bricker, L., Wray, S. Differing In Vitro Potencies of Tocolytics and Progesterone in Myometrium From Singleton and Twin Pregnancies. Reprod Sci. 23 (1), 98-111 (2016).
- Arrowsmith, S., Quenby, S., Weeks, A., Burdyga, T., Wray, S. Poor spontaneous and oxytocin-stimulated contractility in human myometrium from postdates pregnancies. PloS one. 7 (5), e36787 (2012).
- Arrowsmith, S., Robinson, H., Noble, K., Wray, S. What do we know about what happens to myometrial function as women age? J Muscle Res Cell Motil. 33 (3-4), 209-217 (2012).
- Quenby, S., Matthew, A., Zhang, J., Dawood, F., Wray, S. In vitro myometrial contractility reflects indication for caesarean section. BJOG. 118 (12), 1499-1506 (2011).
- Turton, P., et al. A comparison of the contractile properties of myometrium from singleton and twin pregnancies. PloS one. 8 (5), e63800 (2013).
- Zhang, J., Bricker, L., Wray, S., Quenby, S. Poor uterine contractility in obese women. BJOG. 114 (3), 343-348 (2007).
- Higgins, C. A., et al. Maternal obesity and its relationship with spontaneous and oxytocin-induced contractility of human myometrium in vitro. Reprod Sci. 17 (2), 177-185 (2010).
- Crankshaw, D. J., O'Brien, Y. M., Crosby, D. A., Morrison, J. J. Maternal body mass index and spontaneous contractility of human myometrium in pregnancy. J Perinatol. 37 (5), 492-497 (2017).
- Luckas, M. J., Wray, S. A comparison of the contractile properties of human myometrium obtained from the upper and lower uterine segments. BJOG. 107 (10), 1309-1311 (2000).
- Chapman, N. R., Kennelly, M. M., Harper, K. A., Europe-Finner, G. N., Robson, S. C. Examining the spatio-temporal expression of mRNA encoding the membrane-bound progesterone receptor-alpha isoform in human cervix and myometrium during pregnancy and labour. Mol Hum Reprod. 12 (1), 19-24 (2006).
- Robson, S. C., Simpson, H., Ball, E., Lyall, F., Bulmer, J. N. Punch biopsy of the human placental bed. Am J Obstet Gynecol. 187 (5), 1349-1355 (2002).
- Popat, A., Crankshaw, D. J. Variable responses to prostaglandin E(2) in human non-pregnant myometrium. Eur J Pharmacol. 416 (1-2), 145-152 (2001).
- Arrowsmith, S., Neilson, J., Wray, S. The combination tocolytic effect of magnesium sulfate and an oxytocin receptor antagonist in myometrium from singleton and twin pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 789-e789 (2016).
- Crankshaw, D. J., Morrison, J. J. Methodology and pharmacological analysis of effects of uterotonic compounds in human myometrium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 205 (2), 155-e156 (2011).
- Di Giglio, M. G., et al. Development of a human vasopressin V1a-receptor antagonist from an evolutionary-related insect neuropeptide. Sci Rep. 7, 41002 (2017).
- Attah, A. F., et al. Ethnobotanical survey of Rinorea dentata (Violaceae) used in South-Western Nigerian ethnomedicine and detection of cyclotides. J Ethnopharmacol. 179, 83-91 (2016).
- Koehbach, J., et al. Oxytocic plant cyclotides as templates for peptide G protein-coupled receptor ligand design. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21183-21188 (2013).
- Taggart, M. J., Burdyga, T., Heaton, R., Wray, S. Stimulus-dependent modulation of smooth muscle intracellular calcium and force by altered intracellular pH. Pflugers Arch. 432 (5), 803-811 (1996).
- Luckas, M. J., Taggart, M. J., Wray, S. Intracellular calcium stores and agonist-induced contractions in isolated human myometrium. Am J Obstet Gynecol. 181 (2), 468-476 (1999).
- Parratt, J. R., Taggart, M. J., Wray, S. Functional effects of intracellular pH alteration in the human uterus: simultaneous measurements of pH and force. J Reprod Fertil. 105 (1), 71-75 (1995).
- Taggart, M., Wray, S. Simultaneous measurement of intracellular pH and contraction in uterine smooth muscle. Pflugers Arch. 423 (5-6), 527-529 (1993).
