Summary
Denne protokollen presenterer en i vitro live bildebehandling fagocytose analysen for å måle astrocyttene phagocytic kapasitet. Renset rotte astrocyttene og microglia brukes sammen med pH indikator-konjugerte synaptosomes. Denne metoden kan oppdage sanntid engulfment og fornedrelse kinetics og gir en passende screening plattform for å identifisere faktorer modulerende astrocytter fagocytose.
Abstract
Astrocyttene er den store celle i hjernen og direkte kontakt synapser og blodkar. Selv om microglial celler har blitt vurdert av store immunceller og bare phagocytes i hjernen, har nyere studier vist at astrocyttene også delta i ulike phagocytic prosesser, for eksempel utviklingsmessige synapse eliminering og rydding av amyloid beta plaketter i Alzheimers sykdom (AD). Disse funnene er effektiviteten av astrocytter engulfment og nedbrytning av deres mål uklart forhold til microglia. Denne mangelen på informasjon er hovedsakelig på grunn av mangel på et analysen system som the kinetics av astrocytter - og microglia-mediert fagocytose er lett sammenlignbare. For å oppnå dette målet, har vi utviklet en langsiktig live bildebehandling i vitro fagocytose analysen for å evaluere phagocytic kapasitet på renset astrocyttene og microglia. I denne analysen er sanntids deteksjon av engulfment og fornedrelse mulig med pH indikator-konjugerte synaptosomes, som avgir lys rød fluorescens i surt organeller, som lysosomer. Våre romanen analysen gir enkel og effektiv deteksjon av fagocytose gjennom live bildebehandling. I tillegg kan denne i vitro fagocytose analysen brukes som en screening plattform for å identifisere kjemikalier og forbindelser som kan forbedre eller hemme astrocyttene phagocytic kapasitet. Som synaptic beskjæring feil og patogene protein akkumulering har vist seg å forårsake psykiske lidelser eller nevrodegenerative sykdommer, bør kjemikalier og forbindelser som modulerer phagocytic kapasitet gliacellene være nyttig i behandling av ulike nevrologiske lidelser.
Introduction
Gliacellene, som refererer til ikke-nervøs cellene i hjernen, er den store celle i sentralnervesystemet (CNS). Tidligere ble gliacellene betraktet som bare støtter celler som hovedsakelig spille passiv roller i å opprettholde nevronale overlevelse og basale synaptic egenskaper. Imidlertid har nye bevis avslørt at gliacellene spille mer aktive roller i ulike aspekter av Surgery, som vedlikeholder hjernen homeostase, formidling synapse formasjon1,2,3 og synapse eliminering4,5og modulerende synaptiske plastisitet6,7. Gliacellene i CNS inkluderer astrocyttene, microglia og oligodendrocytes. Blant disse cellene, astrocyttene og microglia har vist seg å spille phagocytic roller av engulfing synapser4,5, apoptotisk celler8, neural rusk9og patogene proteiner, for eksempel amyloid beta plaketter10,11. Utvikle hjernen eliminere astrocyttene synapser i dorsal lateral geniculate kjernen (dLGN) til MERTK - og MEGF10-avhengige fagocytose4. Tilsvarende microglia også eliminere C1q-belagt synapser under utviklingsstadier gjennom klassiske supplement gjennomgripende5. Interessant, har det blitt antydet at feil i synapse beskjæring kan være en av initiativtakerne til flere nevrologiske lidelser. For eksempel har det vært vist at mutasjoner i komplement komponent 4 (C4), noe som øker komplement-mediert synapse beskjæring av microglia, er sterkt assosiert med utbredelsen av schizofreni mennesker12. En fersk papir har også vist at den klassiske komplementbanen er hyperactivated i initiering av Annonsen og induserer tidlig synapse tap i denne sykdommen13.
Sammenlignet med microglia-mediert fagocytose, er om astrocytter-mediert fagocytose bidrar til innvielse og progresjon av ulike nevrologiske lidelser mindre klart. En fersk papir antyder imidlertid at faktorer som endrer frekvensen av normal synapse beskjæring av astrocyttene kan forstyrre hjernen homeostase, og bidra til AD mottakelighet og patologi14. Frekvensen av synapse beskjæring av astrocyttene kontrollert kraftfullt av ApoE isomerene, med en beskyttende allelet for Annonsen (ApoE2) sterkt forbedrer hastigheten og en risiko allelet for Annonsen (ApoE4) betydelig redusere hastigheten. Videre, samlet transgene mus uttrykke ApoE4 mye mer synaptic C1q enn kontroll eller ApoE2 mus14. Disse data tyder på at svekket astrocytter-mediert fagocytose tidlig AD hjernen kan føre til opphopning av senescent C1q-belagt synapser/synaptic rusk som aktiverer komplement-mediert microglial fagocytose, kjører synaptic degenerasjon . Nedsatt phagocytic kapasitet astrocyttene i ApoE4 operatører kan også bidra til ukontrollert akkumulering av amyloid beta plaketter i AD-berørte hjernen.
