Summary
Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.
Abstract
Eiwit-eiwitinteractie zijn fundamentele mechanismen voor het doorgeven van signaaltransductie in meest cellulaire processen; Daarom zijn de identificatie van nieuwe eiwit-eiwit interactie pairs en eiwit interactie dynamiek controle van bijzonder belang voor het openbaren van hoe planten reageren op omgevingsfactoren en/of ontwikkelingsstoornissen signalen. Een overvloed aan benaderingen zijn ontwikkeld voor eiwit-eiwitinteractie, in vitro of in vivoonderzoeken. Onder hen is de onlangs opgerichte luciferase complementatie imaging (LCI) assay de eenvoudigste en snelste methode voor het aantonen van in vivo eiwit-eiwitinteractie. In deze test, is EiwitA of eiwit B gefuseerd met de amino-terminal of carboxyl-terminal helft van luciferase, respectievelijk. Wanneer EiwitA met eiwit B communiceert, zal de twee helften van luciferase worden toegevoegd om te vormen van een functionele en actieve luciferase enzym. Luciferase activiteit kan worden vastgelegd met een luminometer of CCD-camera. In vergelijking met andere benaderingen, toont de LCI assay eiwit-eiwitinteractie zowel kwalitatief als kwantitatief. Agrobacterium infiltratie in Nicotiana benthamiana bladeren is een veelgebruikt systeem voor voorbijgaande eiwit expressie. Met de combinatie van LCI en voorbijgaande expressie tonen deze benaderingen dat de fysieke interactie tussen COP1 en SPA1 geleidelijk was verminderd na de Jasmonaat behandeling.
Introduction
Oog op de coördinatie van groei met zijn omgeving, planten geëvolueerd tot elegante signaalroutes om te voelen, transduce en te reageren op signalen van de signalering. Zoals de lopers in een estafette zijn eiwitten nodig spelers in signaaltransductie van planten. Het is algemeen erkend dat eiwit-eiwit interactie (PPI) een belangrijke rol voor mobiele communicatie speelt. Proteïne fosforylatie, acetylation en afbraak zijn allemaal afhankelijk van de fysieke interactie tussen een doel-eiwit en haar wijzigen enzymen. Bijvoorbeeld, Jasmonate ZIM-domein eiwit (JAZ) familie eiwitten interactie met transcriptiefactor MYC2 en onderdrukken zijn transcriptionele activiteit1,2. Gezien het belang van PPI onderzocht grootschalige eiwit interactomes in fabrieken geweest onlangs3,4,5. Deze interactome resultaten verder onthullen de complexe regelgeving netwerk dat coördineert voor diverse cellulaire functies.
Er zijn enkele gevestigde benaderingen voor de controle van de PPI. De bepaling van gist twee hybride (Y2H) is de meest gebruikte methode voor de detectie van de PPI. Y2H is gemakkelijk uit te voeren, en geschikt voor een snelle test onderzocht eiwitinteractie. Y2H wordt ook op grote schaal gebruikt voor de screening van de onbekende wisselwerking partners voor de specifieke eiwit-of-interest. Echter omdat Y2H is geheel uitgevoerd in gist, kan niet zij nadenken het echte scenario in plantaardige cellen en brengt hoge valse positieve tarieven. Een andere soortgelijke strategie is de bepaling van de pull-down. In het algemeen twee eiwitten zijn uitgedrukt en gezuiverd van Escherichia coli cellen en vervolgens gemengd en geïmmobiliseerd voor het opsporen van eiwitinteractie. Hoewel deze methode niet tijdrovend is, niet kan het verkrijgen in vivo interactie resultaten ofwel. Voor in vivo de doeleinden van de interactie is co-immunoprecipitation (co-IP) de meest populaire assay, die houdt van hoge kwaliteit-antistoffen tegen immunoprecipitate de eiwit-of-interest en de mogelijkheid van indirecte PPIs kan niet worden uitgesloten. Bovendien, als gevolg van de ingewikkelde experimentele procedures in co-IP variëren de resultaten meestal met individuele expertise.
Verslaggever gebaseerd reconstitutie testen verder sterk de opsporing van in vivo PPI. Deze methoden omvatten de firefly luciferase complementatie imaging (LCI) assay8, fluorescentie resonance energy transfer (FRET)6en bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC)7. Hoewel deze drie benaderingen beter dan co-IP aan de directe in-vivo PPI, FRET en BiFC specifieke microscopen te detecteren signalen van de fluorescentie moeten en kunnen niet gemakkelijk kwantificeren van de intensiteit van de interactie. LCI maakt daarentegen gebruik van firefly luciferase, die gloeien zal na reageren met haar substraat luciferine. Nog belangrijker, kan PPI intensiteit worden bepaald uit de waarde van luciferase activiteit. LCI geeft dus niet alleen of de twee eiwitten interactie of niet, maar verstrekt ook informatie over de dynamiek van de interactie op een behandeling. Hoewel er enkele gevestigde methoden voor de controle van interactie dynamics (gebaseerd op oppervlakte plasmon resonantie of thermo-stabiliteit verschuivingen)9,10, betekent dit dat deze benaderingen gevoelige instrumenten of specifieke etikettering nodig. LCI is daarentegen eenvoudiger uit te voeren en te detecteren.
