Summary
Denne protokollen beskriver en ny metode for å undersøke en form for kjemisk neurostimulation wholemount rotten Netthinne i vitro med signalstoffet glutamat. Kjemisk neurostimulation er et lovende alternativ til den konvensjonelle elektrisk neurostimulation retinal neurons for behandling av irreversible blindhet forårsaket av photoreceptor degenerative sykdommer.
Abstract
Photoreceptor degenerative sykdommer forårsake uopprettelig blindhet gjennom progressiv tap av photoreceptor celler i netthinnen. Netthinnen protesene er en ny behandling for photoreceptor degenerative sykdommer som søker å gjenopprette visjon ved kunstig stimulere overlevende retinal neurons i håp om å fremlokkende forståelig visuell persepsjon hos pasienter. Gjeldende retinal proteser vist suksess i gjenopprette begrenset visjon til pasienter som bruker en rekke elektroder elektrisk stimulere netthinnen men møte store fysiske barrierer i å gjenopprette høy skarphet, naturlige visjon pasienter. Kjemisk neurostimulation bruke native nevrotransmittere er en biomimetic alternativ til elektrisk stimulering og kunne omgå grunnleggende begrensningene knyttet til netthinnen proteser bruker elektrisk neurostimulation. Spesielt har kjemiske neurostimulation potensial til å gjenopprette mer naturlig visjon med tilsvarende eller bedre visual acuities til pasienter ved å injisere svært små mengder av nevrotransmittere, samme naturlig agenter for kommunikasjon brukt av retinal kjemisk synapser, med mye finere oppløsning enn gjeldende elektrisk proteser. Men som en relativt uutforsket stimulering paradigme er det ingen etablert protokoll for å oppnå kjemiske stimulering av netthinnen i vitro. Formålet med dette arbeidet er å gi et detaljert rammeverk for å utføre kjemisk stimulering av netthinnen for etterforskerne som ønsker å studere potensial av kjemiske neuromodulation av netthinnen eller lignende nevrale vev i vitro. I dette arbeidet, beskriver vi eksperimentelle oppsett og metodikk for fremlokkende retinal ganglion celle (RGC) spike svar lik visuelle lys svar i vill-type og photoreceptor-utartet wholemount rotten Netthinne ved å injisere kontrollerte mengder signalstoffet glutamat i subretinal plass med glass Mikropipetter og en egendefinert multiport microfluidic. Denne metodikken og protokollen er generelle nok å være tilpasset neuromodulation andre nevrotransmittere, eller med andre nevrale vev.
Introduction
Photoreceptor degenerative sykdommer, for eksempel retinitis pigmentosa og aldersrelatert makuladegenerasjon, er viktigste arvbare årsakene til synstap og er for tiden uhelbredelig1,2. Selv om disse sykdommer oppstår fra en rekke spesifikke genetiske mutasjoner, kjennetegnes photoreceptor degenerative sykdommer som en gruppe av progressiv tap photoreceptor cellene i netthinnen, som til slutt fører til blindhet. Tap av fotoreseptorer utløsere utbredt remodeling gjennom netthinnen men gjenlevende retinal neurons, inkludert bipolar celler og RGCs, fortsatt intakt og relativt funksjonelle i avanserte stadier av photoreceptor degenerasjon3 ,4,5,6,7.
Mekanismer og patologi av disse sykdommene har vært godt preget3,4,5,6,7 men en effektiv behandling fortsatt er unnvikende. De siste tre tiårene, har forskere verden over undersøkt en rekke terapeutiske behandlinger for å gjenopprette visjon til de berørte med photoreceptor degenerative sykdommer inkludert gene terapi8, stilk cellen behandling9, netthinnen transplantasjon10og kunstig stimulering11,12 av de overlevende retinal nervecellene. Av disse er mest klinisk tilgjengelig netthinnen proteser, som er kunstige neurostimulation enheter som tradisjonelt har benyttet en rekke elektroder å stimulere elektrisk enten bipolar celler eller RGCs i bestemte mønstre med mål om å skape kunstige visuelle oppfatninger i pasienter11. Dagens generasjon elektrisk proteser, som Argus II13 og Alpha-IMS14 enheter, har oppnådd klinisk godkjenning og Foreløpige undersøkelser har vist at de kan forbedre livskvaliteten for pasienter ved å gjenopprette en mål visjon med både epiretinal (foran på netthinnen) og subretinal (bak netthinnen) implantert enheter15,16. Forskningsgrupper verden arbeider på fremmarsj retinal proteser utover at disse første generasjon enheter17,18,19,20 men har møtt vanskeligheter utforme en elektrisk protesen kan gjenopprette høy skarphet visjon toppnivå juridiske blindhet pasienter. Nyere studier har vist at oppnå høyere romlig oppløsning enn aktiveres av dagens generasjon elektrisk-baserte protesene er utfordrende på grunn av injeksjon oppkrevingsgrense, som nødvendiggjør bruk av store elektroder å trygt stimulere netthinnen neurons på bekostning av romlig oppløsning, dvs synsskarphet11,21. Videre elektrisk stimulering er ytterligere begrenset fordi det vanligvis stimulerer alle nærliggende celler og derfor utløser unaturlig og forvirrende oppfatninger hos pasienter, hovedsakelig fordi det er en iboende unaturlig stimulering paradigme21. Likevel har elektrisk stimulering tidlige suksesser vist at kunstig neurostimulation kan være en effektiv behandling for photoreceptor degenerative sykdommer. Dette fører en til hypothesize at en enda mer effektiv behandling kan være oppnåelig ved å stimulere netthinnen nevrotransmitter kjemikalier naturlig agenter for kommunikasjon på kjemiske synapser. Formålet med metoden presentert i denne utredningen er å utforske terapeutiske muligheten for kjemiske stimulering, som søker å etterligne naturlig systemet synaptic kommunikasjon mellom retinal neurons, som en biomimetic alternativ til elektrisk stimulering for en netthinnen protese.