I tillegg har det vært vist at gliacellene i alderen Drosophila hjernen mister sine phagocytic kapasitet på grunn av redusert oversettelse av Draper, en homolog av Megf10 astrocyttene bruker for phagocytosing synapser. Gjenopprette Draper nivåer reddet phagocytic kapasitet gliacellene, effektivt klarert skadet axonal rusk i alderen hjernen i samme grad som i unge hjernen, indikerer at aldring-indusert endringer i phagocytic kapasitet astrocyttene kan bidra til avbrudd i hjernen homeostase15.
Basert på disse nye resultatene, kan modulerende phagocytic kapasitet astrocyttene være en attraktiv terapeutiske strategi for å forebygge og behandle ulike nevrologiske lidelser. I denne forbindelse har det vært flere forsøk på å forbedre phagocytic kapasitet astrocyttene, for eksempel ved inducing forsuring av lysosomer med surt nanopartikler16 og overexpressing transkripsjon faktor EB (TFEB), som forbedrer lysosome biogenesis17. Til tross for disse forsøkene er det fortsatt uklart hvordan astrocyttene og microglial forskjellige sine phagocytic kinetics og om vi skal øke eller redusere sine phagocytic kapasitet i ulike sykdommer.
I dette papiret presenterer vi en roman i vitro analysen for å oppdage den phagocytic kapasiteten av astrocyttene i sanntid. Dataene viser forskjellige kinetics av engulfment og fornedrelse i astrocyttene og microglia. Astrocytter-conditioned medium (ACM), som inneholder utskilles faktorer fra astrocyttene, er avgjørende for effektiv fagocytose astrocyttene og microglia. Videre spiller Megf10, en phagocytic reseptor astrocyttene og en homolog av Ced-1 og Draper, viktige roller i astrocytter-mediert fagocytose8,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av The Korea avansert Institutt for vitenskap og teknologi institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC), KA2016-08.
1. synaptosome rensing
Merk: Disse prosedyrene er tilpasset fra en tidligere utgitte19 med flere endringer for å forbedre avkastningen av renset synaptosomes (figur 1).
- Forberede usammenhengende tetthet gradert media.
- Plasser følgende på is: 3%, 10% og 23% tetthet gradert løsninger gradient buffer (ta til 250 mL vann med 109.54 g av sukrose og 606 mg Tris 5 mL av 0,2 M EDTA, pH 7.4); homogenisere buffer (Legg til 25 mL av 4 x gradient buffer og 500 µL 50 mm DTT i 74.5 mL vann); homogenizer morter.
Merk: Tetthet gradert løsning og forberedelser er presentert i tabell 1. For å forberede 3%, 10% og 23% tetthet gradert løsninger, kan du bruke raw tetthet gradert løsning. - Forberede seks krystallklart sentrifuge rørene per tre voksne mus.
- Legge til 3 mL 23% tetthet gradert løsning på bunnen av hver sentrifuge rør med en 1-mL pipette. Deretter sakte gjøre et lag med 3 mL 10% tetthet gradert løsning på 23% tetthet gradert løsningen med beite pipette og 1-mL pipette. Til slutt Legg 3 mL 3% tetthet gradert løsning på toppen. I dette trinnet bruker du forsiktig for å unngå introdusere bobler.
- Dekke sentrifuge rør med plast brytes og holde rørene på is.
- Plasser følgende på is: 3%, 10% og 23% tetthet gradert løsninger gradient buffer (ta til 250 mL vann med 109.54 g av sukrose og 606 mg Tris 5 mL av 0,2 M EDTA, pH 7.4); homogenisere buffer (Legg til 25 mL av 4 x gradient buffer og 500 µL 50 mm DTT i 74.5 mL vann); homogenizer morter.
- Nedkjøling en høyhastighets sentrifuge og ultracentrifuge til 4 ° C.
- Sterilisere kirurgisk utstyr (drift saks, Castroviejo våren saks og buede tang) med 70% etanol. Forberede et lite glass beaker med 25 mL homogenisere bufferen på is og veie begeret.
- Ekstraktet tre voksne (ca 12 uker gamle) mannlige mus hjernen.
- Dislocate cervical vertebra og kuttet halsen med opererer saks. Løsner huden av hodet og skallen langs midtlinjen kirurgisk saks og buede tang. Avgiftsdirektoratet olfactory lyspærer og lillehjernen med Castroviejo våren saks.
- Sette gjenværende hjernen i begeret med buet tang og veie hjernen. Skyll hjernen flere ganger med iskald homogenisere buffer å fjerne blod på overflaten av hjernen.
