Summary
Этот протокол представляет в vitro жить изображений фагоцитоза assay для измерения фагоцитарной способности астроциты. Астроциты очищенный крыса и микроглии используются наряду с синаптосомах конъюгированных показатель рН. Этот метод может обнаружить реального времени полного охвата контейнера пламенем и деградации кинетики и предоставляет платформу подходящий скрининг для выявления факторов, модулирует экзоцитоз фагоцитоза.
Abstract
Астроциты являются типом крупных клеток в головном мозге и напрямую связаться с синапсов и кровеносных сосудов. Хотя Микроглии клеток были рассмотрены основные иммунные клетки и только фагоцитов в головном мозге, недавние исследования показали, что Астроциты также принимают участие в различных процессах фагоцитоза, например развития синапса ликвидация и удаление бета-амилоидных бляшек в болезни Альцгеймера (AD). Несмотря на эти выводы эффективность поглощения экзоцитоз и деградации их целей является неясным по сравнению с микроглии. Это отсутствие информации обусловлено главным образом отсутствием пробирного системы, в котором легко сопоставимы кинетика экзоцитоз - и микроглии опосредованной фагоцитоза. Для достижения этой цели, мы разработали долгосрочный жить изображений в пробирке фагоцитоза анализа для оценки фагоцитарной способности очищенный астроциты и микроглии. В этот assay возможно с помощью РН конъюгированных индикатор синаптосомах, выделяющие ярко красной флуоресценции в кислой органеллы, например лизосомы реального времени обнаружения поглощения и деградации. Наш Роман пробирного обеспечивает простое и эффективное обнаружение фагоцитоза путем жить изображений. Кроме того этот в vitro фагоцитоза assay может использоваться как платформа скрининга для выявления химических веществ и соединений, которые могут повысить или препятствовать фагоцитарной способности астроциты. Как было показано, что синаптических обрезка неисправности и накопление патогенных белка причиной психических расстройств или нейродегенеративных заболеваний, химических веществ и соединений, которые модулируют фагоцитарной способности глиальные клетки должны быть полезны в лечении различных неврологические расстройства.
Introduction
Глиальные клетки, которые относятся к не возбудимых клеток в головном мозге, являются основным клетки типа в центральной нервной системе (ЦНС). Ранее глиальные клетки были расценены как просто вспомогательные клетки, которые главным образом играть пассивная роль в поддержании выживаемость нейронов и базальной синаптических свойства. Однако новые данные показали, что глиальные клетки играть более активную роль в различных аспектах нейробиологии, таких как поддержание гомеостаза головного мозга, посредничество синапса формирования1,2,3 и СИНАПС ликвидации4,5и модулирующая синаптической пластичности6,7. Глиальные клетки в ЦНС включают астроциты, Микроглия и олигодендроциты. Среди этих клеток, астроциты и микроглии показали играть фагоцитарной роли путем поглощение синапсы4,5, apoptotic клетки8, нейронные мусора9и патогенных белков, таких как бета амилоида бляшки10,11. В развитие мозга астроциты устранить синапсов в спинной латеральное коленчатое (dLGN) через MERTK - и MEGF10-зависимой фагоцитоза4. Аналогичным образом микроглии также устранить C1q-покрытием синапсы этапах развития через каскад классической дополнением5. Интересно, что было высказано предположение о том, что дефекты в синапсе Обрезка может быть одним из инициаторов нескольких неврологических расстройств. Например было показано, что мутации в компонент 4 (C4), в которых увеличивается дополнение опосредованной синапса обрезка микроглии, сильно связаны с преобладанием шизофрении в людей12. Недавний документ также показал, что путь классической дополнением гиперактивными в стадии инициации AD и индуцирует ранних синапса потери в этой болезни13.
По сравнению с микроглии опосредованной фагоцитоза, ли экзоцитоз опосредованной фагоцитоза способствует инициации и прогрессирования различных неврологических расстройств является менее ясным. Однако недавний документ свидетельствует о том, что факторы, которые изменяют уровень нормальной синапса обрезки, астроциты может подорвать гомеостаза головного мозга и способствовать AD восприимчивость и патологии14. Уровень обрезки синапса, астроциты мощно контролируется ароЕ изомеров, с защитной аллеля для AD (ApoE2) сильно повышение скорость и риск аллеля для AD (ApoE4) значительно снижение ставки. Кроме того трансгенных мышей, выражая ApoE4 накопленных гораздо больше синаптических C1q чем ApoE2 мышей14или управления. Эти данные позволяют предположить, что нарушение экзоцитоз опосредованной фагоцитоза в начале объявления мозга может вызвать накопление стареющей C1q-покрытием синапсы/синаптической мусора, который активирует фагоцитоз дополнение опосредованной микроглии, вождение синаптических дегенерация . Нарушением фагоцитарной способности астроциты в ApoE4 перевозчиков может также способствовать бесконтрольное накопление бета-амилоидных бляшек в ад затронутых мозги.
