Summary
Denne artikel beskriver eksperimentelle protokoller for at undersøge ex vivo sammentrækninger af menneskelige myometrium og deres anvendelse i drug discovery. Denne teknik bruges til at forbedre forståelsen af myometrial fysiologi og patofysiologi samt at validere farmakologiske data fra romanen forskning sonder eller narkotika fører.
Abstract
Opdagelse og karakterisering af roman lægemiddelsammensætninger eller biokemiske sonder stole på robust og fysiologisk relevante assay systemer. Vi beskriver metoder til at måle ex vivo myometrium kontraktilitet. Denne analyse kan bruges til at undersøge faktorer og molekyler der er involveret i modulation af myometrial sammentrækning og til at bestemme deres excitatoriske eller hæmmende handlinger, og dermed deres terapeutiske potentielle in vivo. Biopsier er fremstillet af kvinder, der gennemgår kejsersnit levering med informeret samtykke. Fine strimler af myometrium er dissekeret, klippet og knyttet til en krafttransducer i 1 mL orgel bade superfused med fysiologisk saltvand løsning ved 37 ° C. Strimler udvikle spontane veer inden for 2-3 h under sæt spænding og forblive stabilt i mange timer (> 6 h). Strips kan også blive stimuleret til at indgå som ved de endogene hormoner, oxytocin og vasopressin, som forårsager koncentration-afhængige graduering af sammentrækning frekvens, kraft og varighed, til mere ligner sammentrækninger i arbejdskraft. Derfor, effekten af kendte og nye narkotika fører kan testes på spontan og agonist-induceret sammentrækninger.
Denne protokol beskriver specifikt hvordan dette assay kan bruges til at bestemme styrken af kendte og nye agenser ved at måle deres effekter på forskellige parametre af menneskelige myometrial sammentrækning. Vi bruger oxytocin- og V1a receptor antagonister, atosiban og SR49059 som eksempler på kendte stoffer, som hæmmer induceret af oxytocin og vasopressin sammentrækninger, og vise, hvordan denne metode kan anvendes til at supplere og validere farmakologiske data fra celle-baserede assays til at støtte udvikling af lægemidler. Virkningerne af roman agonister i forhold til oxytocin og vasopressin kan også karakteriseres. Mens vi bruger eksemplet med oxytocin / vasopressin system, denne metode kan også bruges til at studere andre receptorer og Ionkanaler, der spiller en rolle i uterus sammentrækning og afslapning til at fremme forståelsen af menneskets uterin Fysiologi og patofysiologi.
Introduction
Målet for drug discovery er at producere roman, potent, og yderst selektiv ligander, som skaber en terapeutisk respons ved at aktivere eller hæmme cellulær signalering veje. Dette kræver en passende analyse system til at teste blyforbindelser med pålidelige, robuste og relevante resultater1. Farmakologiske teknikker såsom ligand-receptor binding og funktionelle assays ansætte ofte heterolog celle-baserede systemer, manipuleret til overexpress receptorer, som ellers ikke ville være til stede2. Disse teknikker give værdifuld indsigt for receptor farmakologi og tidlige udvikling af lægemidler, kan oplysningerne ikke afspejler et sandt i vivo scenario. Det er derfor vigtigt, at farmakologisk data fra celle-baserede assays også valideres i fysiologisk relevante modeller.
Uterin glat muskulatur (myometrium) udgør den muskuløs lag af livmoderen, som er ansvarlig for sammentrækninger i løbet af arbejdskraft, at udviske og spile livmoderhalsen og levere fosteret3. Sammentrækning af myometrium er spontan; Det kræver ikke hormonal og nervøs input til kontrakt4. Sammentrækninger er tilvejebragt ved spontane depolarisering af myometrial cellens membran, hvilket fører til åbningen af spænding-drives Ca2 +-kanaler (L-Type kanaler) og tilstrømning af Ca2 + til celle5. Calcium komplekser med calmodulin og aktiverer myosin lys kæde kinase, som til gengæld phosphorylates myosin aktivering kryds broen cyklus dannelse med aktin og sammentrækning. Afslapning er typisk formidlet af nedtrapning fosforylering af myosin af myosin fosfatase og en reduktion i koncentrationen af Ca2 + via sin ekstrudering fra cellen og/eller binding til sarcoplasmic reticulum (SR)5,6 ,7.
Flere metoder er blevet udviklet for at studere myometrial funktion og dysfunktion, i vivo interne og eksterne tocography og intrauterin pres katetre, at generation af omdannet eller udødeliggjort celler af myometrial oprindelse8 ,9,10,11,12. Mens celle kultur systemer kan afsløre, om et stof kan handle på celleniveau, kan strimler af væv inden for orgel bade bruges som værktøjer til at måle funktionelle svar af hele væv til farmakologisk reagenser. Traditionelle orgel badet er typisk et stort opvarmet glas kammer, som er i stand til at bedriften mellem 5 og 50 mL fysiologisk kogsaltopløsning (PSS). Strimler inden for disse store kamre kræver normalt luftning med ilt og store mængder af PSS. Strimler af vævet er dissekeret og suspenderet inden for badning kammer og knyttet til en krafttransducer, som måler ændringer i spændinger, som under en sammentrækning. Strimler af myometrium fra både mennesker og dyr, herunder guinea gris13, mus14, rotte15, kanin16og andre17,18, har været brugt af en række forskningsgrupper for at undersøge mange spørgsmål vedrørende myometrial fysiologi og patologi, herunder præmature og dysfunktionelle arbejde. For eksempel, myometrial strimler har været brugt til at identificere faktorer, der regulerer og ændre myogenic aktivitet19,20,21, bestemme organelle funktion som SR22, samt undersøge modulatorer af ion-kanaler23,24,25,26, pumper og varmevekslere27 for at afgøre deres rolle i myometrial fysiologi.
Denne ex vivo -teknik giver mulighed for vurdering af væv sammentrækning ydeevne og den direkte virkning af forskellige agenter på parametrene for sammentrækning måles herunder, sammentrækning force (styrke), frekvens og varighed, samt den integrationen af disse værdier, til at generere et indeks over samlede arbejde (gennemsnitlige integrerende kraft eller arealet under kurven, AUC). Isoleret væv strip forberedelse udgør en model af mere end én celletype, kan den fysiologiske reaktion af hele væv måles. Orgel bad og isoleret væv strip er derfor et nyttigt redskab i forbindelse med bro mellem celle kultur arbejde og hele dyret /vivo arbejder. Derfor inden for drug discovery, virkningerne af roman agenter i deres excitatoriske (dvs., stimulerende) eller hæmmende (dvs., afslapning) potentielle i vivo kan blive nærmere vurderet. Denne teknik blev med succes anvendt i udviklingen af oxytocin- og V1a-receptor (OTR og V1aR) antagonist atosiban som en tocolytic agent til at hæmme præmature arbejdskraft sammentrækninger og forsinke præterm fødsel. In vitro test af atosiban på myometrial strimler fandt antagonist stand til at reducere oxytocin (OT)-induceret sammentrækninger28,29,30. Vigtigere er disse undersøgelser hjalp til at validere translationel værdien af atosiban og genereret proof-of-concept data behov for at tage det frem til kliniske forsøg31,32,33,34 . Atosiban er nu bredt anvendt som foretrukne stof for at forsinke arbejdskraft i Europa. Lignende proof-of-concept test blev gennemført for oxytocin analog carbetocin til at vise sin terapeutiske potentiale i forebyggelsen af post-partum blødning35,36,37. Andre blyforbindelser i øjeblikket under udvikling med denne analyse omfatter retosiban (GSK221149A)38 og nolasiban (data upubliceret). Disse metoder har også været anvendt med succes til at sammenligne mellem patientgrupper39,40,41,42,43,44, 45,46,47 og undersøges for intra-arter forskelle.