Merk: Tidligere 9 mL homogenisere buffer 1 g av hjernen vev ble anbefalt. - Legge til 4 mL homogenisere buffer og 1 g av hjernen vev å homogenizer mørtelen. Mens homogenisere hjernen, legge homogenisere buffer opptil 8 mL.
- Del av homogenate i to 50 mL høyhastighets sentrifuge rør. Vask mørtelen med 1 mL av fersk homogenisere bufferen og legge den til rør.
Advarsel: Gå gjennom trinnene 1.3-1.7 så raskt som mulig. Mindre enn 20 min anbefales. - Sentrifuge homogenates i høyhastighets sentrifuge rør 1000 x g i 10 min på 4 ° C med tregere bremser.
Merk: Angi retardasjon hastighet (brems) på to eller tre når maksimal graden av retardasjon er ni. - Forsiktig legge nedbryting til en ny 50 mL tube og legge opptil 12 mL homogenisere bufferen.
- Sakte og forsiktig Pipetter 2 mL utvannet nedbryting over 3% tetthet gradert løsningen med en 1-mL pipette og plassere rør på is.
- Sentrifuge på 31 000 x g i 5 min på 4 ° C med ingen bremser.
Merk: Angi retardasjon hastighet på en (null) eller kysten. - Plasser rørene på is og samle synaptosome brøken mellom 23% tetthet gradert løsning og 10% tetthet gradert løsning med en 2-mL pipette i en 50-mL tube. Legge til iskald sukrose/EDTA bufre opptil 80 mL og dele den inn i fire 50-mL høyhastighets sentrifuge rør.
Merk: Se Figur 3 for fraksjonert synaptosomes med merket graderinger. - Sentrifuge 20.000 x g i 30 min på 4 grader med færre pauser.
Merk: Angi retardasjon hastighet på to eller tre når maksimal graden av retardasjon er ni. - Nøye fjerne nedbryting med en 1-mL pipette, resuspend synaptosome pellets med 1 mL av isotonic fysiologisk buffer (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 1.2 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES og 10 mM glukose, pH 7.4)20. Legge 1 mL av 10% DMSO i isotonic fysiologisk buffer (siste konsentrasjon av DMSO: 5%) og samle synaptosomes i en 50-mL høyhastighets sentrifuge tube.
- Aliquot 1 mL i 1,5-mL rør. Måle protein konsentrasjonen av synaptosomes med Bradford analysen.
- Raskt fryse rør og lagre rør i en-80 ° C fryser til pH indikator Bøyning.
2. pH indikator Bøyning
- Sentrifuge 1.5-mL rør med synaptosomes 21,092 x g i 3-4 min på 4 ° C.
- Fjern nedbryting, legge 200 µL av 0.1 M Na2CO3 og bland godt av pipettering.
Merk: Na2CO3 ble lagt å heve pH som succinimidyl ester mest effektivt reagerer med primære aminer på en litt alkaliske pH. - Legge 2 µL av pH indikatoren til rør og forsiktig vortex.
Advarsel: Bruk 1 µL av pH indikatoren per 0,3 mg synaptosome løsning. - Minimere eksponering av dekker rør med aluminiumsfolie og ruge dem for 1-2 h ved romtemperatur (RT) i en vri shaker med mild agitering på 30-40 rpm.
- Stoppe agitasjon og tilsett 1 mL av DPBS.
- Sentrifuge rør 21,092 x g i 1-2 min.
- Fjern nedbryting og tilsett 1 mL av DPBS å resuspend pellet av mild pipettering.
- Gjenta trinn 2.6-2.7 minst sju ganger fjerne ubundet pH indikator.
- Fjern nedbryting og resuspend pellets med 200 µL av DPBS med 5% DMSO.
Merk: på dette punktet, alle synaptosomes er ikke fungerer. Vi har bekreftet at fosfatidylserin (PS) har vært utsatt for den ytre membranen av synaptosomes, som fungerer som en "spise-meg" signal (Figur 4).
3. astrocyttene og Microglia rensing
Merk: Denne protokollen for astrocytter rensing er tilpasset fra en tidligere utgitte21. Rensing av rotte astrocyttene og microglia er beskrevet i denne protokollen. Bestemte prosedyrer for rensing musen astrocyttene og microglia er også beskrevet i notatene.
- Dagen før rensing
- Forbered pre belagt celle kultur retter og løsninger.
- Forberede fem 145 mm x 20 mm Petri retter med 25 mL 50 mM Tris-HCl (pH 9,5). Plass primær eller sekundær antistoff behandling i Petri retter seg som beskrevet nedenfor. Inkuber rettene i fryseren over natten.
