Summary
この説明は前のヴィヴォひと子宮筋の収縮や創.の応用を研究する実験的プロトコル小説研究プローブから薬理学的データを検証するだけでなく新たな子宮筋生理機能の理解を改善するためにこのテクニックを使用または薬剤をリードします。
Abstract
探索と新規医薬品化合物または生化学的なプローブの特性評価は、堅牢な生理学的に関連するアッセイ系に依存します。我々 は前のヴィヴォ子宮筋収縮力を測定する方法を説明します。このアッセイは、要因を調査する使用ことができに関わる分子群の子宮筋収縮と彼らの興奮あるいは抑制の行動を決定するための変調と、それゆえ彼らの治療の潜在的なin vivo。生検は、インフォームド コンセントと帝王切開で配信を受けている女性から取得されます。細く切った子宮の解剖、クリップ、1 mL オルガン風呂 37 ° C で生理食塩液隔内力変換器に接続されています。ストリップ設定張力の下で 2-3 時間以内の自発収縮を開発し、安定して多くの時間を (> 6 h)。ストリップは、内因性ホルモン濃度依存性収縮頻度の変調を引き起こす、オキシトシンとバソプレシン、強制や期間より近い労働の収縮などを契約にも刺激できます。したがって、自然とアゴニストによる収縮に対する既知および新規の医薬品リードの効果をテストできます。
このプロトコルは具体的にはこの分析を使用してひと子宮筋収縮の様々 なパラメーターに及ぼす影響を測定することによって既知および新規エージェントの効力を決定する方法について説明します。オキシトシンと V1 a受容体拮抗薬、atosiban、オキシトシンとバソプレシン収縮を阻害し、補完し、検証のこのメソッドの使用方法を示す知られている化合物の例として SR49059 を用いてください。薬理学的データの医薬品開発を支援するために細胞に基づく試金から得られます。オキシトシンとバソプレッシンと比較して新規のアゴニストの効果も特徴付けられます。我々 は、オキシトシンの例を使用しながら/バソプレシン システムでは、このメソッドはまた、他の受容体と子宮収縮と弛緩人間の子宮の生理学および病態生理学の理解を進めるために役割を果たすイオン チャネルを研究するために使用します。
Introduction
創の目標は、小説で、強力なアクティブ化したり、細胞のシグナル伝達経路を阻害することによって治療の反応を生成する選択性の高いリガンドを生成することです。これにより、信頼性の高い、堅牢で、関連性の高い結果1と鉛の化合物をテストするための適切な測定システムが必要です。リガンド-受容体結合および機能アッセイなどの薬理学的手法は、しばしば異種細胞ベース システム、2はないでしょう過剰受容するように設計を採用しています。これらの技法は、受容体の薬理学と創薬初期段階のための貴重な洞察力を提供、しながら得られたデータは真生体内でシナリオを表さない場合があります。したがって、細胞に基づく試金から薬理学的データが生理学的に関連するモデルにも検証されていることが重要です。
子宮の平滑筋 (子宮) は、分娩中に消し去ると、子宮頸部の拡張および胎児3を配信する収縮に責任がある子宮の筋層を構成します。子宮筋の収縮が自然です。4契約にホルモンや神経の入力は必要ありません。収縮は電圧駆動 Ca2 +の開口部につながる子宮筋細胞膜の自発分極によってもたらされる-チャンネル (L 型チャネル) および Ca2 + 5セルに流入。カルモジュリンのカルシウム複合体と順番ミオシン クロス ブリッジのサイクル形成収縮とアクチンの結合を有効にすることを廃止するミオシン軽鎖キナーゼを活性化します。リラクゼーションは通常解消リン酸化ミオシンによるミオシン軽鎖ホスファターゼと Ca2 +の押し出しはセルおよび/または筋小胞体に隔離 (SR)5,6 を介して濃度の減少によって媒介されます。 ,7。
子宮筋の機能と障害、体内の内部および外部の tocography と子宮内圧カテーテルから子宮筋起源8 の変形や不死化細胞の生成に勉強をいくつかの方法が開発されています。 ,9,10、11,12。細胞培養システムは、物質が細胞レベルで動作することができるかどうかを検出できる、しながらオルガン浴場内組織のストリップは、薬理学的試薬に全体の組織の機能の反応を測定するツールとして使用できます。伝統的なオルガンのお風呂は、通常 5 と 50 mL 生理食塩水 (PSS) の間保持することができる大規模な加熱ガラス容器です。これらの大型チャンバー内でストリップ通常酸素および PSS の大量の曝気が必要です。組織のストリップに解剖し入浴室内で中断し、収縮張力の変化を測定する力変換器に接続されています。人間とモルモット13、14マウス、ラット15、ウサギ16などを含む動物から子宮の17,18のストリップを調べる多くの研究グループによって使用されています。子宮筋の生理学と病理学、早産と機能不全の労働者を含むに関する多くの質問。たとえば、子宮ストリップは、規制し修正筋活動19,20,21,22SR などの細胞器官の機能を決定する要因を識別するために使用されているだけでなくイオンの変調器を調査チャンネル23,24,25,26、ポンプおよび交換器27子宮筋生理学におけるそれらの役割を決定するのには。
