Summary
Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.
Abstract
Protein-protein etkileşimleri sinyal iletimi en hücresel süreçler içinde geçişi için temel mekanizmaları vardır; Bu nedenle, kimliği roman protein-protein etkileşim çiftleri ve protein etkileşim dynamics izleme nasıl bitkiler çevresel faktörler ve/veya gelişimsel sinyalleri yanıt ifşa için özel ilgi vardır. Yaklaşımlar bir bolluk içinde vitro veya vivo içindeprotein-protein etkileşimlerini incelemek için geliştirilmiştir. Bunlar arasında Imaging (LCI) yeni kurulan luciferase uluslara tahlil vivo içinde protein-protein etkileşimleri gösteren için en basit ve en hızlı yöntemdir. Bu tahlil, protein A veya protein B luciferase, amino-terminal veya karboksil-terminal yarısı ile sırasıyla eritilmiş olan. Protein A protein B ile etkileşim kurduğunda, luciferase iki yarısı fonksiyonel ve aktif luciferase enzim oluşturmak için yeniden. Luciferase faaliyet luminometer veya CCD kamera ile kaydedilebilir. Diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, LCI tahlil hem nitelik hem de nicelik protein-protein etkileşimleri gösterir. Agrobacterium infiltrasyon Nicotiana benthamiana yaprakları geçici protein ifade için yaygın olarak kullanılan bir sistemdir. LCI ve geçici ifade kombinasyonu ile COP1 ve SPA1 arasındaki fiziksel etkileşimi jasmonate tedaviden sonra yavaş yavaş düşürülmüştür bu yaklaşımlar göster.
Introduction
Büyüme çevresi ile koordine etmek için bitkiler hissediyorum, transduce ve sinyal yardımlar için yanıt vermek için zarif sinyal yolları gelişmiştir. Bir bayrak yarışı kaçakçıları gibi bitki sinyal iletimi gerekli oyuncu proteinlerdir. Bu yaygın olarak protein-protein etkileşim (PPI) hücresel iletişim için önemli bir rol oynar kabul edilmiştir. Protein fosforilasyon, asetilasyon ve yıkımı tüm hedef protein ve onun değiştirme enzimler arasında fiziksel etkileşim bağlıdır. Örneğin, Jasmonate ZIM-etki alanı protein (JAZ) aile proteinler transkripsiyon faktörü MYC2 ile etkileşim ve onun transkripsiyon etkinlik1,2bastırmak. ÜFE önemi göz önüne alındığında, büyük ölçekli protein interactomes tesislerinde olmuştur son zamanlarda3,4,5araştırdı. Bu interactome sonuçlar daha da çeşitli hücresel fonksiyonları koordinatları karmaşık düzenleyici ağ ortaya koyuyor.
ÜFE izlemek için kurulan bir yaklaşım vardır. Maya iki hibrid (Y2H) tahlil PPI algılama için en çok kullanılan yöntemdir. Y2H yapmak kolay ve protein etkileşimlerini incelemek hızlı bir test için uygundur. Y2H bilinmeyen etkileşim ortakları belirli protein-in-faiz için eleme için de yaygın olarak kullanılır. Y2H tamamen Maya gerçekleştirilir çünkü ancak, bu gerçek senaryo bitki hücreleri ve yüksek yanlış pozitif oranları getiriyor yansıtmak değil. Başka bir strateji açılan tahlil olduğunu. Genel olarak, iki protein ifade edilen Escherichia coli hücrelerden saf ve karışık ve protein etkileşimleri algılamak için immobilize. Bu yöntem zaman alıcı olmasa da, bu vivo içinde etkileşim sonuçları da elde edemiyor. Vivo etkileşim, co-immunoprecipitation (co-IP) yüksek kalite antikor immunoprecipitate protein ilgi gerektirir ve dolaylı PPIs olasılığı dışlayamazsınız en popüler tahlil amaçlıdır. Ayrıca, co-IP karmaşık deneysel prosedürler nedeniyle sonuçlar genellikle bireysel uzmanlığı ile farklı.