Her beskriver vi brugen af isolerede ex vivo væv strimler fra gravide menneskelige myometrium inden for små (1 mL) custom-made orgel bade til at illustrere, hvordan denne metode kan bruges til at supplere og validere farmakologiske data fra celle-baserede assays . Biopsier blev i vid udstrækning fremstillet af kvinder, der gennemgår pre labor elektiv kejsersnit (CS) levering, som de er planlagt kirurgi og derfor er lettere at planlægge biopsi samling, har nem adgang til myometrium, og væv vil ikke har været udsat for nogen uterotonic stimulanser eller afslapning forud for operationen. Biopsier fås dog også hos kvinder, der gennemgår uplanlagte (nød) CS levering i arbejdskraft giver tilstrækkelig tid til fuldt samtykke patienten. De fleste biopsier er opnået under operationen fra det nedre uterine segment i stedet for kirurgisk snit, men det er også muligt at få prøver fra øvre segment48,49. I nogle tilfælde efter vaginal levering, er punch biopsier fra placenta sengen også opnået50. Men dette er ikke den mest konventionelle rute og mængden af myometrial væv hentet er lille. Ikke-gravide myometrium kan fås fra præ- eller Post-menopausale kvinder, der gennemgår hysterektomi for godartet gynækologisk betingelser. En fuld tykkelse biopsi er stikprøven efter patologi undersøgelse, fra den lavere corpus fra livmoderhalsen, og myometrium er taget fra midten af livmodervæggen at undgå serosal og endometrie overflader.
Protocol
Passende institutionelle, etiske review board og sikkerhed godkendelse til forsøg med humane væv skal være på plads før arbejdet med alle humane væv. Alt arbejde beskrevet heri modtaget godkendelse fra den lokale forskning etiske komité (Liverpool øst, REC Ref 10/H1002/49) og institutionelle review bestyrelserne for den forskning og udviklingsafdeling, Liverpool Women's Hospital og University of Liverpool.
Bemærk: Alle biopsier beskrevet i denne protokol blev indhentet fra kvinder, der gennemgår før arbejdskraft elektiv CS levering på Liverpool Women's Hospital og hver kvinde gav skriftligt informeret samtykke til at deltage.
1. løsninger
- Forberede modificerede Krebs fysiologisk saltvand løsning (PSS) med følgende sammensætning: 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 7,8 mM glukose, 10,9 mM HEPES og 2,0 mM CaCl2.
Bemærk: Lydstyrken skal foretages bestemmes efter antallet af væv bade i drift, strømningshastigheden af systemet (1 mL/min), og anslået længde af forsøget, herunder ækvilibrering og udvaskning tid. - Justere pH til 7.4 ved hjælp af 4 M NaOH.
2. Vævscentre badekar sat op
- Forvarm væv bad system reservoir til ~ 45 ° C ved hjælp af en recirkulerende vandbad indstillet på 55-60 ° C.
Bemærk: Vandbeholderen i bunden af apparatet er opvarmet til ~ 45 ° C, som efter giver mulighed for varmevekslingen med PSS i peristaltiske slangen kører igennem, sikrer PSS i væv badet er ved 37 ° C. Nogle justering at indstille temperaturer kan være nødvendigt at sikre, at temperaturen af PSS i væv bad når 37 ° C. Dette vil variere afhængigt af apparatet bruges og indstille strømningshastigheder. - Manuelt skifte på eventuelle andre nødvendige udstyr herunder forstærker, dataopsamling og registreringssystem og suge pumper.
- Placer hver peristaltiske feeder tube (en tube per badekar) omkring ruller af peristaltiske pumpehoved. Sikre med at fastholde stopper og stramning kompression cams og låsning af taster omkring rørene. Læg de frie ender af peristaltiske feeder rør i en 1 L beholder med PSS og starte pumpe til at tillade PSS skal løbende perfuse i væv bade.
- Sikre suction pumper fungerer korrekt og at løsning i badet er konstant at flow ind i badet er lig med satsen for fjernelse. Niveau af PSS i væv badet kan justeres ved at manipulere med dybden af den suge rør i badet ved hjælp af modeldesignerens ler.
- Kalibrere kraft transducere ved at placere en kendt vægt (svarende til 1 millinewton (mN, enheden for kraft)) på transducer krog og optagelse indbøjningen opdaget af erhvervelse software.
Bemærk: Værdier kan justeres i softwaren, således at værdierne registreres automatisk konverteres til mN bevirke, at behovet at udføre eventuelle yderligere konverteringer under analysen. Kalibrering af force transducere skal udføres før væv montering.
3. væv forberedelse og dissektion af strimler
- Saml biopsier af gravide menneskelige myometrium (1 – 2 cm3) på CS efter levering af baby og moderkagen. Få (typisk) fuld tykkelse biopsier, hvor både perimetrium (yderste serosa lag af livmoderen) og decidua (inderste lag i livmoderen) er til stede. Brug kun myometrial væv (central muskel lag). Se figur 1A-B.
- Fjerne (væsentlige) decidua og enhver vedhængende føtale membraner (hvis tilstede), som disse væv er kendt for at producere stoffer, der kan ændre myometrial kontraktilitet.
Bemærk: I kirurgi, prøver er placeret i Hanks Balanced Salt løsning (HBSS) eller frisk PSS og opbevares ved 4 ° C. Ideelt bør væv anvendes inden for 12-16 h af kirurgi, men undersøgelser har vist ingen skade til kontraktilitet efter 18 h af samling med opbevaring på 4 ° C51. Passende kontrol skal udføres for at bekræfte væv levedygtighed og funktion efter længere tids opbevaring ved 4 ° C. Prøverne her er taget fra den øverste kant af den nedre uterine segment indsnit site og ikke fra det øvre segment. De nedre og øvre dele af livmoderen har vist sig at indgå tilsvarende48, dermed anses lavere segment biopsier for at være en god afspejling af øvre segment myometrial aktivitet.
- Fjerne (væsentlige) decidua og enhver vedhængende føtale membraner (hvis tilstede), som disse væv er kendt for at producere stoffer, der kan ændre myometrial kontraktilitet.
- Forberede dissektion område og nødvendige instrumenter herunder: store dissektion saks, lille markriyor dissekere saks, to dissekere pincet, dissektion pins og aluminium væv klip, omkring en dissektion mikroskop med både faste og zoom forstørrelse.
- Sted biopsi prøven på et klart silastic-baserede dissektion parabol (Se Tabel af materialer) fyldt med PSS og nøje orientere biopsi, således at de serøse hinder og decidua kanter er identificeret figur 1B.
- Brug benene til at sikre biopsi i bunden af fadet. Sikre væv forbliver hydreret med PSS under hele dissektion.
- Manuelt Tænd mikroskopet lyskilde og inspicere vævet under mikroskop ved 10 x forstørrelse at identificere regioner i myometrium gratis fra arvæv, serosa, decidua og enhver vedhængende føtale membraner hvis til stede.
- Udføre stump dissektion ved hjælp af store dissektion saks til at adskille to tilstødende væv lag, afslører to fly eller ark af muskler.
Bemærk: Det er ofte lettere at finde en lille lomme mellem væv lag til at begynde adskillelsen, men skal sørges for at undgå små fartøjer på biopsi kant, som de kan forveksles med "lommer". - Sted dissekere pins på hvert hjørne af væv til at fastgøre den. Inspicere plader af muskel udkig regioner af muskel med fibrene løber parallelt.