Oversettelse av begrepet terapeutisk kjemisk stimulans til en kjemisk retinal protese er avhengig av kjemisk aktivere målet retinal neurons med små mengder av innfødte signalstoffer, som glutamat, gjennom en microfluidic enhet som består av et stort utvalg av microports svar på visuell stimulering. På denne måten vil en kjemisk retinal protese i hovedsak være et biomimetic kunstig photoreceptor lag som oversetter fotoner naturlig nå netthinnen til kjemiske signaler. Siden disse kjemiske signalene bruker samme signalstoffer benyttes i vanlig retinal signalering og stimulere overlevende retinal nervecellene i en degenerert netthinnen gjennom samme synaptic veier brukt av normalt syn veier, den resulterende visuelle persepsjon gjennom en kjemisk retinal protese kan være mer naturlig og forståelig sammenlignet med en fremkalt gjennom en elektrisk protese. Videre, siden microports som utgis nevrotransmittere kan gjøres svært små og plassert i høye befolkningstetthet, i motsetning til elektrodene, en potensiell kjemisk protese kan være dugelig å oppnå mer fokal stimulering og høyere romlige oppløsning enn en elektrisk protese. Således, basert på disse potensielle fordeler, en kjemisk retinal protese tilbyr en lovende alternativ til elektriske proteser.
Kjemisk stimulering av netthinnen, men er relativt lite utforsket inntil nylig. Mens elektrisk stimulering av netthinnen har vært godt preget over tiår med arbeid i vitro22,23, i vivo23,24og kliniske studier13 ,14, studier av kjemiske stimulering har vært begrenset til noen i vitro arbeider25,26,27,28. Iezzi og Finlayson26 og Inayat et al. 27 vist epiretinal kjemiske stimulering av netthinnen i vitro med en enkelt elektronen og et multielectrode utvalg (MEA), henholdsvis, registrere glutamat utløste svarene på netthinnen neurons. Flere nylig, Rountree et al. 28 vist differensial stimulering av av og på netthinnen veier med glutamat fra subretinal siden og en MEA registrere neuronal svarene fra flere områder på netthinnen.Selv om disse verkene har foreløpig etablert muligheten for kjemiske stimulering, videre studier er nødvendig å undersøke mange aspekter av denne tilnærmingen utover de adressert hittil25,26,27 , 28og finjustere terapeutiske stimulering parameterne i både i vitro og vivo dyremodeller før oversette dette konseptet til en kjemisk retinal protese som beskrevet ovenfor. Men for øyeblikket er det ingen etablert metode for å utføre kjemisk stimulering av netthinnen i litteratur og metodene som brukes i tidligere verk har ikke blitt beskrevet i slike detaljer som vil være viktig for replicative studier. Derfor er begrunnelsen for notatet metoder å gi et godt definert rammeverk for å gjennomføre i vitro kjemiske stimulering av netthinnen for disse etterforskere interessert i enten replikere våre tidligere studier27, 28 eller ytterligere fremme dette begynnende begrepet kjemiske neurostimulation.
Her viser vi en metode for å gjennomføre i vitro kjemiske stimulering av netthinnen nerveceller i wholemount Netthinne av vill-type rotter og en photoreceptor degenerert rotte modell som nærmere etterligner progresjon av photoreceptor degenerative sykdommer hos mennesker. Begrunnelsen bak utvikle denne stimulering metoden i vitro modeller er å evaluere de terapeutiske områdene med ulike stimulering parametere og studere nevrale respons egenskaper som er umulig eller vanskelig å i vivo modeller, spesielt i de første studiene fokusert på å vurdere muligheten for denne tilnærmingen. Her viser vi både ett område og samtidige multi-site kjemiske stimulations av Netthinne ved å levere små mengder 1 mM glutamat nær målet retinal neurons via kommersielt tilgjengelig én port glass Mikropipetter og en tilpasset micromachined flere porter microfluidic enhet, henholdsvis. Mens både single- og multi-område stimulations oppnå det grunnleggende målet for å undersøke terapeutiske muligheten av kjemiske neuromodulation, har hver en distinkt formål med en unik fordel. Ett område stimulering, som kan oppnås med kommersielt tilgjengelig pre trakk glass Mikropipetter, kan brukes til å injisere kjemikalier direkte i undergrunnen av netthinnen på ett enkelt sted og tjener til å undersøke om observerbare RGC pigg rate svar som ligner på visuelt vakte lys svar brakt frem focally under injeksjonsstedet. På den annen side, multi-site stimulering, som krever en spesielt fabrikkerte multiport microfluidic enhet, kan brukes til å injisere kjemikalier romlig på flere nettsteder over overflaten av netthinnen og tjener til å undersøke hvor godt glutamat-utløste RCG reaksjonsmønster tilsvarer glutamat injeksjon mønstre i mønster stimulering studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjene skissert av National Research Council's Guide og bruk av forsøksdyr. Dyr håndtering og euthanasia protokoller blir gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Illinois i Chicago.
1. dyremodeller
- Vill-type lang-Evans rotter
- Skaffe en 24-32 dag gammel vill-type lang Evans Hooded rotte av begge kjønn reist med en standard 12t dag/natt rytme.
- Mørk tilpasse rotta ved å plassere den i et helt mørkt rom 1t før begynnelsen eksperiment.
- S334ter-3 rotter
- Krysse transgene albino homozygous S334ter-3 rotte linjen (begge kjønn), uttrykker to kopier av mutant rhodopsin genet, med pigmentert vill-type lang-Evans rotte å produsere pigmentert heterozygote S334ter-3 rotter som viser photoreceptor degenerasjon lignende i progresjon til menneskelig retinitis pigmentosa29,30.
