Summary
Det här protokollet beskriver en ny metod för att utreda en form av kemiska neurostimulering av wholemount råtta näthinnor i vitro med signalsubstansen glutamat. Kemiska neurostimulering är ett lovande alternativ till den konventionella elektriska neurostimulering av retinala nervceller för behandling av irreversibel blindhet orsakad av ljusmätare degenerativa sjukdomar.
Abstract
Ljusmätare degenerativa sjukdomar orsaka obotlig blindhet genom progressiv förlust av ljusmätare celler i näthinnan. Retinal proteser är en framväxande behandling för ljusmätare degenerativa sjukdomar som syftar till att återställa vision genom att artificiellt stimulera de överlevande retinala nervcellerna i hopp om att framkalla begripliga visuell perception hos patienter. Nuvarande retinal proteser har visat framgång i att återställa begränsad vision till patienter som använder en matris av elektroder att elektriskt stimulera näthinnan men möter betydande fysiska hinder i att återställa hög skärpa, naturlig vision till patienter. Kemiska neurostimulering använder infödda signalsubstanser är en biomimetiska alternativ till elektrisk stimulering och kunde förbifartsleden de grundläggande begränsningar som är associerad med retinal proteser med elektriska neurostimulering. Specifikt, har kemiska neurostimulering potential att återställa naturligare vision med jämförbara eller bättre visual pressauppförandet till patienter genom att injicera mycket små mängder signalsubstanser, samma naturliga agenter för kommunikation som används av retinal kemiska synapser, på mycket finare upplösning än nuvarande elektriska proteser. Dock som en relativt outforskat stimulering paradigm finns det inget etablerat protokoll för att uppnå kemisk stimulering av näthinnan i vitro. Syftet med detta arbete är att ge en detaljerad ram för fullbordande av kemisk stimulering av näthinnan för utredare som vill studera den potentiella av kemiska neuromodulation av näthinnan eller liknande neurala vävnader in vitro. I detta arbete, vi beskriver experiment och metodik för framkalla retinal ganglion cell (RGC) spike Svaren liknar visual ljus svaren i vildtyp och ljusmätare-degenererade wholemount råtta näthinnor genom att injicera kontrollerade mängder signalsubstansen glutamat i subretinalområdet använda glas Mikropipetter och en anpassad multiport mikroflödessystem enhet. Denna metodik och protokollet är tillräckligt allmänna för att anpassas för neuromodulation använder andra signalsubstanser eller även andra neurala vävnader.
Introduction
Ljusmätare degenerativa sjukdomar, såsom retinitis pigmentosa och åldersrelaterad makuladegeneration, är ledande ärftliga orsakerna till synnedsättning och är för närvarande obotliga1,2. Även om dessa sjukdomar uppstår från en mängd specifika genetiska mutationer, karakteriseras ljusmätare degenerativa sjukdomar som en grupp av progressiv förlust av ljusmätare celler i näthinnan, vilket så småningom orsakar blindhet. Förlusten av fotoreceptorer utlösare utbredd remodeling hela näthinnan men överleva retinala nervceller, inklusive bipolära celler och RGCs, förbli intakt och relativt funktionella även i avancerade stadier av ljusmätare degeneration3 ,4,5,6,7.
Mekanismerna och patologier av dessa sjukdomar har varit väl karakteriserade3,4,5,6,7 men en effektiv behandling förblir svårfångade. Under de senaste tre decennierna, har forskare i hela världen undersökt en mängd olika terapeutiska behandlingar för att återställa vision till de drabbade med ljusmätare degenerativa sjukdomar inklusive gen terapi8, stamceller behandling9, retinal transplantation10, och konstgjorda stimulering11,12 av de överlevande retinala nervcellerna. Av dessa är den mest kliniskt tillgängliga retinal proteser, som är konstgjorda neurostimulering enheter som traditionellt har använt en matris av elektroder att elektriskt stimulera bipolära celler eller RGCs i ett specifikt mönster med målet att att skapa konstgjorda visuella föreställningar i patienter11. Nuvarande generationen elektriska proteser, såsom Argus II13 och Alpha-IMS14 enheter, har uppnått klinisk godkännande och preliminära studier har visat att de kan förbättra livskvaliteten för patienter genom att återställa en mått på vision använder både epiretinal (framsidan av näthinnan) och subretinala (baksidan av näthinnan) implanteras enheter15,16. Forskargrupper runt om i världen arbetar på att vidareutveckla retinal proteser bortom dessa första generationens enheter17,18,19,20 framgångar men har inför svårigheter utforma en elektrisk protes kan återställa hög synskärpa vision under den juridiska blindhet nivån till patienter. Nyare studier har visat att uppnå högre spatial upplösning än som aktiveras av den nuvarande generationen elektriska-baserade proteser är utmanande på grund av kostnad injektion gränsen, som kräver användning av stora elektroder att säkert stimulera retinala nervceller på bekostnad av rumslig upplösning, dvs synskärpa11,21. Elektrisk stimulering är dessutom ytterligare begränsad eftersom det vanligtvis stimulerar alla närliggande celler och därför väcker onaturliga och förvirrande uppfattningar hos patienter, till stor del eftersom det är en inneboende onaturliga stimulering paradigm21. Ändå, de tidiga framgångarna av elektrisk stimulering har visat att konstgjorda neurostimulering kan vara en effektiv behandling för ljusmätare degenerativa sjukdomar. Detta leder till hypotes att en ännu effektivare behandling kan vara möjlig genom att stimulera näthinnan med neurotransmittor kemikalier, naturliga agenter för kommunikation vid kemiska synapser. Syftet med metoden presenteras i denna uppsats är att undersöka terapeutiska genomförbarheten av kemisk stimulering, som syftar till att efterlikna det naturliga systemet av synaptisk kommunikation mellan näthinnans nervceller, som ett alternativ till elektrisk stimulering för biomimetiska för en retinal protes.
