Summary
Dette manuskriptet beskriver en enkel og rask eksperimentelle prosedyren for å bestemme protein-protein interaksjoner basert på måling av luciferase aktivitet.
Abstract
Protein-protein interaksjoner er grunnleggende mekanismer for videresending signaltransduksjon i mest cellulære prosesser; Identifikasjon av roman protein-protein samhandling par og overvåking protein samhandling dynamics er derfor av særlig interesse for å avsløre hvordan planter reagerer på miljømessige faktorer og/eller utviklingsmessige signaler. En mengde tilnærminger har blitt utviklet for å undersøke protein-protein interaksjoner, enten i vitro eller i vivo. Blant dem er den nylig etablerte luciferase complementation imaging (LCI) analysen den enkleste og raskeste metoden for å demonstrere i vivo protein-protein interaksjoner. I denne analysen, protein A eller protein B er smeltet sammen med den amino-terminal eller carboxyl-terminal delen av luciferase, henholdsvis. Når protein A samhandler med protein B, vil de to halvdelene av luciferase rekonstitueres for å danne en funksjonell og aktive luciferase enzym. Luciferase aktivitet kan registreres med en luminometer eller CCD-kameraet. Sammenlignet med andre tilnærminger, viser LCI analysen protein-protein interaksjoner både kvalitativt og kvantitativt. Agrobacterium infiltrasjon i Nicotiana benthamiana blader er en mye brukt system for forbigående protein uttrykk. Med en kombinasjon av LSI og forbigående uttrykk viser disse metodene at det fysiske samspillet mellom COP1 og SPA1 ble gradvis redusert etter jasmonate behandling.
Introduction
Samordne vekst med omgivelsene, planter utviklet seg elegante signalveier forstand, transduce og svare på signalnettverk signaler. Som løpere i et relé rase er proteiner nødvendig spillere i anlegget signaltransduksjon. Det har vært anerkjent at protein-protein interaksjon (PPT) spiller en viktig rolle for mobil kommunikasjon. Protein fosforylering, acetylation og fornedrelse er alle avhengige av fysiske samspillet mellom et mål protein og dens endring enzymer. For eksempel Jasmonate ZIM domener protein (JAZ) familie proteiner samhandle med transkripsjon faktor MYC2 og undertrykke sine transcriptional aktivitet1,2. Gitt viktigheten av PPT utforsket store protein interactomes i planter har vært nylig3,4,5. Disse interactome resultatene ytterligere avsløre komplekse regulatoriske nettverket som koordinerer mangfoldig cellulære funksjoner.
Er det noen etablerte metoder for overvåking PPI. Gjær to hybrid (Y2H) analysen er den mest brukte metoden for påvisning av PPT. Y2H er enkel å utføre, og egnet for en rask test for å undersøke protein interaksjoner. Y2H er også mye brukt for screening ukjent samhandling partnere for den bestemte protein-av-begrave. Men fordi Y2H er helt gjennomført i gjær, gjenspeiler ikke det den virkelige situasjonen i anlegget celler og gir høy falske positive priser. En annen lignende strategi er rullegardin analysen. Generelt, er to proteiner uttrykt renset fra Escherichia coli celler og blandet og immobilisert for å oppdage protein interaksjoner. Selv om denne metoden ikke er tidkrevende, det kan ikke hente i vivo samhandling resultatene enten. For i vivo samhandling formål er co-immunoprecipitation (co-IP) mest populære analysen, som krever høy kvalitet mot immunoprecipitate protein-av-begrave og kan ikke utelukke muligheten for indirekte PPIs. Videre, på grunn av kompliserte eksperimentelle prosedyrene i co-IP, resultatene vanligvis varierer med individuelle kompetanse.
Reporteren basert rekonstituering analyser forhånd høyeste gjenkjenning av i vivo PPI. Disse metodene omfatter fluorescens resonans energi overføring (bånd)6, resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC)7og den firefly luciferase complementation imaging (LCI) analysen8. Selv om disse tre tilnærminger er bedre enn co-IP for å reflektere den direkte i vivo PPT, bånd og BiFC trenger bestemte mikroskop å oppdage fluorescens signaler og kan ikke lett kvantifisere samhandling intensiteten. Derimot utnytter LCI firefly luciferase, som vil lyse etter reagere med sin substrat luciferin. Enda viktigere, kan PPI intensitet bestemmes fra verdien for luciferase aktivitet. Dermed angir LCI ikke bare om to proteiner samhandle eller ikke, men gir også informasjon om interaksjon dynamikken på behandling. Selv om det er noen etablerte metoder for overvåking samhandling dynamics (basert på overflaten plasmon resonans eller thermo-stabilitet Skift)9,10, krever disse metodene ømfintlige instrumenter eller bestemte merking. LCI er derimot enklere å utføre og oppdage.