Bemærk: Region identifikation kan blive hjulpet ved at følge retningen af små kapillærer perfusing gennem væv. Blid trække frontviden væv kan også hjælpe med at identificere den retning, hvorpå fibrene rejser. - Skåret væk strimler af væv ~ 2 mm bred x 8 mm længde x 1 mm tyk langs længdeaksen på linje med retningen af muskelfibre ved hjælp af små dissektion saks.
Bemærk: Pleje skal tages kun holde væv af den oprindelige skåret kant for at undgå skader. - Gentag processen med at dissekere ud antallet af påkrævede strips til eksperimentet.
- PIN hver strimmel i begge ender til rette og sikre til fadet, tager sig ikke over stretch i vævet.
- Fastgør aluminium væv clips i hver ende, så vævet mellem dem er ~ 5 mm længe og forsigtigt skære væk overskydende væv (figur 1 c).
- Overførsel til en ren skål fyldt med PSS klar til montering.
4. montering væv i badene
- Overføre stripsene til eksperimentelle væv bade. Montere strimler horisontalt end vertikalt (som i traditionelle orgel bade) (figur 2B).
- Fastgør den ene ende af hver strimmel af klippet til krafttransducer, som måler væv sammentrækning, og den anden til en fast krog både inden for væv kammeret.
Bemærk: Kapacitet af væv badet er ~ 1 mL, som er stort nok til at sikre stripsene er helt nedsænket i badet. - Sikre strimler på bunden af hver krog i badet.
- Åbn optagelse software ved at dobbeltklikke på ikonet software.
- Juster optagelse for hver kanal, så det er i betragtning i vinduet kanal.
- Justere Y akseskala til at læse mellem 0-10 V (svarende til 0-10 mN post kalibrering) ved at højreklikke på Y-aksen, vælge 'plan', og inputting minimum og maksimale værdier for 0 og 10, henholdsvis. Vælg 'OK'. Gentag for hver kanal optagelse.
- Tryk på 'Indspil' på softwaren til at starte live optagelse.
Bemærk: Hvis strimler ikke er fastgjort til bunden af hver krog, kunne de glider under sammentrækning, som vil blive vist som en 'hakket' på optagelsen. Sæt spændingen vil ændre og derfor sammentrækninger efter skred kan variere. - Strække vævet i hvert bad ved manuelt at dreje micromanipulators knyttet til hver transducer. Følg den opadgående væv bevægelse fra baseline på skærmen og fortsætte med at slå micromanipulators indtil den oprindelige spænding når 0,2 g (~ 2 mN).
Bemærk: Vævet vil straks begynde at slappe af (bemærket ved et fald i baseline spænding), typisk at nå frem til en konstant spænding i mellem 0,5 – 1 mN. Denne definerede spænding er blevet optimeret til væv strimler af denne størrelse i vores forsøgsbetingelser. Hvis andre mellemstore væv der skal anvendes, er det vigtigt, at passende længde-spænding forholdet undersøgelser er udført for at optimere den hvilende kraft skal anvendes. - Tillad væv til blandingen henstår i ~ 2 h indtil spontane veer opstår.
Bemærk: en lille forhøjning i baseline spænding er normalt observeret og er en god indikation af væv levedygtighed og at det vil være kontraktile.
5. udfordrende væv med 40 mM kalium (høj K+)
- Hvis ingen spontan veerne forekomme efter 2 h af montering, udfordre strimler med en høj kalium saltopløsning hvor kalium er forhøjet til 40 mM af isosmotic substitution af NaCl til KCl. For høj K+tilføje følgende (i mM): 119.6 NaCl, 40 KCl, 1,2 MgSO4, 7,8 glukose, 10.9 HEPES og 2,0 CaCl2.
Bemærk: I glatte muskelceller såsom myometrium forårsager anvendelsen af høj K+ sammentrækning af indirekte åbning spænding drives calcium kanaler fører til maksimal tilstrømning af Ca2 + i væv celler. Høj K+ kan derfor bruges som en foranstaltning til at teste det generelle forbrugerprisindeks fra væv integritet samt at opnå et mål for maksimal væv svar.- Placer feeder tube til badet indeholdende strimlen for at blive udfordret i laboratoriet glasflaske indeholdende høj K+ for 1-2 min.
- Returnere feeder tube til beholderen for PSS.
- Hvor en reaktion på høje K+ er nået, fortsat overvågning strip for en yderligere 1 h. Hvis der ikke er nogen kontraktile reaktion til høj K+ eller ingen spontan aktivitet fremkaldte post høj K+ svar, kassere strimlen.
Bemærk: Eksperimentatoren skal også være klar over det døde rum (tid, det tager for løsning at nå frem til væv bad) feeder slangen før vurderingen af svar til høj K+. Dette kan tage 2-3 min og vil afhænge af strømningshastigheden. - For at sikre fuldstændig udskylning af høj K+ fra bad og feeder-rør, som kan påvirke efterfølgende manøvrer, vent indtil spontane veer vender tilbage til pre høj K+ amplitude, før du fortsætter yderligere med eksperimentet.
6. test virkningerne af kendte og nye forbindelser på Myometrial sammentrækning
Bemærk: Forsøg at teste effekten af nye lægemidler og reagenser på myometrial funktion kan udføres på spontan (figur 3A) eller agonist-stimuleret sammentrækninger (figur 3B-C). For agonist stimuleret sammentrækninger, OT eller arginin vasopressin (VP) er føjet til PSS en koncentration på 0,5 nM og bruges i hele eksperimentet (figur 3B-C). Koncentrationen af OT er blevet optimeret for denne analyse, da det giver sammentrækninger, der er phasic i naturen40,52. Koncentrationer af større end dette kan føre til langvarig og vedvarende (tonic) sammentrækninger (Se Ref41,44 eksempler) under-agonister som effekten af forskellige agenter er vanskelig at vurdere og den eksperimentelle tidsramme behov udvides kraftigt til at rumme den øget varighed af individuelle sammentrækninger og reduktion i frekvens. I dette eksempel eksperiment, OT eller VP er tilføjet til at stimulere veerne så at antagonisme af kendte OTR og V1aR antagonister, atosiban og SR49059, eller af vores nye sammensatte [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT), kan vurderes.
- Forberede koncentrationer af test-forbindelser i PSS (med eller uden 0,5 nM OT/VP) fortyndes med minimum 1/1.000 fortynding, sikring af en lang række fusioner er medtaget som dem, der ikke fremkalde en reaktion til koncentrationer, der overstiger maksimale svar.
- Der laves en tilsvarende række fortyndinger med lige store mængder af køretøjet (f.eks., dimethylsulfoxid, acetonitril eller destilleret vand).
Bemærk: Det er ofte nemmest at forberede den højeste koncentration, dvs., 10-6 M (fra et lager af 10-3 M) og derefter udføre serielle fortyndinger langs en logaritmisk skala (fx10-6-10-10 M). Volumen skal forberedes afhænger tidspunktet for ansøgningen, strømningshastigheden af de apparater, og antallet af strimler undersøges, f.eks.en 25 min anvendelse af reagens og en gennemstrømningshastighed på 1 mL/min., et minimum af 25 mL af hver koncentration pr. væv bad er requir ed. - Anvende den første koncentration af stof til væv ved at placere feeder slangen til væv badet i laboratoriet glasflaske indeholdende reagens på den ønskede koncentration.
Bemærk: Det skal ske, når en stabil basislinje af spontan eller OT/VP-stimuleret sammentrækninger er opnået. - Anvende den tilsvarende køretøj kontrol løsning på samme måde til et andet bad.