Översättning av begreppet terapeutisk kemisk stimulering till en kemisk retinal protes är beroende av kemiskt aktivera target retinala nervceller med små mängder av infödda neurotransmittorer, såsom Glutamat, släppt igenom en mikroflödessystem enhet bestående av ett stort utbud av microports svar på visuell stimulans. På detta sätt skulle en kemisk retinal protes i huvudsak vara ett lager av biomimetiska-konstgjorda ljusmätare som översätter fotoner naturligt når näthinnan till kemiska signaler. Eftersom dessa kemiska signaler använder de samma signalsubstanser som utnyttjas i normala retinal signalering och stimulera överlevande retinala nervceller i en urartad näthinnan på samma synaptic stigar som används av normal syn vägar, den resulterande visuellt uppfattning som uppnås genom en kemisk retinal protes kan vara mer naturligt och begripligt jämfört med en frammanade genom en elektrisk protes. Dessutom eftersom den microports genom vilka neurotransmittorer frigörs kan göras extremt liten och klädd i hög densitet, till skillnad från elektroderna, en potentiella kemiska protetiska kan vara duglig till åstadkomma mer fokal stimulering och högre spatial upplösning än en elektrisk protes. Således, utifrån dessa potentiella fördelar, en kemisk retinal protes erbjuder ett mycket lovande alternativ till elektriska proteser.
Kemisk stimulering av näthinnan, men har varit relativt lite utforskat tills nyligen. Medan elektrisk stimulering av näthinnan har karakteriserats väl över decennier av arbete genom in vitro22,23, i vivo23,24och kliniska studier13 ,14, studier på kemisk stimulering har varit begränsade enbart till ett fåtal in vitro- verk25,26,27,28. Iezzi och Finlayson26 och Inayat o.a. 27 visat epiretinal kemisk stimulering av näthinnan i vitro med en enda elektrod och en multielectrode (MEA), respektive att registrera glutamat frammanade Svaren av retinala nervceller. Mer nyligen, Rountree o.a. 28 visat differentiell stimulering av de på och retinal vägar med glutamat från den subretinal sidan och en MEA för att registrera de neuronala svar från flera platser på näthinnan.Även om dessa verk har preliminärt fastställt genomförbarheten av kemisk stimulering, ytterligare studier är nödvändiga för att undersöka många aspekter av detta tillvägagångssätt utöver de upp hittills25,26,27 , 28, och finjustera parametrarna terapeutisk stimulering i både in vitro- och in-vivo djurmodeller innan att översätta konceptet till en kemisk retinal protes som diskuterats ovan. Men för närvarande finns det ingen etablerad metodik för fullbordande av kemisk stimulering av näthinnan i litteraturen och de metoder som används i tidigare verk har inte beskrivits i sådan detalj som skulle vara avgörande för replikationsförmåga studier. Den logiska grunden för denna metoder uppsats är därför att tillhandahålla en väldefinierad ram för att genomföra in vitro- kemisk stimulering av näthinnan för de intresserade antingen replikera våra tidigare studier27, utredarna 28 eller ytterligare framåt denna begynnande begreppet kemiska neurostimulering.
Här visar vi en metod för att genomföra in vitro- kemisk stimulering av retinala nervceller i wholemount näthinnor av vildtyp råttor och en ljusmätare degenererade råtta modell som noggrant efterliknar progressionen av ljusmätare degenerativa sjukdomar hos människor. Logiken bakom utveckla denna stimulering metod i in vitro- modeller är att utvärdera de terapeutiska intervall av olika stimulering parametrar och studera neural respons egenskaper som skulle vara omöjligt eller svårt att Observera i i vivo modeller, särskilt under de första studierna fokuserade på att utvärdera genomförbarheten av denna strategi. I den här proceduren visar vi både plats och samtidiga multi-site kemiska stimuli av näthinnor genom att leverera små mängder av 1 mM glutamat nära målet retinala nervceller via kommersiellt tillgängliga single-port glas Mikropipetter och en anpassad micromachined multi-port mikroflödessystem enhet, respektive. Medan både singel- och multi stimuli uppnå det grundläggande målet att undersöka terapeutiska genomförbarheten av kemiska neuromodulation, ändamålsenlig varje distinkta med en unik fördel. Den enda plats stimulering, som kan åstadkommas med kommersiellt tillgängliga före drog glas Mikropipetter, kan användas för att injicera kemikalier direkt i ytan av näthinnan på en enda sajt och tjänar till att undersöka om observerbara RGC spike ränta Svaren som liknar visuellt framkallat ljus Svaren kan utlösas focally under injektionsstället. Däremot, multi-site stimulering, som kräver ett speciellt fabricerade multiport mikroflödessystem enhet, kan användas för att injicera kemikalier rumsligt på flera platser över ytan av näthinnan och tjänar till att undersöka hur väl glutamat-framkallat RCG svar mönster motsvarar glutamat injektion mönster i mönster stimulering studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök genomfördes enligt de riktlinjer som beskrivs av National Research Council's Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Djurens hantering och dödshjälp-protokoll var granskas och godkänns av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Illinois i Chicago.
1. djurmodeller
- Vildtyp Long-Evans råttor
- Upphandla en 24-32 dag gammal vildtyp lång Evans Hooded råtta oavsett kön tog upp med en standard 12 h dag/natt rytm.
- Mörka anpassa råttan genom att placera den i ett helt mörkt rum för 1 h före början experiment.
- S334ter-3 råttor
- Korsa den transgena albino homozygot S334ter-3 tjalla fodrar (oavsett kön), uttrycker två kopior av genen muterad rhodopsin, med en pigmenterad vildtyps-lång-Evans råtta att producera pigmenterade heterozygot S334ter-3 råttor som uppvisar ljusmätare degeneration liknande i progression till mänskliga retinitis pigmentosa29,30.