BSL-1 rett: 20 µL av 5 mg/mL BSL-1 (Griffonia simplicifolia Lektiner)
Sekundær-bare rett: 60 µL 2,4 mg/mL geit anti-mus IgG + IgM (H + L)
CD45 parabolen: 60 µL 2,4 mg/mL geit anti-mus IgG + IgM (H + L)
O4 rett: 60 µL 2,4 mg/mL geit anti-mus IgM (μ-kjeden spesifikke)
Itgb5 (Integrin β5) parabolen for rotte astrocyttene: 60 µL 2,4 mg/mL geit anti-mus IgG + IgM (H + L)
Merk: For å knytte sekundære antistoff til hydrofobe overflaten av Petriskål, langsom vedlegg ved lave temperaturer anbefales. Det er imidlertid mulig å coat Petriskål med sekundær antistoff 2 h på 37 ° C. Antistoffer for astrocytter panorering er brukt forskjellig avhengig av dyreartene; for eksempel HepaCAM parabolen for musen astrocyttene: 60 µL 2,4 mg/mL geit anti-mus IgG + IgM (H + L)
- Dag for rensing
- Forberede immunopanning.
- Forberede 50 mL rør og legge til aksjer til rør. Detaljert lagerløsning forberedelsene er presentert i tabell 1.
- Forbered Tube 1 (enzym): 22 mL enzym lager (enzym lager: 1 x Earle balansert saltløsning (EBSS)+0.46% D (+)-glukose + 26 mM NaHCO3 og0,5 mM EDTA).
- Forbered Tube 2 (lav Ovo): 42 mL hemmer lager (Inhibitor lager: 1 x EBSS+0.46% D (+)-glukose + 26 Mm NaHCO3).
- Forbered Tube 3 (høy Ovo): 10 mL av hemmer lager.
- Fest 0.22-µm sprøyte filtre tips av 2-mL Pipetter koblet til en CO2 (95% O2 og 5% CO2) tank. Boble CO2 i rør 1-3. Stopp bobler når løsningene slår oransje.
- Fullføre løsninger.
Forsiktig: Komplett og ruge løsningen i rør 1 på 34 ° C i 15 min før bruk enzym aktivisering.- Forbered Tube 1 (enzym): 22 mL av enzymet lager + 180 U papain + 0.004 g L-cystein.
- Forbered Tube 2 (lav Ovo): 42 mL av hemmer lager + 3 mL lav Ovo + 200 µL av DNase.
- Forbered Tube 3 (høy Ovo): 10 mL av hemmer lager + 2 mL høy Ovo + 20 µL av DNase.
- Forbered Tube 4 (0,2% BSA): 19 mL 1 X DPBS + 1 mL av 4% BSA + 8 µL av DNase.
- Forbered Tube 5 (0.02% BSA): 45 mL 1 X DPBS + 5 mL Tube 4 + 50 µL av DNase.
- Forvarm en vann bad og varme blokk på 34 ° C.
- Pakke rotte cortex.
- Sterilisere kirurgisk utstyr med 70% etanol og forberede 100 mm Petri retter med DPBS.
- Forberede en akryl boks. Sett to til tre lag av vev i bunnen av boksen og tilsett 1 mL av isoflurane i boksen.
- Bedøve pups for 20-40 s i boksen og Bekreft anesthetization foten knipe med tang. Avsløre det hjerte22 og perfuse pups 10-mL sprøyte med DPBS.
Merk: Perfusjon brukes blodlegemer forurensning unngås under microglia panorering trinnet. - Kutt det pup upper cervical linje i nakken med kirurgisk saks og incise hodet huden langs midtlinjen. Lage et snitt på skallen langs midtlinjen og åpne skallen med buet tang.
- Avgiftsdirektoratet lillehjernen med Castroviejo våren saks. Ta ut resterende hjernen og plasserer den i en 100 mm Petriskål fylt med DPBS.
- Fjerne andre områder som mellomhjernen og hippocampus fra cortex med Castroviejo våren saks under mikroskopet. Fjerne meninges med fine tang.
- Overføre cortex til en ny 60 mm rett og fjerne de gjenværende DPBS i fatet. Hogge vevet med nr. 10 blad.
- Distansere cortex til en enkeltcelle suspensjon
- Hell den filtrerte Tube 1-løsningen i en 60 mm parabol og legge 50 µL av DNase1. Swirl løsningen i fatet.
Merk: DNase brukes til å hemme samling av DNA fra sprukket celler. - Plasser rett til en 34 ° C varme og dekke det med lokk med et hull i midten. Bruke en loddebolt for å gjøre hullet i lokket på Petriskål 60 mm.
- Koble 22-µm sprøyte filtre slik CO2 tank og plassere filter i hullet.
- Inkuber retten på 34 ° C i 45 min. virvel løsningen i parabolen hvert 10 til 15 min.
- Hell den filtrerte Tube 1-løsningen i en 60 mm parabol og legge 50 µL av DNase1. Swirl løsningen i fatet.
- Fullfør de panorering rettene.
- Fjerne panorering rettene som har vært belagt med sekundær antistoffer fra fryseren en dag i forveien. La BSL-1 parabol og sekundære antistoff-bare rett på RT.