- Registrere tidspunktet for ansøgningen (dvs.når feeder rørledninger blev ændret).
- Gentag processen for hver koncentration ved sekventielt placere feeder slangen i laboratoriet glasflaske indeholdende den næste koncentration i serien og Gentag indtil alle koncentrationer er blevet anvendt.
Anvendelsen af hver koncentration kan være mellem 15 og 30 min, men bør være i overensstemmelse for hver koncentration anvendt og mellem eksperimenter. Dem med OT eller VP-stimuleret sammentrækninger tendens til at kræve de længere anvendelse (f.eks., 25 min) for at tage højde for reduktionen i sammentrækning frekvens observeret under stimulation. Foreløbige forsøg til at finde frem til den optimale anvendelse bør udføres på forhånd med nogen nye reagens bliver testet. - Returnere feeder tube til PSS (med eller uden OT/VP) til udvaskning.
- Klik på 'stop' for at afslutte live optagelse. Straks gemme dataene i en passende mappe og eksportere en version som en '.mat' fil.
7. dataanalyse
NOTE: Data capture og analyse kan udføres af et vilkårligt antal af kommercielt tilgængelige data erhvervelse softwarepakker. Se Tabel af materialer for detaljer af software, der anvendes i denne protokol. For en nøjagtig vurdering af kontraktile aktivitet, parametre af sammentrækninger måles omfatter: i) amplitude af sammentrækning, ii) hyppigheden af sammentrækning, iii) varigheden af sammentrækning, og iv) gennemsnitlige kraft integral (figur 4). Gennemsnitlig kraft integreret svarer til arealet under kurven sammentrækning og er derfor et indeks af væv strip samlede arbejde i en given tid. Nogle af eller alle parametrene, der kan analyseres. Som minimum anbefales det, at den gennemsnitlige integrerende kraft og amplitude af sammentrækning er analyseret53. I eksperimenter beskrevet her målt vi ændringer i amplitude af sammentrækning og arealet under kurven.
- Importere the.mat fil til analyse software.
- Justere kolonnen svarende til X-aksen til at afspejle den eksperimentelle tid, under hensyntagen til interval samplingfrekvens. Eksperimenter er typisk optaget på 10 Hz svarende til 10 prøver/s eller 600 prøver/min.
- Plotte data som en X-Y koordinere graph bruger "Plot | Line"funktion.
- Nul baseline af sammentrækning ved hjælp af funktionen 'oversætte lodret' på software.
- Vælg en passende kontrolperiode.
Bemærk: Dette er perioden umiddelbart forud for anvendelsen af den første koncentration af regent, men lig med varigheden af anvendelsen af reagens (figur 4A). For eksempel, hvis anvendelsen af stoffet X er for 25 min, bruge 25 min forud for den første anvendelse af narkotika X som kontrol. - Aflæs Y-aksen, optage amplitude (kraft) af sammentrækning på max toppen af hver sammentrækning forekommer i den tidsramme, der er valgt, og beregne en gennemsnitsværdi.
- Måle varigheden af sammentrækning på 50% af denne maksimale peak af læsning fra X-aksen i starten og slutningen af hver sammentrækning og optage en gennemsnitsværdi.
- Tæl antallet af sammentrækninger, der forekommer i tidsrammen til at generere en værdi for frekvens.
- Brug funktionen 'integration' til at beregne AUC (i arbitrære enheder, a.u.) for den valgte periode.
Bemærk: For at optage AUC præcist, det er vigtigt, at grundlinjen i sammentrækninger er sat til nul på Y-aksen. - Sekventielt flytte gennem hver af koncentrationer og optage de forskellige parametre af sammentrækning.
- Angive kontroldata som 100% og udtrykke de værdier, der er opnået under hver koncentration af reagens som en procentdel af denne kontrol dvs, værdier for stimulation bør > 100% mens afslapning bør være < 100%.
Bemærk: Normalisere dataene på denne måde bør tillade brugeren at sammenligne resultater på tværs af strimler og farmakologiske behandlinger. - Gentag for hver eksperiment og overføre data til en grafisk pakke.
Representative Results
Brug af denne model, kan reaktion på forskellige agonister og antagonister af sammentrækning og nye agenser af kendt eller ukendt funktion undersøges og kvantificeres. Standard farmakologiske parametre som EF50 og IC50 værdier kan beregnes når reagenser, der anvendes i en bred vifte af koncentrationer, f.eks., 10-5– 10-9 M og tilføjet i stigende koncentrationer langs en logaritmisk skala.
Oxytocin Receptor Antagonist koncentration / respons eksperimenter
I dette eksperiment, var parret strimler af menneskelige myometrium skåret som beskrevet ovenfor og vist i figur 1, monteret i væv bade som afbilledet i figur 2, og lov til at reagensglasset for at producere stabil sammentrækninger af lig amplitude og frekvens. Strimler blev derefter udsat for den endogene OTR agonist, OT (0,5 nM) til at stimulere veerne. Efter en periode med stabil aktivitet under OT (typisk 45 min.), blev atosiban anvendt til en stribe i stigende koncentrationer langs en logaritmisk skala (10-9– 10-6 M). Den anden strimmel var alene tilbage i OT som tidsstyring. Et eksempel på svar på atosiban kan ses i figur 5A. At tage sammentrækninger umiddelbart forud for den første koncentrationen af atosiban kontrol (100%), blev amplitude og AUC for hver koncentration anvendt beregnet som vist i figur 4. For tiden-kontrol eksperimenter, blev tid-ækvivalent af eksperimentelle manøvrer målt. Dataene blev derefter afbildet og kurver monteret ved hjælp af funktionen ikke-lineær regression i en grafisk softwarepakke (figur 5B-C). Hvad angår beregning af den hæmmende effekt, blev den relative styrke af atosiban beregnet ved at måle den IC50 som koncentration forårsager halvdelen maksimal (50%) hæmmende svar. Det samme kan ske for agonister eller stimulatorer af sammentrækning. I dette tilfælde beregnes styrken af sammensat fra EF50 (den koncentration, der forårsager halvdelen maksimal stimulerende svar).
Undersøge svar af nye forbindelser og teste deres Receptor selektivitet
Vi brugte denne fysiologisk relevante model af ex vivo menneskelige myometrial sammentrækninger for at undersøge de antagonistiske effekter af nyligt syntetiserede indelukke, [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT) på sammentrækninger stimuleret med enten den indfødte V1a R agonist, VP eller indfødte OTR agonist, OT. Vi brugte denne analyse for at validere receptor selektivitet [D-Arg8] INT, der havde været tidligere bestemmes ved farmakologiske celle-baserede metoder til at være en antagonist V1aR men ikke OTR54.
I dette eksperiment, blev menneskelige myometrial strimler udsat for 0,5 nM VP eller 0,5 nM OT for omkring 1 time at stimulere sammentrækninger som vist i figur 3, før tilføje vores nye sammensatte [D-Arg8] INT i stigende koncentrationer (figur 6A og figur 6 C). Dette blev derefter sammenlignet med de kommercielt tilgængelige, kendt V1aR antagonist, SR49059 (fig. 6B). Figur 6A illustrerer koncentrationen afhængige falder i VP-stimuleret humane myometrial sammentrækninger med stigende koncentrationer af [D-Arg8] INT. Data for amplitude af sammentrækning og AUC for hver koncentration er sammenfattet i figur 6Aii-iii. Effekten er lig at vist til stigende koncentrationer af den kendte V1aRasmussen-hæmmer, SR49059, vist i figur 6Bi-iii. [D-Arg8] INT over V1aRasmussen, men ikke over OTR selektivitet fremgår af det faktum, at [D-Arg8] INT gør ikke fald menneskelige myometrial sammentrækninger som har været stimuleret med OT (figur 6 c) som amplitude og AUC forblev stabil (figur 6Cii-iii).