- Höja heterozygot avkomma med standard 12 h dag/natt rytmen och använda råttor av varje kön för experiment i följande åldrar motsvarar följande ljusmätare degeneration stadier: tidiga skede degeneration: 14-20 dagar gamla. Mellersta skede degeneration: 21-27 dagar gamla. Sent skede degeneration: 28-35 dagar gamla. Helt blind: > 50 dagar gammal.
- Mörka anpassa råttan genom att placera den i ett helt mörkt rum för 1 h före början experiment.
2. beredning av Ames' Medium lösning och Perfusion System
Figur 1: Schematisk av experiment. Schematisk bild av den experimentella setup för kemisk stimulering med hjälp av ett glas mikropipett (A) och en anpassad multiport mikroflödessystem enhet (B). Näthinnan är placerad på en pMEA och kontinuerligt perfusion med färska, syresatt Ames medium lösning från både toppen och botten genom pMEA perforeringen. Neurala svar signalerna plockas upp av elektroderna på pMEA matas genom MEA förstärkaren till en data förvärv dator. Visuella och kemisk stimulering är fulländad med en grön lysdiod och en 8-kanals trycket injektor, respektive, och båda stimuli utlöses av en särskild stimulans dator, som också används för att placera pipetten via en precision 3-axlig micromanipulator. Ett inverterat Mikroskop används för att iaktta näthinnan under ett experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: experiment. (A) fotografi av alla experimentella inställningar visar de relativa positionerna för alla komponenter. MEA förstärkare systemet är placerad ovanpå en inverterade Mikroskop, som används för att visuellt inspektera näthinnan och digitalt bild gränssnittet enhet-retina med hjälp av den bifogade höghastighetskamera under experimentet. Toppen och botten perfusion kontrolleras oberoende av varandra med hjälp av en Solenoidstyrd perfusion system. Injektion, position kontroll och impedans mätningar är fulländad med en tryck spridare, micromanipulator och patch clamp förstärkare (orange fält; visas mer i detalj i B), respektive. Den mikropipett eller enhet sätts in en patch clamp headstage för impedans mätningar och monterad på gondolen (indikeras av gröna rutan; visas mer i detalj i C) att underlätta positionering med hjälp av en micromanipulator. (B) en närbild av de mät- och instrument som används i experimentet: 8-kanals trycket injektorn, micromanipulator styrsystem, patch clamp förstärkare för impedans mätning och sug fartyget för perfusion eliminering. (C) en närbild av injektion system utlastningsanordningen visar en multiport enhet har kopplats ihop med pipett innehavaren, patch clamp headstage och micromanipulator. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Perfusion setup. (A) fotografi av toppen av MEA förstärkaren visar platsen för den översta perfusionen och sug samt den gröna lysdioden används för visuell ljus stimulans. (B) en närbild av pMEA perfusion kammaren som illustrerar de exakta platserna topp perfusionen och sug, pMEA och referenselektroden används för impedans mätning. (C) en photomicrograph av perfusion bottenplattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Obs: Se figur 1, figur 2och figur 3
- Mäta ut 900 mL avjoniserat vatten vid rumstemperatur (~ 21 ° C) och placera i 1 L behållare.
- BEGJUTA vattnet med 100% CO2 med en bubblande mekanism.
- Tillsätt 8,8 g pulveriserat Ames' medium till vatten i 1 L behållare.
- Skölj Ames' medium behållare med några mL avjoniserat vatten för att avlägsna alla spår av pulveriserad Ames' medium och lägga till 1 L behållare.
- Tillsätt 25,3 mL natriumbikarbonatlösning (7,5% w/v31) till 1 L behållare.
- Tillsätt ytterligare vatten för att få lösningen till en slutlig volym av 1 L.
- Fortsätt startas vattnet med CO2 under cirka 5 minuter.
- Stoppa CO2 perfusion och börja startas lösning med en medicinsk kvalitet gasblandning av 95% O2 och 5% CO2 i minst 30 min eller tills pH stabiliserar på 7,4.
Obs: För tillämpningen av detta protokoll skall Ames medium hålls vid rumstemperatur (~ 21 ° C) under hela försöket att förhindra CO2 eller O2 från utgasning, som kan absorbera raderna perfusion med luftbubblor. - Rengör botten och toppen perfusion rören genom att fylla med 70% etanol och sedan tvätta båda linjerna 3 gånger med avjoniserat vatten. Fyll den nedersta raden med avjoniserat vatten och den översta raden med luft.
3. Wholemount Retinal förberedelse
Figur 4: Dissection och wholemount beredning av näthinnan. (A) fotografi av en intakt ögonmussla som tagits från en ljusmätare-urartade djur. (B) Photomicrograph av näthinnan med längsgående snitt plattas det ut. (C) efter utplattning av näthinnan, det placeras på en nätrastret med ljusmätare sida att kontakta mesh och tillplattad i luft (utanför perfusion medium) för att säkerställa att det finns inga veck eller böjda kanter. (D) de mesh och näthinnan snabbt överförs till pMEA med ganglion celler att kontakta elektroderna och omedelbart perfusion med syresatt Ames medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: perforerad multielectrode array. (A) fotografi av perforerade multielectrode matrisen används i protokollet. Näthinnan är placerad på den elektrod array (indikeras av den röda rektangeln, som visas i detalj i B) inom pMEA kammaren att tillåta kontinuerlig perfusion med syresatt Ames medium. (B) en photomicrograph elektrod matrisens själv illustrerar arrangemanget av perforeringar mellan elektroderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Obs: Se figur 4 och figur 5
- Använda en handhållen Röd LED ficklampa till dim röd belysning, avliva djuret via koldioxid kvävning följt av cervikal dislokation eller någon annan valt metod, enligt IACUC protokoll.
- Enucleate båda ögonen med en JUVELERARAFFÄR #5 pincett och placera utan ögon i en 60 mm diameter petriskål med ca 3-4 mL färsk, syresatt Ames medium lösning.