Het principe van LCI is dat de amino-terminal en carboxyl-terminal helften van luciferase (genaamd N-Luc of C-Luc, respectievelijk) waren gesmolten met EiwitA en B, en deze twee fusion eiwitten gelijktijdig werden uitgedrukt in plantencellen. Eiwit A communiceert met eiwit B, zal de twee helften van luciferase worden toegevoegd om een actieve luciferase enzym. Luciferase activiteit kan worden opgespoord met een luminometer of CCD-camera. Het is niet nodig voor het verkrijgen van stabiele transformants voor LCI; voorbijgaande expressie is genoeg om een kwalitatief hoogwaardige interactie resultaat te krijgen.
RING-type E3 ubiquitin ligase constitutieve photomorphogenic 1 (COP1) interageert met een horde van transcriptiefactoren en hun afbraak tot en met de 26S proteasoom11bevordert. Sommige van deze COP1-gerichte transcriptiefactoren zijn positieve regelgevers voor photomorphogenesis. In duisternis communiceert COP1 met suppressor van Phytochroom A-105 1 (SPA1), die COP1 E3 activiteit8verbetert. Na waarneming van licht, zal de researchdieren de COP1-SPA1 interactie vervolgens stabiliseren COP1 substraten12,13,14te COP1 activiteit remmen trekt. In het volgende voorbeeld illustreert de biologische betekenis van studeren PPI en het bepalen van de PPI dynamiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van planten (8 weken)
- Zet 50 Nicotiana benthamiana zaden in een 1,5 mL microcentrifuge buis met 1 mL 5% NaClO en 0,1% Triton X-100 (V/V) oplossing en laat gedurende 5 minuten om de zaden te steriliseren.
- Spoel de zaden met steriel water 5 keer en schorten zaden in 200 µL van steriel water.
- Zorgvuldig plaats individuele zaden over het oppervlak van de MS-agar medium (1 L: 1 x Murashige & Skoog zouten, 10 g sacharose, pH 5,8 (KOH), 1% agar) met fijne tips en winkel middellange platen in 4 ° C voor 3 dagen om te synchroniseren van kiemkracht.
Opmerking: Microbe om besmetting te voorkomen, deze stap uitvoeren op een schone bankje. Het is niet nodig om te schudden van de buis tijdens sterilisatie. - Plaats van middellange platen onder normale groei omstandigheden (22 ° C, 80-90-µmolm-2s-1 witte lichtintensiteit) voor 10 dagen en breng de ontkiemde zaailingen in de bodem.
Opmerking: Zorg ervoor dat het insluiten van zaailing wortels in de bodem en doen geen schade toebrengen aan de wortels. Bedek het dienblad met een transparante plastic cover's nachts om vochtigheid. - Planten groeien in een beheerste groei kamer op een 16/8 uur licht/donker cyclus en 70% vochtigheid. 7-week-oude N. benthamiana planten zijn klaar voor Agrobacteriumtumefaciens infiltratie(Figuur 1).
Opmerking: Water planten en plagen controle desgewenst planten om gezond te houden.
2. Pre-steady expressie in N. Benthamiana bladeren (7-10 dagen)
- Leveren 150 ng van plasmiden, (pEGAD-HA-LUC controle plasmide, lege vector en geconstrueerd plasmide voor LCI assay, in dit geval we gebruikten pCAMBIA1300-Nluc en pCAMBIA1300-Cluc voor plasmide bouw) in A. tumefaciens bevoegde cel van de stam GV3101 met een standaard electroporation methode.
- Cultuur A. tumefaciens Luria Bertani (LB) agar medium (1 L: 10 g NaCl, gistextract 5 g, 10 g trypton, 1,5% agar) met 50 µg/mL kanamycine en 50 µg/mL rifampicine bij 28 ° C gedurende 4 dagen.
Opmerking: De keuze van de antibiotica hangt de vector en de stam van de A. tumefaciens gebruikt. - Inoculeer een single A. tumefaciens kolonie van elke plaat in 3 mL vloeibare voedingsbodem LB met 50 µg/mL kanamycine en 50 µg/mL rifampicine en schudden bij 220 rpm bij 28 ° C gedurende 24 uur doorgeven van cultuur van de cel.