Figur 1: menneskelige myometrial biopsi dissektion. (A) A diagram over den menneskelige livmoder viser tre væv lag, der omfatter livmodervæggen. Det inderste lag er endometriet (decidua i graviditet, rød pil), det midterste lag er den myometrium (muskuløs lag, sort pil), der genererer sammentrækninger, og det yderste lag er perimetrium (eller serosal membran, blå pil) som danner en beskyttende pels omkring livmoderen. Regionen af interesse for biopsi prøveudtagning er afbildet af den sorte firkant. Et eksempel biopsi fra en gravid kvinde under kejsersnit er vist i (B) med den decidua og myometrial lag fremhævet (serosa ikke synlig). Det er vigtigt, at de forskellige væv lag er fastlagt, så strimler af myometrium er korrekt dissekeret for eksperimenter. Et eksempel strimmel af myometrium, som er blevet dissekeret og afskæres er vist i (C). Typisk er 2-6 strimler skåret og klippet som vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: multi orgel bad eksperimentelle sæt op bruges til at måle sammentrækninger af menneskelige myometrium. (A) strimler af myometrium er placeret i små (1 mL) orgel bad kamre placeret oven på et opvarmet reservoir, (i) og er superfused med fysiologisk saltvand løsning (PSS) som en peristaltisk pumpe (ii). Reservoiret er fastholdt på et sæt temperatur som en cirkulerende vandbad (iii). Hver strimmel er knyttet til en krafttransducer (iv), der registrerer ændringer i spænding under sammentrækning. Dette er forstærket af en transbridge forstærker (v) og omdannet til et digitalt signal (vi), som er optaget på et edb-system (vii) kører den tilknyttede erhvervelse software. (B) forstørret billede af et orgel bad kammer med en stribe af humane myometrium i situ (rød pil), badet i PSS med ene ende knyttet til en krafttransducer og den anden til en fast krog. ()C) skematisk oversigt over opsætning. Væv kamre fyldt med PSS er konstant perfunderet med varmede PSS ved 37 ° C, som er via varmevekslingen med en opvarmet vandreservoir under bade (holdt ved 45 ° C) og en cirkulerende vandpumpen indstillet på 55 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: spontan og agonist-stimuleret sammentrækninger af menneskelige myometrium in vitro-. I agonist-fri betingelser, spontane sammentrækninger forblive stabile for over 3 h af optagelse uden betydelige tab af amplitude eller område-under-the-kurve (AUC) (Aii, Aiii), demonstrerer robustheden af denne model til at undersøge de anvendelsen af forskellige agenter på spontan sammentrækning. Efter etablering af stabile, spontane veer, blev 0,5 nM oxytocin (B, OT) eller vasopressin (C, VP) føjet til fysiologisk saltvand løsningen (PSS). Kontraktioner under stimulation også forblive stabil i et antal timer uden betydelige tab af sammentrækning amplitude (Bii, Cii) eller AUC (Biii, Ciii) gør det muligt for effekten af forskellige kontraktile agenter til at være undersøgt i overværelse af myometrial agonister. Data præsenteres som mean ± standardfejl af middelværdien (SEM). Bemærk, for agonist-stimuleret sammentrækninger (B, C), kontrolperiode (100%) er taget efter de første 45 min anvendelse af agonist, når veerne er stabiliseret. I alle tilfælde var strimler superfused med PSS ved 37 ° C, pH 7,4 (Reproduced fra Arrowsmith et al. 40 med tilladelse fra Reproduktive videnskaber og Di Giglio et al. 54 med tilladelse fra Videnskabelige rapporter under licensen Creative fælles Open Access). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: dataanalyse. (A) En hensigtsmæssig kontrolperiode vist med rødt blev fastsat ved at vælge sammentrækninger umiddelbart forud for anvendelsen af testforbindelsen (Drug X). Denne kontrolperiode, er også lige i tide til anvendelsen af stof X (f.eks.40 min i dette eksempel). Når målte værdier for perioden kontrol er indstillet som 100%. Alle efterfølgende målinger er derefter udtrykt som en procentdel af kontrol. (B) der er 4 forskellige parametre af sammentrækning, der kan måles: a amplitude af sammentrækning, hvilke måler sammentrækning styrke (styrke, mN), (ii) hyppigheden af sammentrækning, hvilke måler hastigheden af sammentrækning, (iii) varigheden af sammentrækning der måles på halv maksimal højeste sammentrækning og (iv) arealet under kurven (også kendt som force integral, arbitrære enheder), hvilket giver et mål for overordnede arbejde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: optagelse atosiban antagonistisk virkning på oxytocin-induceret sammentrækninger i menneskelige myometrium. Når spontane veer var oprettet, blev sammentrækninger stimuleres med oxytocin receptor agonist, oxytocin (OT). Sammentrækninger fik lov til at stabilisere under stimulation for en yderligere 45 min. (A) den V1a og OT receptor antagonist, atosiban blev derefter anvendt i stigende koncentrationer langs en logaritmisk skala (10-9-10-5M). Sammentrækninger i perioden forud for den første koncentration af atosiban blev målt og taget som kontrol (100%). Aktivitet under hver efterfølgende koncentration blev målt og udtrykt som en procentdel af kontrol. Det samme blev udført for strimler udsat for OT alene ved hjælp af tid, der svarer til eksperimentelle manøvrer. Data blev afbildet i grafiske software: (B, C) Vis koncentration-respons-kurver for den antagonistisk virkning af atosiban (blå) og passende fortynding af køretøjet (grå, tidsstyring) på OT-inducerede myometrial sammentrækning amplitude og arealet under kurven (AUC), henholdsvis. Data præsenteres som gennemsnit ± standard fejl af middelværdien (SEM) procentdel af amplitude og AUC af kontrolaktivitet (før anvendelse af atosiban). IC50 værdier blev derefter beregnet som give den koncentration, som halvt maksimal hæmmende (50%) svaret for amplitude af sammentrækning og kraft integral (AUC) opnåede (Reproduced fra Arrowsmith et al. 40 med tilladelse fra Reproduktive Sciences). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: prøvning af en roman stof på menneskers myometrial sammentrækning effekt og receptor selektivitet. Efter spontan sammentrækninger af menneskelige myometrium blev etableret, blev veerne stimuleret med enten vasopressin receptor agonist, vasopressin (VP) (Ai, Bi) eller oxytocin receptor agonist, oxytocin (OT) (Ci). Effekten af [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT) og kommercielt tilgængelige V1aR antagonist, SR49059 på sammentrækninger stimuleret af VP blev vurderet ved at anvende stigende koncentrationer af stofferne. Typiske reaktioner er vist i (Ai, Bi). De tilknyttede analyseret data for amplitude og arealet under kurven (AUC) er vist i (ii) og (iii), henholdsvis hvor effekten har været udtrykt som procentdel af kontrol aktivitet (100%). Både [D-Arg8] INT og kendte V1aR antagonist, SR49059 forårsaget en dosis afhængige nedgang i amplitude og AUC, støtte [D-Arg8] INT rolle som et V1aR receptor antagonist i menneskelige myometrium. I modsætning hertil [D-Arg8] INT påvirkede ikke sammentrækninger stimuleret af OT (Ci-iii), derfor ligeledes til vores resultater fra celle-baserede assays, [D-Arg8] INT viser også selektivitet mod V1aRasmussen i menneskelige myometrium (Data gengivet fra Di Giglio et al. 54 med tilladelse fra Videnskabelige rapporter under licensen Creative fælles Open Access). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Mens de fleste udvikling af lægemidler er bestemt til behandling af menneskelige lidelser, udføres mest grundlæggende forskning primært i animalsk væv. Her, beskriver vi metoder til at undersøge ex vivo sammentrækninger af menneskelige myometrium fremstillet af kirurgi, som kan bruges til at behandle en række vigtige spørgsmål relateret til uterin Fysiologi og patologi, samt at validere funktionelle svar til kendte og nye farmakologiske midler til at støtte udvikling af lægemidler. Navnlig, fremhæve vi brugen af denne analyse at undersøge de antagonistiske svar af en kendt OTR og V1aR konkurrencedygtige antagonist, atosiban på OT-inducerede gravid myometrial sammentrækninger, samt at bestemme svar og receptor selektivitet af en nyudviklet selektiv V1aR antagonist, [D-Arg8] INT. Vi demonstrere at vigtige farmakokinetiske parametre såsom EF50 og IC50 kan beregnes, som justerer godt med celle-baserede farmakologi data.