- Medan observerar ögat genom ett dissektion stereomikroskop med belysning topp och botten täckt med rött filter skärm, göra ett litet snitt i hornhinnan ansiktet med en skalpell eller ett par vass sax.
- Klipp från detta små snitt till kanten av hornhinnan och sedan förlänga snittet i ett omkretsriktningen avsnitt runt hela kanten av hornhinnan. Ta bort nu fristående hornhinnan tillsammans med linsen, genomskinlig vattenlösning och glaskroppen humors.
- Håll försiktigt ögonmusslan med ett par pincett och noggrant göra två små snitt på motsatta sidor av ögonmusslan. Använd sedan två par pincett för att försiktigt dra isär ögonmusslan vid varje snitt och separata näthinnan från sklera. Långsamt lyfta hela näthinnan från sklera och ögonmussla. Skär synnerven, om det fortfarande är monterat.
- Gör längsgående snitt i näthinnan att erhålla hälften eller kvartalet sektioner med sax och sedan försiktigt isär en retinal avsnitt på en nylon mesh (100 µm gängdiameter med 350 µm öppning) med ganglion celler (konkav av näthinnan) vänd bort från mesh.
- Placera mesh och näthinnan på en perforerad multielectrode array (pMEA) med ganglionceller i kontakt med den pMEA ytan. Sedan försiktigt placera ett vägt skiva rutnät ovanpå maskan som håller näthinnan på plats.
4. MEA och förvärvet Datainställning
Figur 6: ljudnivå av pMEA. (A) representativa inspelning av en delmängd av pMEA elektroder uppvisar höga ihållande brus. Detta buller beror oftast på en brist på ordentlig kontakt mellan pMEA kontakt kuddar och stiften av MEA förstärkaren till följd av normalt slitage av lagrets tunna perforerade polyimid över pMEA, speciellt vid kontakt kuddar. Den andra möjliga källan till buller är vanligtvis lösning läckt ut på de pMEA förstärkare kontakta kuddar. Ihållande buller på grund av dålig pin kontakt eller läckt lösning på kontakt kuddar kan vanligen korrigeras av skiftande ställning i pMEA inom förstärkaren för att få bättre kontakt och rengöring och torkning kuddar, respektive. Om buller inte kan undanröjas genom rengöring eller skiftande pMEA ställning, kan pMEA behöva bytas ut helt. (B) representativa inspelning av bullernivåer från en delmängd av pMEA elektroder från en ren pMEA med bra kontakt mellan pMEA och förstärkare. Den genomsnittliga ljudnivån är vanligtvis inom ±16 µV. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Obs: Se figur 6
- Under dim röd belysning, placera pMEA i MEA förstärkare och Stäng förstärkare spärrarna.
- Om referenspunkterna som inte redan finns på den pMEA avdelning ringen, etch två 'X'-formade märken placerade ca 5 mm mellanrum i ett område som är väl synlig från ovan med boom-stativ monterade mikroskopet.
- Placera utloppet topp perfusion inne i pMEA kammaren och slå på översta perfusion ventilen att uppnå en perfusion ca 3 mL per minut. Placera den övre insuget på önskad perfusatet nivå (~ 5 mm djup) och säkerställa att den fungerar.
- Öppna programvaran data förvärv på data förvärv datorn och klicka på 'spela' för att börja ta emot data. Säkerställa att alla pMEA kanaler är brusfri och inspelning neurala signaler.
- Genom att titta på en levande digital bild av inverterade mikroskopet synfält på en bildskärm, iaktta bottenytan av pMEA för bevis att lösningen rinner genom perfusion bottenplattan.
5. glutamat stimulering förberedelse
Figur 7: glas mikropipett och multiport mikroflödessystem enhet. (A) en pipett hållare innan du sätter in en mikropipett eller enhet. Silver/silverklorid elektroden (50 µm i diameter) är elektriskt kopplad till adaptern på slutet för att gränssnittet med den patch clamp headstage. (B) ett fotografi av glas mikropipett gränssnitt med pipett innehavaren visar var trycket porten används för att initiera pneumatiska injektioner. (C) en anpassad multiport mikroflödessystem enhet (1 cm 1 cm 0.134 cm) bifogas en anpassade 3D-tryckt fixtur och gränssnitt med pipett innehavaren genom ett rostfritt stål rör. Enheten, som var tillverkade i två lager, har åtta microports (diameter 14 µm) i det nedersta lagret (340 µm tjock) och åtta på chip reservoarer (diameter 1,6 mm) för att lagra glutamat i det översta lagret (1 mm tjock). Var och en av de åtta microports i nedre lagret av enheten självständigt är ansluten till en på-chip reservoar i det översta lagret via en i-plane microchannel och varje på-chip reservoar i sin tur är ansluten till trycket hamn 8-kanals trycket injektorn via en flexibel slang att tillåta oberoende aktivering av microports för mönstrade multisite injektioner. (D) en närbild av multiport enheten innehas av pincett innan du kopplar in slangen gränssnitt fixturen visar ordningen av de åtta självständigt-adresserbara på chip reservoarerna och slang inlopp. (E) en photomicrograph av bottenytan av enheten visar de åtta 14 µm diameter microports ordnade i en 3 x 3-konfiguration med 200 µm mellanrum att anpassa med elektroderna på pMEA. Åttana utanför microports utnyttjas för multisite injektioner, medan den centrala hamnen användes strängt för justering under tillverkning av enheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Obs: Se figur 7.
- Bered glutamat genom att blanda lager glutamat solutionwith syresatt Ames medium lösning för att få ett 0,5 mL prov med en arbetande koncentration på 1 mM glutamat.
- Sätt försiktigt in en pre drog 10 µm diameter mikropipett eller rostfritt stål staven ansluten till multiport mikroflödessystem enheten i en vanlig pipett hållaren som innehåller en 50 µm diameter silver/silverklorid tråden.