Кроме того было показано, что глиальные клетки в возрасте мозг дрозофилы потерять их фагоцитарной способности благодаря снижению перевод Дрейпер, гомолога Megf10 , астроциты использовать для phagocytosing синапсов. Восстановление уровней Дрейпер спасли фагоцитарной способности глиальных клеток, которые эффективно очистить поврежденные аксональное мусора в возрасте мозг в подобные степени, что в молодой мозга, указав, что старение индуцированной изменения в фагоцитарной способности Астроциты могут способствовать нарушению гомеостаза головного мозга15.
Основываясь на этих новых результатов, модулирует фагоцитарной способности астроциты может быть привлекательным терапевтические стратегии для профилактики и лечения различных неврологических расстройств. В этой связи там было несколько попыток повышения фагоцитарной способности астроциты, например, вызывающих подкисление лизосом с кислой наночастиц16 и экспрессирующих транскрипционный фактор EB (TFEB), который может увеличить Лизосома биогенеза17. Несмотря на эти попытки, до сих пор неясно как астроциты и Микроглии клеток отличаются в их фагоцитарной кинетики и ли мы должны увеличить или уменьшить их фагоцитарной потенциала в различных заболеваний.
В этой статье мы представляем Роман в vitro assay для обнаружения фагоцитарной способности астроциты в режиме реального времени. Данные показывают различные кинетики сплошным и деградации в астроциты и микроглии. С кондиционером экзоцитоз среднего (ACM), который содержит секретируемые факторов от астроциты, имеет важное значение для эффективного фагоцитоза астроциты и микроглии. Кроме того Megf10, фагоцитарной рецепторов в астроциты и гомолога КНИ-1 и Дрейпер, играет важнейшую роль в экзоцитоз опосредованной фагоцитоза8,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены Корейский передовой институт науки и технологии институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC), KA2016-08.
1. synaptosome очистки
Примечание: Эти процедуры взяты из опубликованных ранее документ19 с несколько модификаций для повышения урожайности очищенный синаптосомах (рис. 1).
- Подготовьте разрывными плотность градиента СМИ.
- Поместите следующие на льду: 3%, 10% и 23% плотности градиента решения в буфере градиента (довести до 250 мл воды с 109.54 г сахарозы, 606 мг трис и 5 мл 0,2 М ЭДТА, рН 7,4); гомогенизации буфера (Добавить 25 мл 4 x градиентного буфера и 500 мкл 50 мм DTT 74,5 мл воды); Гомогенизатор ступку и пестик.
Примечание: Градиент плотности раствора и подготовка представлены в таблице 1. Подготовить 3%, 10% и 23% плотности градиента решения, используйте объемная плотность градиента решение. - Подготовьте шесть ультрачистый пробирок на трех взрослых мышей.
- Добавьте 3 мл раствора градиент плотности 23% в нижней части каждого пластиковых пробирок с Пипетка 1-мл. Затем медленно Сделайте слой с 3 мл 10% плотности градиентного раствора на верхней части решения 23% плотность градиента с пипеткой пастбищ и Пипетка 1-мл. Наконец добавьте 3 мл 3% плотности градиентного раствора на вершине. В этот шаг осторожность во избежание введения пузыри.
- Обложка пробирок с полиэтиленовой пленкой и держать трубы на льду.
- Поместите следующие на льду: 3%, 10% и 23% плотности градиента решения в буфере градиента (довести до 250 мл воды с 109.54 г сахарозы, 606 мг трис и 5 мл 0,2 М ЭДТА, рН 7,4); гомогенизации буфера (Добавить 25 мл 4 x градиентного буфера и 500 мкл 50 мм DTT 74,5 мл воды); Гомогенизатор ступку и пестик.
- Precool высокоскоростной центрифуги и ультрацентрифугирования до 4 ° C.
- Стерилизуйте хирургические оборудования (ножницы, ножницы Кастровьехо весной и Изогнутый пинцет) с 70% этиловом спирте. Подготовить небольшой стеклянный стакан с 25 мл гомогенизации буфера на льду и весят стакан.
- Извлечь мозги из трех взрослых (примерно 12 недель) мышей-самцов.
- Вывихнуть шейного позвонка и вырезать шею с операционной ножницы. Шелушиться кожа головы и черепа вдоль средней линии, используя операционной ножницы и Изогнутый пинцет. Акцизный обонятельные луковицы и мозжечке Кастровьехо весной ножницами.
- Положите оставшиеся мозги в стакан с изогнутой щипцами и весят мозги. Промывайте мозги несколько раз с ледяной гомогенизации буфера для удаления крови на поверхности мозга.
Примечание: Ранее, 9 мл гомогенизации буфера 1 g тканей мозга было рекомендовано. - Добавьте 4 мл гомогенизации буфера и 1 g тканей мозга гомогенизатор раствором. Во время гомогенизации мозги, добавить гомогенизации буфера до 8 мл.
- Гомогенат трутневых делят на два 50-мл высокоскоростной пробирок. Промыть раствором с 1 мл свежего гомогенизации буфера и добавить его к трубкам.