- Heve heterozygote avkom med standard 12t dag/natt rytme og bruke rotter av begge kjønn for eksperimenter av følgende aldre tilsvarer følgende photoreceptor degenerasjon stadier: tidlig stadium degenerasjon: 14-20 dager gammel. Midtre fase degenerasjon: 21-27 dager gammel. Sent stadium degenerasjon: 28-35 dager gammel. Helt blind: > 50 dager gamle.
- Mørk tilpasse rotta ved å plassere den i et helt mørkt rom 1t før begynnelsen eksperiment.
2. forberedelse av Ames' middels løsning og perfusjon System
Figur 1: skjematisk av eksperimentelle oppsett. Skjematisk av eksperimentelle oppsettet for kjemiske stimulering bruke a glass brønnene (A) og en egendefinert multiport microfluidic enhet (B). Netthinnen er plassert på en pMEA og kontinuerlig parfyme med friske, oksygenrikt Ames middels løsning både på toppen og bunnen gjennom de pMEA hullene. Nevrale respons signaler plukket opp av elektrodene på pMEA mates gjennom MEA forsterkeren inn en data oppkjøpet datamaskin. Visuelle og kjemiske stimulering er oppnådd med en grønn LED og en 8-kanals press injektor, henholdsvis, og begge stimuli utløses av en dedikert stimulans datamaskin, som også brukes til å plassere pipette via en presisjon 3-akse micromanipulator. En invertert mikroskop brukes til å observere netthinnen under et eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksperimentelle oppsett. (A) bilde av hele eksperimentelle oppsettet viser de relative plasseringene til alle komponenter. MEA forsterker systemet plasseres oppå en invertert mikroskop, som brukes til å visuelt inspisere netthinnen og digitalt bilde enhet-netthinnen grensesnittet ved hjelp av det vedlagte høyhastighets kameraet under eksperimentet. Topp og bunn perfusjon styres uavhengig ved hjelp av en magnetventil-kontrollerte perfusjon system. Injeksjon, posisjon kontroll og impedans målinger er oppnådd med en trykket injektor, micromanipulator og patch klemme forsterker (oransje boks, vises mer detaljert i B), henholdsvis. Brønnene eller enhet er satt inn i en patch klemme headstage for impedans målinger og montert på en portal (angitt av grønne boksen, vises mer detaljert i C) å lette posisjonering ved hjelp av en micromanipulator. (B) et nærbilde av målings- og instrumentene som er brukt i forsøket: 8-kanals press injektoren, micromanipulator kontrollsystem, patch klemme forsterker for impedansmåling og suge fartøyet for perfusjon eliminering. (C) et nærbilde av injeksjon system gantry viser en multiport enhet tilkobles med Pipetter holderen, patch klemme headstage og micromanipulator. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: perfusjon oppsett. (A) bilde av toppen av MEA forsterkeren viser plasseringen av den øverste perfusjonen og sug samt grønn LED brukt visuell lys stimulering. (B) et nærbilde av pMEA perfusjon kammeret illustrerer nøyaktig plassering av den øverste perfusjonen og sug, pMEA og referanse elektrode brukes for impedansmåling. (C) en photomicrograph av perfusjon bunnplaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Merk: Se figur 1, figur 2og Figur 3
- Måle ut 900 mL de-ionisert vann ved romtemperatur (~ 21 ° C), og plasser i 1 L beholder.
- Perfuse vannet med 100% CO2 bruker en boblende mekanisme.
- Legge 8,8 g av pulverisert Ames' medium til vann i 1 L beholder.
- Skyll Ames' medium container med noen mL de-ionisert vann for å fjerne alle spor av pulverisert Ames' medium og legge til 1 L beholder.
- Legge til 25.3 mL natriumbikarbonat løsning (7,5% w/v31) 1 L beholder.
- Legge til vann for å bringe løsningen til et endelig antall 1 L.
- Fortsett perfusing vannet med CO2 i ca 5 min.
- Stoppe CO2 perfusjon og begynne perfusing løsning med en medisinsk kvalitet gassblanding av 95% O2 og 5% CO2 i minst 30 min eller til pH stabiliserer seg på 7,4.
Merk: I forbindelse med denne protokollen, Ames mediet er holdt ved romtemperatur (~ 21 ° C) gjennom å forhindre CO2 eller O2 askepartikler, som kan occlude perfusjon linjene med luftbobler. - Rengjør bunn og topp perfusjon rør ved fylling med 70% etanol, og deretter vaske begge linjene 3 ganger med de-ionisert vann. Fyll poenget med de-ionisert vann og den øverste linjen med luft.
3. Wholemount Retinal forberedelse
Figur 4: disseksjon og wholemount utarbeidelse av netthinnen. (A) fotografi av en intakt eyecup tatt fra en photoreceptor-utartet dyr. (B) Photomicrograph av netthinnen med langsgående kutt å flate den. (C) etter sammenslåing netthinnen, den er plassert på et mesh rutenett med photoreceptor side å kontakte mesh og flat i luften (utenfor perfusjon medium) å sikre at det ikke er noen kaster eller krøllet kanter. (D) mesh og netthinnen raskt overført til pMEA med ganglion celle side å kontakte elektrodene og umiddelbart parfyme med oksygenrikt Ames medium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: perforert multielectrode matrise. (A) fotografi av perforerte multielectrode matrisen brukes i protokollen. Netthinnen plasseres på elektroden matrisen (angitt med den røde rektangelet som vises i større detalj i B) innenfor pMEA kammeret tillate kontinuerlig perfusjon med oksygenrikt Ames medium. (B) en photomicrograph av elektroden matrisen selv illustrerer hvordan perforeringer mellom elektrodene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Merk: Se Figur 4 og figur 5
- Bruke en håndholdt rød LED lommelykt gi dim røde lys, euthanize dyr via karbondioksid kvelning etterfulgt av cervical forvridning eller en valgt metode, ifølge IACUC protokoller.
- Enucleate begge øynene ved hjelp av en gullsmedens #5 pinsett og sett enucleated øyne i en 60 mm diameter Petriskål med ca 3-4 mL friske, oksygenrikt Ames medium.