Obs: Om impedans upptäckt inte är tillgänglig, kommer silver/silverklorid tråden kan utelämnas. - Gränssnitt pipetten hållaren med den patch-clamp headstage och Anslut trycket port luer anslutningen av innehavaren pipett på kanal 1 i trycket insprutningssystemet, om använder en glas mikropipett eller port luer anslutningarna av varje 8 injektion hamnarna med kanalerna 1-8 av trycket insprutningssystemet, om använder multiport enheten.
- Manuellt slå på tryck insprutningssystemet och slå på kanal 1 (eller kanaler 1-8, som är tillämpligt). Kontrollera att systemet är portad till atmosfären och satt Injekteringstryck till 0.1 psi.
- Slå på micromanipulator och kalibrera den genom att trycka på knappen 'Kalibrera' på manipulator handkontrollen. Placera micromanipulator så att mikropipett spetsen (eller botten av enheten, i förekommande fall) är ca 30 mm ovanför MEA förstärkaren.
- Fyll en liten petriskål med glutamat lösning (1 mM glutamat i standard Ames medium) och placera den under micromanipulator. Lägre mikropipett tip (eller enheten) in i lösning och fyllning genom att trycka på knappen 'Fill' på trycket insprutningssystemet (undertryck i -13 i H2O) tills det finns ungefär 20 mm lösning synliga i glas mikropipett eller den Multiport enhet slangar.
- Om apparaten används multiport, slå kanal 1 i trycket injektorn off och upprepa protokollet för kanalerna 2-8. Lyfta den mikropipett tip eller enhet ur lösningen, ta bort petriskål och placera micromanipulator ovanför pMEA kammaren.
- Använder ett stereomikroskop med boom-stativ monterade, justera mikropipett spetsen eller hörnen på enheten med referenspunkterna etsas in i ringen med pMEA i kammaren. Lagra manipulator positioner i programvaran kontroll knapparna 'Store referens A' och 'Store referens B' (eller helt enkelt Observera manipulator koordinaterna manuellt) att kartlägga koordinatsystemet för manipulatorn med pMEA elektroderna.
- Använda programvaran manipulator kontroll, Välj en target pMEA elektrod med robust spontan aktivitet och klicka på knappen ”Flytta till kanal' för att justera glas micropipettewith target elektroden.
6. gränssnitt med Retina
- Om impedans mätning är tillgänglig, slå på patch clamp förstärkare och initiera impedans visualisering programvaran genom att klicka på 'Start'-knappen för att visualisera impedansen i silver/silverklorid elektroden inuti hållaren pipett. Medan du observerar realtid impedans signaler, långsamt sänka mikropipett eller enheten tills den kontaktar näthinnans yta som indikeras av en snabb ökning impedans signal (se figur 8). Spara eller anteckna placeringen av näthinnans yta.
- Om impedans mätning inte är tillgänglig, identifiera kontakt med retinal ytan genom visuell observation, att detta kommer att vara mindre EXAKTA. Sänk till pipett eller enheten tills den synbart kontaktar den övre ytan av Ames medium lösningen i MEA kammaren.
- Medan du observerar toppen av näthinnan med ett inverterat Mikroskop, långsamt Sänk sedan till pipett eller enheten tills den övre ytan av näthinnan är synbart förvrängd, vilket indikerar att kontakt har tagits med retinal ytan. Spara eller anteckna placeringen av näthinnans yta.
- För subsurface stimulering, lägre pipetten ytterligare 40 µm (för S334ter-3 näthinnor) eller 70 µm (för vildtyp näthinnor).
- Utföra några kort varaktighet (10-30 ms) injektioner med hjälp av tryck-insprutningssystem (0.1 psi) för att avgöra om cellerna nära mikropipett spetsen eller enhet microports är mottagliga för glutamat stimulering genom att Observera de neurala signalerna med datainsamling programvara.
Obs: Framgångsrika injektioner kommer framkalla en klart synlig spike hastighet brista eller spike hämning (se figur 9). Om inget svar har observerats, flytta den mikropipett eller enhet på en annan elektrod.
Figur 8: impedans mätning. (A) en schematisk av impedans mätning tekniken. Använda patch clamp förstärkaren, övervakas impedansen hos mikropipett kontinuerligt eftersom det sänks långsamt mot näthinnans yta. När mikropipett ligger över näthinnan, resulterar Ames medium relativt höga Joniska ledningsförmåga i en låg impedans läsning. Eftersom mikropipett gör kontakt med retinal ytan, Joniska konduktiviteten genom silver/silverklorid tråd reduceras, orsakar en snabb ökning i uppmätta impedansen. (B) en handling som visar impedans ändringen registreras strax före och efter kontakten av pipettspetsen med retinal ytan. Den uppmätta impedansen är relativt låg när mikropipett spetsen är i lösning strax före kontakt (indikeras av regionen orange till vänster). När kontakt sker (indikeras av röda pilspetsen och den gröna regionen höger), ökar impedans snabbt på grund av minskad Joniska ledningsförmåga vid kontakt med retinala vävnaden. I praktiken är näthinnans yta registrerad som höjd motsvarande uppkomsten av den kraftiga uppgången av den uppmätta impedansen (platsen av röda pilspetsen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: elektroden inspelningar av neural aktivitet under visuell, spontan, och glutamat injektion inspelningar. (A) representativa inspelningar från nio pMEA elektroder visar högpass filtrerade elektrod data under visuell ljus stimulans med en grön LED där varje rektangel visar neurala data från en unik elektrod. Varje elektrod inspelning visar insamlade under den första sekunden efter att vrida på den gröna lysdioden (timing visas med orange pilspetsar i varje tomt) med en gemensam spänning skala visas i de vänstra y. Spikar identifierades med hjälp av en tröskel spänning på-18 µV (horisontella röda linjen i varje elektrod tomt) och representeras av de svarta spåren över grön elektrod data. Visuell stimulans orsakade en explosion av spikar (excitation) i alla elektroder utom överst i mitten en, som besatt en hämmande reaktion på ljus. (B) en liknande tomt för samma elektroderna visar spontan neural aktivitet utan visuell eller injektion stimulering. Även om mindre skurar var närvarande, var mönster av spikar mycket annorlunda från de som registrerats som svar på visuell stimulering. (C) representativa inspelningar från den samma undergrupp av elektroder registreras omedelbart efter en glutamat injektion på centrala elektroden (tidpunkten anges av orange pilspetsar i varje tomt). Injicerade glutamat utlöste en explosion av spikar i centrala elektroden som var mycket lik de visuellt framkallat spike skurar. Alla andra elektroderna påverkades inte av glutamat injektion, vilket visar den fina rumsliga upplösningen av tekniken med kemisk stimulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. initiera Retinal inspelning och stimulans Program
- Orient den gröna LED mot den övre ytan av näthinnan. Börja inspelningen med programvaran data förvärv på dedikerad inspelning datorn genom att skriva filnamnet och klicka på ”record”-knappen.
