Summary
इस पांडुलिपि luciferase गतिविधि की माप के आधार पर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का निर्धारण करने के लिए एक आसान और तेजी से प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन ।
Abstract
प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत सबसे सेलुलर प्रक्रियाओं में संकेत transduction रिले के लिए बुनियादी तंत्र हैं; इसलिए, उपंयास प्रोटीन प्रोटीन संपर्क जोड़े और निगरानी प्रोटीन संपर्क गतिशीलता की पहचान कैसे पौधों पर्यावरणीय कारकों और/या विकास के संकेतों का जवाब बताने के लिए विशेष रुचि के हैं । दृष्टिकोण के ढेर सारे प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए विकसित किया गया है, या तो इन विट्रो में या vivo में। उनमें से, हाल ही में स्थापित luciferase पूरक इमेजिंग (LCI) परख vivo प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत में प्रदर्शन के लिए सबसे सरल और तेजी से विधि है । इस परख में, प्रोटीन एक या प्रोटीन बी अमीनो के साथ जुड़े हुए है-टर्मिनल या carboxyl-luciferase के टर्मिनल आधा, क्रमशः । जब प्रोटीन एक प्रोटीन बी के साथ सूचना का आदान प्रदान, luciferase के दो हिस्सों के लिए एक कार्यात्मक और सक्रिय luciferase एंजाइम फार्म का पुनर्गठन किया जाएगा । Luciferase गतिविधि एक luminometer या सीसीडी-कैमरा के साथ दर्ज किया जा सकता है । अंय दृष्टिकोण के साथ तुलना में, LCI परख प्रोटीन-प्रोटीन दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक बातचीत से पता चलता है । निकोटियाना benthamiana पत्तियों में एग्रोबेक्टीरियम घुसपैठ क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रणाली है । LCI और क्षणिक अभिव्यक्ति के संयोजन के साथ, इन तरीकों से पता चलता है कि COP1 और SPA1 के बीच शारीरिक संपर्क धीरे-jasmonate उपचार के बाद कम हो गया था ।
Introduction
आदेश में अपने पर्यावरण के साथ विकास के समंवय के लिए, पौधों को भावना, transduce सुरुचिपूर्ण संकेतन रास्ते विकसित किया है, और संकेत cues का जवाब । एक रिले दौड़ में धावकों की तरह, प्रोटीन संयंत्र संकेत transduction में आवश्यक खिलाड़ी हैं । यह व्यापक रूप से मांयता दी गई है कि प्रोटीन प्रोटीन संपर्क (पीपीआई) सेलुलर संचार के लिए एक प्रमुख भूमिका निभाता है । प्रोटीन फास्फारिलीकरण, acetylation, और गिरावट सभी एक लक्ष्य प्रोटीन और उसके संशोधित एंजाइमों के बीच शारीरिक संपर्क पर निर्भर हैं । उदाहरण के लिए, Jasmonate ZIM-डोमेन प्रोटीन (झझ) परिवार के प्रोटीन प्रतिलेखन कारक MYC2 के साथ बातचीत और उसके transcriptional गतिविधि1,2को दबाने । पीपीआई के महत्व को देखते हुए पौधों में बड़े पैमाने पर प्रोटीन interactomes हाल ही में3,4,5का पता लगाया गया है । इन interactome परिणाम आगे जटिल नियामक नेटवर्क है कि विविध सेलुलर कार्यों निर्देशांक प्रकट करते हैं ।
पीपीआई की निगरानी के लिए कुछ स्थापित दृष्टिकोण हैं । खमीर दो संकर (Y2H) परख पीपीआई पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है । Y2H करने के लिए आसान है, और एक त्वरित परीक्षण के लिए उपयुक्त करने के लिए प्रोटीन बातचीत की जांच । Y2H भी व्यापक रूप से विशिष्ट प्रोटीन के हित के लिए अज्ञात बातचीत भागीदारों स्क्रीनिंग के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, क्योंकि Y2H पूरी तरह से खमीर में किया जाता है, यह संयंत्र कोशिकाओं में वास्तविक परिदृश्य