Summary
Dit artikel wordt beschreven experimentele protocollen om te studeren ex vivo contracties van menselijke myometrium en hun toepassing in drugontdekking. Deze techniek wordt gebruikt voor verbetering van het inzicht van myometrial fysiologie en pathofysiologie alsmede over de farmacologische gegevens van roman onderzoek sondes valideren of drugs leidt.
Abstract
Ontdekking en karakterisering van nieuwe farmaceutische stoffen of biochemische sondes, is afhankelijk van robuuste en fysiologisch relevante assay systemen. We beschrijven de methoden voor het meten van ex vivo myometrium contractility. Deze test kan worden gebruikt om te onderzoeken factoren en moleculen betrokken bij de modulatie van myometrial contractie en bepalen hun excitatory of remmende acties, en dus hun therapeutisch potentieel in vivo. Biopten worden verkregen van vrouwen die een keizersnede levering met geïnformeerde toestemming. Fijne reepjes van myometrium zijn ontleed, geknipt en gekoppeld aan een transducer kracht binnen 1 mL orgel Baden superfused met fysiologische zoutoplossing oplossing bij 37 ° C. Strips ontwikkelen van spontane weeën binnen 2-3 h onder de ingestelde spanning en stabiel blijven voor vele uren (> 6 h). Strips kunnen ook worden gestimuleerd te contracteren, zoals door de endogene hormonen, oxytocine en vasopressine, waardoor de concentratie-afhankelijk van contractie frequentie modulatie, kracht en duur, meer lijken contracties in arbeid. Vandaar, het effect van bekende en nieuwe drug leads kan worden getest op agonist-geïnduceerde en spontane weeën.
Dit protocol heeft specifiek details hoe deze test kan worden gebruikt om te bepalen van de potentie van bekende en nieuwe agenten door het meten van de effecten daarvan op verschillende parameters van contractie van de menselijke myometrial. We gebruiken de oxytocine- en V1a -receptorantagonisten, atosiban en SR49059 als voorbeelden van bekende stoffen die remmen van oxytocine en vasopressine-geïnduceerde contracties, en aantonen hoe deze methode kan worden gebruikt om te vullen en te valideren farmacologische gegevens verkregen op cel-gebaseerde testen op de steun van de Geneesmiddelenontwikkeling. De effecten van nieuwe agonisten in vergelijking met oxytocine en vasopressine kunnen ook worden gekarakteriseerd. Terwijl we het voorbeeld van de oxytocine gebruiken / vasopressine systeem, deze methode kan ook worden gebruikt om andere receptoren en ionenkanalen die een rol bij samentrekking van de baarmoeder en ontspanning spelen aan het begrip van menselijke uteriene fysiologie en pathofysiologie verder te studeren.
Introduction
Het doel van de drugontdekking is roman, krachtige, en zeer selectieve liganden die een therapeutische respons genereren door activeren of remming van cellulaire signaalroutes te produceren. Dit vereist een passende assay systeem waarin voor het testen van loodverbindingen met relevante, betrouwbare en robuuste resultaten1. Farmacologische technieken zoals ligand-receptor bindende en functionele vitrotests dienst vaak heterologe cel-gebaseerde systemen, ontworpen om overexpress receptoren die anders niet aanwezig2 zouden. Terwijl deze technieken waardevolle inzichten voor receptor farmacologie en vroege Geneesmiddelenontwikkeling bieden, kan een scenario waar in vivo niet overeen met de gegevens die zijn verkregen. Daarom is het belangrijk dat de farmacologische gegevens van cel-gebaseerde testen ook in fysiologisch relevante modellen worden gevalideerd.
Uteriene glad spierweefsel (myometrium) vormt de gespierde laag van de baarmoeder die verantwoordelijk voor weeën tijdens arbeid die uitwissen is en het verwijden van de baarmoederhals en het leveren van de foetus-3. Samentrekking van myometrium is spontaan; het vereist geen hormonale of nerveus input voor het contract van4. Weeën zijn teweeggebracht door spontane depolarisatie van de celmembraan van de myometrial die tot de opening van spanning bediende Ca2 leidt +-kanalen (L-Type) en de toestroom van Ca2 + in de cel-5. Calcium complexen met Calmoduline en activeert myosin lichtketting kinase, die op zijn beurt kinaseenzym myosin cross brug cyclus formatie met actine en contractie inschakelen. Ontspanning is meestal gemedieerd door ambtshalve phosphorylation van myosin door myosin fosfatase en een vermindering van de concentratie van Ca2 + via de extrusie van de cel-en/of vastleggen in de sarcoplasmic reticulum (SR)5,6 ,7.
Verschillende methoden zijn ontwikkeld om te bestuderen van de myometrial functie en dysfunctie, van in vivo interne en externe tocography en uteriene druk katheters, tot de generatie van getransformeerde of vereeuwigd cellen van myometrial oorsprong8 ,9,10,11,12. Terwijl cel cultuur systemen detecteren kunnen of een stof op cellulair niveau handelen kan, kunnen stroken van weefsels binnen orgel Baden worden gebruikt als instrumenten voor het meten van functionele reacties van hele weefsels op farmacologische reagentia. Het traditionele orgel bad is meestal een groot verwarmd glas kamer die geschikt voor bedrijf tussen 5 en 50 mL fysiologische zoutoplossing (PSS is). Strips binnen deze grote kamers kunnen doorgaans alleen beluchting met zuurstof en grote volumes van PSS. Stroken weefsel worden ontleed en geschorst in de vergaderzaal van het zwemwater en gekoppeld aan een kracht transducer die veranderingen in spanning, zoals tijdens een samentrekking meet. Reepjes myometrium van zowel mensen als dieren met inbegrip van, cavia13en14van de muis, rat15, konijn16e.a.17,18, door een aantal onderzoeksgroepen zijn gebruikt om te onderzoeken veel vragen met betrekking tot myometrial fysiologie en pathologie, met inbegrip van premature en disfunctionele arbeid. Bijvoorbeeld, myometrial strips zijn gebruikt om te identificeren factoren die regelen en wijzigen van de myogenic activiteit19,20,21, bepalen organel functie zoals de SR22, alsmede onderzoek naar modulatoren van ion kanalen23,24,25,26, pompen en warmtewisselaars27 om te bepalen van hun rol in de Fysiologie van de myometrial.
Deze ex vivo -techniek maakt het mogelijk voor de beoordeling van de prestaties van de samentrekking van weefsel en het directe effect van verschillende agenten op de parameters van de contractie te meten met inbegrip van contractie kracht (sterkte), frequentie en duur, evenals de integratie van deze waarden, voor het genereren van een index voor de totale hoeveelheid werk die gedaan (gemiddelde integraal kracht of oppervlak onder de kromme, AUC). Zoals de voorbereiding van de strip geïsoleerde weefsel een model voor meer dan één celtype vormt, kan de fysiologische respons van het hele weefsel worden gemeten. Het orgel bad en geïsoleerde weefsel strip vormen dus een nuttig instrument in het verstrekken van de brug tussen cel cultuur werk en hele dier / werkin vivo . Dus, op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling, de gevolgen van nieuwe agenten in termen van hun excitatory (d.w.z., stimulerende) of remmende (d.w.z., ontspanning) potentiële in-vivo kan worden nauwer beoordeeld. Deze techniek werd met succes gebruikt in de ontwikkeling van de oxytocine- en V-1a-(OTR en V1aR) receptor antagonist atosiban als een agent van de tocolytic te remmen van premature Arbeid contracties en vroeggeboorte te vertragen. De antagonist staat aanzienlijk te verminderen oxytocine (OT) in vitro testen van atosiban op myometrial strips gevonden-geïnduceerde contracties28,29,30. Vooral deze studies heeft bijgedragen tot het valideren van de translationeel waarde van atosiban en gegenereerd de proof-of-concept-gegevens die nodig zijn om het toekomen aan klinische proeven31,32,33,34 . Atosiban wordt nu veel gebruikt als de drug van keuze uit te stellen van arbeid in Europa. Soortgelijke proof-of-concept studies werden uitgevoerd voor de analoge carbetocin van oxytocine te tonen zijn therapeutisch potentieel bij het voorkomen van post-partum bloedingen35,36,,37. Andere loodverbindingen momenteel in ontwikkeling met deze test omvatten38 van de retosiban (GSK221149A) en nolasiban (gegevens ongepubliceerd). Deze methoden hebben ook met succes gebruikt om te vergelijken tussen patiëntengroepen39,40,41,42,43,44, 4547 46,,en onderzoek op intra-soorten verschillen.