- När inspelningen har startat öppna programmet stimulus kontroll och läsa in standard stimulans filen genom att klicka på knappen ”Läs stimulans fil”. Nästa, klicka på knappen ”Kör stimulans fil” att inleda stimulans standardfilen bestående av stimuli och data förvärv protokollet beskrivs i kommentaren nedan.
Obs: a 30 prövningar av 2 s ON och 2 s OFF hela fältet flash (5 lm/m2 intensitet) använder den gröna lysdioden. (ii) 120 s för data utan att använda den gröna lysdioden för att registrera den spontana aktiviteten av näthinnan över en liknande tidsram. (iii) 1 eller fler uppsättningar av glutamat injektioner bestående av 30 prövningar av glutamat injektioner på 0,1 psi med 10-30 ms injektion gånger (ca 100-300 pL per injektion) och 3 s interpulse varaktigheter. När det gäller multi-site injektioner, väljer du 2 eller fler portar att injicera samtidigt.
Figur 10: Peristimulus histogrammen för visuell, spontan, och glutamat svaren. (A) representant peristimulus histogram (30 ms binwidth) av spike data från delmängden av elektroder i figur 9A, i genomsnitt över 20 prövningar av visuell ljus stimulans. En gemensam spike hastighet skala tillämpades på alla elektroder och visas på de vänstra y. Den svarta linjen i varje elektrod tomt representerar den genomsnittliga spike hastigheten för alla spikar som noterats under den första sekunden efter att slå den gröna lysdioden på. Som kan ses, orsakade visuell stimulans ett övergående excitatoriska spike rate svar på alla elektroder utom överst i mitten elektroden, som hade en hämmande transientsvar för ljus. (B) genomsnittliga spontana spike rate Svaren registreras vid de samma elektroderna utan några visuella eller kemisk stimulering. Utan stimulering är de spike priserna för varje elektrod relativt konstant. (C) de genomsnittliga spike rate svar inspelade på samma elektroderna som svar på en glutamat injektion vid ett läge ovanför centrala elektroden. Endast övergående svaret uppenbart är excitatoriska svar på elektroden direkt under injektionsstället. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll kan användas att kemiskt stimulera såväl normal, vildtyp näthinnor som ljusmätare urartade näthinnor, trots den betydande cellulära remodeling orsakas av förlust av fotoreceptorer. Innan början experiment med antingen ljusmätare degenererat eller vildtyp näthinnor, inspelning och stimulering utrustning (figur 1 och figur 2) behovet att vara redo och pMEA (figur 5) bör rengöras för att minimera den buller på varje elektrod kanal (figur 6). Även om ljusmätare urartade näthinnor är tunnare och därför mer känslig än vildtyp näthinnor, samma dissektion förfarande (figur 4) används för båda. Följande dissektion, näthinnan placeras försiktigt på pMEA med ganglion cell vänd elektroderna och den pMEA säkrade inuti MEA förstärkaren (figur 3A), där det kan vara ständigt perfusion med färska, syresatt Ames medium från både topp (figur 3B) och nedre (figur 3 c) sidor. Efter att säkerställa näthinnan har stabiliserats från kirurgiskt trauma, är en glas mikropipett eller multiport enhet monterade i en pipett hållaren (figur 7A-E) och gränssnitt med en patch-clamp headstage vars läge styrs av en 3-axlig precision micromanipulator. Microport(s) av pipett eller enheten bör då i linje med en mål-elektrod och försiktigt sänkas tills kontakt kan upptäckas med metoden impedans visas i figur 8 eller visuellt bekräftas via mikroskopi. När injektion leverans port(ar) placeras på rätt plats på ytan eller under ytan av näthinnan, kan programmet stimulering initieras.
En representativ uppsättning av neural aktivitetsinspelningar på en delmängd av pMEA elektroderna visas i figur 9 för visual (figur 9A), spontan (figur 9B) och exogent injicerade glutamat (figur 9 c) stimuli. Framgångsrik visuell och kemiska stimuli är vanligtvis observerbara som skurar av RGC spikar eller tillfälligt upphörande av tillsatta aktivitet, som kan ses i exemplen i figur 9. Om närliggande celler är okänslig för kemisk stimulering, liknar resulterande spike data beteendet spontana tillsatta. Efter utdrager RGC spikar och organisera dem i prövningar, kan neurala svaren på varje elektrod illustreras med en genomsnittlig peristimulus tid histogram (PSTH) av den tillsatta hastigheten, såsom de som visas i figur 10, som motsvarar den råa elektroden data i figur 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden presenteras här visar en unik nervstimulering paradigm, retinala nervceller stimuleras vari kemiskt genom att injicera infödda neurotransmittor kemikalier i ytan av näthinnan in vitro. Denna kemiska stimulering teknik ger flera fördelar över den konventionella elektriska stimulering teknik, inklusive selektivitet och hög fokal specificitet av målet nervceller. Protokollet över Detaljer hur liten volym pneumatiska injektioner av signalsubstansen glutamat levereras nära målet retinala nervceller använder antingen en single-port glas mikropipett eller en anpassad micromachined multiport mikroflödessystem enhet framkalla fysiologiskt betydande RGC svaren. Även om detta protokoll har demonstrerats med endast Glutamat, fortfarande protokollet användbar för att studera kemiska stimulering av näthinnan med andra typer av neurotransmittorer. Dessutom medan det är bättre att använda en pMEA för en Elektrofysiologisk inspelning32 som beskrivs i detta protokoll, andra MEA mönster, kunde inklusive icke-perforerade typ användas för att uppnå liknande resultat som pMEA. I de följande punkterna diskuterar vi de viktigaste stegen i våra protokoll, metoder för att felsöka vanliga problem, och de begränsningar och framtida tillämpningar av denna stimulering teknik.