- Mens observere øyet gjennom en disseksjon stereomicroscope med topp og bunn illuminators dekket med røde filteret skjermen, lag et lite innsnitt i hornhinnen ansiktet ved hjelp av en skalpell eller et par skarp saks.
- Klippet fra denne lite innsnitt på kanten av hornhinnen og utvide kuttet i en omkrets del rundt hele kanten av hornhinnen. Fjern nå frittliggende hornhinnen med linsen, gjennomsiktige vann- og glasslegemet humors.
- Mens du forsiktig holder eyecup med et par pinsett, må du nøye to små incisions på motsatt side av eyecup. Deretter bruker du to par tang forsiktig trekkes fra hverandre eyecup på hver av incisions og skille netthinnen fra sclera. Sakte løfte hele netthinnen fra sclera og eyecup. Kuttet synsnerven, hvis det er fortsatt festet.
- Langsgående kutt i netthinnen å skaffe halvparten kvartal seksjoner med saks, og deretter forsiktig spre en netthinnen del på en nylon maske (100 µm gjengediameter med 350 µm åpning) med ganglion celler (konkave siden av netthinnen) mot fra nettet.
- Plass nett og netthinnen på et perforert multielectrode array (pMEA) med ganglieceller i kontakt med pMEA overflaten. Deretter forsiktig plassere et vektet skive rutenett på nettet for å holde netthinnen på plass.
4. MEA og Data oppkjøpet oppsett
Figur 6: støynivået av pMEA. (A) representant opptak av et delsett av pMEA elektroder viser høye vedvarende støy. Denne støyen er vanligvis på grunn av mangel på skikkelig kontakt mellom pMEA kontakt pads og pinnene på MEA forsterkeren som følge av normal slitasje av tynne perforert polyimid (pi) laget over pMEA, spesielt i kontakt pads. Andre mulig støy er vanligvis løsning lekket ut på pMEA forsterker kontakt pads. Vedvarende støy som skyldes dårlig pin kontakt og/eller lekkasje løsning på kontakt pads kan vanligvis rettes ved skiftende posisjonen til pMEA i forsterkeren å få bedre kontakt og rengjøring og tørke pads, henholdsvis. Hvis støy ikke kan elimineres ved rengjøring eller skiftende pMEA posisjonen, må pMEA byttes helt. (B) representant opptak av støy fra et delsett av pMEA elektroder fra et rent pMEA med god kontakt mellom pMEA og forsterker. Gjennomsnittlig støynivået er vanligvis ±16 µV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Merk: Se figur 6
- Under dim rød belysning, plassere pMEA i MEA forsterker og Lukk forsterker låsene.
- Hvis referanse merker ikke allerede finnes på pMEA kammeret ringen, etse to "X"-formet merker linjeavstand ca 5 mm fra hverandre i et område som er lett synlig ovenfra med boom-stativ montert mikroskopet.
- Plasser øverste perfusjon uttaket inne i pMEA kammeret og slå på topp perfusjon ventilen for å oppnå en perfusjonsmåling rate på ca 3 mL per minutt. Plasser øverste inntaks vik på ønsket perfusate nivå (~ 5 mm dyp) og sikre at det fungerer.
- Åpne den oppkjøp programvaren på data oppkjøpet datamaskinen og klikk på "play"-knappen for å starte mottak av data. Kontroller at alle pMEA kanaler er støyfri og innspilling nevrale signaler.
- Ser en live digital image av invertert mikroskop synsfelt på en skjerm, kan du observere at undersiden av pMEA for bevis at løsningen er strømmer gjennom perfusjon bunnplaten.
5. glutamat stimulering forberedelse
Figur 7: Glass brønnene og multiport microfluidic enheten. (A) en pipette holder før du setter inn en brønnene eller enhet. Sølv/sølv klorid elektroden (50 µm diameter) kombinert elektrisk kortet på slutten grensesnitt med oppdateringen klemme headstage. (B) et bilde av glass brønnene tilkobles med Pipetter abonnenten viser plasseringen av press porten som brukes til å starte pneumatiske injeksjoner. (C) en egendefinert multiport microfluidic enhet (1 cm 1 cm 0.134 cm) knyttet til et egendefinert 3D-trykt innslag og tilkobles med Pipetter innehaver gjennom et rustfritt stål rør. Enheten, som ble fabrikkert i to lag, har åtte microports (diameter 14 µm) i det nederste laget (340 µm tykk) og åtte på prosessoren reservoarer (diameter 1,6 mm) for lagring av glutamat i det øverste laget (1 mm tykk). Hver av de åtte microports i det nederste laget av enheten er uavhengig koblet til en på prosessoren reservoaret i det øverste laget via en i-flyet microchannel, og hver på prosessoren reservoaret igjen er koblet til en press port av 8-kanals press injektoren via en fleksible rør tillate uavhengig aktivering av microports for mønstret multisite injeksjoner. (D) nærbilde av multiport enheten holdt av pinsett monterer rør grensesnitt lampen viser arrangement av åtte uavhengig-adresserbare på prosessoren reservoarer og rør viker. (E) en photomicrograph på undersiden av enheten viser åtte 14 µm-diameter microports arrangert i en 3 x 3-konfigurasjon med 200 µm avstand å justere med elektrodene på pMEA. Åtte utenfor microports benyttes for multisite injeksjoner, mens sentrale porten ble brukt strengt for justering under fabrikasjon av enheten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Merk: Se figur 7.
- Forberede glutamat løsning ved å blande lager glutamat solutionwith oksygenert Ames middels løsning for å få en 0,5 mL prøve på en arbeider konsentrasjon av 1 mM glutamat.
- Nøye sett pre trakk 10 µm-diameteren brønnene eller rustfritt stål stangen koblet til multiport microfluidic enheten inn i en standard pipette holder som inneholder en 50 µm-diameter sølv/sølv klorid wire elektrode.