Hier beschrijven we het gebruik van geïsoleerde ex vivo weefsel strips van zwangere menselijke myometrium binnen kleine (1 mL) op maat gemaakte orgel baden om te illustreren hoe deze methode kan worden gebruikt ter aanvulling en farmacologische gegevens verkregen op cel-gebaseerde testen valideren . Biopsieën zijn grotendeels afkomstig van vrouwen ondergaan vooraf arbeid electieve keizersnede (CS) levering zoals ze zijn geplande operatie en vandaar zijn gemakkelijker te plannen biopsie collectie, gemakkelijk toegang hebben tot het myometrium en weefsels zal niet zijn blootgesteld aan een uterotonic stimulerende middelen of skeletspierrelaxantia voorafgaand aan de operatie. Biopten kunnen echter ook worden verkregen bij vrouwen ondergaan ongeplande (nood) CS levering in arbeid mits er is voldoende tijd om volledig de toestemming van de patiënt. Meeste biopten worden verkregen tijdens de operatie uit de lagere uteriene segment op de site van chirurgische incisie, maar het is ook mogelijk te krijgen van monsters van het bovenste segment48,49. In enkele gevallen na vaginale levering, zijn punch biopten uit de placenta bed ook verkregen50. Echter, dit is niet de meest klassieke route en de hoeveelheid myometrial weefsel Teruggeplaatst is klein. Niet-zwangere myometrium kan worden verkregen van pre- of post-menopauzale vrouwen ondergaan hysterectomie voor goedaardige Gynaecologische aandoeningen. Een volledige dikte biopsie is bemonsterde na pathologie onderzoek, van de lagere corpus uit de buurt van de baarmoederhals, en myometrium is afkomstig uit het midden van de baarmoederwand, de serosal en baarmoederslijmvlies oppervlakken vermijden.
Protocol
Passende institutionele, ethische evaluatie bestuur en veiligheid goedkeuring voor experimenten met menselijke weefsels moet in de plaats voordat u gaat werken met elke menselijke weefsels. Alle werk beschreef hierin ontvangen goedkeuring van de lokale onderzoek ethische Commissie (Liverpool East, REC Ref 10/H1002/49) en institutionele evaluatie boards van de Research en Development afdeling, Liverpool Women's Hospital en Universiteit van Liverpool.
Opmerking: Alle biopsieën beschreven in dit protocol werden verkregen uit vrouwen ondergaan pre arbeid electieve CS levering bij Liverpool Women's Hospital en elke vrouw gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen.
1. oplossingen
- Bereiden van gemodificeerde Krebs fysiologische zoutoplossing oplossing (PSS) met de volgende samenstelling: 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl 1.2 mM MgSO4, 7,8 mM glucose, 10.9 mM HEPES en 2.0 mM CaCl2.
Opmerking: Het volume worden gemaakt wordt bepaald volgens het aantal weefsel Baden in werking, het debiet van het systeem (1 mL/min), en naar schatting van de duur van het experiment met inbegrip van evenwichtsinstelling en wassen. - Breng de pH op 7.4 met behulp van 4 M NaOH.
2. de weefsels bad instellen
- Verwarm het weefsel Bad systeem reservoir tot ~ 45 ° C met behulp van een recirculatie waterbad vastgesteldop 55-60 ° C.
Opmerking: Het waterreservoir in de basis van het apparaat wordt verhit tot ~ 45 ° C, die na het warmte-uitwisseling met de PSS in de peristaltische buis doornemen, zodat zorgt ervoor de PSS in het bad weefsel bij 37 ° C. Enige aanpassing temperaturen instellen kan nodig zijn om ervoor te zorgen dat de temperatuur van de PSS in het bad weefsel bereikt 37 ° C. Dit zal variëren afhankelijk van het apparaat gebruikt en debiet. - Handmatig overschakelen op een andere noodzakelijke apparatuur inclusief de versterker, data-acquisitie en registratiesysteem en zuig pompen.
- Plaats elke peristaltische feeder buis (één tube per bad) rond de rollen van het hoofd van de peristaltische pomp. Veilig met de behoudende stopt en door aanscherping van de compressie-cams en vergrendelen van toetsen rond de buizen. Plaats van de vrije uiteinden van de peristaltische feeder buizen 1 L verpakkingsgasssen van PSS en beginnen de pomp zodat het PSS aan voortdurend perfuse in de baden van het weefsel.
- Zorg ervoor de Zuig pompen zijn goed functioneert en dat het niveau van de oplossing in het bad constant, is zodanig dat de stroom in het bad gelijk is aan het tarief van de verwijdering. Het niveau van PSS in het bad weefsel kan worden aangepast door het manipuleren van de diepte van de zuiging buis in het bad met behulp van de modeler van klei.
- Kalibreren krachttransductors door het plaatsen van een bekende gewicht (equivalent aan 1 millinewton (mN, eenheid van geweld)) op de transducer haak en opname van de uitwijking gedetecteerd door de acquisitie software.
Opmerking: Waarden kunnen worden aangepast in de software zodanig dat de waarden worden vastgelegd, worden automatisch geconverteerd naar mN ontkenning van de noodzaak om uit te voeren van eventuele verdere conversies tijdens de analyse. Kalibratie van krachttransductors moet worden uitgevoerd voordat weefsel montage.
3. de weefsels voorbereiding en dissectie van Strips
- Biopten van zwangere menselijke myometrium (1-2 cm3) verzamelen bij CS na de bevalling van de baby en de placenta. Verkrijgen (typische) volledige dikte biopsieën waarin zowel de perimetrium (buitenste sereus vlies laag van de baarmoeder) en de decidua (binnenste laag van de baarmoeder) aanwezig zijn. Gebruik alleen myometrial weefsel (centrale spier laag). Zie figuur 1A-B.
- Verwijderen (essentieel) decidua en een aanhangend foetale membranen (indien aanwezig) als deze weefsels zijn bekend voor de productie van stoffen die myometrial contractility kunnen veranderen.
Opmerking: In de chirurgie, monsters worden geplaatst in Hanks evenwichtig zout oplossing (HBSS) of vers PSS en opgeslagen bij 4 ° C. Ideaal is dat de weefsels moeten worden gebruikt binnen 12-16 h van chirurgie, maar studies hebben aangetoond geen afbreuk te doen aan contractility na 18 h van collectie met opslag bij 4 ° C51. Passende controles moeten worden uitgevoerd om te bevestigen weefsel levensvatbaarheid en functie na langdurige opslag bij 4 ° C. De monsters hier zijn genomen vanaf de bovenrand van de lagere uteriene segment incisie site en niet vanaf het bovenste segment. De segmenten van het boven- en ondergrenzen van de baarmoeder is aangetoond dat het contract ook48, dus lagere segment biopten worden beschouwd als een goede weerspiegeling van het bovenste segment myometrial activiteit.
- Verwijderen (essentieel) decidua en een aanhangend foetale membranen (indien aanwezig) als deze weefsels zijn bekend voor de productie van stoffen die myometrial contractility kunnen veranderen.
- Voorbereiden van de dissectie gebied en de vereiste instrumenten waaronder: grote dissectie schaar, kleine Vannas ontleden schaar, twee ontleden pincet, dissectie pinnen en aluminium weefsel clips, rond een dissectie Microscoop met zowel vaste en zoom vergroting.
- Plaats de biopsie monster op een schotel duidelijk op silastic gebaseerde dissectie (Zie Tabel van materialen) gevuld met PSS en zorgvuldig oriënteren de biopsie zodat de sereus vlies en decidua randen worden geïdentificeerd figuur 1B.
- Gebruiken pinnen ter beveiliging van de biopsie aan de basis van de schotel. Zorg ervoor dat het weefsel gehydrateerd met PSS gedurende het proces van de dissectie blijft.
- Handmatig overschakelen op de Microscoop lichtbron en inspecteren van het weefsel onder de Microscoop op 10 x vergroting te identificeren van de regio's van myometrium vrij van littekenweefsel, sereus vlies, decidua en een aanhangend foetale membranen indien aanwezig.