- Pipetteer 75 µL van de bacteriecultuur in 15 mL verse LB opgietvloeistof met 50 µg/mL kanamycine en 50 µg/mL rifampicine, verdunnen het met een factor 200. Cultuur de bacteriën bij 220 t/min bij 30 ° C gedurende ongeveer 8 h, totdat OD600 tussen 0.5 tot 1.0 is.
- Breng de vloeibare cultuur van A. tumefaciens in 15 mL centrifuge buizen en centrifugeer bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 15 min. negeren het supernatant en Suspendeer de pellet in 15 mL transformatie oplossing te wassen pellet.
- Draai de buis bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 15 minuten en verwijder het supernatant. De wassen stap nogmaals.
- Resuspendeer de pellet in 5 mL van de oplossing van de transformatie en houd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Pas de dichtheid van A. tumefaciens pellet cellen met transformatie oplossing totdat de uiteindelijke concentratie van OD600 0,5 of mix twee steekproeven met gelijke volume voor testen gepaarde eiwitinteractie is.
- Zwevende cellen infiltreren in de 4th naar 7th bladeren met een naaldloze spuit van 1 mL (Figuur 1-B-C). Na de infiltratie, planten onmiddellijk te bedekken met een zwarte plastic cover en plaats de lade in duisternis voor 12u. Daarna groeien planten zoals gebruikelijk voor 2 tot 4 dagen voor het opsporen van LUC activiteiten.
Opmerking: Kies gezonde bladeren van vergelijkbare grootte. De infiltratie van vier verschillende zones in één blad is prima.
3. opsporen van Luciferase activiteit (één dag)
Opmerking: Er zijn twee manieren om luciferase activiteit te controleren. Een op imaging is gebaseerd, en de andere is voor het kwantitatief meten van luciferase activiteit.
-
Imaging-methode
- Loskoppelen van een geïnfiltreerde blad en zet de hele bijsluiter op de drager van de MS-agar.
- Spray luciferine werkende buffer op het blad adaxial oppervlak met een 50 mL spray fles. Houd de materialen in het donker voor 5 min om quench de chlorofyl auto-fluorescentie.
- Gebruik een weinig licht gekoelde CCD imaging apparatuur (gekoeld tot-30 ° C) om te fotograferen (Figuur 2). De licht-geplaatst belichtingstijd is 50 ms en luminescentie detectie tijd is 1 min.
Opmerking: Pas de parameters volgens de handleiding van de machine. Lagere temperaturen zullen de signaal-ruisverhouding om beeldkwaliteit te verbeteren.
- U kunt ook meten luminescentie rechtstreeks met een commerciële luminometer.
- Zorgvuldig uitgesneden blad fragmenten (ongeveer 0,25 cm2) uit de infiltratie oppervlakte van de N. benthamiana bladeren en de schijf blad onderdompelen in 100 µL van gedeïoniseerd water in een witte 96-wells-plaat (Figuur 3).
- Voeg 10 µL van luciferine werkende buffer en laat gedurende 5 minuten. Voer specifieke behandelingen om te bestuderen van de dynamiek van de interactie eiwit.
Opmerking: Detecteren de luminescentie met een luminometer op verschillende tijdstippen te verkrijgen van de dynamiek van luciferase activiteit, die de kinetiek van eiwit-eiwitinteractie onder bepaalde behandeling hebben ondergaan vertegenwoordigen. Deze methode heeft voordelen voor het testen van een groot aantal eiwit paren tegelijk. Voor mensen zonder een commerciële luminometer, onderzoeken de luciferase eiwit abundanties door westelijke vlek, daarom verwijzen naar de LUC activiteit quantitively. Als licht niet noodzakelijkerwijs vereist is, net houden van de plaat in de luminometer en meten van luminescentie op verschillende tijdstippen. Overigens, zet de plaat in een kamer van de groei tijdens de detectie-kloof. Gebruik voor het verkrijgen van statistisch significante resultaten, ten minste drie replicaat-biologische organismen. Hoewel LUC activiteiten uit verschillende infiltratie zones variëren zal, stroken hun veranderende patronen na normalisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drie belangrijke stappen kunnen worden uitgekozen in dit luciferase complementatie protocol voor de studie van eiwit-eiwit interacties in vivo, met inbegrip van de plantengroei, tabak infiltratie en de luciferase assay. De meest cruciale stap in dit protocol is vloeibare A. tumefaciens infiltreren in de N. benthamiana bladeren (Figuur 1).