Muhabir dayalı sulandırma deneyleri büyük ölçüde vivo içinde PPI tespiti ilerlemek. Bu yöntemler Floresans rezonans enerji transferi (FRET)6, bimolecular floresan uluslara (BiFC)7ve (LCI) tahlil8Imaging ateş böceği luciferase uluslara içerir. Bu üç yaklaşım olmasına rağmen daha iyi co-IP doğrudan vivo içinde yansıtmak için PPI, perde ve BiFC floresan sinyallerini algılamak için özel mikroskoplar gerekir ve kolayca etkileşim yoğunluğunu ölçmek olamaz. Buna ek olarak, LCI, substrat biyoluminesans ile tepki sonra parlayan ateş böceği luciferase yararlanır. Daha da önemlisi, ÜFE yoğunluk luciferase aktivite değerinden belirlenebilir. Böylece, LCI sadece iki protein etkileşim veya değil, ancak aynı zamanda tedavi üzerine etkileşim dinamikleri hakkında bilgiler sağlar olup olmadığını gösterir. Etkileşim (yüzey plasmon rezonans veya termo-istikrar vardiyalara göre) dynamics9,10, izlemek için kurulan bir yöntem olmakla bu yaklaşımlar hassas aletler veya belirli etiketleme gerektirir. Buna ek olarak, LCI gerçekleştirmek ve bulmak kolaydır.
LCI prensip luciferase (N-Luc veya C-Luc, sırasıyla adlı) amino-terminal ve karboksil-terminal yarısı bu protein A ve B ve proteinlerin aynı anda bitki hücrelerinde ifade bu iki füzyon ile erimiş. Protein A protein B ile etkileşim, luciferase iki yarısı bir etkin luciferase enzim olmak yeniden. Luciferase faaliyet luminometer veya CCD kamera ile tespit edilebilir. LCI için kararlı transformants elde etmek gerekli değildir; geçici ifade bir yüksek kaliteli etkileşim sonuç almak için yeterlidir.
HALKA tipi E3 Ubikuitin ligaz bünye photomorphogenic 1 (COP1) transkripsiyon faktörleri sayısız ile etkileşim ve onların bozulması-26S proteasome11teşvik etmektedir. Bu COP1 hedefli transkripsiyon faktörlerin bazıları olumlu düzenleyiciler, photomorphogenesis için. Karanlıkta, COP1 phytochrome A-105 1 (SPA1), COP1 E3 etkinlik8artırır bastırıcı ile etkileşime girer. Sonra algı ışık photoreceptors COP1 etkinliği inhibe ve COP1 yüzeylerde12,13,14stabilize etmek üzere COP1-SPA1 etkileşimi iptal etmek. Bu örnek eğitimi PPI ve ÜFE dynamics belirleme biyolojik önemi gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bitki (8 hafta) hazırlanması
- %5 NaClO ve % 0.1 Triton X-100 (V/V) çözüm ve bırak tohumlar sterilize etmek 5 min için 1 mL içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 50 Nicotiana benthamiana tohum koymak.
- 5 kez tohum steril su ile durulayın ve tohum steril su 200 µL içinde askıya alma.
- Dikkatli bir şekilde yer bireysel tohum ince ipuçları ve çimlenme eşitlemek 3 gün boyunca 4 ° C'de mağaza orta plakaları ile MS-agar orta (1 l (KOH), 1 x Murashige & Skoog tuzları, 10 g Sükroz, pH %5,8 1 agar) yüzeyinin.
Not: mikrop kirlenmesini önlemek için temiz bir bankta bu adımı gerçekleştirin. Tüp sterilizasyon sırasında sallamak gerekli değildir. - Koşullarda normal büyüme (22 ° C, 80-90 µmolm-2s-1 beyaz ışık şiddeti) 10 gün için orta plakaları yerleştirin ve ardından toprağa germinated fidan aktarın.