- Uitvoeren van botte dissectie gebruiken om grote dissectie schaar te scheiden van de twee lagen van de aangrenzende weefsel, waaruit twee vliegtuigen of bladen van spier.
Opmerking: Het is vaak gemakkelijker te vinden een klein zakje tussen de lagen van het weefsel om te beginnen met de scheiding maar zorg moet worden genomen om te voorkomen dat kleine schepen aan de rand van de biopsie zoals zij kunnen worden verward met 'zakken'. - Plaats ontrafeling van pinnen op elke hoek van het weefsel om het te beveiligen. Inspecteer de bladen van de spier op zoek naar regio's van de spier met vezels parallel lopen.
Opmerking: Regio identificatie kan worden geholpen door de richting van de kleine haarvaten zoogdierlevercellen door het weefsel te volgen. Zachte trekken aan de rand van het weefsel kan ook helpen identificeren van de richting waarin de vezels reist. - Stroken weefsel weggesneden ~ 2 mm breed x 8 lengte mm x 1 mm dik langs de longitudinale as uitgelijnd met de richting van de vezels van de spier met behulp van kleine dissectie schaar.
Opmerking: Zorg moet men zich alleen houdt het weefsel door de eerste gesneden rand om schade te voorkomen. - Herhaal het proces om te ontleden het aantal vereiste stroken voor het experiment.
- Elke strip pin aan beide uiteinden rechtzetten en veiligste tot de schotel, over stretch niet te verzorgen van het weefsel.
- Koppelen van aluminium weefsel clips aan elk uiteinde, zodat het weefsel tussen hen is ~ 5 mm lang en zorgvuldig weg gesneden alle overtollige weefsel (Figuur 1 c).
- Overbrengen naar een schone schotel gevuld met PSS klaar voor montage.
4. montage van de weefsels in de Baden
- De strips overbrengen in de experimentele weefsel Baden. Mount de strips horizontaal in plaats van verticaal (zoals in de traditionele orgel Baden) (figuur 2B).
- Sluit één uiteinde van elke strip door de clip aan de transducer van kracht, die de samentrekking van weefsel meet, en de andere een vaste haak beide in de vergaderzaal van het weefsel.
Opmerking: De capaciteit van het weefsel bad is ~ 1 mL die groot genoeg is om ervoor te zorgen dat de strips zijn volledig ondergedompeld in het bad. - Zorg ervoor de strips aan de basis van elke haak in het bad.
- De opnamesoftware niet openen door te dubbelklikken op het pictogram software.
- De opname voor elk kanaal zodanig aanpassen dat het is in de weergave in het venster kanaal.
- De Y-as schaal tussen 0-10 V (gelijk aan 0-10 mN post kalibratie) door rechts te klikken op de Y-as, selecteren 'schaal', en invoeren van minimale en maximale waarden van 0 en 10, respectievelijk lezen aanpassen. Selecteer 'OK'. Herhaal deze stappen voor elke opname kanaal.
- Druk op 'record' op de software om te beginnen van de live-opname.
Opmerking: Als de strips zijn niet beveiligd aan de basis van elke haak, kon ze glijden tijdens contractie die als een 'notch' op de opname verschijnen zal. De ingestelde spanning zal veranderen en hierdoor contracties na ontsporing kan verschillen. - Strekken het weefsel in elk bad door handmatig draaien van de micromanipulators gekoppeld aan elke transducer. Volg het weefsel van de opwaartse beweging van de basislijn op het scherm en draai de micromanipulators totdat de basislijn spanning 0.2 g (~ 2 mN bereikt) blijven.
Opmerking: Het weefsel zal onmiddellijk beginnen te ontspannen (aangegeven door een daling van de basislijn spanning), meestal het bereiken van een constante spanning van tussen 0,5 – 1 mN. Deze gedefinieerde spanning is geoptimaliseerd voor weefsel strips van deze omvang in onze experimentele omstandigheden. Als andere formaat weefsels worden gebruikt moeten, is het essentieel dat de juiste lengte-spanning relatie onderzoeken worden uitgevoerd om te optimaliseren de rust kracht worden toegepast. - Toestaan dat de tissues aan equilibreer gedurende ~ 2 h tot spontane weeën ontstaan.
Opmerking: een kleine kanteling in basislijn spanning wordt meestal waargenomen en is een goede indicatie van de levensvatbaarheid van het weefsel en dat zij zullen contractiele.
5. de uitdaging van het weefsel met 40 mM kalium (hoge K+)
- Als er geen spontane weeën optreden na 2U van montage, daag de strips met een hoog kalium zout oplossing waarin door isosmotic vervanging van NaCl KCl kalium is verheven tot 40 mM. Voor de hoge K+, voeg de volgende (in mM): 119.6 NaCl, 40 KCl, 1.2 MgSO47,8 glucose, 10.9 HEPES en 2.0 CaCl2.
Opmerking: In de gladde spieren zoals myometrium, toepassing van hoge K+ veroorzaakt contractie door spanning geëxploiteerd calcium kanalen leidt tot maximale toestroom van Ca2 + in de weefselcellen niet indirect te openen. Hoge K+ kan dus worden gebruikt als een maatregel om te testen de algemene index van weefsel integriteit, alsmede het bereiken van een zekere mate van maximale weefsel reactie.- Plaats de buis van de feeder voor het bad met de strip te worden aangevochten in een laboratorium fles met hoge K+ voor 1-2 min.
- De feeder buis terugkomen in de container van de PSS.
- Indien een reactie tot hoge K+ is bereikt, blijven volgen van de strip voor een verdere 1 h. Als er geen contractiele antwoord tot hoge K+ is of geen spontane activiteit ontlokte post hoge K+ respons, gooi de strip.
Opmerking: De experimentator moet ook bewust van de dode ruimte (tijd genomen voor oplossing te bereiken van het bad weefsel) in de buis van de feeder voor de beoordeling van de reactie op de hoge K+. Dit duurt 2-3 min en debiet zal afhangen. - Om ervoor te zorgen volledige wegspoeling van de hoge K+ van het bad en feeder buizen, die invloed kunnen zijn op latere manoeuvres, wachten tot spontane weeën weer in pre hoge K+ amplitude voordat u doorgaat met het experiment verder.
6. het testen van de effecten van bekende en nieuwe verbindingen op Myometrial contractie
Opmerking: Experimenten voor het testen van het effect van nieuwe medicijnen en reagentia op myometrial functie kunnen worden uitgevoerd op spontane (figuur 3A) of een agonist-gestimuleerd contracties (figuur 3B-C). Voor agonist gestimuleerd contracties, OT of arginine vasopressine (VP) wordt toegevoegd aan de PSS tot een concentratie van 0,5 nM en gedurende het gehele experiment (figuur 3B-C) wordt gebruikt. De concentratie van OT is geoptimaliseerd voor deze bepaling, aangezien deze weeën die phasic in de natuur40,52biedt. Concentraties van agonisten groter dan dit tot langdurige, aanhoudende (tonica) contracties (Zie Ref41,44 voor voorbeelden leiden kan) onder die het effect van verschillende agenten is moeilijk in te schatten en het experimentele tijdsbestek moet worden aangepast aan de verhoogde duur van individuele contracties en vermindering in frequentie sterk uitgebreid. In dit voorbeeld experiment, OT of VP is toegevoegd ter stimulering van weeën dus dat antagonisme door bekende OTR en V-1aR antagonisten, atosiban en SR49059, of door onze nieuwe compound [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT), kan worden beoordeeld.
- Voorbereiden van de concentraties van de test verbinding(en) in PSS (met of zonder 0,5 nM OT/VP) verdund met een minimum van 1/1000 verdunning, zorgen voor een breed scala van concentraties zijn opgenomen zoals die doen niet het uitlokken van een reactie aan concentraties die hoger zijn dan de maximale reactie.