को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते है और उच्च झूठी सकारात्मक दरों लाता है । इसी तरह की एक और रणनीति को खींच-परख रहे हैं । सामांय में, दो प्रोटीन व्यक्त कर रहे है और ई कोलाई कोशिकाओं से शुद्ध और फिर मिश्रित और प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए मैटीरियल । हालांकि इस विधि समय लेने वाली नहीं है, यह vivo में संपर्क परिणाम या तो प्राप्त नहीं कर सकते । के लिए vivo बातचीत प्रयोजनों में , सह immunoprecipitation (सह आईपी) सबसे लोकप्रिय परख है, जो उच्च गुणवत्ता एंटीबॉडी की आवश्यकता है immunoprecipitate के लिए प्रोटीन के हित और अप्रत्यक्ष PPIs की संभावना को बाहर नहीं कर सकते । इसके अलावा, सह में जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के कारण आई पी, परिणाम आम तौर पर व्यक्तिगत विशेषज्ञता के साथ बदलती हैं ।
रिपोर्टर आधारित पुनर्गठन परख बहुत vivo पीपीआई में का पता लगाने के अग्रिम । इन तरीकों प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट)6, bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक (BiFC)7, और जुगनू luciferase पूरक इमेजिंग (LCI) परख8शामिल हैं । हालांकि इन तीन दृष्टिकोण से बेहतर है सह आईपी को प्रतिबिंबित करने के लिए vivo पीपीआई, झल्लाहट में प्रत्यक्ष, और BiFC प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने के लिए विशिष्ट सूक्ष्मदर्शी की जरूरत है और आसानी से बातचीत की तीव्रता नहीं कर सकते । इसके विपरीत, LCI जुगनू luciferase, जो अपने सब्सट्रेट luciferin के साथ प्रतिक्रिया के बाद चमक जाएगा का लाभ लेता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, पीपीआई तीव्रता luciferase गतिविधि के मूल्य से निर्धारित किया जा सकता है । इस प्रकार, LCI न केवल इंगित करता है कि दो प्रोटीन बातचीत या नहीं, लेकिन यह भी उपचार पर संपर्क गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करता है । हालांकि वहां की निगरानी के लिए कुछ स्थापित तरीके है संपर्क गतिशीलता (सतह plasmon अनुनाद या थर्मामीटरों-स्थिरता बदलाव के आधार पर)9,10, इन तरीकों नाजुक उपकरणों या विशिष्ट लेबल की आवश्यकता है । इसके विपरीत, LCI प्रदर्शन और पता लगाने के लिए आसान है ।
LCI के लिए सिद्धांत यह है कि एमिनो टर्मिनल और carboxyl-टर्मिनल luciferase के हिस्सों (एन ल्यूक या सी-ल्यूक, क्रमशः) प्रोटीन ए और बी के साथ जुड़े हुए थे, और इन दो फ्यूजन प्रोटीन एक साथ संयंत्र कोशिकाओं में व्यक्त किए गए । प्रोटीन बी के साथ एक इंटरैक्ट करता है, तो luciferase के दो हिस्सों एक सक्रिय luciferase एंजाइम होने के लिए पुनर्गठन किया जाएगा । Luciferase गतिविधि एक luminometer या सीसीडी-कैमरा के साथ पता लगाया जा सकता है । यह LCI के लिए स्थिर transformants प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है; परिवर्तनीय अभिव्यक्ति एक उच्च गुणवत्ता वाले संपर्क परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है ।
अंगूठी प्रकार E3 ubiquitin ligase गठन photomorphogenic 1 (COP1) प्रतिलेखन कारकों के साथ बातचीत करता है और 26S proteasome11के माध्यम से उनके क्षरण को बढ़ावा देता है । इन COP1 के कुछ लक्षित प्रतिलेखन कारकों photomorphogenesis के लिए सकारात्मक नियामकों हैं । अंधकार में, COP1 phytochrome के दमन के साथ इंटरैक्ट करता है A-१०५ १ (SPA1), जो COP1 E3 गतिविधि को बढ़ाता है 8. प्रकाश की धारणा के बाद, photoreceptors COP1 गतिविधि को बाधित और फिर COP1 सब्सट्रेट12,13,14स्थिर करने के लिए COP1-SPA1 संपर्क निराकृत होगा । इस उदाहरण के अध्ययन पीपीआई के जैविक महत्व और पीपीआई गतिशीलता का निर्धारण दिखाता है ।