Not: fide kökleri toprağa taktığınızdan emin olun ve kökleri zarar vermeyen. Tepsiyi nem korumak için bir şeffaf plastik kapak ile gecede kapsayacak. - 16 h/8 h açık/koyu döngüsü ve % 70 nem kontrollü büyüme odasındabir bitkiler büyümek. 7-hafta-yaşlı i. benthamiana bitkiler Agrobacteriumtumefaciens infiltrasyon (şekil 1A) için hazır.
Not: bitkilerin su ve bitkiler sağlıklı tutmak için gerektiği gibi zararlıları kontrol edin.
2. geçici ifade İ. Benthamiana yaprakları (7-10 gün)
- Plazmid teslim 150 ng (pEGAD-HA-LUC denetim plazmid, boş vektör ve inşa plazmid LCI için tahlil, bu durumda biz pCAMBIA1300-Nluc ve pCAMBIA1300-Cluc plazmid yapımı için kullanılan) A. tumefaciens yetkili hücreye GV3101 ile zorlanma bir Standart elektroporasyon yöntemi.
- Kültür A. tumefaciens Luria-Bertani (LB) agar orta (1 l 10 g NaCl, 5 g maya ekstresi, 10 g tryptone, %1,5 agar) içeren 50 µg/mL sefaloridin ve Rifampisin 28 ° c 4 gün için 50 µg/mL.
Not: Vektör ve kullanılan A. tumefaciens zorlanma antibiyotik seçimi bağlıdır. - Bir aşılamak her plaka A. tumefaciens koloni 3 mL LB sıvı orta sefaloridin 50 µg/mL ve 50 µg/mL Rifampisin içeren tek ve 28 ° c hücre kültürü yaymak 24 h için 220 rpm'de sallamak.
- Bakteriyel kültürünün 75 µL 15 mL taze LB sıvı sefaloridin 50 µg/mL ve 50 µg/mL Rifampisin, 200 katına sulandrarak içeren orta içine aktarın. OD600 0.5-1.0 arasında olana bakteri için 8 h hakkında 30 ° C'de 220 rpm'de kültür.
- 15 mL santrifüj tüpleri A. tumefaciens sıvı kültüründe aktarmak ve 4.000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika atma süpernatant süreyle santrifüj kapasitesi ve pelet pelet yıkamak için dönüştürme çözüm 15 mL askıya alma.
- 4000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika tüp spin ve süpernatant atın. Bir kez daha çamaşır adımı yineleyin.
- Pelet 5 mL dönüştürme çözüm resuspend ve 2 h için oda sıcaklığında tutmak. OD600 son konsantrasyonu 0.5 veya karışımı iki örnek ile eşit birim test eşleştirilmiş protein etkileşimleri için olana A. tumefaciens Pelet hücreleri dönüştürme çözüm ile yoğunluğunu ayarlayın.
- Askıya infiltrat hücreleri içine 7 4th th 1 mL needleless şırınga (şekil 1B-C) bırakır. İnfiltrasyon sonra bitkiler hemen ile siyah bir plastik kapak kapak ve karanlık 12 h için belgili tanımlık tepsi yer. Bundan sonra 2-4 gün önce LUC faaliyetleri tespit için her zamanki bitkiler büyümek.
Not: sağlıklı yaprakları benzer boyutu seçin. Bir yaprak dört farklı dilimlerinde infiltrasyonu yolunda.
3. Luciferase etkinlik (bir gün) tespit
Not: Luciferase etkinliğini izlemek için iki yol vardır. Bir görüntüleme üzerinde temel alır ve diğer kantitatif luciferase etkinliğini ölçmek etmektir.
-
Görüntüleme yöntemi
- İnfiltre bir yaprak bağlantısını kesin ve tüm broşür MS-agar orta koymak.