Merk: Hvis impedans gjenkjenning ikke er tilgjengelig, sølv/sølv klorid wire elektrode kan bli utelatt. - Grensesnitt pipette holderen med patch-klemme headstage og koble press port luer tilkobling av pipette abonnenten kanal 1 av press injeksjon system, hvis bruker glass brønnene, eller koble press port luer tilkoblinger av 8 injeksjon portene kanaler 1-8 av press injeksjon system, hvis bruker multiport enheten.
- Manuelt slå på press injeksjon system og slå på kanal 1 (eller kanaler 1-8, som er aktuelt). Kontroller at systemet er ventilert atmosfæren og angi injeksjon press til 0,1 psi.
- Slå på micromanipulator og kalibrere det ved å trykke på "Kalibrere"-knappen på kontrolleren manipulator. Plasser micromanipulator slik at brønnene tipset (eller undersiden av enheten, som er aktuelt) er ca 30 mm over MEA forsterkeren.
- Fylle en liten Petriskål glutamat løsning (1 mM glutamat i standard Ames medium), og plasser den under micromanipulator. Lavere brønnene tips (eller enheten) til løsningen og fyll ved å trykke knappen "Fylle" på trykk injeksjon system (inntaks press på-13 i H2O) inntil det er ca 20 mm løsning i glass brønnene eller multiport enheten rør.
- Hvis bruker multiport enheten, slå kanal 1 av press injektoren av og gjenta protokollen for kanaler 2-8. Brønnene tips eller enheten ut av løsningen, fjerne Petriskål, og plasser micromanipulator over pMEA kammeret.
- Bruker en boom-stativ montert stereomicroscope, Juster brønnene spissen eller hjørnene av enheten med henvisningen merkene etset inn i pMEA kammeret ringen. Lagre manipulator stillingene i Kontrollprogramvaren bruke knappene 'Store referanse A' og 'Store referanse B' (eller skrive manipulator koordinatene manuelt) til å tilordne koordinatsystemet til manipulatoren med pMEA elektrodene.
- Bruker manipulator Kontrollprogramvaren, Velg en pMEA målelektrode med robust spontan aktivitet og klikk "Flytt til kanal" for å justere glass micropipettewith målelektrode.
6. grensesnitt med netthinnen
- Hvis impedansmåling er tilgjengelig, slå på oppdateringen klemme forsterkeren og starte impedans visualisering programvaren ved å klikke "Start" for å visualisere impedans på sølv/sølv klorid elektroden inne pipette abonnenten. Mens observere sanntid impedans signaler, sakte senke den brønnene eller enheten til det kontakter retinal overflaten som angitt av en rask økning i impedansen signal (se Figur 8). Lagre eller Noter plasseringen av netthinnen overflaten.
- Hvis impedansmåling er tilgjengelig, oppdage kontakt med retinal overflaten gjennom visuell observasjon, men dette vil være mindre presise. Senk den pipette eller enheten til det synlig kontakter overflaten av Ames middels løsningen i MEA kammeret.
- Så, mens observere toppen av netthinnen med en invertert mikroskop, sakte senke pipette eller enhet til toppen overflaten av netthinnen er synlig forvrengt, som angir at kontakten har blitt gjort med retinal overflaten. Lagre eller Noter plasseringen av netthinnen overflaten.
- For undergrunnen stimulering, lavere pipette ytterligere 40 µm (for S334ter-3 Netthinne) eller 70 µm (for vill-type Netthinne).
- Utføre noen kort varighet (10-30 ms) injeksjoner med press injeksjon (0,1 psi) systemet for å avgjøre hvis cellene i nærheten av brønnene spissen eller enheten microports er mottakelige for glutamat stimulering ved å observere thе nevrale signaler med datainnsamling programvare.
Merk: Vellykket injeksjoner vil lokke fram en tydelig spike rate briste eller spike hemming (se figur 9). Hvis ingen svar er observert, flytte til brønnene eller enheten på en annen elektrode.
Figur 8: impedansmåling. (A) en skjematisk av impedans måleverdien teknikken. Bruker oppdateringen klemme forsterkeren, er impedans på brønnene kontinuerlig overvåket når den senkes sakte mot retinal overflaten. Når brønnene er over netthinnen, resulterer relativt høy ioniske ledningsevne Ames medium i en lav impedans lesing. Brønnene gjør kontakt med retinal overflaten, ionisk ledningsevne gjennom sølv/sølv klorid kabelen reduseres, forårsaker en rask økning i målt impedans. (B) et plott vise impedans endringen registrert like før og etter kontakt pipette tips med retinal overflaten. Målt impedansen er relativt lav når brønnene spissen i løsning like før kontakt (angitt med oransje regionen til venstre). Når kontakten er laget (angitt av røde pilspiss og grønne området høyre), øker impedansen raskt på grunn av redusert ioniske ledeevne ved kontakt med netthinnen vev. I praksis er retinal overflaten registrert som høyden tilsvarer utbruddet av bratte økningen av målt impedansen (plassering av røde pilspiss). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: elektrode innspillinger av nevrale aktivitet under visuell, spontane, og glutamat injeksjon innspillinger. (A) representant opptak fra ni pMEA elektroder viser høypass-filtrerte elektrode data under visuell lys stimulering med en grønn LED der hvert rektangel viser nevrale dataene fra en unik elektrode. Hver elektrode innspilling illustrerer samles i første andre når du slår på grønn LED (timing vises med oransje pilspisser i hver tomt) med vanlig spenning skala vises i de venstre y-akser. Toppene ble identifisert med en terskel spenning av-18 µV (vannrett rød linje i hver elektrode tomt) og representeres av svart spor over grønne elektrode dataene. Visuell stimulering forårsaket en eksplosjon av toppene (eksitasjon) i alle elektroder unntatt øverst i midten en, som hadde en hemmende reaksjon på lys. (B) et lignende plott for samme elektrodene viser spontan nevrale aktivitet uten synlig eller injeksjon stimulering. Selv om mindre støt var tilstede, var mønstre av toppene svært forskjellige fra de innspilte svar på visuell stimulering. (C) representant opptak fra samme delsettet med elektroder registreres umiddelbart etter en glutamat injeksjon på sentrale elektroden (timing angitt av oransje pilspisser i hver tomt). Den injiserte glutamat vakte en serie av toppene i sentrale elektroden som var svært lik visuelt utløste spike serieopptak. Alle andre elektroder var upåvirket av glutamat injeksjon, som viser den fine romlig oppløsningen av kjemiske stimulering teknikken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
7. starte Retinal opptak og stimulans programmet
- Plasser grønn LED mot toppen overflaten av netthinnen. Starte innspilling med den oppkjøp programvaren på datamaskinen som dedikert opptak ved å skrive inn filnavnet og klikke på "record"-knappen.