- Bereid een gelijkwaardige reeks verdunningen waarbij gelijke hoeveelheid voertuig (b.v., dimethylsulfoxide, acetonitril of gedestilleerd water);
Opmerking: Het is vaak makkelijkst te bereiden de hoogste concentratie, dat wil zeggen, 10-6 M (uit een voorraad van 10-3 M) en voer seriële verdunningen langs een logaritmische schaal (bijvoorbeeld10-6-10-10 M). Het volume te stellen is afhankelijk van het moment van de aanvraag, debiet van het apparaat, en aantal strips worden onderzocht, bijvoorbeeldvoor de toepassing van een 25 min van reagens en een debiet van 1 mL/min, een minimum van 25 mL voor elke concentratie per weefsel bad is requir Ed. - De eerste concentratie van samengestelde toepassen door het weefsel door het plaatsen van de buizen van de feeder voor het weefsel bad in een fles laboratorium met het reagens in de gewenste concentratie.
Opmerking: Dit moet gebeuren zodra een gestage basislijn van spontane of OT/VP-gestimuleerd contracties is bereikt. - Breng de corresponderende voertuig controle oplossing in een tweede bad op dezelfde manier.
- Registreren de tijd van toepassing (d.w.z., wanneer de feeder buis werd gewijzigd).
- Herhaal dit proces voor elke concentratie door het opeenvolgend plaatsen de feeder-buis in de fles laboratorium met de volgende concentratie in de serie en herhaal tot alle concentraties zijn toegepast.
De toepassing voor elke concentratie kan tussen 15 en 30 min maar moet consistent voor elke concentratie toegepast en tussen experimenten. Die een OT of VP-gestimuleerd contracties hebben de neiging te verlangen van de langere perioden van de toepassing (bijvoorbeeld, 25 min) ter verantwoording voor de vermindering in de frequentie van de contractie waargenomen onder stimulatie. Voorbereidende experimenten om te bepalen van de optimale toepassing tijd moeten vooraf worden uitgevoerd met elke nieuwe reagens wordt getest. - De feeder buis terugkomen door PSS (met of zonder OT/VP) te wassen.
- Klik op 'stop' ter afsluiting van de live-opname. Onmiddellijk de gegevens een geschikte map opslaan en exporteren van een versie als een '.mat' bestand.
7. de gegevensanalyse
Opmerking: Data capture en analyse kan uitgevoerd worden door een willekeurig aantal commercieel beschikbare data acquisitie softwarepakketten. Zie Tabel van materialen voor meer informatie over software die in dit protocol wordt gebruikt. Voor een nauwkeurige beoordeling van contractiele activiteit, de parameters van de weeën te meten omvatten: i) amplitude van contractie, ii) frequentie van contractie, iii) duur van contractie, en iv) gemiddelde kracht integraal (Figuur 4). Gemiddelde kracht integraal komt overeen met het oppervlak onder de kromme contractie en kan daarom een index voor de totale hoeveelheid werk gedaan door de strook weefsel binnen een bepaalde tijd. Sommige of alle van de parameters kunnen worden geanalyseerd. Als een minimum, is het aanbevolen dat de gemiddelde integraal kracht en amplitude van contractie geanalyseerde53. In de hier beschreven proeven we veranderingen in amplitude van contractie en gebied onder de curve gemeten.
- The.mat bestand importeren door de analysesoftware.
- De kolom die overeenkomt met de X-as aan de experimentele tijd, rekening houdend met de bemonsteringsfrequentie van de interval aanpassen. Experimenten worden meestal geregistreerd bij 10 Hz overeenkomt met 10 monsters/s of 600 monsters/min.
- De gegevens als het een gebruik van X-Y coördineren grafiek uitzetten "Plot | De functie van de regel".
- Nul van de basislijn van contractie met behulp van de functie 'vertalen verticale' op de software.
- Selecteer een periode passende controlemaatregelen.
Opmerking: Dit is de periode onmiddellijk voorafgaand aan de aanvraag van de eerste concentratie van regent maar gelijk aan de duur van de toepassing van het reagens (figuur 4A). Bijvoorbeeld, als de toepassing van de drug X 25 min, gebruiken de 25 min voorafgaand aan de eerste aanvraag van drug X als het besturingselement. - Afgelezen aan de Y-as, noteer de amplitude (kracht) van samentrekking op het max hoogtepunt van elke contractie optreedt in het tijdsbestek geselecteerd en een gemiddelde waarde berekenen.
- De duur van samentrekking op 50% van deze maximale piek meten door lezing uit de X-as aan het begin en einde van elke contractie en opnemen van een gemiddelde waarde.
- Het aantal contracties die zich voordoen in het tijdsbestek voor het genereren van een waarde voor de frequentie.
- Gebruik de 'integratie'-functie voor het berekenen van de AUC (in eenheden van willekeurige a.u.) voor de geselecteerde periode.
Opmerking: Als u opnemen nauwkeurig AUC, het is essentieel dat de basislijn van de weeën is ingesteld op nul op de Y-as. - Opeenvolgend doorlopen elk van de concentraties en opnemen van de verschillende parameters van contractie.
- De gegevens van het besturingselement instellen als 100% en uitdrukkelijke de verkregen onder elke concentratie van reagens als een percentage van deze waarden controleren d.w.z., waarden voor stimulatie moet > 100% terwijl ontspanning moet < 100%.
Opmerking: Normaliseren van de gegevens op deze manier mag de gebruiker wilt vergelijken resultaten over strips en farmacologische behandelingen. - Herhaal voor elk experiment en de gegevens overbrengen naar een grafisch pakket.
Representative Results
Met behulp van dit model, kan het antwoord op verschillende agonisten en antagonisten van contractie alsmede nieuwe agenten van bekende of onbekende functie worden bestudeerd en gekwantificeerd. Standaard farmacologische parameters zoals EG50 en IC50 waarden kunnen worden berekend wanneer de reagentia worden gebruikt in een breed scala van concentraties, bijvoorbeeld, 10-5–10-9 M en toegevoegd in toenemende concentraties langs een logaritmische schaal.
Oxytocine Receptor Antagonist concentratie-reactie experimenten
In dit experiment, gepaarde stroken van menselijke myometrium waren te knippen zoals hierboven beschreven afgebeeld in Figuur 1, gemonteerd in de baden van weefsel, zoals afgebeeld in Figuur 2, en mogen voor de productie van stabiele contracties van gelijke amplitude equilibreer en frequentie. Strips werden vervolgens blootgesteld aan de endogene OTR-agonist, OT (0,5 nM) ter stimulering van weeën. Na een periode van stabiele activiteit onder OT (meestal 45 min), werd atosiban toegepast op een strip in de toenemende concentraties langs een logaritmische schaal (10-9–10-6 M). De tweede strip werd achtergelaten in OT alleen zo-besturingselement tijd. Een voorbeeld van de reactie op atosiban kan worden gezien in figuur 5A. Nemen de weeën die onmiddellijk voorafgaat aan de eerste concentratie van atosiban als besturingselement (100%), werd de amplitude en de AUC voor elke concentratie toegepast berekend zoals aangegeven in Figuur 4. Voor tijd-control-experimenten, werd het tijd-equivalent van experimentele manoeuvres gemeten. De gegevens werden vervolgens uitgezet en curven uitgerust met de niet-lineaire regressiefunctie in een grafische softwarepakket (figuur 5B-C). Op het gebied van de berekening van de remmende werking, werd de relatieve sterkte van atosiban berekend door het meten van de IC-50 die de concentratie waardoor de helft maximale (50%) remmende reactie is. Hetzelfde kan worden gedaan voor agonisten of stimulatoren van contractie. In dit geval de potentie van de stof is berekend op basis van de EG-50 (de concentratie die halve maximale stimulerend reactie veroorzaakt).
Onderzoek naar de reactie van nieuwe verbindingen en het testen van hun selectiviteit Receptor
We gebruikten dit fysiologisch relevante model van ex vivo de contracties van de menselijke myometrial te onderzoeken de antagonistische effecten van een nieuw samengestelde verbinding, [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]) op contracties gestimuleerd met ofwel de inheemse V1a R-agonist, VP of de inheemse OTR-agonist, OT. We gebruikt deze test om te valideren van de selectiviteit van de receptor van [D-Arg8] INT, die eerder had vastgesteld door farmacologische cel-gebaseerde methoden om een antagonist op de V1aR maar niet op de OTR-54.