- Biyoluminesans çalışma arabellek yaprak adaxial yüzeyine 50 mL sprey şişe sprey. Malzemeler klorofil otomatik Floresans gidermek 5 min için anlatmamanı.
- Esir alma imge (Şekil 2) için aparatı (-30 ° C-soğutmalı) görüntüleme bir düşük ışık soğutmalı CCD kullanın. Işık under çekim hızı 50 ms ve ışıldama algılama zaman 1 dak.
Not: makine kılavuzuna göre parametrelerini ayarlamak. Düşük sıcaklıklar görüntü kalitesini artırmak için sinyal-gürültü oranı artıracaktır.
- Alternatif olarak, bir ticari luminometer ile doğrudan ışıldama ölçmek.
- Dikkatle i. benthamiana yaprakların infiltrasyon alanından (yaklaşık 0.25 cm2) yaprak parçaları kesip ve yaprak disk 100 µL 96-şey beyaz plaka (şekil 3) deiyonize su içine bırakın.
- Biyoluminesans çalışma arabelleği 10 µL eklenir ve 5 min için bırakılır. Sonra protein etkileşim dynamics çalışmaya spesifik tedaviler gerçekleştirin.
Not: bir luminometer protein-protein etkileşimleri belirli tedavi altında Kinetik temsil luciferase aktivite dynamics elde etmek için farklı zaman noktalarda ile ışıldama algılamak. Bu yöntem çok sayıda protein çiftleri aynı anda test etmek için avantajları vardır. Bu bir ticari luminometer olmadan luciferase protein miktar tarafından western blot incelemek, bu nedenle LUC aktivite quantitively bakın. Işık mutlaka gerekli değildir, sadece plaka luminometer içinde tutmak ve farklı zaman noktalarda ışıldama ölçmek. Aksi takdirde, plaka algılama boşluk sırasında bir büyüme odasına taşımak. İstatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için en az üç biyolojik çoğaltır kullanın. LUC faaliyetleri farklı infiltrasyon bölgelerdeki değişir de, onların değişen desenler normalleştirme sonra tutarlı vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üç büyük adım protein-protein etkileşimleri vivobitki büyüme, tütün infiltrasyon ve luciferase tahlil de dahil olmak üzere, eğitim için bu luciferase uluslara protokolündeki saydı. Bu iletişim kuralı en önemli adımda sıvı A. tumefaciens i. benthamiana yaprakları (şekil 1) sızmak.
İşte jasmonate COP1-SPA1 etkileşimleri azaltarak onaylayan bu teknik kullanışlılığı bir örnektir. Luciferase amino-terminal ve karboksil-terminal yarısı COP1 ile erimiş (COP1-NLuc) veya SPA1 (CLuc-SPA1), anılan sıraya göre. COP1-SPA1 etkileşimleri fonksiyonel luciferase tamamlayıcı neden. Luciferase aktivite CCD kamera (Şekil 2) tarafından yansıma ve enzimatik aktivite ile bir luminometer (şekil 3) tespit edilebilir. O luciferase olasılığını dışlamak için tedavi tarafından etkilenir, tam uzunlukta luciferase (LUC) gene de geçici bir denetimi hizmet için i. benthamiana yaprakları ifade. Luciferase faaliyet jasmonate tedavi (süresi 0) öncesi 1 ayarlayın ve sonra jasmonate tedavi alınan her luciferase aktivite değeri zaman almak göreli luciferase hareket (şekil 4) için 0 ile normalleştirilmiş. Sonuçlar (luciferase etkinliği ile yansıtılır) COP1-SPA1 etkileşimleri yavaş yavaş karanlıkta reddetti gösterdi ve o JA tedavi daha fazla onların etkileşim düşük.
Resim 1 . İ. benthamiana infiltrasyon işlemde.