この前のヴィヴォテクニックにより測定される、組織収縮のパフォーマンスの評価と収縮のパラメーターに異なるエージェントの直接影響のためなど、収縮力 (強さ)、頻度、および期間と同様行う合計作業 (平均不可欠な力または曲線の下の領域) のインデックスを生成するため、これらの値の統合。隔離されたティッシュのストリップの準備は、1 つ以上のセル型のモデルを構成すると、全体の組織の生理的反応が測定できます。オルガン バストイレ分離組織のストリップ、したがって細胞培養作業と全体の動物間のブリッジを提供する便利なツール/生体内で動作します。したがって、創薬、新薬の興奮性の面での影響の分野で (すなわち、刺激的な) または抑制 (すなわちリラクゼーション) 潜在的な生体内でより密接に評価できます。この手法はオキシトシンと V1 aの開発で使用される正常に-早産収縮を阻害し、早産を遅らせるに子宮収縮抑制剤として (OTR と V1 aR) 受容体拮抗薬 atosiban。拮抗薬オキシトシン (OT) を大幅に削減することができるが見つかりましたの in vitroテスト子宮ストリップの atosiban の-収縮28,29,30を誘発します。重要なはこれらの研究 atosiban の直線移動の値を検証する助けし、必要を前方に臨床試験31,32,33,34 概念実証データを生成.Atosiban は、今広くヨーロッパの労働を遅延する選択の薬剤として使用されます。産後出血35,36,37を防ぐために、治療の可能性を表示するオキシトシン アナログ carbetocin の類似概念実証研究を行った。このアッセイで開発中の他の鉛化合物は、retosiban (GSK221149A)38と nolasiban (未発表のデータ) にもあります。これらのメソッドは、患者グループ39,40,41,42,43,44,間で比較して正常に使用されているも45,,4647種内の差異を調べるとします。
ここでこのメソッドを使用して、補完し、細胞に基づく試金から得られる薬理学的データを検証する方法を説明するために小 (1 mL) カスタムメイド オルガン浴場内ひと子宮筋妊娠中から組織ストリップ分離前のヴィヴォの使用を説明します。.生検は、いずれかに組織がさらされていない予定手術、生検のコレクションのスケジュール、子宮筋に簡単にアクセスを容易に、それ故に、事前に労働科目帝王 (CS) 配信を受ける女性から得られた主子宮收縮刺激や手術前に弛緩。しかし、生検は患者を完全に同意する十分な時間が提供する労働の予定外 (緊急事態) CS 配信を受ける女性からも入手できます。しかしそれは上部のセグメント48,49からサンプルを取得することも、ほとんど生検手術外科的切開のサイトで下の子宮セグメントから得られます。経腟分娩を次にいくつかの場合、胎盤のベッドからパンチ生検も取得されている50。しかし、これはほとんどの従来のルートではない、取得子宮筋組織量が少ない。非妊娠子宮筋は、良性婦人科疾患の子宮摘出術を受ける前や閉経後の女性から入手できます。全層生検子宮頸から下のコーパスからのサンプリング後の病理検査で、子宮筋層、漿膜と子宮内膜の表面を回避する子宮壁の中央から撮影します。
Protocol
生体実験の適切な制度的、倫理的な検討委員会と安全性承認は、任意の人間の組織で作業する前に場所でなければなりません。すべての作業説明本研究倫理委員会から承認を取得 (リバプール東, REC Ref 10/h1002 オリーブスモルト/49) と研究と開発部、リバプールの女性の病院とリバプール大学の倫理委員。
注: このプロトコルで記述されているすべての生検は、参加する前の労働リバプール女性の病院でそれぞれの女性の分娩の CS 方法を与えた同意を受ける女性から得られました。
1. ソリューション
- 次の組成を変更したクレブス生理食塩液 (PSS) を準備: 154 mM NaCl、KCl 5.6 mM、1.2 mM MgSO4、7.8 mM グルコース、10.9 mM HEPES、2.0 mM CaCl2。
注: ボリュームを操作、システム (1 mL/分) の流量で組織浴場の数に応じて決定され、平衡とウォッシュ アウト時間を含む実験の長さを推定します。 - 7.4 4 M NaOH を使用して pH を調整します。
2. 組織バスの設定
- ~ 45 ° c 55-60 ° C で循環水の風呂を使用して組織の風呂システム貯水池を予熱します。
注: 装置の基盤に水の貯留は、縦貫、蠕動のチューブで PSS との熱交換を可能にした組織のバースの PSS は、37 ° C で確実に ~ 45 ° C に加熱はティッシュお風呂で PSS の温度が 37 ° C に達するように温度を設定するいくつかの調整が必要であります。これは器具を使用し、流量を設定によって異なります。 - 増幅器、データ集録、記録システム、吸引ポンプなど他の必要な機器を手動で切り替えます。
- 蠕動性ポンプ頭部のローラの周り蠕動フィーダー チューブ (バスあたり 1 つの管) を配置します。終了位置を保持したおよび圧縮カムを引き締め、チューブ周囲のキーをロックして固定します。PSS の 1 L 容器に蠕動フィーダー チューブの自由端し継続的に組織の浴場に灌流して PSS を許可するようにポンプを起動します。
- 吸引ポンプが正しく動作しているようにお風呂に流れの速度に等しい除去率、お風呂での溶液のレベルが一定を確認します。ティッシュお風呂で PSS のレベルは、モデラーの粘土を使ってお風呂で吸引チューブの深さを操作することによって調整できます。
- 探触子フックに知られて減量 (1 millinewton (mN, 力の単位) に相当) を配置し、集録ソフトウェアによって検出たわみを記録力変換器を調整します。
注: 値は記録された値が自動的に変換 mN の分析中に、さらに変換を実行する必要性を否定するようなこと、ソフトウェアで調整できます。力変換器の校正は、組織マウントする前に行う必要があります。
3. ティッシュの準備とストリップの解剖