In dit experiment, werden menselijke myometrial strips blootgesteld aan 0,5 nM VP of 0,5 nM OT voor ongeveer 1 h ter stimulering van weeën, zoals weergegeven in Figuur 3, voorafgaand aan onze nieuwe samengestelde [D-Arg8] INT in toenemende concentraties (figuur 6A en figuur toe te voegen 6 C). Dit werd vervolgens vergeleken met de verkrijgbare, bekende V1aR antagonist, SR49059 (figuur 6B). Figuur 6A illustreert concentratie afhankelijke dalingen in menselijke myometrial VP-gestimuleerd contracties met toenemende concentraties van INT. [D-Arg8] De gegevens voor amplitude van contractie en AUC voor elke concentratie worden samengevat in figuur 6Aii-iii. Het effect is vergelijkbaar met dat weergegeven voor toenemende concentraties van het bekende V1aR-remmer, SR49059, getoond in figuur 6Bi-iii. De selectiviteit van [D-Arg8] INT naar de V1aR maar niet naar de OTR wordt aangetoond door het feit dat [D-Arg8] INT niet daling menselijke myometrial contracties die hebben zijn gestimuleerd met OT (Figuur 6 c) niet als amplitude en AUC bleef stabiel (figuur 6Cii-iii).
Figuur 1: menselijke myometrial biopsie dissectie. (A) A diagram van de menselijke baarmoeder weergegeven: het weefsel van de drie lagen waaruit de baarmoederwand. De binnenste laag is het endometrium (decidua in zwangerschap, rode pijl), de middelste laag is het myometrium (gespierde laag, zwarte pijl), die contracties genereert en de buitenste laag is de perimetrium (of serosal membraan, blauwe pijl) welke vormen een beschermende vacht rond de baarmoeder. De regio van belang zijn voor de bemonstering van de biopsie is afgebeeld door de zwarte rechthoek. De biopsie van een voorbeeld van een zwangere vrouw genomen tijdens de keizersnede wordt getoond in (B) met de decidua en myometrial lagen gemarkeerde (sereus vlies niet zichtbaar). Het is essentieel dat de lagen verschillende weefsel worden aangeduid zodat stroken myometrium correct voor experimenten worden ontleed. Een voorbeeld-strip van myometrium die is ontleed en afgekapt wordt weergegeven in (C). Meestal zijn 2 – 6 stroken knippen en afgekapt zoals. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: multi organ Bad experimentele set up gebruikt voor het meten van de contracties van menselijke myometrium. (A) Strips van myometrium worden in kleine (1 mL) orgel geplaatst bad kamers geplaatst op de top van een verwarmde reservoir (i) en zijn superfused met fysiologische zoutoplossing oplossing (PSS) door middel van een peristaltische pomp (ii). Het reservoir wordt onderhouden op een ingestelde temperatuur door middel van een circulerende waterbad (iii). Elke strip is gekoppeld aan een kracht transducer (iv), die veranderingen in spanning tijdens contractie registreert. Dit wordt versterkt door een transbridge versterker (v) en omgezet in een digitaal signaal (vi), die is geregistreerd op een computersysteem (vii) de bijbehorende acquisitie software. (B) uitgebreide beeld van een orgel bad kamer met een strook van menselijke myometrium in situ (rode pijl), badend in de PSS met één uiteinde verbonden aan een kracht transducer en anderzijds aan een vaste haak. ()C) schematisch overzicht van de set-up. Weefsel kamers gevuld met PSS zijn voortdurend geperfundeerd met verwarmde PSS bij 37 ° C, die via warmte-uitwisseling met een verwarmde waterreservoir onder de Baden is (gehouden bij 45 ° C) en een circulerende waterpomp vastgesteld op 55 ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: agonist-gestimuleerd en spontane weeën van menselijke myometrium in vitro. Onder agonist-vrij, spontane weeën stabiel gedurende meer dan 3 uur van opname zonder een significant verlies van amplitude of gebied-onder-de-curve (AUC) (Aii, Aiii), blijven demonstreren de robuustheid van dit model voor het onderzoek naar de toepassing van verschillende agenten op spontane contractie. Na de oprichting van stabiele, spontane weeën, is 0,5 nM oxytocine (B, OT) of vasopressine (C, VP) toegevoegd aan de oplossing van de fysiologische zoutoplossing (PSS). Contracties onder stimulatie ook stabiel blijven voor een aantal uren zonder een significant verlies van contractie amplitude (Bii, Cii) of AUC (Biii, Ciii) waardoor het effect van verschillende contractiele agenten als onderzocht in het bijzijn van myometrial-agonisten. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Opmerking, voor agonist-gestimuleerd contracties (B, C), de controle-periode (100%) is genomen na de eerste 45 min voor toepassing van de agonist, zodra de contracties hebben gestabiliseerd. In alle gevallen waren stroken superfused met PSS bij 37 ° C, pH 7.4 (Reproduced van Clive Arrowsmith et al. 40 met toestemming van Reproductieve wetenschappen en Di Giglio et al. 54 met toestemming van Wetenschappelijke rapporten onder de creatieve gemeenschappelijke Open Access license). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: gegevensanalyse. (A) Een passende controlemaatregelen periode weergegeven in het rood werd bepaald door het selecteren van de contracties onmiddellijk voorafgaand aan de aanvraag van de teststof (Drug X). Deze periode van de controle is ook gelijk tijdig aan de toepassing van de Drug X (bijvoorbeeld40 min in dit voorbeeld). Zodra de gemeten waarden voor de periode van de controle worden ingesteld als 100%. Alle latere metingen zijn vervolgens uitgedrukt als een percentage van de controle. (B) er zijn 4 verschillende parameters van de krimp die kan worden gemeten: (i) de amplitude van contractie die meet contractie kracht (force, mN), (ii) frequentie van contractie die snelheid van contractie, (iii) duur van contractie meet die wordt gemeten bij halve maximale piek contractie, en (iv) gebied onder de curve (ook bekend als een kracht integraal, willekeurige eenheden) waardoor een maatregel van algemene werkzaamheden gedaan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: de antagonistische effect van atosiban op oxytocine-geïnduceerde contracties opnemen in menselijke myometrium. Zodra er spontane weeën ontstonden, werden contracties gestimuleerd met de oxytocine receptor agonist, oxytocine (OT). Contracties mochten te stabiliseren onder stimulatie voor een verdere 45 min. (A) de V1a en OT receptor antagonist, atosiban werd vervolgens toegepast in toenemende concentraties langs een logaritmische schaal (10-9-10-5M). De weeën tijdens de periode die voorafgaat aan de eerste concentratie van atosiban werden gemeten en als controle (100%). De activiteit onder elke latere concentratie werd gemeten en uitgedrukt als een percentage van de controle. Hetzelfde werd uitgevoerd voor strips blootgesteld aan OT alleen met behulp van de tijd-equivalent van experimentele manoeuvres. Gegevens werden uitgezet in grafische software: (B, C) Toon concentratieresponskrommen voor de antagonistische werking van atosiban (blauw) en in geval van verdunning van voertuig (grijs, tijdcontrole) op myometrial OT-geïnduceerde contractie amplitude en gebied onder de curve (AUC), respectievelijk. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) percentage van de amplitude en de AUC van controle activiteit (vóór de toepassing van atosiban). IC50 waarden werden vervolgens berekend die geven de concentratie waartegen de helft maximale remmende (50%) het antwoord op de amplitude van contractie en kracht integraal (AUC) is bereikt (Reproduced van Clive Arrowsmith et al. 40 met toestemming van Reproductieve wetenschappen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: testen van de selectiviteit van het effect en de receptor van een roman samengestelde op contractie van de menselijke myometrial. Na spontane weeën van menselijke myometrium werden opgericht, werden contracties gestimuleerd met de vasopressine receptor agonist, vasopressine (VP) (Ai, Bi) of de oxytocine receptor agonist, oxytocine (OT) (Ci). Het effect van [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]) en de verkrijgbare V1aR antagonist, SR49059 op contracties gestimuleerd door VP werd beoordeeld door toenemende concentraties van de stoffen toe te passen. Typische reacties zijn weergegeven in (Aien Bi). De bijbehorende geanalyseerd gegevens voor amplitude en gebied onder de curve (AUC) worden vermeld in (ii) en (iii), respectievelijk waar het effect heeft uitgedrukt als percentage van de controle activiteiten (100%). Zowel [D-Arg8] INT en de bekende V1aR antagonist, SR49059 veroorzaakt een dosis afhankelijke daling van de amplitude en AUC, ter ondersteuning van de rol van [D-Arg8] INT als een V1aR receptor antagonist in menselijke myometrium. Daarentegen [D-Arg8] INT beïnvloedde niet contracties gestimuleerd door OT (Ci-iii), dus ook naar onze bevindingen uit cellen gebaseerd, INT [D-Arg8] toont ook selectiviteit naar de V1aR in menselijke myometrium (gegevens opgenomen van Di Giglio et al. 54 met toestemming van Wetenschappelijke rapporten onder de creatieve gemeenschappelijke Open Access license). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Terwijl de meeste Geneesmiddelenontwikkeling is bedoeld voor de behandeling van menselijke aandoeningen, meest fundamenteel onderzoek gebeurt voornamelijk in dierlijke weefsels. Hier beschrijven we methoden voor het onderzoek naar ex vivo contracties van menselijke myometrium chirurgie die kan worden gebruikt om aan te pakken een aantal belangrijke vragen aan baarmoeder gerelateerde fysiologie en pathologie, evenals voor het valideren van functionele reacties verkregen bekende en nieuwe farmacologische agentia op de steun van de Geneesmiddelenontwikkeling. In het bijzonder, wijzen wij het gebruik van deze test om te onderzoeken de antagonistische reactie van een bekende OTR en V1aR concurrerende antagonist, atosiban op zwangere myometrial OT-geïnduceerde contracties, evenals over het bepalen van de reactie en de receptor selectiviteit van een nieuw ontwikkelde selectieve V1aR antagonist, INT. [D-Arg8] We laten zien dat belangrijke farmacokinetische parameters zoals EG50 en IC50 kunnen worden berekend, die goed met de farmacologie van cel-gebaseerde gegevens uitlijnen.