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Protocol
1. पौधों की तैयारी (8 सप्ताह)
- एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ५० निकोटियाना benthamiana बीज रखो 5% NaClO और ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० (वी/वी) समाधान के 1 मिलीलीटर और 5 मिनट के लिए छोड़ने के लिए बीज निष्फल ।
- बाँझ पानी के साथ बीज कुल्ला 5 बार और २०० µ में बीज निलंबित बाँझ पानी की l ।
- ध्यान से एमएस-आगर मध्यम (1 एल: 1x Murashige और Skoog साल्ट, 10 ग्राम सुक्रोज, पीएच ५.८ (कोह), 1% आगर) की सतह पर ठीक सुझावों के साथ और मध्यम प्लेटों की दुकान 4 डिग्री सेल्सियस में 3 दिनों के लिए अंकुरण सिंक्रनाइज़ करने के लिए व्यक्तिगत बीज जगह है ।
नोट: सूक्ष्म संदूषण से बचने के लिए, एक क्लीन बेंच पर यह चरण निष्पादित करें । नसबंदी के दौरान ट्यूब शेक करना जरूरी नहीं है । - सामान्य वृद्धि की स्थिति के तहत मध्यम प्लेटों को रखें (22 ° c, ८०-९० µ molm-2s-1 सफेद प्रकाश तीव्रता) 10 दिनों के लिए, और फिर अंकुरित अंकुरों को मिट्टी में स्थानांतरित करें ।
नोट: मिट्टी में अंकुरित जड़ों को डालने के लिए सुनिश्चित करें और जड़ों को नुकसान न पहुंचाएं । नमी बनाए रखने के लिए रातोंरात एक पारदर्शी प्लास्टिक कवर के साथ ट्रे को ढक कर रखें । - एक 16 एच/8 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र और ७०% आर्द्रता पर एक नियंत्रित विकास कक्ष में पौधों को विकसित करना । 7 सप्ताह पुराने एन benthamiana संयंत्रों Agrobacteriumtumefaciens घुसपैठ (चित्रा 1ए) के लिए तैयार हैं ।
नोट: जल संयंत्रों और नियंत्रण कीट के रूप में पौधों को स्वस्थ रखने की जरूरत है ।
2. N. Benthamiana पत्तियों में क्षणिक अभिव्यक्ति (7-10 दिन)
- उद्धार १५० plasmids के एनजी (pEGAD-हा-ल्यूक नियंत्रण प्लाज्मिड, खाली वेक्टर, और प्लाज्मिड परख के लिए LCI का निर्माण, इस मामले में हम pCAMBIA1300-Nluc और pCAMBIA1300 निर्माण के लिए Cluc का इस्तेमाल किया) में एक के साथ प्लाज्मिड सक्षम सेल तनाव tumefaciens मानक electroporation विधि ।
- कल्चरल A. tumefaciens on Luria-Bertani (LB) आगर मध्यम (1 L: 10 ग्राम NaCl, 5 ग्राम यीस्ट निकालने, 10 ग्राम tryptone, १.५% आगर) जिसमे ५० µ g/एमएल के कनमीसिन और ५० µ g/एमएल के 4 दिनों के लिए 28 ° c पर रिफैंपिसिन/
नोट: एंटीबायोटिक दवाओं की पसंद वेक्टर और ए. tumefaciens तनाव इस्तेमाल पर निर्भर करता है । - लगाना प्रत्येक थाली से एक एकल ए. tumefaciens कॉलोनी पौंड तरल मध्यम के 3 मिलीलीटर में ५० µ जी/एमएल कनमीसिन और ५० µ जी/रिफैंपिसिन के एमएल और 28 डिग्री सेल्सियस पर २२० rpm पर शेक 24 ज के लिए सेल संस्कृति का प्रचार करने के लिए ।
- बैक्टीरियल संस्कृति के ७५ µ एल स्थानांतरण 15 मिलीलीटर ताजा पौंड तरल मध्यम में ५० µ g/एमएल के कनमीसिन और ५० µ जी/रिफैंपिसिन के एमएल, कमजोर यह २०० के एक कारक द्वारा । संस्कृति २२० rpm पर बैक्टीरिया के बारे में 8 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, जब तक आयुध डिपो६०० ०.५ १.० के बीच है ।
- 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में ए. tumefaciens तरल संस्कृति स्थानांतरण और 15 मिनट के लिए ४,००० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और गोली को धोने के लिए परिवर्तन समाधान के 15 मिलीलीटर में गोली निलंबित ।