Предупреждение: Выполните шаги 1,3-1,7 так быстро, как можно скорее. Рекомендуется использовать менее чем за 20 мин. - Центрифуга гомогенатах в высокоскоростной пробирок на 1000 g x 10 мин при температуре 4 ° C с медленнее тормоза.
Примечание: Установите замедления (тормоз) на два или три, когда максимальная скорость замедления составляет девять. - Тщательно супернатант в новой 50 мл трубки и добавить до 12 мл гомогенизации буфера.
- Тщательно и медленно Пипетка 2 мл разбавленной супернатант над 3% плотность градиентного раствора с Пипетка 1-ОД и место трубы на льду.
- Центрифуга на 31000 g x 5 минут при температуре 4 ° C с без тормозов.
Примечание: Установить скорость замедления в одном (ноль) или побережья. - Место труб на льду и собирать synaptosome фракция между 23% плотности градиента и 10% плотности градиента с пипетки 2 мл в 50-мл пробирку. Добавить ледяной сахарозы/ЭДТА буфер до 80 мл и делят его на четыре Высокоскоростные центрифуги 50 мл трубки.
Примечание: Смотрите Рисунок 3 для фракционированный синаптосомах с метками градиентов. - Центрифуга на 20000 x г за 30 мин на 4 градусов с меньшим количеством перерывов.
Примечание: Установите замедления на два или три, когда максимальная скорость замедления составляет девять. - Тщательно удалить супернатант с Пипетка 1-ОД, Ресуспензируйте synaptosome лепешка с 1 мл раствора20изотоническим физиологическим буфера (140 мм NaCl, 3 мм KCl, 1,2 мм MgCl2, 1,2 мм NaH2PO4, 10 мм HEPES и глюкозы 10 мм, рН 7,4). Добавить 1 мл 10% ДМСО в изотоническим физиологическим буфера (конечная концентрация ДМСО: 5%) и собирать синаптосомах в одной высокоскоростной центрифуги 50-мл пробирку.
- Аликвота 1 мл в 1,5 мл пробирок. Измерьте концентрацию протеина используя assay Брадфорд синаптосомах.
- Быстро замораживания труб и хранить трубы в морозильник-80 ° C до pH индикатор спряжение.
2. рН показатель спряжение
- Центрифуга для 1.5 мл пробирок с синаптосомах на 21,092 x g для 3-4 мин при 4 ° C.
- Удалить супернатант, добавить 200 мкл 0,1 М Na2CO3 и перемешать хорошо закупорить.
Примечание: Na2CO3 было добавлено для повышения рН как Эстер succinimidyl наиболее эффективно реагирует с первичных аминов в слегка щелочной рН. - 2 мкл pH индикатор, трубки и аккуратно водоворот.
Предупреждение: Используйте 1 мкл pH индикатор на 0,3 мг synaptosome решения. - Сведения к минимуму воздействия света, покрывая трубы с алюминиевой фольгой и инкубировать их для 1-2 ч при комнатной температуре (RT) в шейкере твист с нежным агитации на 30-40 об/мин.
- Остановить агитации и добавить 1 мл DPBS.
- Центрифуга для труб на 21,092 x g для 1-2 мин.
- Удалить супернатант и добавьте 1 mL DPBS Ресуспензируйте гранулы, нежный закупорить.
- Повторите шаги 2,6-2,7 по меньшей мере семь раз, чтобы удалить несвязанные pH индикатор.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 200 мкл DPBS с 5% ДМСО.
Примечание: на данный момент, все синаптосомах являются нефункциональными. Мы подтвердили, что фосфатидилсерина (PS) подвергся воздействию внешней мембраны синаптосомах, которая функционирует как «съесть-me» сигнал (рис. 4).
3. астроциты и микроглии очистки
Примечание: Этот протокол для очистки экзоцитоз заимствована из опубликованных ранее документ21. В этом протоколе описан очистки астроциты крыса и микроглии. Конкретные процедуры для очистки мыши астроциты и микроглии также описаны в примечаниях.
- День до очистки
- Готовят блюда культуры предварительно покрытых клеток и решения.
- Подготовка пяти 145 мм x 20 мм Петри с 25 мл 50 мм трис-HCl (рН 9,5). Место первичного или вторичного антитела лечение в чашках Петри отдельно, как описано ниже. Инкубируйте блюда в морозильную камеру на ночь.
BSL-1 блюдо: 20 мкл 5 мг/мл BSL-1 (лектина simplicifolia Griffonia)
Среднее только блюдо: 60 мкл 2,4 мг/мл коза анти мыши IgG + IgM (H + L)
CD45 блюдо: 60 мкл 2,4 мг/мл коза анти мыши IgG + IgM (H + L)
O4 блюдо: 60 мкл 2,4 мг/мл коза анти мыши IgM (μ цепи конкретно)
Itgb5 (интегрин β5) блюдо для крыс астроциты: 60 мкл 2,4 мг/мл коза анти мыши IgG + IgM (H + L)
Примечание: Чтобы прикрепить вторичные антитела к гидрофобной поверхности Петри, рекомендуется медленно вложений при низких температурах. Однако это возможно для пальто Петри с вторичное антитело для 2 ч при 37 ° C. Антитела для панорамирования экзоцитоз используются по-разному в зависимости от видов животных; к примеру, HepaCAM блюдо для мыши астроциты: 60 мкл 2,4 мг/мл коза анти мыши IgG + IgM (H + L)
- День очистки
- Подготовка к immunopanning.