- Vaske de andre tre ganger med 20 mL DPBS.
- Hell en tilstrekkelig mengde 0.02% BSA i rettene. Plassere bestemte primære antistoffer i tilsvarende retter:
CD45 parabolen: 12 mL 0.02% BSA + 20 µL av 0,5 mg/mL rotte anti-musen CD45
Itgb5 rett: 12 mL 0.02% BSA + 20 µL av 0,5 mg/mL Itgb5
O4 rett: 8 mL 0.02% BSA og 4 mL O4 antistoff
Merk: For mus immunopanning, bruke musen anti-rotte CD45 (0,5 mg/mL) for microglia og HepaCAM (0,5 mg/mL) for astrocyttene. - Forberede 30 mL av 30% FBS med neurobasal media og 10 mL 1 X-EBSS. Varm opp begge løsninger i et vannbad 34 ° C.
- Hemme papain reaksjonen.
- Overføre papain-behandlet vev til en ny 50 mL tube. Vent til vev å avgjøre. Sug opp væske av sugekraft.
- Legg 4 mL av lav Ovo løsning til røret og swirl løsningen å vaske cellene.
- Gjenta trinn 3.6.1-3.6.2 tre ganger for å stoppe enzym reaksjonen.
- Triturate cortex vev.
- Legg til 6 mL av lav Ovo i badekaret. Sug opp og slipp vev raskt med en 5-mL pipette.
Forsiktig: Ikke innføre bobler. - Forberede en ny 50 mL tube og legge 5 mL av lav Ovo. Samle enkeltceller i et nytt rør.
- Gjenta trinn 3.6.1-3.6.2 to ganger og endre 5-mL Pipetter til en 1-mL pipette.
- Gjenta føden til mer enn 95% av vev ikke er synlige.
- Lag et lag med høy Ovo løsning fra rør 3 med en 10-mL pipette under lav Ovo inneholder dissosiert celler.
- Sentrifuge 190 x g for 6 min med noen bremser.
Merk: Angi retardasjon hastighet på en eller to når maksimal graden av retardasjon er ni.
- Legg til 6 mL av lav Ovo i badekaret. Sug opp og slipp vev raskt med en 5-mL pipette.
- Filtrer enkeltceller.
- Nøye Sug opp nedbryting av sug, så resuspend pellets med 3 mL 0.02% BSA løsning med en 1-mL pipette.
- Legge til 0.02% BSA løsning opptil 9 mL.
- Forberede en ny 50 mL tube og 20-µm celle sil på røret. Våt celle silen med 1 mL 0.02% BSA.
- Overfør enkelt celle suspensjon til celle silen. Filtrere 1 mL samtidig.
- Vask celle silen med 3 mL 0.02% BSA. Gjør ikke mer enn 15 mL filtrerte enkeltcelle suspensjon.
- Inkuber røret i et vannbad 34 ° C i 45-60 minutter for celle utvinning. Celle utvinning trinnet gir relocalization til cellen overflaten proteiner til membranen.
- Utføre panorering av cellene.
- Vask CD45 panorering parabolen tre ganger med 20 mL av DPBS. Vask hver tallerken tre ganger med 20 mL DPBS umiddelbart før bruk.
- Hell enkeltcelle suspensjon i CD45 panorering parabolen. La fatet i 28 min og riste parabolen i 14 minutter. For å fjerne ubundet celler fra bunnen, nøye riste parabolen.
- Overføre celle suspensjon til sekundær-bare parabolen. Vent 20 min og nøye riste parabolen for 10 min. For å få microglia fra CD45 parabolen, gå til trinn 3.9.2.
- Overføre celle suspensjon i BSL-1 fatet. La fatet for 10 til 12 min.
- Overføre til O4 parabolen. Vent 20 min og riste på 10 min.
- Overføre til Itgb5 parabolen. La fatet for 40 min og forsiktig risting hvert 10 min.
Merk: For musen panorering, overføre celle suspensjon i HepaCAM fatet.
- Koble celler fra parabolen.
- Mix 400 µL av trypsin (30.000 U/mL i EBSS) med preincubated 8 mL 1 X-EBSS.
- Hell frittliggende celle suspensjon i retten i en avfall bøtte.
- Vask parabolen åtte ganger med DPBS.
- Hell 8 mL EBSS med trypsin i fatet.
- Inkuber parabolen for 5 til 10 min i 37 ° C inkubator. Inkuber i 10 min CD45 fatet og 5 min på Itgb5 og HepaCAM retter.
- Tapp fatet og observere rett under et mikroskop.
Merk: Hvis de fleste av astrocyttene ikke har løsrevet, sett rett tilbake i inkubator for en annen 5 min. - Hell 10 mL av 30% FBS i retten å nøytralisere trypsin.
- Pipetter opp og ned i hele fatet koble astrocyttene eller microglia.