Bruger flere strimler samtidig giver mulighed for direkte sammenligning af flere agent effekter, konkurrence eksperimenter med antagonister og passende tid og køretøj kontrol. Som strimler er ofte tilberedt i grupper af 2, 4 eller 8, giver denne teknik moderat overførselshastighed, gør det muligt for afprøvning af 2 – 4 forbindelser på 6-8 (kumulative) koncentrationer (pr. biopsi). Denne metode giver også real-time data, således at virkningerne kan vurderes hurtigt og protokoller kan justeres. Desuden, denne teknik kan bruges til at teste forbindelser af interesse og har været anvendt med succes af en række forskergrupper fokuseret på myometrial fysiologi og i drug discovery. Udover at analysere ren forbindelser som beskrevet i denne hvidbog, uterin kontraktilitet model har også været og med held kan udnyttes til at screene for romanen uterotonic stoffer fra blandinger, såsom drogetilberedninger fra traditionel medicin7 , 55 , 56.
Selvom denne model er teknisk robust og viser god reproducerbarhed, det har nogle begrænsninger: dissektion kan være svært for dem uvant med væv eller dissektion hospitalsudstyr, dermed nye brugere vil kræve lidt tid til at optimere væv forberedelse og protokoller. Det skal også bemærkes, at menneskelige myometrium afviger betydeligt i udseende til andre modeller som rotter og mus. De fleste gnavere livmoder er sammensat af to rør-lignende uterin horn, hver komplet med en æggestok i den ene ende og sluttede på livmoderhalsen. Hvert horn har klart definerede langsgående og cirkulær muskel lag, som let kan adskilles på dissektion, mens de forskellige fibertyper i menneskelige myometrium er ofte flettet sammen, danner en 'maske'. Derudover er sammentrækning profiler af menneskelige myometrium meget forskellige til gnavere. Mest bemærkelsesværdigt, er sammentrækninger i menneskelige myometrium mindre hyppige men længere varighed. Eksperimentelle tidsrammer for arbejder med menneskelige myometrium er derfor ofte langt længere end gnavere modeller. Forskelle i receptor udtryk mellem arter kan også bidrage til ganske markante forskelle i svarene til agonister og dette bør tages i betragtning, hvis ekstrapolere resultater på tværs af arter.
Der er også antallet af trin, der har brug for at maksimere output fra dette system. Kritiske trin omfatter bevarelse af væv levedygtighed som pasning når du håndterer væv for at undgå enhver unødig skade under dissektion eller ved montering. En dygtig øje er forpligtet til at dissekere fine strimler af uterin muskel, sikring af orienteringen af muskelfibre er i længderetning og efter flyet af væv, samt at undgå ar væv, decidua og små fartøjer. For at støtte orientering formål, når modellen er i laboratoriet, er det muligt at føje et mærke (f.eks små kirurgiske søm) på tidspunktet for indsamlingen til den ene side af biopsi at afgrænse den serosal kant fra decidual kant.
Væv bør holdes på en støt 36-37 ° C under eksperimenter som væv funktion er underlagt temperatursvingninger. Dette kan opnås med en robust klimaanlæg i laboratoriet. Konstant perfusion af varmede PSS sikrer, at temperaturen er vedligeholdt og rødmen ud af affaldsprodukter fra sammentrækning. Temperatur inden for orgel bade kan ændres ved at ændre strømningshastighed eller justere bad vandtemperaturen direkte. Små bad størrelse i forhold til traditionelle 5-50 mL bade sikrer en relativt hurtig omsætning af PSS og udvaskning af reagenser. Miniaturiserede orgel bad reducerer som beskrevet her, også mængden af PSS og reagenser af interesse behov, hvilket minimerer omkostningerne og besparende dyrebare, nyudviklet kemikalier. Desuden, på grund af den lille bad størrelse og ved hjælp af en HEPES-baseret buffer, kræver dette system ikke iltning fxaf boblende PSS med carbogen. Standardisering af spænding anvendes til strimler er også vigtig. Strimler af denne størrelse (5 mm x 2 mm x 1 mm), bør dette være ca 2 mN (svarende til ~0.2 g). Alternative metoder omfatter anvendelse af en høj kalium løsning til at fremkalde maksimal sammentrækning og strækker sig til halvdelen af denne maksimale sammentrækning. Det bør imidlertid noteres, at spændingen anvendes i vivo kan variere.
De vigtigste udfordringer omfatter at få væv fra menneskelige emner, men selv om beskatning, humane væv klart repræsenterer den mest fysiologisk relevante (og givende) model til at studere uterin sammentrækning i menneskers sygdom og drug discovery. Den isolerede væv strimler dog ikke nødvendigvis svare til væv i vivo som de er fritaget for eksempel af hormonelle og nervøse input som selv ikke afgørende for sammentrækning, vil modulere sammentrækninger in vivo. Denne analyse giver imidlertid mulighed for at analysere myometrial sammentrækninger på en kontrolleret måde, adskilt fra sådanne påvirkninger. Det giver også mulighed for effekten af faktorer som hormonal kontrol af sammentrækning (f.eks.via OT, VP, prostaglandiner, etc.) skal efterforskes, giver ledetråde til regulering af myometrial funktion. Som væv er fremstillet af forskellige kvinder, er der naturligvis nogle variation i de spontane kontraktile profiler mellem enhederne. Derfor er det ofte nødvendigt at udføre eksperimenter på et stort antal (~ n = 10) prøver at minimere variationen i nogle datasæt53. Dette er det vigtigste, når man sammenligner kontraktile aktivitet mellem forskellige patientgrupper. Normalisere svar agonister og antagonister til at styre aktivitet (dvs., at udtrykke som en procentdel af kontrolaktivitet eller høj K+) reducerer nogle af denne variation. Derudover kan data for at reducere Inter strip variation, normaliseres til strip integrationskugle ved at måle deres længde og vægt post eksperimenter41. Dette er især nyttigt, når man sammenligner sammentrækning mønstre mellem forskellige patientgrupper.