- Подготовка 50 мл трубки и добавьте запасы трубок. Подготовка подробных Стоковый раствор представлен в таблице 1.
- Подготовка трубки 1 (фермент): 22 мл бульона фермента (фермент складе: 1 x Эрл сбалансированного солевого раствора (EBSS)+0.46% D (+)-глюкоза + 26 мм NaHCO3 и0,5 мм ЭДТА).
- Подготовка трубки 2 (низкий Ovo): 42 мл бульона ингибитора (ингибитор складе: 1 x EBSS+0.46% D (+)-глюкоза + 26 мм NaHCO3).
- Подготовка трубки 3 (высокая Ovo): 10 мл ингибитор запасов.
- Придаем 0,22 мкм шприц фильтры советы пипетки 2-мл, подключенных к CO2 (95% O2 и 5% CO2) танк. Пузырь CO2 в пробирки 1-3. Остановите кипящей при решения превратить оранжевый.
- Комплексные решения.
Предупреждение: Полное и инкубировать раствор в трубки 1 в 34 ° C в течение 15 минут перед использованием для активации фермента.- Подготовка трубки 1 (фермент): 22 мл фермента складе + 180 U папаин + 0,004 г L-цистеина.
- Подготовка трубки 2 (низкий Ovo): 42 мл ингибитор акций + 3 мл Low Ovo + 200 мкл DNase.
- Подготовка трубки 3 (высокая Ovo): 10 мл ингибитор акций + 2 мл высокой Ovo + 20 мкл DNase.
- Подготовка трубки 4 (0,2% BSA): 19 mL 1 X DPBS + 1 мл 4% BSA + 8 мкл DNase.
- Подготовка трубки 5 (0.02% BSA): 45 мл 1 X DPBS + 5 мл трубки 4 + 50 мкл DNase.
- Нагревать воду ванны и тепла блок в 34 ° C.
- Экстракт коры головного мозга крысы.
- Стерилизовать хирургические оборудования с 70% этанола и подготовить Петри 100-мм с DPBS.
- Подготовьте акриловые окна. Положить два или три слоя тканей в нижней части окна и добавить 1 мл изофлюрановая в поле.
- Анестезировать щенков для 20-40 s в поле и подтвердите анестезии, щепотку ноги с щипцами. Подвергать сердце22 и perfuse щенков, используя шприц 10 мл с DPBS.
Примечание: Чтобы избежать заражения клеток крови во время панорамирования шага микроглии используется перфузии. - Вырезать щенка верхней шейки матки линии шеи с операционной ножницы и надрезать кожу головы вдоль средней линии. Сделать надрез на череп вдоль средней линии и открыть черепа с изогнутой щипцами.
- Акцизный мозжечка с Кастровьехо весной ножницами. Взять из оставшихся мозга и поместите его в чашку Петри 100-мм с DPBS.
- Удаление других областей таких как среднего мозга и гиппокампе из коры Кастровьехо весной ножницами под микроскопом. Удаление мозговых оболочек с тонкой щипцами.
- Передача коры в новое блюдо 60-мм и удалить оставшиеся DPBS в блюдо. Чоп ткани с лезвием № 10.
- Отделить коры в одну ячейку подвеска
- Налить отфильтрованной трубки 1 решение в блюдо 60-мм и 50 мкл DNase1. Вихрем решение в блюдо.
Примечание: DNase используется для подавления агрегации ДНК из расколовшегося клеток. - Поместите блюдо в блок 34 ° C тепла и накрыть крышкой, которая имеет отверстие в середине. Используйте паяльник сделать отверстие в крышке Петри 60-мм.
- Подключите 22-мкм шприц фильтры к трубе бака2 CO и поместите кончик фильтр в отверстие.
- Инкубируйте блюдо в 34 ° C на 45 мин вихрем решение в блюдо каждые 10-15 мин.
- Налить отфильтрованной трубки 1 решение в блюдо 60-мм и 50 мкл DNase1. Вихрем решение в блюдо.
- Закончите приготовления блюд панорамирования.
- Удаление панорамирования блюда, которые были покрыты вторичные антитела из морозильника в день впереди времени. Оставьте BSL-1 блюдо и вторичные антитела только блюдо на RT.
- Вымойте другие блюда три раза с 20 мл DPBS.