- CS で赤ちゃんと胎盤の出産後妊娠ひと子宮 (1-2 cm3) 生検を収集します。子宮外膜 (子宮の外側の漿膜層) と脱落膜 (子宮の内層) の両方が存在 (典型的な) 全層生検を取得します。子宮筋組織 (中央筋層) のみを使用します。図 1 aBを参照してください。
- これらの組織は、子宮収縮を変えることができる物質を生成する知られている (本質的な) 脱落膜との付着性の胎児膜 (存在する場合) を削除します。
注: 手術でサンプル ハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) または新鮮な PSS に配置、4 ° C で保存理想的な研究を示している収縮性を損なう 4 ° C51でストレージとコレクションの 18 h の後しかし組織を外科 12-16 時間以内使用ください。4 ° C で長期保存後組織生存率および機能を確認するために適切なコントロールを行う必要があります。ここでのサンプルと上部のセグメントではなく低い子宮セグメント切開部位の上端から取得されます。子宮の下部と上部のセグメントは、同様に48の契約に示されている、それ故により低いセグメント生検と見なされます上部セグメント子宮筋活動の良い反射。
- これらの組織は、子宮収縮を変えることができる物質を生成する知られている (本質的な) 脱落膜との付着性の胎児膜 (存在する場合) を削除します。
- 郭清範囲と必要な機器を含む準備: 大解剖はさみ、小さな Vannas 解剖はさみ、2 つの解離鉗子、郭清ピンと固定両方解剖顕微鏡、ズームの周りのアルミ組織クリップ倍率。
- クリア シラスティック ベース解剖皿の上生検サンプル (材料の表を参照してください)、PSS と慎重に満たされた場所、生検をオリエンテーションは、漿膜、脱落膜のエッジを識別できるように図 1 b。
- ピンを利用して、料理のベースに生検をセキュリティで保護します。組織の切離プロセス中で、PSS 水和ままを確認します。
- 手動で顕微鏡光源に切り替え、子宮筋の瘢痕組織、漿膜、脱落膜、および存在する場合任意の付着性胎児膜から無料の領域を識別するために 10 倍の倍率の顕微鏡で組織を検査します。
- 別々 の 2 つの平面または筋肉のシートを明らかに 2 つの隣接する組織レイヤーに大解剖はさみを使って鈍的切離を実行します。
注: 分離を開始する組織の層の間の小さなポケットを見つけるに簡単には多くの場合、彼らは 'ポケット' に間違われることが、生検の端に小型船舶を避けるために注意する必要があります。 - それを確保するための組織の各コーナーのピンの場所を解剖します。並列で実行されている繊維と筋の地域を探して筋のシートを検査します。
注: 領域の同定は、小さな毛細血管を介して組織灌の方向に従うことによって支援が可能します。組織エッジで優しく引っ張ってはまた繊維を旅している方向を識別するを助けることができます。 - 組織のストリップを切り取る 〜 2 mm 幅 x 8 全長 mm x 1 mm 厚の小型解剖はさみを使って筋線維方向に揃えて長手方向軸線に沿って。
注: 注意が必要だけ組織を保持するために損傷を防ぐため最初のカットのエッジ投稿。 - 実験に必要なストリップの数を分析するプロセスを繰り返します。
- 各ストリップをまっすぐにし、ストレッチに配慮、料理への組織を保護する両端ピンします。
- 各端のアルミ組織クリップを装着して、それらの間の組織が 〜 5 mm 長く、慎重にカット任意の過剰な組織 (図 1)。
- PSS の取り付けの準備でいっぱいきれいな皿に転送します。
4. お風呂で組織をマウント
- 実験的組織のお風呂にストリップを転送します。(伝統的なオルガン浴場) のようにストリップを垂直ではなく水平方向にマウント (図 2 b)。
- 組織の収縮を測定する力トランスデューサーにクリップによって各ストリップの一端を接続し、固定する他は両方組織チャンバー内をフックします。
注: 組織バスの容量は 〜 1 mL のストリップが完全にお風呂で水中に沈むことを確認するのに十分な大きさであります。 - お風呂で各フックの基部にストリップを確認します。
- レコーディング ソフトウェアをソフトウェア アイコンをダブルクリックして、開きます。
- これは、チャネルのウィンドウ ビューで各チャネルの録音を調整します。
- Y 軸、選択 'scale' と入力最小値の 0 と 10、最大値をそれぞれ右クリックして 0-10 V (0-10 mN の記事の校正に相当) の間に読むに Y 軸のスケールを調整します。「OK」を選択します。各チャンネルの録音に繰り返します。
- ライブ録音を開始するソフトウェアの「レコード」を押します。
注: 各フックのベースにストリップが保護されていない場合 'ワンランク上' の記録として表示される収縮中にスリップが。セットの張力を変更し、したがって収縮後滑りが異なる場合があります。 - 各トランスデューサーに接続されているマニピュレーターを手動で回して各お風呂で組織を伸ばします。ベースラインから画面の上方の組織の動きに従い、基準張力 0.2 g (~ 2 mN) に達するまでにマニピュレーターを回り続けます。
注: 組織はすぐにリラックス (基準張力の低下によって記載)、開始通常 0.5-1 の間の安定した張力を達するミネソタ。この定義の緊張感は、私達の実験条件でこのサイズの組織に最適化されています。その他のサイズの組織を使用する場合は、適用する安静時の力を最適化する適切な長さ-張力関係の調査が行われているが不可欠です。 - 平衡のために組織を許可する 〜 2 h まで自発収縮が発生します。
注: 基準張力の小さい上昇は通常観察され、組織の生存率の目安は、それは収縮されます。
5. 40 mM カリウム (高 K+) を持つ組織に挑戦