För att få säker och pålitlig kemisk stimulering, skall flera kritiska steg utföras i detta protokoll. En av de kritiska steg är att få en framgångsrik retinal beredning genom noggrant utvinna näthinnan och minimera mängden tid som hålls utanför syresatt Ames medium, dvsnär flackare nymalen dissekerade näthinnan på rutnätet mesh Innan du överför den till pMEA perfusion med Ames medium. Inledande dissektion av näthinnan kräver vassa dissektion verktyg och praxis eftersom råtta ögat är relativt liten. Dessutom utvinning av ljusmätare urartade näthinnor kan vara särskilt svårt eftersom de är mer ömtåliga än de redan bräckliga normala retinae, och är därför benägna att riva. Hela dissektion processen, från första enucleation till utsläppande näthinnan på pMEA, bör ske så snabbt som möjligt att förhindra för tidig celldöd av brist på syre eller andra näringsämnen. Mekanisk trauma förmedlas till vävnaden under dissektion bör minimeras genom att undvika en skär genom eller vävnadsskada, eftersom detta kan också leda till onaturliga neurala svaren och celldöd.
Efter att placera näthinnan på pMEA, bör vara försiktig vid initiering av toppen och botten perfusion och sug linjer, eftersom detta är en vanlig felkälla av experimentet. Alla perfusion och sug linjer måste kontrolleras för clearance före början experimentet och regelbundet undersökt hela experimentet att se till att luftbubblor inte hindrar flödet genom linjerna. Bildandet av luftbubblor inom perfusion kardemumman kan i synnerhet helt hindrar flödet av perfusion tack vare sin mindre diameter och därmed orsaka en för tidigt slut på experimentet genom att beröva näthinnan av syre och näringsämnen. På grund av faran av luftbubblor bedrivs protokollet ovan vid rumstemperatur i stället för på en mer idealisk fysiologiska temperatur att undvika den outgassingen av upplöst syre eller koldioxid från Ames medium lösningen. Om luftbubblor Täpp en av perfusion raderna under ett experiment, kan de oftast vara spridda i mindre, icke-occluding bubblor genom att trycka lätt på raden perfusion.
Ett annat vanligt problem relaterade till perfusion systemet är finjustering av insugningstrycket botten så att den rymmer näthinnan ordentligt i kontakt med elektroderna men utan skador. Om sug trycket är för högt, kan det suga små bitar av näthinnan via perforeringen av pMEA och så småningom leda till upphörande av alla neurala svar. Däremot, om trycket är för lågt, kommer näthinnan flyta bort från elektroderna och därför störa neurala inspelningen. Justera insugningstrycket mellan dessa två extrema nivåer kräver övning och underlättas om pMEA används över en inverterade Mikroskop, vilket gör en noggrann observation av perforeringen av pMEA. Genom att observera dessa perforationer medan du justerar sug, kan man hitta den rätta balansen som upprätthåller kontakt utan att skada näthinnan. För att minimera möjligheten av fotoblekning fotoreceptorer när stimulera vildtyp näthinnor, inverterade mikroskopet Upplysaren bör filtreras för att avge rött ljus endast och visuella observationer bör slutföras så snabbt som möjligt.
Efter att säkerställa korrekt perfusion villkoren, nästa kritiska steg refererar till enheten eller pipetten med en synlig fast punkt eller markör på pMEA så att den injektion port(ar) kan anpassas exakt med pMEA elektroder. Detta görs normalt via triangulering vari två referenspunkterna placeras på kanten av pMEA kammaren är grovt linje med glas mikropipett tip eller sevärdheter på multiport enheten genom visuell observation från ovan med hjälp av den Boom-stativ monterade Mikroskop. En finare anpassningen av den injektion port(ar) med målet elektroder uppnås då genom okulärbesiktning genom det inverterade mikroskopet. När justerats ordentligt, bör försiktighet iakttas när man närmar sig näthinnan med en pipett eller en mikroflödessystem enhet, eftersom någon manipulator jitter eller drift kan krossa näthinnan eller skada pMEA. Det bästa sättet att undvika att oavsiktligt skada näthinnan är att kontinuerligt övervaka impedansen i pipett elektroden att upptäcka just kontakt med retinal ovansidan. Impedans mätning kan också användas för att snabbt kontrollera om mikropipett spetsen satts in under ytan av näthinnan är blockerad, vilket anges av en onormalt hög (vanligtvis i intervallet gigaohm) impedans. Om blockerade, kan mikropipett spetsen oftast rensas genom att initiera en högtryck puls med sin spets placeras nära näthinnan att undvika oavsiktliga skador. I sällsynta fall, kan blockerade pipetter behöva bytas ut helt om hög tryckpulser inte avmarkera blockeringen. En onormal eller hög impedans värde kan också registreras när referenselektroden inte ordentligt gränssnitt mellan lösningen i pMEA kammaren och patch clamp förstärkaren.