- Налейте достаточное количество 0,02% BSA в блюда. Место первичного антитела в соответствующую посуду:
CD45 блюдо: 12 мл 0,02% BSA + 20 мкл 0.5 мг/мл крыса анти мыши CD45
Itgb5 блюдо: 12 мл 0,02% BSA + 20 мкл 0.5 мг/мл Itgb5
O4 блюдо: 8 мл 0,02% BSA и 4 мл O4 антитела
Примечание: Для immunopanning мыши, использовать мышь анти крыса CD45 (0.5 мг/мл) для Микроглия и HepaCAM (0,5 мг/мл) для астроциты. - Подготовка 30 мл 30% FBS с neurobasal средствами массовой информации и 10 мл 1 X EBSS. Разминка оба решения в ванну воды 34 ° C.
- Ингибируют реакции папаин.
- Папаин лечение тканей передать новый 50-мл. Ждать для тканей урегулировать. Аспирационная жидкости методом всасывания.
- Добавить 4 мл раствора низкой Ovo в трубку и вихрем решение для мытья клетки.
- Повторите шаги 3.6.1-3.6.2 три раза для остановки реакции энзима.
- Нарезанных тканей коры.
- Добавьте 6 мл Low Ovo в ванну. Аспирационная и отпустить тканей быстро с Пипетка 5-мл.
Предупреждение: Не вводить пузыри. - Подготовка новой 50 мл трубки и добавьте 5 мл Low Ovo. Собирайте отдельные ячейки в новой трубки.
- Повторите шаги 3.6.1-3.6.2 два раза и измените Пипетка 5-мл на 1 мл пипетки.
- Повторите Тритурация до тех пор, пока более чем 95% тканей не видны.
- Сделайте слой раствора высокой Ovo из трубки 3 с 10 мл пипетки ниже низкого Ovo содержащих отделить клеток.
- Центрифуга на 190 g x 6 мин с несколько тормоза.
Примечание: Установите замедления на один или два, когда максимальная скорость замедления составляет девять.
- Добавьте 6 мл Low Ovo в ванну. Аспирационная и отпустить тканей быстро с Пипетка 5-мл.
- Фильтрат одиночных клеток.
- Тщательно удалить супернатант методом всасывания, а затем Ресуспензируйте лепешка с 3 мл 0,02% раствора БСА с Пипетка 1-мл.
- Добавить раствор 0,02% BSA до 9 мл.
- Подготовьте новый 50-мл и 20 мкм ячейки фильтра поверх трубки. Влажные клетки ситечко с 1 мл 0,02% раствора БСА.
- Перевести одну ячейку подвеска в ячейки сита. Фильтр 1 мл за один раз.
- Промойте ситечко ячейки с 3 мл 0,02% раствора БСА. Не делать более чем 15 мл суспензии отфильтрованных одну ячейку.
- Инкубируйте трубку в ванну воды 34 ° C на 45-60 минут для восстановления клеток. Этап восстановления клеток позволяет relocalization белков клеток поверхности мембраны.
- Выполняйте панорамирование клеток.
- Вымойте CD45 панорамирования блюдо три раза с 20 мл DPBS. Вымойте каждое блюдо три раза с 20 мл DPBS непосредственно перед использованием.
- Наливайте одну ячейку подвеска в CD45 панорамирование блюдо. Оставьте блюдо для 28 мин и встряхнуть блюдо для 14 мин. Чтобы удалить свободные клетки от дна, тщательно встряхните блюдо.
- Передача суспензию клеток на средних только блюдо. Подождите 20 минут и тщательно встряхнуть блюдо за 10 мин. Чтобы получить микроглии CD45 блюдо, перейдите к шагу 3.9.2.
- Перенесите суспензию клеток в BSL-1 блюдо. Оставьте блюдо для 10-12 мин.
- Перевод на блюдо O4. Подождите 20 минут и трясти за 10 мин.
- Трансфер в Itgb5 блюдо. Оставьте блюдо для 40 мин и осторожно встряхивайте каждые 10 мин.
Примечание: Для сдвига мыши, передача суспензию клеток в HepaCAM блюдо.
- Отсоединение клетки от блюдо.
- Mix 400 мкл трипсина (30 000 ед/мл в EBSS) с преинкубации 8 мл 1 X EBSS.
- Налейте ведро отходов подвеска отдельные ячейки в блюдо.
- Вымойте блюдо в восемь раз с DPBS.
- Налейте в блюдо 8 мл EBSS трипсином.
- Инкубируйте блюдо для 5 до 10 минут в инкубаторе 37 ° C. Проинкубируйте втечение 10 мин для CD45 блюдо и 5 минут для Itgb5 и HepaCAM блюд.
- Коснитесь значка блюдо и наблюдать за блюдо под микроскопом.
Примечание: Если большинство астроциты имеют не отсоединяется, вернуть блюдо в инкубатор для еще 5 мин. - Залить 10 мл 30% FBS в блюдо для нейтрализации трипсина.
- Пипетка вверх и вниз, в весь блюдо для отсоединения астроциты или микроглии.
- Передача решения в 50-мл пробирку.