Begrænsninger af denne teknik også omfatter adgang til frisk væv, som kræver gode arbejdsforbindelser med hospitalspersonale, især teater personale og involverede i forbindelse med samtykke. Etiske tilladelser fra den lokale videnskabsetisk Komité og Institut eller hospital review board skal også være på plads. Samling af menneskelige myometrium er sandsynligvis udført i CS levering, når donoren er under kirurgi. Biopsi er taget fra samme uterin indsnit stedet lavet for at levere babyen og derfor patienten behøver ikke at gennemgå nogen yderligere procedurer. Theater personale og kirurgen udfører biopsi skal gøres opmærksom på den efterfølgende anvendelse af væv, og at de ikke skal være placeret i Fikseringsvæske løsninger sådan med hensyn til at sende til en patologi afdeling. Den lange eksperimentelle tidsramme er en anden overvejelse. Eksperimenter med humane væv tage mange timer (typisk > 6 h) (i modsætning til 2-3 h for et lignende eksperiment i rotte eller mus livmoderen), på grund af den langsommere hyppigheden af sammentrækning og 2-3 h tidsforsinkelsen mellem væv montering og etablering af spontan sammentrækninger. Men, som vi har vist, humant væv sammentrækninger er robust, og når etableret kan kontrakten i mange timer uden betydelig træthed40.
Dette system giver også andre udfordringer i vivo arbejde at overvinde herunder mulighed for at teste farmaceutiske reagenser på gravide væv. Denne teknik nemt kan ekstrapoleres til andre arter, herunder mus hvorved indledende resultater kan bekræftes, før du fortsætter yderligere i hele dyreforsøg. Kontrolleret ændringer i temperatur, sammensætningen af superfusate (PSS), og pH kan gøres nemt at efterligne forskellige scenarier i vivo og analysere effekten af disse ændringer på sammensatte adfærd. De grundlæggende principper for måling isometriske spænding i myometrial strimler kan også udvides til måling af samtidige ændringer i intracellulære calcium koncentration eller pH ved brug af fluorescerende Ca eller pH (H+) indikatorer og udstyr til at opdage og optage fluorescens57,58,59,60.
Generelt, den menneskelige myometrium repræsenterer en robust og fysiologisk relevante model til at karakterisere og validere nye terapeutiske forbindelser i drug discovery — både rene stoffer og blandinger. Vi har givet eksempler på dens anvendelse i drug discovery med hensyn til ordningen med OT/VP og fokuseret på OTR og V1enR antagonister til at vise, hvordan denne model kan bruges til at bestemme sammensatte effektiviteten og styrken på definerede mål og validere ligand selektivitet. Men det skal bemærkes at denne teknik kan bruges til at studere ethvert mål af interesse eller sti fører til myometrial sammentrækning (eller afslapning) samt støtte drug opdagelsen af nye mål og veje, og fremme vores forståelse af myometrial Fysiologi og patofysiologi.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning er blevet støttet af den østrigske videnskab fond (FWF) gennem projektet I3243 og det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale No 714366). CWG er blevet støttet af en australsk Research Council (ARC) fremtid Fellowship (FT140100730) og MM en ARC Discovery tidlige karriere forsker (DECRA) Fellowship (DE150100784). SA understøttes af en Harris-Wellbeing præterm fødsel forskning centrum Grant administreres af velvære for kvinder, UK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
| Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
| GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
| LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
| Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
| BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
| Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
| Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
| Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
| Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
| Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
| Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
| Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
| Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
| Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
| Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
| Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
| Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
| Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
| Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
| Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
| Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
| HBSS | SIGMA | H9269 | |
| Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
| Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
| [Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398 (1), 227-238 (2010).
- Wray, S. Insights into the uterus. Exp Physiol. 92 (4), 621-631 (2007).
- Wray, S., Kupittayanant, S., Shmygol, A., Smith, R. D., Burdyga, T. The physiological basis of uterine contractility: a short review. Exp Physiol. 86 (2), 239-246 (2001).
- Matthew, A., Shmygol, A., Wray, S. Ca2+ entry, efflux and release in smooth muscle. Biol Res. 37 (4), 617-624 (2004).
- Wray, S., et al. Calcium signaling and uterine contractility. J Soc Gynecol Investig. 10 (5), 252-264 (2003).
- Gruber, C. W., O'Brien, M. Uterotonic plants and their bioactive constituents. Planta medica. 77 (3), 207-220 (2011).
- Maul, H., Maner, W. L., Olson, G., Saade, G. R., Garfield, R. E. Non-invasive transabdominal uterine electromyography correlates with the strength of intrauterine pressure and is predictive of labor and delivery. J Matern Fetal Neonatal Med. 15 (5), 297-301 (2004).
- Newman, R. B. Uterine contraction assessment. Obstet Gynecol Clin North Am. 32 (3), 341-367 (2005).
- Haran, G., Elbaz, M., Fejgin, M. D., Biron-Shental, T. A comparison of surface acquired uterine electromyography and intrauterine pressure catheter to assess uterine activity. Am J Obstet Gynecol. 206 (5), 412-e415 (2012).
- Condon, J., et al. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biol Reprod. 67 (2), 506-514 (2002).
- Soloff, M. S., et al. Immortalization and characterization of human myometrial cells from term-pregnant patients using a telomerase expression vector. Mol Hum Reprod. 10 (9), 685-695 (2004).
- Buxton, I. L., Vittori, J. C. Cholesterol depletion enhances both spontaneous and agonist-evoked uterine smooth muscle contractions in a reversible manner. Proc West Pharmacol Soc. 48, 126-128 (2005).
- Matthew, A., Kupittayanant, S., Burdyga, T., Wray, S. Characterization of contractile activity and intracellular Ca2+ signalling in mouse myometrium. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11 (4), 207-212 (2004).
- Heaton, R. C., Taggart, M. J., Wray, S. The effects of intracellular and extracellular alkalinization on contractions of the isolated rat uterus. Pflugers Arch. 422 (1), 24-30 (1992).
- Hutchings, G., Deprest, J., Nilius, B., Roskams, T., De Ridder, D. The effect of imatinib mesylate on the contractility of isolated rabbit myometrial strips. Gynecol Obstet Invest. 62 (2), 79-83 (2006).
- Wilson, R. J., Allen, M. J., Nandi, M., Giles, H., Thornton, S. Spontaneous contractions of myometrium from humans, non-human primate and rodents are sensitive to selective oxytocin receptor antagonism in vitro. BJOG. 108 (9), 960-966 (2001).
- Choudhury, S., Garg, S. K., Singh, T. U., Mishra, S. K. Functional and molecular characterization of maxi K+ -channels (BK(Ca)) in buffalo myometrium. Anim Reprod Sci. 126 (3-4), 173-178 (2011).
- Smith, R. C., McClure, M. C., Smith, M. A., Abel, P. W., Bradley, M. E. The role of voltage-gated potassium channels in the regulation of mouse uterine contractility. Reprod Biol Endocrinol. 5, 41 (2007).
- Jones, K., Shmygol, A., Kupittayanant, S., Wray, S. Electrophysiological characterization and functional importance of calcium-activated chloride channel in rat uterine myocytes. Pflugers Arch. 448 (1), 36-43 (2004).
- Popescu, L. M., et al. Imatinib inhibits spontaneous rhythmic contractions of human uterus and intestine. Eur J Pharmacol. 546 (1-3), 177-181 (2006).
- Taggart, M. J., Wray, S. Contribution of sarcoplasmic reticular calcium to smooth muscle contractile activation: gestational dependence in isolated rat uterus. J Physiol. 511 (Pt 1), 133-144 (1998).
- McCallum, L. A., Pierce, S. L., England, S. K., Greenwood, I. A., Tribe, R. M. The contribution of Kv7 channels to pregnant mouse and human myometrial contractility. J Cell Mol Med. 15 (3), 577-586 (2011).
- Bernstein, K., et al. Calcium-activated chloride channels anoctamin 1 and 2 promote murine uterine smooth muscle contractility. Am J Obstet Gynecol. , (2014).
- Khan, R. N., Morrison, J. J., Smith, S. K., Ashford, M. L. Activation of large-conductance potassium channels in pregnant human myometrium by pinacidil. Am J Obstet Gynecol. 178 (5), 1027-1034 (1998).