När placerad på en målplats, ska injektionsvolymen på glutamat kontrolleras noggrant av begränsa trycket, injektion tid och neurotransmittorn koncentration att förhindra överstimulering av nervceller, som har visat sig orsaka excitotoxic skador.Parametrarna för glutamat-injektion detaljerad i detta protokoll representerar en regim som är långt under den kända tröskeln för orsakar glutamat excitotoxicitet33 men, när du försöker detta protokoll med andra typer av neurotransmittorer, motsvarande gränsvärden för excitotoxicitet effekter måste beaktas för säker stimulering. Även 0.1 psi Injekteringstryck föreskrivs i protokollet ovan härrör från det lägsta möjliga tryck inställning tillgänglig på 8-kanals trycket injektorn används i denna studie, men har producerat framgångsrika resultat konsekvent. 0.1 psi för signalsubstansen injektioner är därför bara suggestiv, men inte begränsande, att uppnå framgångsrika kemiska stimuli. Om lägre aktivering tryck är möjliga med en olika tryck injektor, kan injektioner utföras vid tryck lägre än 0,1 psi.
En begränsning i detta protokoll med in vitro- wholemount retinal preparat är fönstret kort experimentella tid, som är begränsade till varaktigheten för 8 h eller mindre, även med extrem omsorg i hela hela experimentet. Detta begränsade experimentella tidsfönster tillåter inte undersökning av några långsiktiga effekter av kemisk stimulering såsom excitotoxicitet. En annan begränsning i detta specifika protokoll är valet att spela in vid rumstemperatur i motsats till fysiologiska temperatur, som sannolikt påverkar både den visuellt - och kemiskt-framkallat spike rate svaren, eftersom tidigare studier har visat att lägre inspelning temperaturer kan förändra den tillsatta hastighet, svar latens och glutamat upptagshastigheten bland flera andra boenden34,35,36,37,38. Denna begränsning skulle kunna undvikas med hjälp av en icke-perforerade MEA med en uppvärmd bottenplatta, i motsats till den pMEA, som utnyttjar en specialdesignad bottenplatta perfusion utan en uppvärmd platta eller en effektiv termisk debubbler för både övre och undre perfusion.
Slutligen, in vitro- preparatet begränsas av nödvändigheten av en aktiv perfusion av syresatt Ames medium att hålla näthinnan friska. Flytande strömmarna orsakas av perfusion systemet är normalt mycket snabbare än de naturliga perfusion mekanismerna Funna i ögat i vivo39och kan störa kemiska injektioner genom att rita injicerade signalsubstanser bort från den näthinnan. Surface-baserade injektioner, som tillverkas med multiport enheten, skulle sannolikt vara mer mottagliga för perfusion aktuella störningar jämfört subsurface injektioner om förekomsten av perfusion från botten av pMEA kunde orsaka en liknande effekt hela hela näthinnan. Av denna anledning glutamat kemikalier i det nuvarande protokollet levererades med pneumatiska pressar, men Injekteringstryck krävs för att uppnå framgångsrika stimulering i vivo kan vara betydligt lägre än utnyttjas för in vitro- studier.
Kemisk stimulering, som syftar till att aktivera nervceller med mer naturliga signalsubstansen stimuli, erbjuder ett effektivt alternativ till konventionell elektrisk stimulering men har inte ännu allvarligt undersökts. Följaktligen finns lite litteratur som beskriver protokoll eller bästa praxis för att uppnå tillförlitlig subretinal kemisk stimulering av retinala nervceller. Senaste studier28 använder det här protokollet har visat att subretinal kemisk stimulering av retinala nervceller kan tillförlitligt framkalla RGC svaren med rumsliga upplösningar jämförbara med eller bättre än elektrisk stimulering av näthinnan, och det finns bevis för att subretinally tillämpas exogena glutamat kan stimulera bipolära celler direkt, vilket gör att denna metod att dra nytta av näthinnans inneboende visuell bearbetning kretsar och, förmodligen, frammana uppfattningar liknar mer dagsljus stimulering.
Ytterligare studier krävs för att validera dessa fynd i icke-murint modellsystem och undersöka frågor som inte tas upp av de tidigare studier, inklusive långsiktiga effekter och praktiska aspekter rörande i vivo genomförandet av detta strategi. Därför ligga framtida inriktningar av detta tillvägagångssätt klart i att översätta konceptet till i vivo djurmodeller genom att utveckla lämplig teknik för att uppnå långsiktiga kemiska leverans och stimulering med en implanterbar ljus-drivna mikrofabricerade enhet som fungerar som en ersättning för det degenererade ljusmätare lagret. Som en relativt understudied stimulering paradigm, bredare tillämpningar av kemisk stimulering har ännu upptäckt, men eftersom näthinnan är en del av centrala nervsystemet40, denna stimulering strategi potentiellt skulle kunna tillämpas i andra nervstimulering sammanhang, såsom behandling av kortikala, spinal cord, eller neuromuskulära sjukdomar med hjälp av olika signalsubstanser. Dessutom skulle presenteras protokollet kunna mer allmänt antas för studier som undersöker effekterna av kontrollerad leverans av ett läkemedel eller andra kemikalier i neurala vävnader med fina spatiotemporal upplösning i en in vitro- miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Det arbete som presenteras i tidningen stöddes av National Science Foundation, framväxande gränser i forskning och Innovation (NSF-EFRI) program bevilja nummer 0938072. Innehållet i detta dokument är endast ansvarig för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av NSF. Författarna vill även tacka Dr Samsoon Inayat för hans arbete designa och testa den första experimentella konfigurationen för kemisk stimulering och Mr Ashwin Raghunathan för hans arbete utforma, tillverka och utvärdera multiport mikroflödessystem enheten används i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
- Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
- Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
- Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
- Zrenner, E. Fighting blindness with microelectronics. Sci Transl Med. 5, (2013).
- Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
- Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
- Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
- Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
- Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
- Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239 (2014).
- Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
- Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009 (2013).
- Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002 (2013).
- Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
- Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
- Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
- Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010 (2015).
- Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505 (2016).
- Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
- Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
- Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
- Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148 (2014).
- Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
- Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
- Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
- Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
- Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
- Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
- Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
- The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).