(A) Abaxial ve infiltrasyon önce bitkilerin adaxial görünümü. (B) infiltrasyon Protokolü göstermek için temsili resim. (C) Abaxial ve infiltrasyon sonra bitkilerin adaxial görünümü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Luciferase faaliyet altında CCD kamera görüntüleme.
(A) temsilcisi görüntüsü altında normal bir ışık alan bir i. benthamiana yaprağı. (B) luciferase faaliyetleri göstermek için algılama ışıldama sinyalleri CCD kamera altında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Gelen ışıma ölçmek nasıl göstermek için temsilcisi görüntü kesme yaprak diskler.
İnfiltre yaprak diskler ve ışıldama sinyalleri ölçmek için 96-şey beyaz bir tabak içine koydu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Temsilcisi bir geçici luciferase uluslara tahlil sonuçları.
(A) tedavi süresi (saat) ve ışıldama değeri (LUC aktivite), özgün sonucunu listelenen. Orada her örnek için üç bağımsız çoğaltır. Bu grafik hazırlamak için farklı tedavi zaman noktalarda LUC aktivite ile zaman 0 göreli LUC aktivite normalleştirilmiş.
(B) COP1-SPA1 etkileşimleri karanlıkta yavaş yavaş gösterilen Quantification göreli LUC faaliyetlerinin, hangi-ebilmek azal ile daha fazla JA tedavi reddetti. Hata çubuğu standart sapma (sd) gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan basit ve in vivo protein-protein etkileşimleri çalışmak için tekrarlanabilir ve protein etkileşim dynamics eksojen tedavi altında tespit için özellikle uygun protokolüdür. Bu tahlil anahtar i. benthamiana infiltrasyon adımdır. İnfiltrasyon başarılı olmasını sağlamak için bitkiler çok sağlıklı olması gerekir. Bir başka önemli faktör luciferase aktivite infiltrasyon sonra kontrol etmek ne zaman olacağı. Doğru cevap bu soru için vardır. Araştırmacılar farklı gün sonra saat8ile dalgalanıyor protein ifade düzeyleri görülmektedir çünkü luciferase en üst düzeyde ifade yargılamaya infiltrasyon, luciferase etkinliğini izlemek için teşvik edilir.
Hiçbir ışıldama bazı denemelerinde algılanabilir mümkündür. Yanlış negatifleri uygun denetimleri olmadan dışarıda değil. Bir tam uzunlukta luciferase infiltrasyon ve luciferase algılama çalışmaları kanıtlamak için gerekli olduğu. Eğer hala yok ışıldama sözde protein etkileşim çiftler halinde, bir ya da iki proteinler yok başarılı bir şekilde ifade edilir diye sonra bir immunoblot protein ifade, algılamak için gerekli olacaktır. Protein etkileşimleri protein konformasyon nedenlerden dolayı luciferase uluslara engel son ihtimal. Bu durumda, protein veya N-Luc ile protein fusion geçiş kullanarak kesildi veya C-Luc bu sorunu çözmek yardımcı olacaktır.
Önceki da geçici ifade için popüler olmakla birlikte, yalıtım önceki ve plazmid teslim protoplast hücrelere belirli uzmanlık ihtiyacı ve zararlı CsCl2 büyük ölçekli plazmid çıkarma için gerektirir. Buna ek olarak, protoplast yalıtım sırasında bitkiler ağır, ÜFE deneyleri, etkileyebilir yaralı.
Hiçbir altın standart tahlil vardır. Bilgimizi, bu kolayca gerçekleştirilen luciferase uluslara tahlil yararlı protein etkileşim Kinetik bilgi sağlayabilir. Tabii ki, protein etkileşimleri vivo içinde eğitim için alternatif yaklaşımlar bu sonuçları onaylamak ve hücrelerdeki biyokimyasal olaylar anlayış geliştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Jiangsu eyaleti doğal Bilim Vakfı (BK20140919), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31470375), öncelik akademik Program Geliştirme, Jiangsu yükseköğretim kurumları ve Qing Lan proje tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