Gelijktijdig gebruik van meerdere strips voorziet in directe vergelijking van meerdere agent effecten, competitie experimenten met antagonisten en passende tijd en voertuig besturingselementen. Als stroken zijn vaak bereid in groepen van 2, 4 of 8, biedt deze techniek gematigde doorvoer, waardoor het testen van 2 – 4 verbindingen bij 6-8 (cumulatief) concentraties (per biopsie). Deze methode biedt ook realtime-gegevens, zodat de effecten kunnen snel worden beoordeeld en protocollen kunnen worden aangepast. Bovendien, deze techniek kan worden gebruikt voor het testen van elke verbinding van belang en heeft met succes gebruikt door een aantal onderzoeksgroepen die gericht zijn op myometrial fysiologie en in Geneesmiddelenontwikkeling. Naast het analyseren van zuivere verbindingen zoals beschreven in dit document, de uteriene contractility model is ook geweest en kan met succes worden gebruikt om het scherm voor nieuwe uterotonic verbindingen van mengsels, zoals kruidenpreparaten van traditionele geneeskunde7 , 55 , 56.
Hoewel dit model technisch robuust is en goede reproduceerbaarheid toont, het heeft wel enkele beperkingen: dissectie moeilijk kan zijn voor wie niet vertrouwd met het weefsel of met behulp van apparatuur van de dissectie, dus nieuwe gebruikers zal enige tijd nodig voor het optimaliseren van weefsel voorbereiding en protocollen. Ook opgemerkt moet worden dat menselijke myometrium verschilt aanzienlijk uiterlijk veel op andere modellen zoals de rat en muis. Meeste knaagdier baarmoeders zijn samengesteld uit twee baarmoeder horens van de buis-achtige, elk compleet met een eierstok aan de ene kant en aan de baarmoederhals. Elke hoorn heeft duidelijk omschreven lengterichting en spier lagen, die gemakkelijk kunnen worden gescheiden op dissectie terwijl de verschillende vezels typen in menselijke myometrium vaak met elkaar verweven zijn vormen een 'mesh'. Daarnaast zijn de profielen van de contractie van menselijke myometrium heel anders dan knaagdieren. Het meest opvallend, zijn contracties in menselijke myometrium minder frequent maar langer in duur. Experimentele termijnen voor het werken met menselijke myometrium zijn daarom vaak veel langer dan knaagdieren modellen. Verschillen in de receptor expressie tussen soorten kunnen ook bijdragen tot heel grote verschillen in reacties op agonisten en dit moet niet vergeten als extrapolatie van de resultaten over soorten.
Er zijn ook aantal stappen moeten rekening houden met het maximaliseren van output van dit systeem. Kritische stappen omvatten behoud van weefsel levensvatbaarheid zoals verzorgen bij het verwerken van weefsels Voorkom geen onnodige schade tijdens dissectie of bij het monteren. Een geschoold oog is vereist om te ontleden fijne reepjes van baarmoeder spier, om ervoor te zorgen de oriëntatie van de spiervezels in de lengterichting volgend op het vlak van het weefsel, alsmede het vermijden van litteken weefsels, decidua en kleine vaartuigen. Steun oriëntatie doeleinden zodra het model in het laboratorium wordt, is het mogelijk een tag (zoals kleine chirurgische stitch) op het moment van collectie toevoegen aan één kant van de biopsie af te bakenen de serosal rand van de decidual rand.
Weefsels moeten bij een gestage 36 – 37 ° C worden bewaard tijdens de experimenten omdat weefsel functie onderhevig aan temperatuurschommelingen is. Dit kan worden bereikt met een robuuste airconditioning unit binnen het laboratorium. Constante perfusie van verwarmde PSS zorgt ervoor dat de temperatuur en het afboeken van afvalproducten van contractie. Temperatuur binnen de orgel-baden kan worden gewijzigd door debiet wijzigen of de temperatuur van het water bad direct aan te passen. De grootte van de kleine bad in vergelijking met traditionele 5-50 mL Baden zorgt voor een relatief snelle omzet van PSS en wegspoeling van reagentia. Het verkleinde orgel-bad vermindert zoals hier beschreven, ook de omvang van de PSS en reagentia van belang nodig, dus het minimaliseren van kosten en sparen kostbare, nieuw ontwikkelde chemicaliën. Bovendien, als gevolg van de grootte van het klein bad en met behulp van een op basis van HEPES buffer, vereist dit systeem niet oxygenatie bvborrelen van de PSS met carbogen. Standaardisatie van de spanningen die zijn toegepast op de strips is ook belangrijk. Dit moet voor strips van deze omvang (5 x 2 x 1 mm), ongeveer 2 mN (equivalent aan ~0.2 g). Alternatieve methoden omvatten de toepassing van een hoog kalium-oplossing voor het opwekken van maximale contractie en die zich uitstrekt tot de helft van deze maximale contractie. Hierbij moet echter worden opgemerkt, dat spanning toegepast in vivo kunnen verschillen.
De belangrijkste uitdagingen omvatten het verkrijgen van weefsels van menselijke proefpersonen, maar hoewel belasten, menselijke weefsels duidelijk vertegenwoordigen de meest fysiologisch relevante (en lonende) model voor het bestuderen van de samentrekking van de baarmoeder in menselijke ziekte en drug ontdekking. De geïsoleerde weefsel stroken echter niet noodzakelijkerwijs als weefsel in vivo hetzelfde doen zoals ze vrijgesteld bijvoorbeeld van hormonale zijn en nerveus die input, hoewel niet essentieel voor contractie, zal het moduleren van contracties in vivo. Deze bepaling echter biedt de mogelijkheid om te analyseren myometrial contracties op een gecontroleerde manier, gescheiden van dergelijke invloeden. Het staat ook voor het effect van factoren zoals hormonale controle van contractie (bijvoorbeeldvia OT, VP, prostaglandines, enz.) moeten worden onderzocht, verstrekken aanwijzingen voor de regulering van de myometrial functie. Weefsels zijn verkregen van verschillende vrouwen, is er natuurlijk enige variatie in de spontane contractiele profielen tussen exemplaren. Vandaar is het vaak nodig voor het uitvoeren van experimenten op een groot aantal (~ n = 10) van de monsters naar het minimaliseren van de variatie in sommige datasets53. Dit is het belangrijkste bij het vergelijken van contractiele activiteit tussen verschillende patiëntengroepen. Normaliseren van de reactie van agonisten en antagonisten besturing van activiteit (d.w.z., uitdrukken als percentage van de activiteit van de controle of hoge K+) vermindert sommige van deze variatie. Daarnaast Verklein Inter strip variatie en kunnen gegevens worden genormaliseerd om te strippen cross doorsnede door het meten van hun lengte en gewicht post experimenten41. Dit is vooral handig bij het vergelijken van contractie patronen tussen verschillende patiëntengroepen.