Prinsippet LCI er at amino-terminal og carboxyl-terminal halvdelene av luciferase (kalt N-Luc eller C-Luc, henholdsvis) var smeltet sammen med protein A og B, og disse to fusion proteiner ble samtidig uttrykt i anlegget celler. Hvis protein A samhandler med protein B, vil de to halvdelene av luciferase rekonstitueres for å være et aktivt luciferase enzym. Luciferase aktivitet kan oppdages med luminometer eller CCD-kameraet. Det er ikke nødvendig å få stabile transformants for LCI; forbigående uttrykket er nok til å ha et høykvalitets samhandling som resultat.
RING-type E3 ubiquitin ligase grunnleggende photomorphogenic 1 (COP1) samhandler med en myriade av transkripsjonsfaktorer og fremmer deres fornedrelse gjennom 26S proteasome11. Noen av disse COP1 målrettede transkripsjonsfaktorer er positiv regulatorer for photomorphogenesis. I mørket samhandler COP1 med suppressor av phytochrome A-105 1 (SPA1), som forbedrer COP1 E3 aktivitet8. Etter oppfatning av lys, vil fotoreseptorer oppheve COP1-SPA1-samhandling for å hemme COP1 aktivitet og deretter stabilisere COP1 underlag12,13,14. Dette eksemplet illustrerer biologiske betydningen av studere PPT og bestemme PPI dynamics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av planter (8 uker)
- Sette 50 Nicotiana benthamiana frø i en 1,5 mL microcentrifuge tube som inneholder 1 mL av 5% NaClO og 0,1% Triton X-100 (V/V) løsning og la stå i 5 minutter å sterilisere frøene.
- Skyll frøene med sterilt vann 5 ganger og suspendere frø i 200 µL av sterilt vann.
- Nøye sted personlige frø på overflaten av MS-agar medium (1 L: 1 x Murashige & Skoog salter, 10 g sukrose, pH 5,8 (KOH), 1% agar) med fine tips og store medium plater i 4 ° C for 3 dager å synkronisere spiring.
Merk: For å unngå mikrobe forurensning, utføre dette trinnet på en ren benk. Det er ikke nødvendig å riste røret i steriliseringsprosessen. - Plasser medium plater under normal vekst forhold (22 ° C, 80-90 µmolm-2s-1 hvit lysintensitet) i 10 dager, og deretter overføre spirer seedlings i jord.
Merk: Kontroller at du setter inn frøplante røtter i jorda og ikke skader røttene. Dekke skuffen med en gjennomsiktig plast dekke over natten å opprettholde fuktighet. - Dyrke planter i et kontrollert vekst rom på en 16 h/8 h lys/mørke syklus og 70% fuktighet. 7-uke-gamle N. benthamiana planter er klar for Agrobacteriumtumefaciens infiltrasjon (figur 1A).
Merk: Vann planter og kontrollere skadedyr som trengs for å holde plantene sunn.
2. forbigående uttrykk i N. Benthamiana blader (7-10 dager)
- Leverer 150 ng av plasmider (pEGAD-HA-LUC kontroll plasmider, tom vektor og konstruert plasmider for LCI analysen, i dette tilfellet vi brukte pCAMBIA1300-Nluc og pCAMBIA1300-Cluc for plasmider konstruksjon) i A. tumefaciens kompetent celle belastning GV3101 med en standard electroporation metode.
- Kultur A. tumefaciens på Luria-Bertani (LB) agar medium (1 L: 10 g NaCl, 5 g gjærekstrakt, 10 g tryptone, 1,5% agar) inneholder 50 µg/mL av kanamycin og 50 µg/mL og på 28 ° C for 4 dager.
Merk: Valg av antibiotika avhenger av vektoren og A. tumefaciens påkjenningen brukes. - Vaksinere en enkelt A. tumefaciens colony fra hver plate i 3 mL LB flytende medium som inneholder 50 µg/mL av kanamycin og 50 µg/mL og og riste på 220 rpm på 28 ° C i 24 timer overføres cellekultur.