- 取り付けの 2 h 以下の自発収縮が発生しない場合カリウムが KCl 塩化ナトリウムの isosmotic 置換による 40 mM に上昇高カリウム塩溶液とストリップに挑戦します。高 K+(mM) で、次を追加: 40 119.6 塩化ナトリウム 2.0 CaCl210.9 HEPES 7.8 グルコース 1.2 MgSO4KCl。
注: 子宮筋など平滑筋、高 K+のアプリケーション収縮を引き起こす、組織細胞への Ca2 +の最大流入につながる電圧動作カルシウム チャネルを直接開きます。高 K+は、対策として組織の整合性を最大組織反応の指標を達成するための一般的なインデックスをテストするため使用できます。- 高 K+に 1-2 分を含むガラス実験室瓶に挑戦するストリップを含むバス用フィーダー チューブを配置します。
- フィーダー チューブを PSS のコンテナーに戻ります。
- ここで高 K+への応答を達成すると、さらに 1 時間のためのストリップの監視を継続します。高 K+収縮反応がない、または誘発自発投稿高 K+応答はありません、ストリップを破棄します。
注: 実験者は、またデッド スペース (組織風呂に到達するソリューションに要する時間) を認識する必要があります。 高 K+への応答を評価する前にフィーダー チューブで。これは 2 〜 3 分かかることがあり、流量に依存します。 - 後続の演習に影響を与える可能性があります、バスおよび送り装置の管から高 K+の完全なウォッシュ アウトを確保するための自発収縮が進む前に前高 K+の振幅に戻るまでを待つ実験でさらに。
6. 子宮筋収縮に対する既知および新規化合物の影響をテスト
注: 自発 (図 3 a) またはアゴニスト刺激収縮 (図 3B-C) の子宮筋機能に及ぼす新規治療薬、試薬にもテストを実行できます。アゴニストの刺激収縮、OT またはアルギニン バソプレッシン (VP) が 0.5 の濃度を与える PSS に追加されます nM あり実験 (図 3 b・ C) で使用されています。自然40,52一過性である収縮を提供するので、このアッセイの OT の濃度を最適化されています。濃度アゴニストより下 (Ref41,44例についてを参照してください)、長期的な持続的なの (トニック) 収縮につながる様々 なエージェントの影響は評価することは困難と実験の時間枠周波数で個々 の収縮と削減の期間の増加に合わせて拡張する必要があります。OT または VP がので収縮を刺激するために追加されますこの例実験で知られている OTR と V1 aR 拮抗薬、atosiban、SR49059、または私たちの新規化合物 [D Arg8] によってその対立-inotocin ([D Arg8] INT) を評価できます。
- PSS でテスト化合の濃度を準備 (または 0.5 nM OT/VP) 最小最大を超える濃度への応答を引き出すないなど含まれている濃度の広い範囲を確保する 1/1,000 希釈で希釈応答。
- 車両 (例えばジメチルスルホキシド、アセトニ トリル、または蒸留水) の平等なボリュームを含む希薄の同じセットを準備します。
注: 10-6 M (10-3 M の在庫) からすなわち、最高濃度を準備し、対数スケール (例えば、10-6-10-10 M) でシリアル希薄を実行する最も簡単なです。準備するボリュームによって異なります 1 mL/分の流量と試薬の 25 分アプリケーションのアプリケーション、装置、および調査するストリップの数、例えば流量の時間、組織バスあたり各濃度の 25 mL 以上が必要ed。 - 組織に必要な濃度で試薬を含むガラス実験室瓶にティッシュお風呂用フィーダー チューブを配置することによって化合物の最初の濃度を適用します。
注: このべき自発または OT/VP 刺激収縮の安定したベースラインが達成されれば。 - 2 番目のバスに同じように対応する車両制御ソリューションを適用します。
- アプリケーション (すなわち、フィーダー チューブが変更されたとき) の時間を記録します。
- シリーズの次の濃度を含むガラス実験室瓶にフィーダー チューブを順番に配置することによって、各濃度のプロセスを繰り返し、繰り返し、全ての濃度が適用されるまで。
各濃度のアプリケーションことができます 15, 30 分間が適用各濃度と実験の間一貫しているべき。OT または VP 刺激収縮を含む (例えば、25 分) 刺激下で観察される収縮頻度の減少のために長時間アプリケーションを必要とする傾向にあります。最適なアプリケーション時間を確認する予備実験はテストされているすべての新しい試薬を事前実行必要があります。 - ウォッシュ アウトする PSS (OT/副社長の有無にかかわらず) にフィーダー チューブに戻る。
- '停止' ライブ録音を終了するをクリックします。すぐに適切なフォルダーにデータを保存し、'.mat' ファイルとバージョンをエクスポートします。
7. データ解析
注: データのキャプチャし、分析を任意の数の市販のデータ集録ソフトウェア パッケージによって実行できます。詳細についてはこのプロトコルで使用されるソフトウェアの材料表を参照してください。収縮能の正確な評価、測定する収縮のパラメーターが含まれます: 収縮の振幅 i)、ii) iii) 収縮、および iv) 平均力積分 (図 4) の持続期間の収縮の頻度。平均力不可欠な収縮曲線下面積と同じです、したがって組織片によって与えられた時間で合計仕事のインデックスです。パラメーターの一部またはすべてを分析することができます。最低限、平均の不可欠な力と収縮の振幅解析53がそれをお勧めします。ここで説明する実験曲線下面積は伸縮の振幅の変化を測定した.