- Добавить 10 мл 30% FBS и 200 мкл DNase в блюдо. Отсоедините клетки снова. DNase используется для подавления агрегации ДНК из расколовшегося клеток.
- Передача решения в трубу. Если клетки остаются в блюдо, добавить еще 10 мл 30% FBS и отсоединение клетки снова.
- Пластина клетки.
- Центрифуга трубку 213 g x 10 мин.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с СМИ.
Примечание: Используйте immunopanned экзоцитоз основные средства массовой информации (IP-про) для астроциты и сетчатки микроглии основные средства массовой информации (ПРК) с immunopanned кондиционером экзоцитоз СМИ (IP-ACM) для микроглии. IP-про и MBM композиции представлены в Таблице материалов. - Подсчет количества ячеек с Горяева.
- Пластина астроциты и микроглии отдельно в PDL-покрытием пластин.
Примечание: Подготовьте PDL-покрытием пластины перед использованием. Подготовить PDL, покрытыми, добавьте 50 мкл 1 мг/мл поли D-Лизин в 5 мл дистиллированной воды и Налейте достаточное количество раствора в хорошо пластины/блюдо и ждать 30 минут Вымойте тарелка/блюдо три раза с дистиллированной водой. - Инкубируйте пластину. Измените половина средств массовой информации каждые 7 дней для астроциты и 3 дня для микроглии.
4. Сбор IP-ACM
- Подготовьте 100-мм блюдо, когда астроциты являются чрезмерно вырожденная.
- Отказаться от средств массовой информации и мыть блюдо три раза с 10 мл DPBS.
- Налейте в блюдо 15 мл низкопротеиновое СМИ.
Примечание: Состав СМИ низкопротеиновое представлена в Таблице материалов. - Инкубируйте блюдо для 7-10 дней в инкубаторе 37 ° C.
- Собирать и сконцентрировать средства массовой информации с 10k (или 30k) трубы центробежного фильтра.
- Центрифуга для трубы в 851 x g при 4 ° C.
Примечание: Центрифуги трубы, пока остальные средства массовой информации не менее чем 1 мл. - Собирать концентрированной СМИ (IP-ACM) в новый 1,5 мл пробирку.
- Измерение концентрации с помощью количественного анализа IP-ACM
5. фагоцитоза Assay жить изображений (рис. 2)
- Подготовка 24-ну плиты (или любой пластины/блюдо, которое готовится для жить изображений) в котором астроциты вырожденная (как правило, 7-10 дней инкубации после очистки идеально подходит для стабилизации клетки).
- Удалите средства массовой информации в каждой скважине и Промыть лунки с 1 мл раствора DPBS, три раза. Для сведения к минимуму воздействия воздуха, быстро промойте скважин.
- Добавьте 300 мкл IP-про с 5 мкл синаптосомах конъюгированных показатель рН и дополнительных факторов, таких как IP-ACM, который может модулировать фагоцитоза глиальных клеток.
- Инкубируйте пластины в CO2 инкубатора для 40 мин. Этот шаг позволяет pH индикатор конъюгированных синаптосомах поселиться в нижней части пластины.
- Извлеките носитель с несвязанных pH индикатор конъюгированных синаптосомах и мыть каждой скважины с 1 мл раствора DPBS, три раза.
Предупреждение: Не мойте жестко. Для сведения к минимуму воздействия воздуха, быстро промойте скважин. - Мкл IP-ABM 500 с дополнительными факторами для тестирования в скважины.
- Возьмите тарелку жить изображений документа и выберите позиции. Отрегулируйте фокус, время экспозиции, яркости и светодиод power.
Примечание: Параметры времени экспозиции, яркости и привело власти являются переменной в зависимости от интенсивности флуоресценции и Цель эксперимента. В assay жить изображений с синаптосомах конъюгированных показатель рН, мы обычно задать эти значения следующим образом: экспозиции: ~ 150-200 мс, яркость: 15 и LED мощность: 4-6. - Задайте формат изображения, промежуток времени и общее количество циклов для жить изображений. Задать интервал времени для 1 или 2 ч в зависимости от сколько позиции выбраны. 2 часа интервалы рекомендуются при выборе более 150 позиций для жить изображений.
- Начните жить изображений эксперименты.
- Проанализируйте данные.
- Откройте программу, Фиджи.
- Импорт последовательности изображений. Преобразуйте изображения в 8-битные оттенки серого.
- Выполняет вычитание фона с прокатки бар радиусом 50 пикселей.
- Начните время серии анализатор V3 плагинов.
Примечание: Адрес для время серии анализатор V3 плагины представлена в Таблице материалов. - Перетащите область интереса (ROI) в изображение и нажмите кнопку Добавить в менеджере ROI.
- Нажмите кнопку «Получить общая интенсивность» в ряды V3_0.