- 15 मिनट के लिए ४,००० x g और 4 ° c पर ट्यूब स्पिन और supernatant त्यागें । वाशिंग स्टेप को एक बार फिर दोहराएं ।
- परिवर्तन समाधान के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए रखने के लिए । परिवर्तन समाधान के साथ ए tumefaciens गोली कोशिकाओं के घनत्व को समायोजित करें जब तक कि आयुध डिपो६०० के अंतिम एकाग्रता ०.५ है, या युग्मित प्रोटीन बातचीत परीक्षण के लिए समान मात्रा के साथ दो नमूने मिश्रण ।
- एक 1 मिलीलीटर सुई सिरिंज (चित्रा 1बी-सी) के साथ 4वें से 7वें पत्ते में निलंबित कोशिकाओं घुसपैठ । घुसपैठ के बाद, एक काले प्लास्टिक कवर के साथ तुरंत कवर पौधों और 12 एच के लिए अंधेरे में ट्रे जगह है । उसके बाद, ल्यूक गतिविधियों का पता लगाने से पहले 2 से 4 दिनों के लिए हमेशा की तरह पौधों को विकसित ।
नोट: समान आकार के स्वस्थ पत्तियों का चयन करें । एक पत्ती में चार विभिन्न जोनों की घुसपैठ ठीक है ।
3. Luciferase गतिविधि का पता लगाना (एक दिन)
नोट: luciferase गतिविधि पर नज़र रखने के दो तरीके हैं । एक इमेजिंग पर आधारित है, और अंय मात्रात्मक luciferase गतिविधि को मापने के लिए है ।
-
इमेजिंग विधि
- एक घुसपैठ पत्ती अलग और एमएस-आगर मध्यम पर पूरी पुस्तिका डाल दिया ।
- एक ५० मिलीलीटर स्प्रे बोतल के साथ पत्ती adaxial सतह पर luciferin काम कर बफर स्प्रे । 5 मिनट के लिए अंधेरे में सामग्री रखने के लिए क्लोरोफिल ऑटो बुझाने प्रतिदीप्ति ।
- (चित्रा 2) छवियों को पकड़ने के लिए एक कम प्रकाश ठंडा सीसीडी इमेजिंग उपकरण (करने के लिए-30 डिग्री सेल्सियस ठंडा) का प्रयोग करें । प्रकाश दायर जोखिम समय ५० ms है, और luminescence का पता लगाने के समय 1 मिनट है ।
नोट: मशीन मैनुअल के अनुसार मापदंडों को समायोजित करें । निचले तापमान छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए संकेत शोर अनुपात में वृद्धि होगी ।
- वैकल्पिक रूप से, एक वाणिज्यिक luminometer के साथ सीधे luminescence उपाय ।
- ध्यान से पत्ता टुकड़े काट (के बारे में ०.२५ cm2) एन benthamiana पत्तियों की घुसपैठ क्षेत्र से और एक ९६ अच्छी तरह से सफेद प्लेट में जल के १०० µ एल में पत्ती डिस्क विसर्जित (चित्रा 3) ।
- luciferin कार्य बफर के 10 µ एल जोड़ें और 5 मिनट के लिए छोड़ दें । तब प्रोटीन संपर्क गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विशिष्ट उपचार करते हैं ।
नोट: luciferase गतिविधि गतिशीलता प्राप्त करने के लिए भिन्न समय बिंदुओं पर एक luminometer के साथ luminescence का पता लगाएँ, जो कुछ उपचार के अंतर्गत प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के कैनेटीक्स का प्रतिनिधित्व करती है. इस विधि एक साथ प्रोटीन जोड़े की एक बड़ी संख्या के परीक्षण के लिए लाभ है । एक वाणिज्यिक luminometer के बिना उन लोगों के लिए, पश्चिमी दाग से luciferase प्रोटीन बहुतायत की जांच, इसलिए ल्यूक गतिविधि quantitively को देखें । अगर रौशनी जरूरी नहीं है, तो बस थाली को luminometer में रखें और नाप luminescence अलग समय बिंदुओं पर करें । अंयथा, पहचान अंतराल के दौरान प्लेट को एक ग्रोथ चैंबर में ले जाएं । सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए, कम से तीन जैविक प्रतिकृति का उपयोग करें । हालांकि विभिन्न घुसपैठ क्षेत्रों से ल्यूक गतिविधियों अलग-अलग होगा, उनके बदलते पैटर्न सामान्यीकरण के बाद संगत कर रहे हैं.