- Overføre løsningen til en 50-mL tube.
- Legge til 10 mL av 30% FBS og 200 µL av DNase i retten. Koble celler igjen. DNase brukes til å hemme samling av DNA fra sprukket celler.
- Overføre løsningen inn i røret. Hvis celler forblir i fatet, legger en annen 10 mL av 30% FBS og koble celler igjen.
- Plate cellene.
- Sentrifuge røret 213 x g i 10 min.
- Sug opp nedbryting og resuspend celle pellets med media.
Merk: Bruk immunopanned astrocytter grunnleggende media (IP-ABM) for astrocyttene og retinal microglia grunnleggende media (MBM) med immunopanned astrocytter-conditioned medier (IP-ACM) for microglia. IP-ABM og MBM komposisjoner er presentert i Tabell for materiale. - Telle celler med en hemocytometer.
- Plate astrocyttene og microglia separat i PDL belagte plater.
Merk: Forbered PDL-belagt platen før bruk. For å forberede PDL belagte plater, legge til 50 µL av 1 mg/mL poly-D-lysin i 5 mL destillert vann og hell en tilstrekkelig mengde løsning i den godt plate/parabolen, og vente 30 min. vask plate/parabolen tre ganger med destillert vann. - Inkuber platen. Endre halvparten av media hver 7 dager for astrocyttene og 3 dager for microglia.
4. samle IP-ACM
- Forberede en 100 mm rett når astrocyttene er altfor confluent.
- Forkaste media og vask parabolen tre ganger med 10 mL av DPBS.
- Hell 15 mL av lav protein media i fatet.
Merk: Lav protein media sammensetningen er presentert i Tabell for materiale. - Inkuber parabolen for 7-10 dager i 37 ° C inkubator.
- Samle og konsentrere media med 10k (eller 30k) sentrifugal filter rør.
- Sentrifuge rør 851 x g på 4 ° C.
Merk: Sentrifuge rør til gjenværende media er mindre enn 1 mL. - Samle konsentrert media (IP-ACM) i en ny 1.5-mL tube.
- Måle konsentrasjonen av IP-ACM kvantitativ analyse
5. fagocytose Live bildebehandling analysen (figur 2)
- Forberede en 24-vel plate (eller noen plate/rett som er forberedt for live-imaging) hvilke astrocyttene er confluent (vanligvis 7 til 10 dager med inkubering etter rensing er ideell for stabilisere cellene).
- Fjerne media i hver brønn og vask brønner med 1 mL av DPBS, tre ganger. For å minimere luft eksponering, vask brønnene raskt.
- Legge til 300 µL av IP-ABM med 5 µL av pH indikator-konjugerte synaptosomes og faktorer som IP-ACM som kan modulere glial celle fagocytose.
- Inkuber platen i en CO2 inkubator for 40 min. Dette trinnet kan pH indikator-konjugerte synaptosomes å bosette til bunnen av platene.
- Fjerne media med ubundet pH indikator-konjugerte synaptosomes og vask hver brønn med 1 mL av DPBS, tre ganger.
Forsiktig: Ikke vask hardt. For å minimere luft eksponering, vask brønnene raskt. - Legg til 500 µL av IP-ABM med flere faktorer å teste i brønnene.
- Ta platen til en live-imaging instrument og velge stillinger. Justere fokus, eksponeringstid, lysstyrke og LED strøm.
Merk: Innstillingene for eksponeringstid, lysstyrke og LED strøm er variabel avhengig av fluorescens intensitet og formålet med eksperimentet. I live-imaging analysen med pH indikator-konjugerte synaptosomes, vi vanligvis sette verdiene som følger: eksponering: ~ 150-200 ms, lysstyrke: 15, og LED: 4-6. - Angi bildeformatet, tid og antall sykluser for live bildebehandling. Angi tidsintervallet til 1 eller 2 timer avhengig av hvor mange posisjoner er valgt. 2 timers mellomrom anbefales når mer enn 150 posisjoner er valgt for live bildebehandling.
- Start live bildebehandling eksperimenter.
- Analysere dataene.
- Åpne programmet Fiji.
- Importere en bildesekvens. Konvertere bilder til 8-biters gråtonebilder.
- Utføre bakgrunn subtraksjon med en rullende bar radius på 50 piksler.
- Start tid serien analyzer V3 plugins.
Merk: Adressen for tiden serien analyzer V3 plugins er presentert i Tabell for materiale. - Dra regionen rundt (ROI) i bildet og klikk Legg til i Avkastningen manager.
- Klikk "Få totalt intensitet" i tidsserien V3_0.