Beperkingen van deze techniek bevatten ook toegang tot vers weefsels waarvoor goede werkrelatie met ziekenhuispersoneel, vooral theater personeel en die betrokken zijn bij het proces van de toestemming. Ethische machtigingen van de lokale onderzoek ethisch comité en Institute of ziekenhuis review board moeten ook op zijn plaats. Verzameling van menselijke myometrium hoogstwaarschijnlijk taakuit CS levering, bij de donor is een operatie ondergaan. De biopsie is overgenomen uit de dezelfde site van de uteriene incisie gemaakt voor het leveren van de baby en daarom de patiënt hoeft niet aan een extra procedures onderworpen. Theater personeel en de chirurg die de biopsie uitvoert moeten bewust worden gemaakt van het latere gebruik van de weefsels en die zij niet mogen worden geplaatst in kleefpoeders oplossingen dergelijke wat verzenden naar een departement van de pathologie. De lange experimentele tijdsbestek is een andere overweging. Experimenten met menselijke weefsels nemen vele uren (meestal > 6 h) (in tegenstelling tot 2 – 3 h voor een soortgelijk experiment in rat of muis baarmoeder), als gevolg van de tragere frequentie van contractie en de 2-3 h vertragingstijd tussen weefsel montage en instelling van spontane contracties. Echter, zoals we hebben aangetoond, menselijk weefsel contracties zijn robuust, en wanneer kan het contract voor vele uren zonder significante vermoeidheid40tot stand gebracht.
Dit systeem maakt het ook mogelijk andere uitdagingen van in vivo werk worden overwonnen met inbegrip van de mogelijkheid om te testen van farmaceutische reagentia op zwangere weefsel. Deze techniek kan gemakkelijk worden geëxtrapoleerd naar andere soorten waaronder de muis waarbij de eerste resultaten kunnen worden bevestigd voordat verdere in hele dierproeven. Gecontroleerde veranderingen in temperatuur, samenstelling van het superfusate (PSS), en pH kan gemakkelijk gemaakt worden aan verschillende scenario's in vivo nabootsen en analyseren het effect van deze wijzigingen op samengestelde gedrag. De fundamentele beginselen van de meting isometrische spanning in myometrial strips kunnen ook worden uitgebreid tot de gelijktijdige wijzigingen in intracellulair calcium concentratie of pH meten door het gebruik van fluorescerend Ca of pH (H+) indicatoren en apparatuur op te sporen en record fluorescentie57,58,59,60.
Over het geheel genomen de menselijke myometrium vertegenwoordigt een robuust en fysiologisch relevante model te karakteriseren en valideren van nieuwe therapeutische stoffen in drugontdekking — zowel zuivere stoffen en mengsels. We hebben voorbeelden gegeven van het gebruik ervan in drugontdekking met betrekking tot het OT/VP-systeem en gericht op OTR en V1eenR antagonisten om te laten zien hoe dit model kan worden gebruikt om te bepalen van samengestelde werkzaamheid en potentie op gedefinieerde doelen en valideren ligand selectiviteit. Echter, het moet niet vergeten dat deze techniek kan worden gebruikt om te studeren geen doelstelling van belang of traject leidt tot myometrial contractie (of ontspanning), evenals op de steun van de drugontdekking van nieuwe doelstellingen en trajecten en verder ons begrip van myometrial Fysiologie en pathofysiologie.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek is ondersteund door het Fonds van de Oostenrijkse Science (FWF) via I3243-project en de European Research Council (ERC) onder de Europese Unie Horizon 2020 voor onderzoek en innovatie (subsidieovereenkomst No 714366). CWG heeft ondersteund door een Australische onderzoek Raad (ARC) toekomst Fellowship (FT140100730) en MM door een ARC Discovery vroege carrière onderzoeker (DECRA) Fellowship (DE150100784). SA wordt ondersteund door een Harris-welzijn premature geboorte centrum onderzoeksbeurs beheerd door welzijn van vrouwen, UK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
| Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
| GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
| LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
| Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
| BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
| Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
| Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
| Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
| Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
| Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
| Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
| Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
| Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
| Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
| Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
| Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
| Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
| Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
| Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
| Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
| Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
| HBSS | SIGMA | H9269 | |
| Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
| Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
| [Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398 (1), 227-238 (2010).
- Wray, S. Insights into the uterus. Exp Physiol. 92 (4), 621-631 (2007).
- Wray, S., Kupittayanant, S., Shmygol, A., Smith, R. D., Burdyga, T. The physiological basis of uterine contractility: a short review. Exp Physiol. 86 (2), 239-246 (2001).
- Matthew, A., Shmygol, A., Wray, S. Ca2+ entry, efflux and release in smooth muscle. Biol Res. 37 (4), 617-624 (2004).
- Wray, S., et al. Calcium signaling and uterine contractility. J Soc Gynecol Investig. 10 (5), 252-264 (2003).
- Gruber, C. W., O'Brien, M. Uterotonic plants and their bioactive constituents. Planta medica. 77 (3), 207-220 (2011).
- Maul, H., Maner, W. L., Olson, G., Saade, G. R., Garfield, R. E. Non-invasive transabdominal uterine electromyography correlates with the strength of intrauterine pressure and is predictive of labor and delivery. J Matern Fetal Neonatal Med. 15 (5), 297-301 (2004).
- Newman, R. B. Uterine contraction assessment. Obstet Gynecol Clin North Am. 32 (3), 341-367 (2005).
- Haran, G., Elbaz, M., Fejgin, M. D., Biron-Shental, T. A comparison of surface acquired uterine electromyography and intrauterine pressure catheter to assess uterine activity. Am J Obstet Gynecol. 206 (5), 412-e415 (2012).
- Condon, J., et al. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biol Reprod. 67 (2), 506-514 (2002).
- Soloff, M. S., et al. Immortalization and characterization of human myometrial cells from term-pregnant patients using a telomerase expression vector. Mol Hum Reprod. 10 (9), 685-695 (2004).
- Buxton, I. L., Vittori, J. C. Cholesterol depletion enhances both spontaneous and agonist-evoked uterine smooth muscle contractions in a reversible manner. Proc West Pharmacol Soc. 48, 126-128 (2005).
- Matthew, A., Kupittayanant, S., Burdyga, T., Wray, S. Characterization of contractile activity and intracellular Ca2+ signalling in mouse myometrium. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11 (4), 207-212 (2004).
- Heaton, R. C., Taggart, M. J., Wray, S. The effects of intracellular and extracellular alkalinization on contractions of the isolated rat uterus. Pflugers Arch. 422 (1), 24-30 (1992).
- Hutchings, G., Deprest, J., Nilius, B., Roskams, T., De Ridder, D. The effect of imatinib mesylate on the contractility of isolated rabbit myometrial strips. Gynecol Obstet Invest. 62 (2), 79-83 (2006).
- Wilson, R. J., Allen, M. J., Nandi, M., Giles, H., Thornton, S. Spontaneous contractions of myometrium from humans, non-human primate and rodents are sensitive to selective oxytocin receptor antagonism in vitro. BJOG. 108 (9), 960-966 (2001).
- Choudhury, S., Garg, S. K., Singh, T. U., Mishra, S. K. Functional and molecular characterization of maxi K+ -channels (BK(Ca)) in buffalo myometrium. Anim Reprod Sci. 126 (3-4), 173-178 (2011).
- Smith, R. C., McClure, M. C., Smith, M. A., Abel, P. W., Bradley, M. E. The role of voltage-gated potassium channels in the regulation of mouse uterine contractility. Reprod Biol Endocrinol. 5, 41 (2007).
- Jones, K., Shmygol, A., Kupittayanant, S., Wray, S. Electrophysiological characterization and functional importance of calcium-activated chloride channel in rat uterine myocytes. Pflugers Arch. 448 (1), 36-43 (2004).
- Popescu, L. M., et al. Imatinib inhibits spontaneous rhythmic contractions of human uterus and intestine. Eur J Pharmacol. 546 (1-3), 177-181 (2006).
- Taggart, M. J., Wray, S. Contribution of sarcoplasmic reticular calcium to smooth muscle contractile activation: gestational dependence in isolated rat uterus. J Physiol. 511 (Pt 1), 133-144 (1998).