- 解析ソフトウェアには、the.mat ファイルをインポートします。
- サンプリング間隔を考慮して、実験の時間を反映する X 軸に対応する列を調整します。実験は通常 10 サンプル/s または 600 サンプル/分に対応する 10 の Hz で記録されます。
- データを使用する X と Y 座標グラフとしてプロット」のプロット |「インライン関数。
- ソフトウェアに '垂直翻訳' 関数を使用して収縮のベースラインはゼロします。
- 適切なコントロール期間を選択します。
注: これは摂政の最初濃度の試薬 (図 4 a) の適用期間に等しいのアプリケーションの直前の期間です。例えば、25 分の薬 X アプリケーションの場合、コントロールと薬物 X の最初のアプリケーションの前 25 分を使用します。 - Y 軸をオフに読んで、最大ピーク時に、選択した期間に発生するそれぞれの収縮の収縮の振幅 (力) を記録し、平均値を計算します。
- 先頭と末尾の各収縮に X 軸をオフに読んで、この最大ピークの 50% 収縮の持続時間を測定し、平均値を記録します。
- 周波数の値を生成する時間枠で発生する収縮の数をカウントします。
- AUC を計算する「統合」機能を使用して (任意の単位 a.u.) 選択されている期間。
注意: AUC を正確に記録するには、が重要です収縮のベースラインが Y 軸の 0 に設定されています。 - 順番に各濃度を移動し、収縮のさまざまなパラメーターを記録します。
- コントロール データを 100% で設定およびエクスプレスこの割合として試薬濃度下で得られた値はすなわち制御、刺激の値をする必要があります > 100% 緩和する必要がありますしながら < 100%。
注: この方法ではデータの正規化のストリップおよび薬理学的治療結果を比較するユーザーをようにします。 - 各実験の繰り返し、グラフィカルなパッケージにデータを転送します。
Representative Results
このモデルを使用すると、さまざまなアゴニストと収縮の拮抗薬だけでなく、既知または未知の関数の新薬への応答および定量化します。試薬濃度、例えば、10-5– 10-9 M の広い範囲で使用され、に沿って濃度の増加に追加するとき、EC50 IC50値などの標準的な薬理学的パラメーターを計算できる、対数スケール。
オキシトシン受容体拮抗剤濃度応答実験
この実験では、ひと子宮筋の対ストリップされた上記カット図 1図 2に示されている、組織お風呂でマウントに示すようし、等しい振幅の安定した収縮を生成する平衡と周波数。ストリップは、内因性の OTR アゴニスト、OT にさらされた (0.5 nM) の収縮を刺激します。OT (通常 45 分) の下で安定した活動の期間の後、atosiban は対数目盛 (10-9– 10-6 M) に沿って濃度の増加の 1 つのストリップに適用されました。2 番目のストリップは、コントロール-と時間 OT に単独で残っていた。Atosiban への応答の例は、図 5 aで見ることができます。収縮制御 (100%) として atosiban の最初の濃度の直前を撮影、振幅と適用各濃度の AUC は、図 4に示すようには計算されました。時間制御実験、実験演習の時間相当を測定しました。プロットされたデータと曲線は、グラフィカルなソフトウェア パッケージ (図 5 b・C) で非線型回帰関数の使用を装備しました。抑制効果を計算の面で atosiban の相対的な効力は濃度原因半分最大 (50%) 抑制性の応答である IC50を測定することによって計算されます。同じはアゴニストまたは収縮の刺激を行うことができます。ここでは化合物の効力は、EC50 (半分の最大刺激応答を引き起こす濃度) から計算されます。
新規化合物の反応を調査し、その受容体選択性のテスト
[D Arg8] 新たに合成された化合物の拮抗作用を調べるためひと子宮筋収縮前のヴィヴォのこの生理学的に関連するモデルを使用-inotocin ([D Arg8] INT) いずれかで刺激収縮に対するネイティブ V1aR アゴニスト、VP、またはネイティブ OTR アゴニスト、OT。この試金を使って以前 OTR54ではなく V1 aR で拮抗する薬理学的セル法による決定されていた [D Arg8] INT の受容体選択性の検証です。
この実験は、ひと子宮筋ストリップ 0.5 nM VP または約 1 時間 0.5 nM OT (図 6Aと図の濃度の増加に当社の新規化合物 [D Arg8] INT を追加する前に、図 3に示すように、収縮を刺激するためにさらされました。6 C). これは、市販の知られている V1 aR 拮抗薬、SR49059 と比較した (図 6 b)。図 6A [D Arg8] INT の濃度の増加と VP 刺激ひと子宮筋収縮の濃度依存の減少を示しています。図 6Aii-iiiには収縮の振幅のデータと各濃度の AUC をまとめます。効果は知られている V1 aR 阻害物質、SR49059、図 6Bi-iiiに示す濃度の増加のような。[D Arg8] INT V1 aR の方は OTR ない方の選択は [D Arg8] INT は振幅と AUC として OT (図 6) で刺激されて減少ひと子宮筋収縮しないこと事実によって示されて安定的に推移 (図 6Cii-iii)。