- Сохраните результаты и интеграции данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом в vitro фагоцитоза assay с долгосрочным жить изображений мы использовали синаптосомах от гомогенатах мозга взрослых мыши, которые были разлучены в решении градиента между градиента решение 23% и 10% градиентного раствора ultracentrifugation ( Рисунок 3). После подготовки синаптосомах подвергаются PS на их наружной мембраны (рис. 4), предполагая, что они потеряли свои функции и может быть признан PS рецепторов в астроциты и микроглии. Как показано на рисунке 5, pH индикатор конъюгированных синаптосомах излучаемого ярко красной флуоресценцией, когда они были поглощены астроциты. Реальном времени сравнения поглощения и деградации потенциала глиальных клеток можно, взяв несколько изображений ROI каждый 1 или 2 h (Дополнительные фильм 1, Дополнительные фильм 2). С помощью этого метода мы продемонстрировали различные кинетики экзоцитоз - и микроглии опосредованной фагоцитоза (рис. 6). Для количественного определения фагоцитоза глиальных клеток, была измерена области (2мкм) красной флуоресценцией сигнала, который называется фагоцитарный индекс в рисунке 6B и Рисунок 7. Хотя астроциты, как представляется, быть эффективным в phagocytosing большое количество синаптосомах конъюгированных показатель рН, микроглии были быстрее на поглощение и унижающее синаптосомах (Рисунок 6B). Микроглии показал максимальное pH индикатор интенсивности 26 ч после pH индикатор конъюгированных synaptosome лечения, тогда как астроциты показал их максимум 45 ч (p-значение < 0,05, двусторонний ANOVA между экзоцитоз с 1 X ACM и микроглии с 1 X ACM). Аналогичным образом Микроглии клеток показали 20,7% снижение общего pH индикатор интенсивности 40 h после пик точки, астроциты показал снижение 17% всего pH индикатор интенсивности в течение того же периода времени, в то время как. Интересно, что наши данные показали, что экзоцитоз выделяется факторы, которые содержатся в ACM, имеют важное значение для увеличения обоих экзоцитоз - и микроглии опосредованной фагоцитоза (Рисунок 6B). Астроциты показали выпустить преодоление молекул, таких как MFGE8, GAS6 и белки, которые можно преодолеть и стимулировать взаимодействие между фагоцитарной рецепторов и «съесть-me» сигналов, таких как PS23. Как упоминалось выше, астроциты устранить синапсов через MERTK и MEGF10 пути4. MEGF10 только выраженные астроциты в головном мозге и участвует в синапсе сплошным путем признания «едят-me» сигналы с неизвестным тождества. Согласна с предыдущими выводами проба показала, что по сравнению с одичал тип (WT) мыши астроциты, Megf10 нокаут-(KO) мыши астроциты обладают существенно ослабленным фагоцитарной способности (рис. 7). По сравнению с WT астроциты, Megf10 KO астроциты показали приблизительно 40% снижение общего pH индикатор интенсивности в точке пик (31 h) (рис. 7).
Рисунок 1. Схема очистки экзоцитоз, с использованием методов immunopanning. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Схема анализа жить изображений фагоцитоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представитель мозга огневки фракционирование в градиента решений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Представитель изображения PS-облученных синаптосомах. (A) A светлые области изображения астроциты с синаптосомах. Синаптосомах прикреплены к астроциты. (B) флуоресцентного изображения синаптосомах tdTomato положительных, которые очищаются от tdTomato выражая мыши мозги. (C) pSIVA связывается с PS, который подвергается внешней мембраны synaptosome и испускает зеленой флуоресценцией. PS (D) определяется pSIVA (зеленый) совместно локализованных с tdTomato положительных синаптосомах (красный). Линейки: 20 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Представитель светлые области и люминесцентные изображения астроциты с pH индикатор конъюгированных синаптосомах в двух точках времени. В 11 ч после лечения (Нижняя панель) pH индикатор конъюгированных синаптосомах обхватил астроциты и излучают красный флуоресценции в то время как они делают не в 1 ч после лечения (верхняя группа). Линейки: 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Фагоцитарной кинетика астроциты крыса и микроглии через долгосрочные жить изображений. (A) A принципиальная схема в vitro assay фагоцитоза с использованием очищенного астроциты и микроглии наряду с синаптосомах конъюгированных показатель рН. Обратите внимание, что прежде чем принимать изображения в реальном времени, несвязанных синаптосомах помыты прочь после 40 минут инкубации. (B) представитель графики, показывающие сплошным и деградации кинетика астроциты и микроглии. ACM, который содержит выделяется экзоцитоз факторы, значительно повышает оба экзоцитоз и микроглии опосредовано synaptosome поглощения. Экзоцитоз: Управления против экзоцитоз с ACM 1 X, ***, Тьюки в множественные сравнения теста. Микроглии: Управления против микроглии с ACM 1 X, ***, Тьюки в множественные сравнения теста. Планки погрешностей указывают S.E.M. *p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,0001, двусторонний ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. Снижение фагоцитарной способности Megf10 KO мыши астроциты с 1 X ACM по сравнению с WT мыши астроциты с 1 X ACM. WT vs. Megf10 KO астроциты с 1 X ACM, ***, двусторонний ANOVA. Планки погрешностей указывают S.E.M. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001 двусторонний ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: раствор рецепты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные фильм 1. Представитель жить изображений видеозапись фагоцитоза pH индикатор конъюгированных синаптосомах, астроциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные фильм 2. Представитель жить изображений видеозапись фагоцитоз pH индикатор конъюгированных синаптосомах Микроглии клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы представляем методы для долгосрочного жить изображений в vitro фагоцитоза assay с использованием очищенного глиальные клетки и синаптосомах конъюгированных показатель рН. Мы показываем, что по сравнению с микроглии, астроциты обладают различной емкости поглощения и деградации при фагоцитозе синаптосомах. Кроме того наши данные позволяют предположить, что экзоцитоз выделяется факторы, которые содержат преодоление молекул, таких как GAS6, белки и MEGE8, имеют важное значение для эффективного PS-зависимых фагоцитоза глиальных клеток в головном мозге. Кроме того Megf10 KO астроциты показывают дефектных фагоцитоз синаптосомах.