- Phillippe, M., Basa, A. Effects of sodium and calcium channel blockade on cytosolic calcium oscillations and phasic contractions of myometrial tissue. J Soc Gynecol Investig. 4 (2), 72-77 (1997).
- Ausina, P., et al. Effect of inhibition of the electrogenic Na+/K+ pump on the mechanical activity in the rat uterus. Fundam Clin Pharmacol. 10 (1), 38-46 (1996).
- Melin, P., Trojnar, J., Johansson, B., Vilhardt, H., Akerlund, M. Synthetic antagonists of the myometrial response to vasopressin and oxytocin. J Endocrinol. 111 (1), 125-131 (1986).
- Hahn, D. W., et al. Evaluation of 1-deamino-[D-Tyr(Oethyl)2, Thr4, Orn8] vasotocin, an oxytocin antagonist, in animal models of uterine contractility and preterm labor: a new tocolytic agent. Am J Obstet Gynecol. 157 (4 Pt 1), 977-982 (1987).
- Demarest, K. T., et al. Profile of an oxytocin antagonist, RWJ 22164 for treatment of preterm labor in laboratory models of uterine contractility. American journal of perinatology. 6 (2), 200-204 (1989).
- Goodwin, T. M., et al. The pharmacokinetics of the oxytocin antagonist atosiban in pregnant women with preterm uterine contractions. Am J Obstet Gynecol. 173 (3 Pt 1), 913-917 (1995).
- Goodwin, T. M., et al. The effect of the oxytocin antagonist atosiban on preterm uterine activity in the human. Am J Obstet Gynecol. 170 (2), 474-478 (1994).
- Goodwin, T. M., et al. Treatment of preterm labor with the oxytocin antagonist atosiban. American journal of perinatology. 13 (3), 143-146 (1996).
- Romero, R., et al. An oxytocin receptor antagonist (atosiban) in the treatment of preterm labor: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with tocolytic rescue. Am J Obstet Gynecol. 182 (5), 1173-1183 (2000).
- Norstrom, A., Andersson, A., Vilhardt, H. Contractile effect of oxytocin and 1-deamino-1-carba-2-tyrosine (0-methyl)-oxytocin in myometrial tissue from non-pregnant and term pregnant women. Acta Endocrinol (Copenh). 122 (5), 566-568 (1990).
- Atke, A., Vilhardt, H. Uterotonic activity and myometrial receptor affinity of 1-deamino-1-carba-2-tyrosine(O-methyl)-oxytocin. Acta Endocrinol (Copenh). 115 (1), 155-160 (1987).
- Hunter, D. J., Schulz, P., Wassenaar, W. Effect of carbetocin, a long-acting oxytocin analog on the postpartum uterus. Clin Pharmacol Ther. 52 (1), 60-67 (1992).
- Moraitis, A. A., Cordeaux, Y., Charnock-Jones, D. S., Smith, G. C. The Effect of an Oxytocin Receptor Antagonist (Retosiban, GSK221149A) on the Response of Human Myometrial Explants to Prolonged Mechanical Stretch. Endocrinology. 156 (10), 3511-3516 (2015).
- Al-Qahtani, S., et al. Diabetes is associated with impairment of uterine contractility and high Caesarean section rate. Diabetologia. 55 (2), 489-498 (2012).
- Arrowsmith, S., Neilson, J., Bricker, L., Wray, S. Differing In Vitro Potencies of Tocolytics and Progesterone in Myometrium From Singleton and Twin Pregnancies. Reprod Sci. 23 (1), 98-111 (2016).
- Arrowsmith, S., Quenby, S., Weeks, A., Burdyga, T., Wray, S. Poor spontaneous and oxytocin-stimulated contractility in human myometrium from postdates pregnancies. PloS one. 7 (5), e36787 (2012).
- Arrowsmith, S., Robinson, H., Noble, K., Wray, S. What do we know about what happens to myometrial function as women age? J Muscle Res Cell Motil. 33 (3-4), 209-217 (2012).
- Quenby, S., Matthew, A., Zhang, J., Dawood, F., Wray, S. In vitro myometrial contractility reflects indication for caesarean section. BJOG. 118 (12), 1499-1506 (2011).
- Turton, P., et al. A comparison of the contractile properties of myometrium from singleton and twin pregnancies. PloS one. 8 (5), e63800 (2013).
- Zhang, J., Bricker, L., Wray, S., Quenby, S. Poor uterine contractility in obese women. BJOG. 114 (3), 343-348 (2007).
- Higgins, C. A., et al. Maternal obesity and its relationship with spontaneous and oxytocin-induced contractility of human myometrium in vitro. Reprod Sci. 17 (2), 177-185 (2010).
- Crankshaw, D. J., O'Brien, Y. M., Crosby, D. A., Morrison, J. J. Maternal body mass index and spontaneous contractility of human myometrium in pregnancy. J Perinatol. 37 (5), 492-497 (2017).
- Luckas, M. J., Wray, S. A comparison of the contractile properties of human myometrium obtained from the upper and lower uterine segments. BJOG. 107 (10), 1309-1311 (2000).
- Chapman, N. R., Kennelly, M. M., Harper, K. A., Europe-Finner, G. N., Robson, S. C. Examining the spatio-temporal expression of mRNA encoding the membrane-bound progesterone receptor-alpha isoform in human cervix and myometrium during pregnancy and labour. Mol Hum Reprod. 12 (1), 19-24 (2006).
- Robson, S. C., Simpson, H., Ball, E., Lyall, F., Bulmer, J. N. Punch biopsy of the human placental bed. Am J Obstet Gynecol. 187 (5), 1349-1355 (2002).
- Popat, A., Crankshaw, D. J. Variable responses to prostaglandin E(2) in human non-pregnant myometrium. Eur J Pharmacol. 416 (1-2), 145-152 (2001).
- Arrowsmith, S., Neilson, J., Wray, S. The combination tocolytic effect of magnesium sulfate and an oxytocin receptor antagonist in myometrium from singleton and twin pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 789-e789 (2016).
- Crankshaw, D. J., Morrison, J. J. Methodology and pharmacological analysis of effects of uterotonic compounds in human myometrium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 205 (2), 155-e156 (2011).
- Di Giglio, M. G., et al. Development of a human vasopressin V1a-receptor antagonist from an evolutionary-related insect neuropeptide. Sci Rep. 7, 41002 (2017).
- Attah, A. F., et al. Ethnobotanical survey of Rinorea dentata (Violaceae) used in South-Western Nigerian ethnomedicine and detection of cyclotides. J Ethnopharmacol. 179, 83-91 (2016).
- Koehbach, J., et al. Oxytocic plant cyclotides as templates for peptide G protein-coupled receptor ligand design. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21183-21188 (2013).
- Taggart, M. J., Burdyga, T., Heaton, R., Wray, S. Stimulus-dependent modulation of smooth muscle intracellular calcium and force by altered intracellular pH. Pflugers Arch. 432 (5), 803-811 (1996).
- Luckas, M. J., Taggart, M. J., Wray, S. Intracellular calcium stores and agonist-induced contractions in isolated human myometrium. Am J Obstet Gynecol. 181 (2), 468-476 (1999).
- Parratt, J. R., Taggart, M. J., Wray, S. Functional effects of intracellular pH alteration in the human uterus: simultaneous measurements of pH and force. J Reprod Fertil. 105 (1), 71-75 (1995).
- Taggart, M., Wray, S. Simultaneous measurement of intracellular pH and contraction in uterine smooth muscle. Pflugers Arch. 423 (5-6), 527-529 (1993).