図 1: ひと子宮筋生検解離します。子宮壁を構成する 3 つの組織の層を示す人間の子宮の A (A) 図。最内層は、子宮内膜 (妊娠、赤い矢印で脱落膜)、中間層は生成の収縮、子宮筋 (筋層、黒矢印)、最も外側の層は、子宮外膜 (または漿膜、青い矢印) フォーム、子宮の周りの保護コート。生検のための関心領域は、黒の四角形で描かれています。妊娠中の女性が帝王切開で中から例生検、脱落膜と子宮筋層強調表示された (漿膜で目に見えない) (B) に示します。子宮筋のストリップは正しく実験のため解剖するように異なったティッシュ層が識別されることが不可欠です。(C) 子宮筋解剖されており、クリップの例ストリップが表示されます。通常、2-6 ストリップにカットし、示すようにクリップされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 多臓器浴室の実験セットをひと子宮筋の収縮を測定するために使用します。(A) 子宮筋層のストリップは小さな (1 mL) オルガンに配置されます (i) 温水貯留層の上に配置された部屋をお風呂、経由して蠕動性ポンプ (ii) 生理食塩液 (PSS) 隔。貯水池は、水循環 (iii) お風呂を経由して設定温度で維持されます。各ストリップは、収縮張力の変化を記録力変換器 (iv) にアタッチされます。(V) transbridge アンプによって増幅され、関連付けられている取得ソフトウェアを実行しているコンピューター システム (vii) に記録されているデジタル信号 (vi) に変換します。(B) 合力トランスデューサーならびに他の固定フックに接続されている拡大器官がバス商工会議所のひと子宮筋の場観察(赤矢印)、ストリップの 1 つの端で PSS を浴びて。(C) 設定の図式的な概観。PSS で満たされた組織室が継続的に、37 ° c (45 ° C で保管) 風呂と 55 ° C で設定、循環水ポンプの下に温水タンクと熱交換を介して温めた PSS 灌流します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ひと子宮筋の自発とアゴニスト刺激収縮体外。振幅またはエリア-下-曲線 (AUC) (Aii、 Aiii) の重要な損失することがなく録音の 3 h 以上の自発収縮が安定アゴニスト無料条件で調査するためこのモデルのロバスト性を示す、自発収縮の様々 なエージェントのアプリケーション。安定した、自発的な収縮を確立した後 0.5 nM オキシトシン (OT、B) または (C, VP) バソプレシンは、生理食塩液 (PSS) に追加されました。収縮刺激下でも安定した数時間収縮の振幅 (Bii、 Cii) または AUC (Biii、 Ciii) の重要な損失なしのままに収縮剤の効果を有効にします。子宮アゴニスト存在下で調べた。データは、平均値 (SEM) の平均 ± 標準誤差を掲載されています。注、収縮を持って安定したらにコントロール期間 (100%) をアゴニストのアプリケーションの最初の 45 分後撮影アゴニスト刺激収縮 (B, C)。すべてのケースでストリップした PSS 37 ° c、pH 7.4 (再現シンクレアルイスらから隔生殖科学と・ ディ ・ ジリオらの許可を得て4054 学術報告から創造的な一般的なオープン アクセス ライセンス許可を受けた)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: データ解析します。(A)赤で示されている適切なコントロール期間だった収縮直前テスト混合物 (薬 X) のアプリケーションを選択することによって決定されます。この制御周期が等しい時間薬 X (例えば、この例では 40 分) のアプリケーションも。値を測定、制御周期は 100% として設定されます。以降のすべての測定値は、コントロールの割合として表されます。(B) 測定することができます収縮の 4 の異なるパラメーターがあります: (i) 収縮強さ (力、mN)、(ii) (iii) の収縮の期間の収縮率を測定する収縮の頻度を測定する収縮の振幅収縮、および全体的な仕事の尺度とする曲線 (力の積分、任意の単位として知られている) 下 (iv) 面積の最大ピーク時の半分で測定されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ひと子宮筋のオキシトシン収縮に対する atosiban の拮抗作用を記録します。自発収縮が確立されると、収縮オキシトシン受容体のアゴニスト、オキシトシン (OT) と刺激を受けました。収縮はさらに 45 分 (A) V1 aと OT 受容体拮抗薬の刺激の下で安定させるために許可された、atosiban は対数スケール (10-9-10-5M) での濃度の増加に適用されます。Atosiban の最初の濃度を上記期間中に収縮を測定し、制御 (100%) として取られます。各後続の濃度下での活動は測定され、コントロールの割合として表されます。同じは OT による実験演習の時間と同等にさらされるストリップ行った。グラフィカル ソフトウェアにプロット データ: (B、 C) を示す atosiban の拮抗作用の濃度-反応曲線 (青)、OT による子宮収縮の振幅の車両 (灰色、タイム コントロール) の希釈を適切なと(AUC)、曲線下面積それぞれ。データは、(前に atosiban のアプリケーション) の制御アクティビティの AUC と振幅の平均 (SEM) 割合の平均 ± 標準誤差として表されます。IC50値を達成 (再現シンクレアルイスらから収縮と力積分 (AUC) の振幅の半分の最大抑制 (50%) の反応がある濃度を与える、求めた40 生殖科学からの許可と)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 小説人間の子宮筋収縮に対する化合物の効果と受容体の選択性をテストします。