Hier is een voorbeeld van het nut van deze techniek bevestigen Jasmonaat vermindering van de COP1-SPA1 interacties. De amino-terminal en carboxyl-terminal helften van luciferase waren gesmolten met COP1 (COP1-NLuc) of SPA1 (CLuc-SPA1), respectievelijk. COP1-SPA1 interacties resulteren in de complementatie van functionele luciferase. De luciferase activiteit was beeld door CCD camera (Figuur 2) en de enzymatische activiteit kan worden opgespoord met een luminometer (Figuur 3). De mogelijkheid uitsluiten dat luciferase zelf wordt beïnvloed door de behandeling, de full-length luciferase (LUC)-gene was ook Transient uitgedrukt in N. benthamiana bladeren om te dienen als een besturingselement. Luciferase activiteit voordat Jasmonaat behandeling (tijd 0) werd ingesteld 1, en vervolgens elke luciferase activiteit waarde verkregen onder Jasmonaat behandeling was genormaliseerd met tijd 0 om de relatieve luciferase activiteit (Figuur 4). De resultaten toonden aan dat COP1-SPA1 interacties (aangegeven door luciferase activiteit) geleidelijk gedaald in duisternis en dat JA-behandeling verder worden teruggedrongen tot hun interacties.
Figuur 1 . Proces voor de infiltratie van de N. benthamiana .
(A) Abaxial en adaxial uitzicht op planten vóór infiltratie. (B) representatief beeld te tonen van het protocol van de infiltratie. (C) Abaxial en adaxial uitzicht op de planten na de infiltratie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Imaging luciferase activiteit onder CCD-camera.
(A) representatieve afbeelding van een blad van de N. benthamiana onder een normale lichte veld. (B) opsporen luminescentie signalen onder CCD-camera luciferase activiteiten worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Representatief beeld te laten zien hoe meten van luminescentie van gesneden blad schijven.
Geïnfiltreerde blad schijven werden gesneden en zet in een 96-Wells witte plaat voor het meten van luminescentie signalen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Vertegenwoordiger vloeit voort uit een voorbijgaande luciferase complementatie assay.
(A) de duur van de behandeling (tijd) en de oorspronkelijke resultaten van de luminescentie waarde (LUC activiteit) werden vermeld. Er zijn drie onafhankelijke replicatieonderzoeken voor elk monster. Voor het voorbereiden van deze grafiek, was LUC activiteit op verschillende behandeling tijd punten genormaliseerd met tijd 0 als de relatieve activiteit voor LUC.
(B) kwantificering van relatieve LUC activiteiten, COP1-SPA1 interacties tonen in duisternis geleidelijk gedaald, die kan worden verminderd door verdere JA behandeling. De foutbalk geeft de standaarddeviatie (sd). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven is eenvoudig en reproduceerbare voor het bestuderen van in vivo eiwit-eiwitinteractie en bijzonder geschikt voor het opsporen van eiwit interactie dynamiek onder exogene behandeling. De belangrijkste stap in deze test is N. benthamiana infiltratie. Infiltratie om succes te verzekeren, moet de planten zeer gezond. Een andere belangrijke factor is wanneer luciferase activiteit controleren na infiltratie. Er is geen juiste antwoord voor deze vraag. Onderzoekers worden aangemoedigd om luciferase activiteit controleren op verschillende dagen na infiltratie te beoordelen wanneer de luciferase wordt uitgedrukt op het hoogste niveau, omdat we de expressie eiwitniveaus schommelt met tijd8waargenomen.
Het is mogelijk dat geen luminescentie in sommige experimenten kan worden gedetecteerd. Valse negatieven kunnen niet zonder de nodige controles worden uitgesloten. Een full-length luciferase-besturingselement is vereist om te bewijzen infiltratie en luciferase detectie werkt. Vervolgens als er nog geen luminescentie in vermeende eiwit interactie paren, zouden een immunoblot moeten detecteren eiwit expressie, in het geval één of twee eiwitten zijn niet met succes uitgedrukt. De laatste mogelijkheid is dat de eiwitinteractie de luciferase complementatie eiwit conformationele redenen zouden kunnen belemmeren. Als dit gebeurt, met behulp van afgekapt proteïne of eiwit een fusie met N-Luc schakelen of C-Luc zullen helpen dit probleem op te lossen.
Hoewel protoplasten ook populair voor voorbijgaande expressie zijn, het isolement van protoplasten en plasmide levering in protoplast cellen moet specifieke expertise en schadelijke CsCl2 vereist voor grootschalige plasmide extractie. Bovendien, tijdens de isolatie van de protoplast, zijn planten zwaar gewond, die van invloed kunnen zijn op de PPI testen.
Er is geen gouden standaard test. Om onze kennis, kan deze gemakkelijk uitgevoerde luciferase complementatie assay handig eiwit interactie kinetiek informatie kan opleveren. Natuurlijk, zal alternatieve benaderingen voor de studie van eiwit interacties in vivo bevestigen deze resultaten en verbetering van het inzicht van biochemische gebeurtenissen in cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (BK20140919), de nationale Natural Science Foundation van China (31470375), de prioriteit academische programma ontwikkeling van Jiangsu instellingen voor hogeronderwijs en de Qing Lan Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