- Overføre 75 µL av bakteriell kultur i 15 mL frisk LB flytende medium som inneholder 50 µg/mL av kanamycin og 50 µg/mL og, fortynne den med en faktor på 200. Kultur bakterier på 220 rpm på 30 ° C i ca 8 timer, til OD600 er mellom 0.5 til 1.0.
- Overføre A. tumefaciens flytende kulturen i 15 mL sentrifuge rør og sentrifuge 4000 x g og 4 ° C i 15 min. Forkast nedbryting og avbryte pellet 15 mL transformasjon løsning å vaske pellets.
- Spinn røret på 4000 x g og 4 ° C i 15 min og forkaste nedbryting. Gjenta trinnet vask igjen.
- Resuspend pellet i 5 mL av transformasjon løsning og holde for 2 timer ved romtemperatur. Justere tettheten av A. tumefaciens pellets celler med transformasjon løsning til den endelige konsentrasjonen av OD600 er 0,5 eller blanding to utvalg med lik volum for testing sammenkoblede protein interaksjoner.
- Infiltrere suspendert cellene i de 4th 7th blader med en 1 mL needleless sprøyte (figur 1ABC). Etter infiltrasjon, dekke planter umiddelbart med en svart plast dekker og plassere skuffen i mørket 12 h. Etter det, dyrke planter som vanlig for 2 til 4 dager før oppdage LUC aktiviteter.
Merk: Velg friske blader av samme størrelse. Infiltrasjon av fire forskjellige soner i ett blad er fin.
3. registrere Luciferase aktivitet (en dag)
Merk: Det er to måter å overvåke luciferase aktivitet. Er basert på bildebehandling, og den andre er å måle kvantitativt luciferase aktivitet.
-
Imaging metode
- Koble en infiltrere blad og sette hele heftet på MS-agar medium.
- Spray luciferin arbeider buffer på blad adaxial overflaten med en 50 mL sprayflaske. Hold materialet i mørket 5 min å slukke klorofyll auto-fluorescens.
- Bruk en lav-lyset avkjølt CCD tenkelig apparat (kjølt ned til-30 ° C) for å ta bilder (figur 2). Lys-arkivert eksponeringstiden er 50 ms luminescence gjenkjenning er 1 min.
Merk: Justere parametere i henhold til maskinen veiledningen. Lavere temperaturer vil forbedre signal-støy-forhold for å forbedre bildekvaliteten.
- Du kan også måle luminescence direkte med en kommersiell luminometer.
- Nøye klippe ut blad fragmenter (om 0,25 cm2) fra området infiltrasjon av N. benthamiana bladene og dyppe blad disken i 100 µL deionisert vann i en 96-brønns hvit plate (Figur 3).
- Legg til 10 µL luciferin arbeider bufferen og la stå i 5 minutter. Deretter utføre spesifikke behandlinger for å studere protein samhandling dynamikken.
Merk: Oppdage luminescence med en luminometer på ulike tidspunkt å få luciferase aktivitet dynamikken, som representerer the kinetics av protein-protein interaksjoner under visse behandling. Denne metoden har fordeler for å teste et stort antall proteiner par samtidig. For dem uten en kommersiell luminometer, undersøke luciferase protein krillens ved western blot, derfor se LUC aktivitet quantitively. Hvis lyset ikke er nødvendigvis nødvendig, bare holde platen i luminometer og måle luminescence på ulike tidspunkt. Ellers Flytt platen til en vekst kammer under gjenkjenning gapet. For å få statistisk signifikante resultater, kan du bruke minst tre biologiske gjentak. Selv om LUC aktiviteter fra forskjellige infiltrasjon soner varierer er deres skiftende mønstre konsekvent etter normalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre hovedtrinn kan bli blinket ut i denne luciferase complementation protokollen for å studere protein-protein interaksjoner i vivo, inkludert plantevekst, tobakk infiltrasjon og luciferase analysen. Det mest avgjørende skrittet i denne protokollen er infiltrert flytende A. tumefaciens til N. benthamiana blader (figur 1).