Чтобы успешно выполнить этот эксперимент, средства массовой информации и DPBS должны быть тщательно обменивались во время стирки шаги (раздел 5). Первичной культивированный астроциты и микроглии, особенно микроглии, уязвимы к воздействию воздуха. Таким образом уменьшение интервалов времени между Стиральная шаги имеет решающее значение для сохранения живых клеток. Для создания долгосрочных жить изображений с live изображения инструментов, ручной фокус рекомендуется, поскольку автофокус может увеличить время экспозиции лазерный/светодиодный, которые могли бы повредить клетки.
В этом методе synaptosome очистки протокол19 слегка изменен. Оригинальный документ отделяет градиента решения в 3%, 10%, 15% и 23%. Однако мы создали 3%, 10% и 23% градиентов решения для увеличения выхода очищенного синаптосомах. Инструкции по immunopanning астроциты и Микроглии клеток также изменяются в этом методе. Цель оригинала, панорамирование протокол21 состоит в очищении только астроциты и использовать BSL-1, только для средних, CD45, O4 и Itgb5 (HepaCAM для мыши) как immunopanning. Так как плиты BSL-1 и средних только удалит эндотелиальных клеток, а также микроглии, мы изменили порядок CD45, только для средних, BSL-1, O4, и Itgb5 (HepaCAM для мыши) для увеличения урожайности микроглии от CD45 панорамирование блюдо. В этом протоколе, мы также увлажненную SD крыса щенков (~ P7-P10) с DPBS через кровеносную систему для удаления различных кровяные клетки, чтобы свести к минимуму загрязнение от населения не микроглии CD45-положительные.
Существует несколько преимуществ в vitro фагоцитоза assay. Показатель рН, используемый в synaptosome спряжение только излучает красной флуоресценции в условиях низкого pH. Таким образом при обработке данных, мы можем непосредственно количественно красной флуоресценцией как сигнал фагоцитарной мероприятий без закалки процедуры для удаления фона сигналов или сложный анализ изображений для получения совместно локализованных сигналы поглощённого материала внутри Фагоциты. Кроме того этот метод позволяет в реальном времени отслеживать глиальных фагоцитоза, принимая изображения pH индикатор интенсивности в пределах данного ROI в нескольких точках времени. Создавая диаграмму с pH индикатор интенсивности до 100 h, поглощения, а также деградации потенциала можно легко контролировать между различными клетками и условий. Еще одним преимуществом является использование синаптосомах. Поскольку ensheathe астроциты синапсов обрабатывает все время с их штраф и были показано поглотить синапсов в естественных условиях4, используя синаптосомах очень подходит для измерения в vitro фагоцитарной способности астроциты. Наконец этот assay в vitro фагоцитоза имеет потенциал, чтобы быть разработаны для изучения глиальных фагоцитоза мусора или амилоид бета миелина, что связано с различными неврологическими расстройствами.
С увеличением продолжительности жизни резкое увеличение числа пациентов с нейродегенеративных заболеваний является неизбежным. СИНАПС потери через глиальные клетки является одним из ведущих факторов в нескольких нейродегенеративных заболеваний13,14. Кроме того аномальные синапса обрезка и дисбаланс мозга гомеостаза может быть связаны с дефектами глиальных фагоцитоза. Таким образом выявление факторов и соединений, которые могут управлять сплошным и деградации потенциала астроциты может иметь решающее значение для нахождения успешного лечения различных неврологических расстройств. Поскольку этот assay в vitro фагоцитоза могут легко масштабируется с multiwell пластинами, этот метод может использоваться в качестве подходящей платформой для различных фильмов для выявления таких факторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Ен-Джу Юнг за ее экспериментальная поддержка во время очистки synaptosome и Jungjoo парк для изображений синаптосомах с PS экспозиции. Кроме того мы благодарим всех членов в лаборатории Чун для полезной дискуссии. Эта работа была поддержана в Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF) Грант, финансируемых правительством Кореи (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 и СР 2016R1C1B3006969) (W.-S. C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