- Lagre resultatene og integrere dataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne i vitro fagocytose analysen med langsiktige live bildebehandling, har vi brukt synaptosomes fra voksen mus hjernen homogenates, som ble atskilt av gradient løsningen mellom 23% gradert løsning og 10% gradert løsning med ultracentrifugation ( Figur 3). Etter utarbeidelse utsatt synaptosomes PS i ytre membran (Figur 4), tyder på at de mistet sin funksjon og kan bli gjenkjent av PS reseptorer i astrocyttene og microglia. Som vist i figur 5, avgis pH indikator-konjugerte synaptosomes lyse røde fluorescens når de ble omsluttet av astrocyttene. Sanntid sammenligning av engulfment og fornedrelse kapasiteten til gliacellene er mulig ved å ta flere bilder av en avkastning hver 1 eller 2 h (supplerende film 1, utfyllende Movie 2). Med denne metoden viste vi ulike kinetics av astrocytter - og microglia-mediert fagocytose (figur 6). For å kvantifisere fagocytose av gliacellene, røde fluorescens signal området (µm2) ble målt, som kalles phagocytic indeks i figur 6B og figur 7. Selv om astrocyttene syntes å være effektive i phagocytosing store mengder pH indikator-konjugerte synaptosomes, microglia var raskere på engulfing og nedverdigende synaptosomes (figur 6B). Microglia viste maksimal pH indikator for intensiteten på 26 h etter pH indikator-konjugerte synaptosome behandling, mens astrocyttene viste maksimum på 45 h (p-verdien < 0,05, toveis VARIANSANALYSE mellom astrocytter med 1 X ACM og microglia med 1 X ACM). Likeledes microglial celler viste 20.7% reduksjon i total pH indikator intensitet 40 h etter det høyeste punktet, mens astrocyttene viste en 17% reduksjon i total pH indikator intensitet i samme periode. Interessant, viste våre data at astrocytter-utskilles faktorer, som var inneholdt i ACM, er avgjørende for å øke både astrocytter - og microglia-mediert fagocytose (figur 6B). Astrocyttene har vist seg å løslate bygge bro molekyler, som MFGE8, GAS6 og proteiner, som kan bygge bro og indusere interaksjoner mellom phagocytic reseptorer og "spise-meg" signaler som PS23. Som nevnt ovenfor, eliminere astrocyttene synapser via MERTK og MEGF10 veier4. MEGF10 uttrykkes bare av astrocyttene i hjernen og deltar i synapse engulfment gjennom erkjennelsen "spise-meg" signaler med ukjent identitet. Med tidligere funn, analysen viste at sammenlignet med vill-type (WT) musen astrocyttene, Megf10 bank-out (KO) musen astrocyttene besatt betydelig svekket phagocytic kapasitet (figur 7). Sammenlignet med WT astrocyttene, Megf10 KO astrocyttene viste en ca 40% reduksjon i total pH indikator for intensiteten på det høyeste punktet (31 h) (figur 7).
Figur 1. Skjematisk av astrocytter rensing ved hjelp immunopanning metoder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk av fagocytose live bildebehandling analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representant hjernen homogenate fraksjoneres i de graderte løsningene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Representant bilder av PS-utsatt synaptosomes. (A) A lyse feltet bilde av astrocyttene med synaptosomes. Synaptosomes er knyttet til astrocyttene. (B) en fluorescerende bilde av tdTomato-positive synaptosomes, som er renset fra tdTomato-uttrykke musen hjerner. (C) pSIVA binder til PS, som er utsatt for ytre membran av synaptosome, og avgir grønne fluorescens. (D) PS oppdaget av pSIVA (grønn) er samlokalisert med tdTomato-positive synaptosomes (rød). Skala bar: 20 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Representant lysende felt og fluorescerende bilder av astrocyttene med pH indikator-konjugerte synaptosomes på to tidspunkt. På 11 h etter behandling (nedre panelet), pH indikator-konjugerte synaptosomes er omsluttet av astrocyttene og avgir røde fluorescens mens de gjør ikke 1t etter behandling (øvre panel). Skala bar: 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Phagocytic kinetics rotte astrocyttene og microglia gjennom langsiktige live-avbildning. (A) A skjematisk diagram av i vitro fagocytose analysen renset astrocyttene og microglia sammen med pH indikator-konjugerte synaptosomes. Merk at før levende bilder er tatt, ubundet synaptosomes er vasket bort etter 40 min med inkubering. (B) representant grafer viser engulfment og fornedrelse kinetics astrocyttene og microglia. ACM, som inneholder astrocytter-utskilles faktorer, vesentlig forbedrer både astrocytter - og microglia-mediert synaptosome opptak. Astrocytter: Kontroll vs astrocytter med ACM 1 X, ***, Tukey er flere sammenligninger test. Microglia: Kontroll vs Microglia med ACM 1 X, ***, Tukey er flere sammenligning test. Feilfelt viser S.E.M. *p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,0001, toveis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Redusert phagocytic kapasitet på Megf10 KO musen astrocyttene med 1 X ACM forhold til WT musen astrocyttene med 1 X ACM. WT vs Megf10 KO astrocyttene med 1 X ACM, ***, toveis VARIANSANALYSE. Feilfelt viser S.E.M. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 toveis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: løsning oppskrifter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra film 1. En representant live bildebehandling video viser fagocytose av pH indikator-konjugerte synaptosomes av astrocyttene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra film 2. En representant live-imaging-video som viser fagocytose av pH indikator-konjugerte synaptosomes av microglial celler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi metoder for en langsiktig live bildebehandling i vitro fagocytose analysen renset gliacellene og pH indikator-konjugerte synaptosomes. Vi viser at sammenlignet med microglia, astrocyttene har ulike engulfment og fornedrelse kapasitet under fagocytose av synaptosomes. I tillegg tyder våre data på at astrocytter-utskilles faktorer, som inneholder bygge bro molekyler som GAS6, proteiner og MEGE8, er avgjørende for effektiv PS-avhengige fagocytose av gliacellene i hjernen. Videre viser Megf10 KO astrocyttene defekt fagocytose av synaptosomes.