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Representative Results
तीन प्रमुख कदम इस luciferase पूरक प्रोटोकॉल में vivo मेंप्रोटीन प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए बाहर एकल जा सकता है, संयंत्र वृद्धि, तंबाकू घुसपैठ सहित, और luciferase परख । इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम एन benthamiana पत्तियों (चित्रा 1) में तरल ए tumefaciens घुसपैठ है ।
यहां इस तकनीक की उपयोगिता का एक उदाहरण है पुष्टि jasmonate COP1-SPA1 बातचीत को कम करने । एमिनो-टर्मिनल और carboxyl-टर्मिनल luciferase के आधा COP1 (COP1-NLuc) या SPA1 (CLuc-SPA1), क्रमशः के साथ जुड़े हुए थे । कार्यात्मक luciferase के पूरक में COP1-SPA1 बातचीत परिणाम. luciferase गतिविधि सीसीडी कैमरा (चित्रा 2) द्वारा imaged था, और एंजाइमी गतिविधि एक luminometer (चित्रा 3) के साथ पता लगाया जा सकता है । luciferase ही उपचार से प्रभावित है कि संभावना को बाहर करने के लिए, पूर्ण लंबाई luciferase (ल्यूक) जीन भी क्षणिक एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए एन. benthamiana में व्यक्त किया गया था. jasmonate उपचार (समय 0) से पहले luciferase गतिविधि 1 के रूप में सेट किया गया था, और उसके बाद jasmonate उपचार के अंतर्गत प्राप्त प्रत्येक luciferase गतिविधि मान समय 0 के साथ संबंधित luciferase गतिविधि (आरेख 4) प्राप्त करने के लिए सामान्यीकृत किया गया था । परिणाम से पता चला है कि COP1-SPA1 बातचीत (luciferase गतिविधि द्वारा परिलक्षित) धीरे अंधेरे में गिरावट आई है, और वह जा उपचार आगे उनकी बातचीत कम हो गई ।
चित्र 1 . N. benthamiana घुसपैठ के लिए प्रक्रिया ।
(क) घुसपैठ से पहले पौधों की Abaxial और adaxial देखें. (ख) प्रतिनिधि छवि को घुसपैठ प्रोटोकॉल दिखाने के लिए । (ग) घुसपैठ के बाद पौधों की Abaxial और adaxial देखें. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . इमेजिंग luciferase गतिविधि के तहत सीसीडी-कैमरा ।
(क) एक सामांय प्रकाश क्षेत्र के तहत एक एन benthamiana पत्ती की प्रतिनिधि छवि । (ख) luciferase गतिविधियों को दिखाने के लिए सीसीडी-कैमरा के तहत luminescence संकेतों का पता लगाना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3। प्रतिनिधि छवि को दिखाने के लिए कैसे कट लीफ डिस्क से luminescence को मापने के लिए ।
घुसपैठ की पत्ती डिस्क काट रहे थे और luminescence संकेतों को मापने के लिए एक ९६-अच्छी तरह से सफेद प्लेट में डाल दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . एक क्षणिक luciferase पूरक परख से प्रतिनिधि परिणाम ।
(क) उपचार की अवधि (समय) और luminescence मूल्य (ल्यूक गतिविधि) के मूल परिणाम सूचीबद्ध किए गए. प्रत्येक नमूने के लिए तीन स्वतंत्र प्रतिकृति है । इस चार्ट को तैयार करने के लिए, ल्यूक गतिविधि अलग उपचार समय बिंदुओं पर सापेक्ष ल्यूक गतिविधि के रूप में समय 0 के साथ सामान्यीकृत किया गया था ।