- Når innspillingen har startet, åpne programmet stimulans kontroll og laste stimulans standardfilen ved å klikke på "Les stimulans fil"-knappen. Klikk deretter på knappen "Kjør stimulans fil" å starte stimulans standardfilen bestående av stimuli og data oppkjøpet protokollen beskrevet i notatet nedenfor.
Merk: (i) 30 studier av 2 s på og 2 s OFF nullfelt flash (5 lm/m2 intensitet) bruker grønn LED. (ii) 120 s data uten å bruke grønn LED for å registrere spontan aktiviteten av netthinnen over en lignende tidsskala. (iii) 1 eller flere sett med glutamat injeksjoner som består av 30 studier av glutamat injeksjoner på 0,1 psi med 10-30 ms injeksjon ganger (ca 100-300 pL per injeksjon) og 3 s interpulse varighet. Ved multi-site injeksjoner, velger du 2 eller flere porter til å injisere samtidig.
Figur 10: Peristimulus histogrammer for visuell, spontane, og glutamat svar. (A) representant peristimulus histogrammer (30 ms binwidth) av spike dataene fra delsettet av elektroder i figur 9A, gjennomsnitt over 20 studier av visuell lys stimulering. En felles topp hastighet skala ble brukt til alle elektroder og vises på de venstre y-akser. Den svarte linjen i hver elektrode tomten representerer den gjennomsnittlige spike rate for alle toppene under første sekund etter aktivere grønn LED. Som kan sees, forårsaket visuell stimulering forbigående eksitatoriske spike rate svar på alle elektroder unntatt øverst i midten elektroden, som hadde en forbigående hemmende reaksjon på lys. (B) gjennomsnittlig spontan spike hjertefrekvensen registrert på samme elektrodene uten noen visuell eller kjemiske stimulering. Uten stimulering er spike priser for hver elektrode relativt konstant. (C) gjennomsnittlig spike hjertefrekvensen registrert på samme elektrodene svar på en glutamat injeksjon på et sted over sentrale elektroden. Bare forbigående svaret tydelig er eksitatoriske svaret på elektroden direkte under injeksjonsstedet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen kan brukes å kjemisk stimulere både normale, vill-type Netthinne samt photoreceptor utartet netthinne, til tross for betydelige mobilnettet remodeling forårsaket av tap av fotoreseptorer. Før begynner eksperimenter med enten photoreceptor utartet eller vill-type netthinne, opptak og stimulering utstyr (figur 1 og figur 2) måtte være klargjort og pMEA (figur 5) burde være renset for å minimere den støy på hver elektrode kanal (figur 6). Selv om photoreceptor utartet Netthinne er tynnere og derfor mer delikat enn vill-type netthinne, samme disseksjon fremgangsmåte (Figur 4) brukes for begge. Følgende disseksjon, netthinnen er nøye plassert på pMEA med ganglion celle side mot elektrodene, og pMEA plassert inni MEA forsterkeren (figur 3A), der det kan være kontinuerlig parfyme med friske, oksygenrikt Ames mediumet fra både toppen (figur 3B) og bunnen (Figur 3 c) side. Kontroller netthinnen har stabilisert seg fra kirurgisk traumer, er et glass brønnene eller multiport enheten montert i en pipette holder (figur 7A-E) og tilkobles med en patch-klemme headstage der plasseringen er kontrollert av en 3-akse presisjon micromanipulator. Microport(s) av pipette eller enheten skal da linje med en målelektrode og nøye senket til kontakt kan oppdages med metoden impedans vist i Figur 8 eller visuelt bekreftet via mikroskopi. Når injeksjon levering porten(e) er plassert på riktig sted på overflate eller undergrunnen av netthinnen, kan stimulering programmet startes.
Et representativt sett av nevrale aktivitet opptak på et delsett av pMEA elektrodene er vist i figur 9 for visual (figur 9A), spontane (figur 9B) og exogenously injisert glutamat (figur 9C) stimuli. Vellykket visuelle og kjemiske stimulations er vanligvis observerbare som pakker med RGC toppene eller midlertidig opphør av skyter aktivitet, som kan sees i eksemplene i figur 9. Hvis nærliggende celler ikke svarer til kjemiske stimulering, vil spike resultatdataene ligne spontan spiking oppførsel. Etter utpakking RGC toppene og organisere dem i rettssaker, kan neural svarene på hver elektrode illustreres med en gjennomsnittlig peristimulus tid histogrammet (PSTH) av spiking rate, som vist i Figur 10, som tilsvarer den rå elektroden data i figur 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteres her viser en unik nevrale stimulering paradigme, der netthinnen neurons kjemisk stimulert av injisere innfødt nevrotransmitter kjemikalier i undergrunnen av netthinnen i vitro. Denne kjemiske stimulering teknikken tilbyr flere fordeler over konvensjonell elektrisk stimulering teknikken, inkludert selektivitet og høy fokus spesifisitet av målet neurons. Protokollen over detaljer hvor liten volum pneumatiske injeksjoner av signalstoffet glutamat levert nær målet retinal neurons bruker enten én port glass brønnene eller en egendefinert micromachined multiport microfluidic enhet framprovosere fysiologisk betydelig RGC svar. Selv om denne protokollen har blitt demonstrert med bare glutamat, fortsatt protokollen nyttig for studerer kjemiske stimulering av netthinnen med andre typer nevrotransmittere. Dessuten, mens det er best å bruke en pMEA for en elektrofysiologiske innspillingen32 som beskrevet i denne protokollen, andre MEA design, inkludert ikke-perforert, kan brukes å oppnå lignende resultater som pMEA. I de følgende avsnittene diskutere vi de viktigste trinnene av våre protokollen, metoder for å løse vanlige problemer og begrensninger og fremtidig bruk av denne stimulering teknikken.