ひと子宮筋の自発収縮が確立された後収縮バソプレシン受容体アゴニスト バソプレッシン (VP) (Ai, Bi) やオキシトシン受容体のアゴニスト、オキシトシン (OT) (Ci) と刺激を受けました。[D-Arg8] の効果-inotocin ([D Arg8] INT) と市販 V1 aR 拮抗薬、副社長によって刺激収縮に対する SR49059 化合物の濃度を適用することによって評価されました。典型的な応答は、(Ai, Bi) に表示されます。関連付けられている分析データの振幅および (AUC) 曲線下面積は、(ii) に示すように、それぞれ、効果にコントロールの割合として表現されています (iii) 活動 (100%)。[D Arg8] INT と知られている V1 aR 拮抗薬 SR49059 振幅と AUC、ひと子宮筋の V1 aR 受容体拮抗薬として [D Arg8] INT の役割をサポート用量依存低下の原因。対照的に、[D Arg8] INT によって刺激される OT (Ci iii)、それ故に同様に我々 の調査をセルベースのアッセイから収縮に影響しなかった、[D Arg8] INT も (データを再現・ ディ ・から人間の子宮に V1 aR への選択性を示しますジリオら54 学術報告から創造的な一般的なオープン アクセス ライセンス許可を受けた)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
ながら、ほとんどの医薬品開発は人間の疾患の治療を対象に、最も基本的な研究を主に動物組織で行います。ここで、重要な質問子宮に関連する生理学と病理学の数に対処するし、機能的反応を検証するために使用できる手術から得られた人間の子宮の収縮前のヴィヴォの調査方法を説明します。既知および新規医薬品開発を支援するために薬理学的エージェント。特に、我々 は、知られている OTR と V1 aR 競争拮抗薬、OT による妊娠子宮筋収縮の atosiban とその応答と受容体の拮抗の応答を調査するため本法の使用を強調表示します。新しく開発された選択的 V1 aR 拮抗薬、[D Arg8] int 型選択性紹介 EC50など IC50重要な薬物動態学的パラメーターが計算できる細胞に基づく薬理データとよく一致します。
同時に複数のタップを使用して複数のエージェントの効果, 拮抗薬, と適切な時間や車両のコントロール競争実験の直接比較のためことができます。ストリップの 2、4、または 8 のグループで準備が多くの場合、この手法は適度なスループット、6-8 (累積) 濃度 (生検) あたり 2-4 化合物のテストを有効にするを提供します。このメソッドはまた、影響を迅速に評価でき、プロトコルを調整することができますリアルタイム データを提供します。さらに、この手法は関心のすべての化合物をテストする使用ことができ、子宮筋生理学と創薬研究に焦点を当てて研究グループの数によって正常に使用されています。本稿で説明したように、純粋な化合物を分析、ほか子宮収縮モデルもされて、新規子宮收縮化合物の混合物からの画面のように正常に利用することができます伝統的な医学7から漢方薬,55,56。
このモデルは技術的に堅牢、良い再現性を示していますが、それはいくつかの制限を持って: 郭清は組織と不慣れなそれらのために困難にすることができますまたは解剖機器を使用して、したがって新しいユーザーが必要組織を最適化するためにいくつかの時間準備およびプロトコル。また、その人間の子宮は、ラットやマウスなどの他のモデルと外観がかなり違う注意する必要があります。ほとんどの齧歯動物の子宮から成る 2 つのチューブ状の子宮角、それぞれ片側卵巣と完了し、子宮頸部で。各ホーンが明確で縦走筋層は、ひと子宮筋の異なるファイバタイプしばしば密接に関連して 'メッシュ' を形成しながら郭清で簡単に分離することができます。さらに、ひと子宮筋の収縮プロファイルは齧歯動物に非常に異なっています。特に、ひと子宮筋の収縮は、期間が長く、それほど頻繁に。ひと子宮筋を操作するための実験の時間枠が多いためくらい齧歯動物モデルよりも長い。種の受容体の発現の違いもアゴニスト レスポンスにはかなり大きな差に貢献できる、これは種の間での結果を外挿する場合は念頭に置く必要があります。
このシステムからの出力を最大化への配慮が必要な手順の数もあります。重要なステップには、解剖時に不必要な損害を避けるために組織を処理するとき、またはマウントの世話など組織性の保存が含まれます。熟練の目が細く切った子宮筋、筋線維の方向は、縦方向と次の組織の面と同様、瘢痕組織、脱落膜と小血管を避け、確保を解剖する必要です。試料は、実験室、オリエンテーションの目的を支援するため脱落膜の端から漿膜の端の輪郭を描くために生検の片側にコレクションの時に (小さな手術ステッチ) などのタグを追加することが可能です。
組織は、組織の機能は温度変動、実験中に安定した 36 ~ 37 ° C で保つ必要があります。これは、堅牢なエアコン ユニット研究室内で実現できます。温めた PSS の一定の血流が保たれ温度収縮からの廃棄物のフラッシュだけでなく。オルガン浴場内温度は流量を変更するまたは直接お風呂の水の温度を調整することによって変更できます。伝統的な 5-50 mL のお風呂に比べると小さなお風呂サイズには、PSS の比較的急速な売り上げ高と試薬のウォッシュ アウトが保証されます。小型オルガン風呂ここで、説明も短くなります PSS のボリューム興味、必要コストを最小限に抑えると貴重なスペア、新開発の化学物質の試薬。さらに、小さな浴槽サイズと HEPES ベースのバッファーを使用して、このシステムは不要酸素など、カーボゲン ・と PSS をバブリングによってです。ストリップに適用される張力の標準化も重要です。このサイズ (5 mm × 2 × 1 mm) のストリップ、約 2 mN (~0.2 g に相当) をする必要がありますこの。代替方法には、最大収縮とストレッチングをこの最大収縮の半分を誘発する高カリウム溶液のアプリケーションが含まれます。しかし、注意する必要があります、適用される張力は生体内で異なる場合があります。