(ख) सापेक्ष ल्यूक कार्यकलापों की ठहराव, अंधकार में COP1-SPA1 सहभागिता को दर्शाते हुए धीरे से अस्वीकृत कर दिया गया, जिसे आगे JA उपचार द्वारा कम किया जा सकता है. त्रुटि पट्टी मानक विचलन (sd) को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
प्रोटोकॉल यहां वर्णित सरल और प्रतिलिपि है vivo प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत में अध्ययन के लिए, और विशेष रूप से उपयुक्त exogenous उपचार के तहत प्रोटीन संपर्क गतिशीलता का पता लगाने के लिए । इस परख में महत्वपूर्ण कदम एन benthamiana घुसपैठ है । घुसपैठ की सफलता सुनिश्चित करने के लिए पौधों को बहुत स्वस्थ होना चाहिए । एक अंय महत्वपूर्ण कारक है जब घुसपैठ के बाद luciferase गतिविधि की जांच करने के लिए । इस सवाल का कोई सही जवाब नहीं है । शोधकर्ताओं ने जब luciferase उच्चतम स्तर पर व्यक्त किया जाता है, क्योंकि हम प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर समय के साथ अस्थिर मनाया जाता है जब न्याय करने के लिए घुसपैठ के बाद विभिन्न दिनों में luciferase गतिविधि पर नजर रखने के लिए प्रोत्साहित कर रहे हैं8.
संभव है कि कुछ प्रयोगों में किसी luminescence का पता न चल सके । उचित नियंत्रणों के बिना False ऋणात्मक को शामिल नहीं किया जा सका । एक पूर्ण लंबाई luciferase नियंत्रण घुसपैठ और luciferase का पता लगाने के काम करता है साबित करने के लिए आवश्यक है । फिर अगर वहां अभी भी ख्यात प्रोटीन संपर्क जोड़े में कोई luminescence है, एक immunoblot के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने की आवश्यकता होगी, मामले में एक या दो प्रोटीन सफलतापूर्वक व्यक्त नहीं कर रहे हैं । पिछले संभावना है कि प्रोटीन पारस्परिक संबंधों के कारण luciferase पूरक बाधा हो सकती है प्रोटीन की वजह से । यदि ऐसा होता है, तो कटा हुआ प्रोटीन का उपयोग या N-ल्यूक या सी-ल्यूक के साथ प्रोटीन संलयन स्विचन इस समस्या को हल करने के लिए उपयोगी हो जाएगा ।
हालांकि protoplasts क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए भी लोकप्रिय हैं, protoplast कोशिकाओं में protoplasts और प्लाज्मिड वितरण के अलगाव विशिष्ट विशेषज्ञता की जरूरत है और बड़े पैमाने पर CsCl निष्कर्षण के लिए2 हानिकारक प्लाज्मिड की आवश्यकता है । इसके अलावा, protoplast अलगाव के दौरान, पौधों को भारी घायल कर रहे हैं, जो पीपीआई परख को प्रभावित हो सकता है ।
कोई सुनहरा मानक परख है । हमारे ज्ञान के लिए, यह आसानी से प्रदर्शन luciferase पूरक परख उपयोगी प्रोटीन संपर्क कैनेटीक्स जानकारी प्रदान कर सकता है । बेशक, vivo में प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण इन परिणामों की पुष्टि और कोशिकाओं में जैव रासायनिक घटनाओं की समझ में सुधार होगा ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम Jiangsu प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (BK20140919), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१४७०३७५), Jiangsu उच्च शिक्षा संस्थानों और किंग लैन परियोजना के प्राथमिकता अकादमिक कार्यक्रम के विकास के द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
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