For å få sikker og pålitelig kjemiske stimulering, må flere kritisk trinn gjøres i denne protokollen. En av de avgjørende skritt er å få en vellykket retinal forberedelse nøye trekke ut netthinnen og minimere tiden det holdes utenfor oksygenrikt Ames medium, dvsnår sammenslåing nylig dissekert netthinnen i mesh rutenettet før du overfører den til pMEA parfyme med Ames medium. Første Disseksjon av netthinnen krever skarp disseksjon verktøy og praksis siden rotten øyet er relativt liten. Videre utvinning av photoreceptor utartet Netthinne kan være spesielt vanskelig siden de er mer sårbar enn de allerede skjøre normal retinae, og er derfor liggende å rive. Hele disseksjon prosessen, fra første enucleation til å plassere netthinnen på pMEA, bør gjøres så raskt som mulig å hindre tidlig celledød mangel på oksygen eller andre næringsstoffer. Mekanisk traume formidles til vev under dissection bør minimaliseres ved å unngå et kutt gjennom eller skade på vev, så dette kan også føre til unaturlig nevrale svar og celledød.
Etter å plassere netthinnen på pMEA, bør utvises ved initiering topp perfusjon og sug linjer, da dette er et felles kontaktpunkt svikt av eksperimentet. Alle perfusjon og sug linjer må være sjekket for klarering før begynnelsen eksperimentet og regelmessig undersøkt gjennom å sikre at luftbobler ikke hindre flyten gjennom linjene. Spesielt kan dannelsen av luftbobler i perfusjon bunnlinjen fullstendig hindre flyten av perfusjon på grunn av dens mindre diameter, og dermed forårsake en prematur slutt på eksperimentet ved netthinnen av oksygen og næringsstoffer. På grunn av faren for luftbobler gjennomføres over protokollen ved romtemperatur i stedet for den mer perfekt fysiologiske temperaturen å unngå askepartikler oppløst oksygen eller karbondioksid fra Ames middels løsning. Hvis luftbobler occlude en av perfusjon linjene under et eksperiment, spre de vanligvis i mindre, ikke skjule bobler lett å peke på perfusjon linjen.
Et annet vanlig problem knyttet til perfusjon systemet er finjustering av bunnen inntaks press slik at den holder netthinnen fast kontakt med elektrodene men uten skade. Dersom inntaks trykket er for høy, kan det suge små biter av netthinnen gjennom hullene av pMEA og til slutt føre til opphør av alle nevrale svar. På den annen side, hvis trykket er for lavt, vil netthinnen flyte fra elektrodene og derfor forstyrre nevrale innspillingen. Justere inntaks press mellom disse to ekstreme nivåer krever praksis og er fremstilt lettere hvis pMEA brukes over en invertert mikroskop, som gir nær observasjon av hullene av pMEA. Ved å observere disse perforeringer mens du justerer inntaks, kan man finne den rette balansen som opprettholder kontakten uten å skade på netthinnen. For å minimere muligheten for photobleaching fotoreseptorer når stimulere vill-type netthinne, den inverterte mikroskop illuminator skal filtreres for å avgi rødt lys bare og visuelle observasjoner bør gjennomføres så raskt som mulig.
Etter å sikre riktig perfusjon betingelsene, refererer neste viktige trinn enheten eller pipette med en synlig fast punkt eller indikator på pMEA slik at injeksjon porten(e) kan nøyaktig justeres elektrodene på pMEA. Vanligvis dette gjøres via triangulering der to referanse merker på kanten av pMEA kammeret er grovt justert med glass brønnene tips eller landemerker på multiport enheten av visuell observasjon ovenfra bruker den boom-stativ montert mikroskop. En finere justering av injeksjon porten(e) med målet elektroder oppnås deretter ved by visuell inspeksjon gjennom Invertert mikroskop. Når riktig justert utvises forsiktighet når du nærmer netthinnen med en pipette eller en microfluidic enhet, siden noen manipulator jitter eller drift kan knuse netthinnen eller skade på pMEA. Den beste måten å unngå utilsiktet skade på netthinnen er å kontinuerlig overvåke impedans på pipette elektroden til nøyaktig oppdage kontakt med overflaten netthinnen. Impedansmåling kan også brukes til å raskt sjekke hvis brønnene spissen satt inn i undergrunnen av netthinnen er blokkert, som angis av en unormalt høy (vanligvis i gigaohm området) impedans. Hvis blokkert, kan vanligvis brønnene spissen fjernes ved å starte en høytrykk puls med sin spissen plassert fra netthinnen å unngå utilsiktet skade. I sjeldne tilfeller må blokkerte Pipetter erstattet helt hvis høytrykk pulser ikke fjerner blokkeringen. En unormal eller høy impedans verdi kan også registreres når referanse elektroden ikke riktig grensesnittet mellom løsningen i det pMEA kammeret og patch klemme forsterkeren.