主な課題は、被験者から組織を得るなどが、課税が人間の組織を明確に表して、最も生理学的人間の疾患および薬剤の発見で子宮収縮を勉強の関連性の高い (とやりがいのある) モデル。ストリップしかし、必ずしもイコールではない体内組織にホルモンの例については、免除するいるし、神経入力、収縮、必須ではありませんが分離された組織が収縮の生体を調節します。この試金は、しかしそのような影響から分離、制御された方法で子宮収縮を分析する機会を提供します。できます収縮 (例えば OT、VP、プロスタグランジン等経由) のホルモン コントロールなどの要因の効果のために調査する子宮機能の調節への糸口を提供します。組織は、別の女性から得られた自然標本間自発収縮特性のいくつかのバリエーションがあります。したがって多数の実験を実行する必要があります (~ n = 10) いくつかのデータセットの53の変動を最小限に抑えるためのサンプルの。これは、患者の異なるグループ間の収縮活性を比較するときに最も重要です。アゴニスト及びアンタゴニスト活性を制御するための応答を正規化 (すなわち、制御アクティビティまたは高 K+の割合として表現する) このバリエーションのいくつかを減らします。さらに、間ストリップの変動を減らすためには、その長さと重量の投稿実験41を測定することにより断面積を除去するデータを正規化することができます。これは、患者の異なるグループ間の収縮パターンを比較するときに特に役立ちます。
この手法の限界はまた病院スタッフ、特に劇場スタッフと良好な協力関係を必要とする新鮮な組織へのアクセスを含めるし、承認プロセスに携わる。ローカルな病院や研究所研究倫理委員会審査委員会から倫理的なアクセス許可はまた場所にする必要があります。ひと子宮筋のコレクションは、ドナー手術を受けているときに CS 配信中に実行される可能性が最も高いです。赤ちゃんを提供するために作ら同じ子宮切開部位から生検を撮影し、従って患者は、さらに追加場合は手術する必要はありません。劇場スタッフと生検を行う外科医後の組織の使用の認識する必要がありますに配置される固定液など病理部門に送信してはなりません。長い実験期間は、別の考慮事項です。生体実験を取る多くの時間 (通常 > 6 h) (ラットまたはマウスの子宮で同様の実験をする 2-3 h) ではなく収縮と組織取付と自発の成立の 2-3 h のラグ タイムの遅い周波数により収縮。しかし、我々 が示されているように人体組織収縮が堅牢で、有意な疲労40せず何時間も契約することができますを確立し。
このシステムでは、妊娠中の組織の医薬品試薬をテストする機能を含む克服すべき体内作業の他の課題もできます。この手法は進む前に最初の結果を確認できるというマウスを含む他の種に容易に推定することができます全体の動物研究でさらに。温度の制御変化の組成 superfusate (PSS) と pH は、体内のさまざまなシナリオを模倣化合物の挙動にこれらの変更の影響を分析して簡単に行うことが。検出する蛍光 Ca または (H+) pH 指示薬と機器を用いて子宮ストリップの等尺性張力の測定の基本原則を細胞内カルシウム濃度や pH の同時変更を測定するに拡張も可能と蛍光57,58,59,60を記録します。
全体的に、人間の子宮を表す堅牢で生理学的に関連するモデルの特徴し、創薬における新規治療化合物を検証する-純粋な化合物との混合物。OT/副社長システムに関する創薬におけるその使用の例を提供し、OTR と V1、R 受容体拮抗薬化合物の有効性と定義されたターゲットでの効力を判断して検証性のこのモデルの使用方法に焦点を当てた。しかし、それは、このテクニックが興味や子宮筋収縮 (または緩和) に至る経路の任意の対象を研究し、新たな目標と経路、創薬を支援するために使用できます、子宮筋の理解を進めることを心に負担すべき生理学と病態生理学。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、プロジェクト I3243 を通じてオーストリア科学基金 (FWF) と欧州研究会議 (ERC) 欧州連合のホライゾン 2020年研究とイノベーション プログラム (許諾契約 No 714366) の下でサポートされています。オーストラリア研究会議 (ARC) 未来フェローシップ (FT140100730)、アーク探索初期キャリア研究員 (DECRA) フェローシップ (DE150100784) MM、CWG をサポートされています。SA は、ハリス幸福早産出生研究センター助成金によって英国女性の健康管理によってサポートされます。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
HBSS | SIGMA | H9269 | |
Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
[Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |
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