Her er et eksempel på nytten av denne teknikken bekrefter jasmonate redusere COP1-SPA1 vekselsvirkningene. Amino-terminal og carboxyl-terminal halvdelene av luciferase var smeltet sammen med COP1 (COP1-NLuc) eller SPA1 (CLuc-SPA1), henholdsvis. COP1-SPA1 vekselsvirkningene føre complementation av funksjonelle luciferase. Luciferase aktiviteten ble avbildet av CCD kamera (figur 2), og den enzymatiske aktiviteten kan oppdages med en luminometer (Figur 3). Å utelukke muligheten som luciferase seg påvirkes av behandlingen, full lengde luciferase (LUC) genet ble også transiently i N. benthamiana blader å tjene som en kontroll. Luciferase aktiviteten før jasmonate behandling (tid 0) ble angitt som 1, og deretter hver luciferase aktivitet verdien under jasmonate behandling ble normalisert tid 0 å få relative luciferase aktiviteten (Figur 4). Resultatene viste at COP1-SPA1 vekselsvirkningene (gjenspeiles av luciferase aktivitet) gradvis avvist i mørket, og at JA behandling ytterligere redusert deres samspill.
Figur 1 . Prosess for N. benthamiana infiltrasjon.
(A) Abaxial og adaxial visning av planter før infiltrasjon. (B) representativt bilde å vise infiltrasjon protokollen. (C) Abaxial og adaxial Vis av planter etter infiltrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Bildebehandling luciferase aktivitet under CCD-kameraet.
(A) representativt bilde av en N. benthamiana blad under en vanlig lys-feltet. (B) oppdager luminescence signaler under CCD-kameraet vise luciferase aktiviteter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representativt bilde som viser hvordan å måle luminescence fra skjær blad disker.
Infiltrere blad disker var kuttet og satt i en 96-brønns hvit plate for å måle luminescence signaler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Representant resultater fra en forbigående luciferase complementation analysen.
(A) behandling varigheten (tid) og opprinnelige resultatene av luminescence verdien (LUC aktivitet) ble oppført. Det er tre uavhengige gjentak for hvert utvalg. For å forberede dette diagrammet, var LUC aktivitet på annen behandling tidspunkt normalisert tid 0 som den relative LUC aktiviteten.
(B) kvantifisering av relativ LUC aktiviteter, viser COP1-SPA1 vekselsvirkningene i mørket gradvis avvist, som kan reduseres ytterligere JA behandling. Feilen baren viser standardavviket (sd). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her er enkel og reproduserbar for å studere i vivo protein-protein interaksjoner, og spesielt egnet for å oppdage protein samhandling dynamics under eksogene behandling. Det viktigste trinnet i denne analysen er N. benthamiana infiltrasjon. For å sikre infiltrasjon suksess, må planter være veldig sunt. En annen viktig faktor er da å sjekke luciferase aktivitet etter infiltrasjon. Det er ingen korrekt svar for spørsmålet. Forskere oppfordres til å overvåke luciferase aktivitet på ulike dager etter infiltrasjon å bedømme når luciferase uttrykkes på høyeste nivå, fordi vi observerte protein uttrykk nivåene fluktuerende med tid8.
Det er mulig at ingen luminescence kan påvises i noen eksperimenter. Feilaktige negativer kan ikke utelates uten riktig kontroller. En full lengde luciferase kontroll er nødvendig å bevise infiltrasjon og luciferase gjenkjenning fungerer. Så hvis det er fortsatt ingen luminescence antatte protein samhandling parvis, må en immunoblot oppdage protein uttrykk, i tilfelle en eller to proteiner ikke er er uttrykt. Siste er at protein interaksjoner kan hindre den luciferase complementation av protein conformational grunner. Hvis dette skjer, bruker avkortet protein eller bytte protein fusjon med N-Luc eller C-Luc vil være nyttig å løse dette problemet.
Selv om protoplasts er også populært for forbigående uttrykk, isolering av protoplasts og plasmider levering i protoplast celler trenger spesialkompetanse og krever skadelig CsCl2 for store plasmider utvinning. I tillegg under protoplast isolasjon, er planter sterkt skadet, som kan påvirke PPI analyser.
Det er ingen golden standard analysen. Til vår kunnskap, kan dette lett utført luciferase complementation analysen gir nyttig protein samhandling kinetics informasjon. Selvfølgelig, vil alternative tilnærminger for å studere protein interaksjoner i vivo bekrefte disse resultatene og forbedre forståelse av biokjemiske hendelser i celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation av Jiangsu provinsen (BK20140919), den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (31470375), prioritet faglig Program utvikling av Jiangsu institusjoner for høyere utdanning og Qing Lan prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