Når posisjonert på en målplassering, bør injeksjon volumet av glutamat kontrolleres nøye av begrensende press, injeksjon tid og nevrotransmitter konsentrasjon å hindre overstimulering av neurons, som har vist seg å forårsake excitotoxic skade.Parameterne glutamat injeksjon detaljert i denne protokollen representerer et regime som er godt under kjent terskelen for forårsaker glutamat excitotoxicity33 , men når du prøver denne protokollen med andre typer nevrotransmittere, tilsvarende terskelen nivåer for excitotoxicity effekter må vurderes for sikker stimulering. Også 0,1 psi injeksjon press foreskrevet i over protokollen ble avledet fra lavest mulig trykket sette tilgjengelig på 8-kanals press injektoren brukt i denne studien, men har produsert vellykkede resultatene konsekvent. Derfor er 0,1 psi for nevrotransmitter injeksjoner bare suggererende, men ikke strenge, å oppnå vellykket kjemiske stimulations. Hvis lave betjening Trykk er mulig med en annerledes trykk injektor, kan injeksjoner utføres på trykk lavere enn 0,1 psi.
En begrensning av denne protokollen som involverer i vitro wholemount retinal forberedelser er vinduet kort eksperimentelle tid, som er begrenset til varigheten på 8 timer eller mindre, selv med ekstrem forsiktighet tatt gjennom hele eksperimentet. Dette begrenset eksperimentelle tidsvinduet tillater ikke undersøkelse av noen langsiktige effekter av kjemisk stimulering som excitotoxicity. En annen begrensning av denne bestemte protokollen er valget å registrere i romtemperatur i motsetning til fysiologiske temperatur, hvilke sannsynligvis påvirker både den visuelt - og kjemisk-utløste pigge hjertefrekvensen, siden tidligere studier har vist at lavere innspillingen temperaturer kan endre skyter pris, svar ventetid, og glutamat opptak rate blant flere andre egenskaper34,35,36,37,38. Denne begrensningen kan unngås ved hjelp av en ikke-perforert MEA med en oppvarmet bunnplaten, i motsetning til pMEA, som benytter en spesialdesignet bunnplaten perfusjon uten en oppvarmet plate og/eller en effektiv termisk debubbler for både topp og bunn perfusjon.
Til slutt, i vitro forberedelsene er begrenset av nødvendigheten for aktive perfusjon av oksygenrikt Ames medium å holde netthinnen sunn. Flytende strøm forårsaket av perfusjon systemet er vanligvis mye raskere enn naturlig perfusjon mekanismer i øyet i vivo39, og kan forstyrre kjemiske injeksjoner av tegning injisert nevrotransmittere unna den netthinnen. Overflate-baserte injeksjoner, slik som de gjorde med multiport enheten, ville trolig være mer utsatt for perfusjon gjeldende forstyrrelser forhold til undergrunn injeksjoner men tilstedeværelsen av perfusjon fra bunnen av pMEA føre en lignende effekt gjennom hele netthinnen. Derfor glutamat kjemikalier i gjeldende protokollen ble levert med pneumatisk trykk, men injeksjon press kreves for å oppnå vellykket stimulering i vivo kan være vesentlig lavere enn benyttet for i vitro studier.
Kjemisk stimulering, som søker å aktivere neurons med mer naturlig nevrotransmitter stimuli, tilbyr et effektivt alternativ til konvensjonell elektrisk stimulering, men ennå ikke blitt alvorlig utforsket. Som en konsekvens, er det lite litteratur beskrive protokollen eller beste praksis for å oppnå pålitelige subretinal kjemiske stimulering av netthinnen neurons. Nyere studier28 bruker denne protokollen har vist at subretinal kjemiske stimulering av netthinnen neurons kan pålitelig framprovosere RGC reaksjoner med romlig oppløsning tilsvarende eller bedre enn elektrisk stimulering av netthinnen, og det er bevis som subretinally brukt eksogene glutamat kan stimulere bipolar celler direkte, slik at denne metoden å dra nytte av netthinnens iboende visuell prosessering krets og, antagelig, fremkaller oppfatninger mer lik dagslys stimulering.
Videre studier er nødvendig for å validere disse funnene i ikke-murint modellsystemer og undersøke problemer som ikke dekkes av de tidligere studiene, inkludert langtidseffekter og praktiske aspekter knyttet til i vivo gjennomføringen av dette strategi. Derfor lyve fremtid retninger av denne tilnærmingen tydelig oversette dette konseptet til i vivo dyremodeller ved å utvikle egnet teknologi for å oppnå langsiktig kjemiske levering og stimulering med en implanterbare lys-drevet microfluidic enhet som fungerer som en erstatning for degenerert photoreceptor laget. Som et relativt lite studert stimulering paradigme, den bredere anvendelser av kjemiske stimulering har ennå å bli oppdaget, men siden netthinnen er en del av det sentrale nervesystemet40, denne stimulering strategien kan potensielt brukes i andre nevrale stimulering kontekster, for eksempel behandling av kortikale, spinal cord eller nevromuskulære lidelser bruker forskjellige neurotransmitters. Videre kan presentert protokollen bli mer generelt vedtatt for studier undersøker virkningene av kontrollert levering av et stoff eller andre kjemikalier i nevrale vev med fint spatiotemporal oppløsning i i vitro omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet presentert i papir ble støttet av National Science Foundation, nye grenser i forskning og innovasjon (NSF-EFRI) programmet gi nummer 0938072. Innholdet i notatet ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til NSF. Forfatterne også ønsker å takke Dr. Samsoon Inayat for sitt arbeid utformet og testet det opprinnelige eksperimentelle oppsettet for kjemiske stimulering og Mr. Ashwin Raghunathan for sitt arbeid design, fabrikasjon og evaluere multiport microfluidic enheten brukes i Denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
- Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
- Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
- Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
- Zrenner, E. Fighting blindness with microelectronics. Sci Transl Med. 5, (2013).
- Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
- Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
- Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
- Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
- Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
- Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239 (2014).
- Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
- Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009 (2013).
- Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002 (2013).
- Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
- Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
- Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
- Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010 (2015).
- Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505 (2016).
- Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
- Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
- Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
- Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148 (2014).
- Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
- Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
- Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
- Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
- Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
- Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
- Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
- The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).