For å utføre dette eksperimentet, må media og DPBS være nøye utvekslet under vask trinnene (del 5). Primær kultivert astrocyttene og microglia, spesielt microglia, er sårbare for luft eksponering. Derfor er redusere tidsintervaller mellom vask trinnene avgjørende for å opprettholde levende celler. Konfigurere langsiktige live bildebehandling med live-imaging instrumenter, anbefales manuell fokus siden autofokus kan øke laserskrivere eksponeringstid, noe som kan skade cellene.
I denne metoden er synaptosome rensing protokollen19 litt endret. Den opprinnelige papiret skiller gradient løsninger til 3%, 10%, 15% og 23%. Men satt vi opp 3%, 10% og 23% gradient løsninger å øke avkastningen av renset synaptosomes. Instruksjonene for immunopanning astrocyttene og microglial celler endres også i denne metoden. Målet med den opprinnelige panorering protokollen21 er å rense bare astrocyttene og bruke BSL-1, sekundær-bare, CD45, O4 og Itgb5 (HepaCAM for mus) som immunopanning. Siden BSL-1 og videregående bare vil fjerne endotelceller samt microglia, vi endret rekkefølgen til CD45 sekundær-bare, BSL-1, O4 og Itgb5 (HepaCAM for musen) å øke avkastningen av microglia fra CD45 panorering parabolen. I denne protokollen, vi også perfused SD rotte unger (~ P7-P10) med DPBS gjennom sirkulasjonssystemet fjerne ulike blod celler for å redusere forurensning fra CD45-positive ikke-microglial bestander.
Det er flere fordeler i vitro fagocytose analysen. PH indikatoren brukes i synaptosome Bøyning bare avgir røde fluorescens lav pH forhold. Derfor ved behandling av data, kan vi direkte kvantifisere røde fluorescens som et signal phagocytic hendelser uten en slukke prosedyre å fjerne bakgrunnen signaler eller komplisert tenkelig analyse for å få samlokalisert signaler svelget lett materiale inne i phagocytes. I tillegg kan denne metoden sanntidssporing av glial fagocytose ved å ta bilder av pH indikator intensitet innenfor en gitt avkastning på flere tidspunkt. Ved å generere en graf med pH indikator intensitet til 100 h, engulfment samt fornedrelse kan kapasitet lett overvåkes mellom forskjellige celler og forhold. En annen fordel er bruken av synaptosomes. Siden astrocyttene ensheathe synapser hele tiden med deres fine prosesser og har vært vist å sluke synapser i vivo4, bruker synaptosomes er svært godt egnet for måling i vitro phagocytic kapasitet av astrocyttene. Endelig, denne i vitro fagocytose analysen har potensial til å utvikles til å studere glial fagocytose av myelin rusk eller amyloid beta, som er relatert til ulike nevrologiske lidelser.
Med økt levealder er en dramatisk økning i antall pasienter med nevrodegenerative sykdommer uunngåelig. Synapse tap gjennom gliacellene er en av de ledende faktorene i flere nevrodegenerative sykdommer13,14. I tillegg kan unormal synapse beskjæring og en ubalanse i hjernen homeostase være forbundet med glial fagocytose defekter. Derfor kan identifisere faktorer og forbindelser som kan styre engulfment og fornedrelse kapasiteten til astrocyttene være avgjørende for å finne vellykket behandlinger for ulike nevrologiske lidelser. Siden denne i vitro fagocytose analysen kan skaleres enkelt med multiwell plater, kan denne metoden brukes som en passende plattform for ulike screenings for å identifisere faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Yeon-Joo Jung for hennes eksperimentell støtte under synaptosome rensing og Jungjoo Park for bilder av synaptosomes med PS eksponering. Dessuten, takker vi alle medlemmer i Chung laboratorium for nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation av Korea (NRF) stipend finansiert av koreanske myndigheter (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 og NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