- McCallum, L. A., Pierce, S. L., England, S. K., Greenwood, I. A., Tribe, R. M. The contribution of Kv7 channels to pregnant mouse and human myometrial contractility. J Cell Mol Med. 15 (3), 577-586 (2011).
- Bernstein, K., et al. Calcium-activated chloride channels anoctamin 1 and 2 promote murine uterine smooth muscle contractility. Am J Obstet Gynecol. , (2014).
- Khan, R. N., Morrison, J. J., Smith, S. K., Ashford, M. L. Activation of large-conductance potassium channels in pregnant human myometrium by pinacidil. Am J Obstet Gynecol. 178 (5), 1027-1034 (1998).
- Phillippe, M., Basa, A. Effects of sodium and calcium channel blockade on cytosolic calcium oscillations and phasic contractions of myometrial tissue. J Soc Gynecol Investig. 4 (2), 72-77 (1997).
- Ausina, P., et al. Effect of inhibition of the electrogenic Na+/K+ pump on the mechanical activity in the rat uterus. Fundam Clin Pharmacol. 10 (1), 38-46 (1996).
- Melin, P., Trojnar, J., Johansson, B., Vilhardt, H., Akerlund, M. Synthetic antagonists of the myometrial response to vasopressin and oxytocin. J Endocrinol. 111 (1), 125-131 (1986).
- Hahn, D. W., et al. Evaluation of 1-deamino-[D-Tyr(Oethyl)2, Thr4, Orn8] vasotocin, an oxytocin antagonist, in animal models of uterine contractility and preterm labor: a new tocolytic agent. Am J Obstet Gynecol. 157 (4 Pt 1), 977-982 (1987).
- Demarest, K. T., et al. Profile of an oxytocin antagonist, RWJ 22164 for treatment of preterm labor in laboratory models of uterine contractility. American journal of perinatology. 6 (2), 200-204 (1989).
- Goodwin, T. M., et al. The pharmacokinetics of the oxytocin antagonist atosiban in pregnant women with preterm uterine contractions. Am J Obstet Gynecol. 173 (3 Pt 1), 913-917 (1995).
- Goodwin, T. M., et al. The effect of the oxytocin antagonist atosiban on preterm uterine activity in the human. Am J Obstet Gynecol. 170 (2), 474-478 (1994).
- Goodwin, T. M., et al. Treatment of preterm labor with the oxytocin antagonist atosiban. American journal of perinatology. 13 (3), 143-146 (1996).
- Romero, R., et al. An oxytocin receptor antagonist (atosiban) in the treatment of preterm labor: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with tocolytic rescue. Am J Obstet Gynecol. 182 (5), 1173-1183 (2000).
- Norstrom, A., Andersson, A., Vilhardt, H. Contractile effect of oxytocin and 1-deamino-1-carba-2-tyrosine (0-methyl)-oxytocin in myometrial tissue from non-pregnant and term pregnant women. Acta Endocrinol (Copenh). 122 (5), 566-568 (1990).
- Atke, A., Vilhardt, H. Uterotonic activity and myometrial receptor affinity of 1-deamino-1-carba-2-tyrosine(O-methyl)-oxytocin. Acta Endocrinol (Copenh). 115 (1), 155-160 (1987).
- Hunter, D. J., Schulz, P., Wassenaar, W. Effect of carbetocin, a long-acting oxytocin analog on the postpartum uterus. Clin Pharmacol Ther. 52 (1), 60-67 (1992).
- Moraitis, A. A., Cordeaux, Y., Charnock-Jones, D. S., Smith, G. C. The Effect of an Oxytocin Receptor Antagonist (Retosiban, GSK221149A) on the Response of Human Myometrial Explants to Prolonged Mechanical Stretch. Endocrinology. 156 (10), 3511-3516 (2015).
- Al-Qahtani, S., et al. Diabetes is associated with impairment of uterine contractility and high Caesarean section rate. Diabetologia. 55 (2), 489-498 (2012).
- Arrowsmith, S., Neilson, J., Bricker, L., Wray, S. Differing In Vitro Potencies of Tocolytics and Progesterone in Myometrium From Singleton and Twin Pregnancies. Reprod Sci. 23 (1), 98-111 (2016).
- Arrowsmith, S., Quenby, S., Weeks, A., Burdyga, T., Wray, S. Poor spontaneous and oxytocin-stimulated contractility in human myometrium from postdates pregnancies. PloS one. 7 (5), e36787 (2012).
- Arrowsmith, S., Robinson, H., Noble, K., Wray, S. What do we know about what happens to myometrial function as women age? J Muscle Res Cell Motil. 33 (3-4), 209-217 (2012).
- Quenby, S., Matthew, A., Zhang, J., Dawood, F., Wray, S. In vitro myometrial contractility reflects indication for caesarean section. BJOG. 118 (12), 1499-1506 (2011).
- Turton, P., et al. A comparison of the contractile properties of myometrium from singleton and twin pregnancies. PloS one. 8 (5), e63800 (2013).
- Zhang, J., Bricker, L., Wray, S., Quenby, S. Poor uterine contractility in obese women. BJOG. 114 (3), 343-348 (2007).
- Higgins, C. A., et al. Maternal obesity and its relationship with spontaneous and oxytocin-induced contractility of human myometrium in vitro. Reprod Sci. 17 (2), 177-185 (2010).
- Crankshaw, D. J., O'Brien, Y. M., Crosby, D. A., Morrison, J. J. Maternal body mass index and spontaneous contractility of human myometrium in pregnancy. J Perinatol. 37 (5), 492-497 (2017).
- Luckas, M. J., Wray, S. A comparison of the contractile properties of human myometrium obtained from the upper and lower uterine segments. BJOG. 107 (10), 1309-1311 (2000).
- Chapman, N. R., Kennelly, M. M., Harper, K. A., Europe-Finner, G. N., Robson, S. C. Examining the spatio-temporal expression of mRNA encoding the membrane-bound progesterone receptor-alpha isoform in human cervix and myometrium during pregnancy and labour. Mol Hum Reprod. 12 (1), 19-24 (2006).
- Robson, S. C., Simpson, H., Ball, E., Lyall, F., Bulmer, J. N. Punch biopsy of the human placental bed. Am J Obstet Gynecol. 187 (5), 1349-1355 (2002).
- Popat, A., Crankshaw, D. J. Variable responses to prostaglandin E(2) in human non-pregnant myometrium. Eur J Pharmacol. 416 (1-2), 145-152 (2001).
- Arrowsmith, S., Neilson, J., Wray, S. The combination tocolytic effect of magnesium sulfate and an oxytocin receptor antagonist in myometrium from singleton and twin pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 789-e789 (2016).
- Crankshaw, D. J., Morrison, J. J. Methodology and pharmacological analysis of effects of uterotonic compounds in human myometrium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 205 (2), 155-e156 (2011).
- Di Giglio, M. G., et al. Development of a human vasopressin V1a-receptor antagonist from an evolutionary-related insect neuropeptide. Sci Rep. 7, 41002 (2017).
- Attah, A. F., et al. Ethnobotanical survey of Rinorea dentata (Violaceae) used in South-Western Nigerian ethnomedicine and detection of cyclotides. J Ethnopharmacol. 179, 83-91 (2016).
- Koehbach, J., et al. Oxytocic plant cyclotides as templates for peptide G protein-coupled receptor ligand design. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21183-21188 (2013).
- Taggart, M. J., Burdyga, T., Heaton, R., Wray, S. Stimulus-dependent modulation of smooth muscle intracellular calcium and force by altered intracellular pH. Pflugers Arch. 432 (5), 803-811 (1996).
- Luckas, M. J., Taggart, M. J., Wray, S. Intracellular calcium stores and agonist-induced contractions in isolated human myometrium. Am J Obstet Gynecol. 181 (2), 468-476 (1999).
- Parratt, J. R., Taggart, M. J., Wray, S. Functional effects of intracellular pH alteration in the human uterus: simultaneous measurements of pH and force. J Reprod Fertil. 105 (1), 71-75 (1995).
- Taggart, M., Wray, S. Simultaneous measurement of intracellular pH and contraction in uterine smooth muscle. Pflugers Arch. 423 (5-6), 527-529 (1993).
