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Neuroscience

Un pH de Novel In Vitro Live-imagerie phagocytose médiée par dosage de l’Astrocyte utilisant Synaptosomes indicateur conjugué

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/56647
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

Summary

Ce protocole présente un test in vitro d’imagerie live phagocytose pour mesurer la capacité phagocytaire des astrocytes. La microglie et les astrocytes purifiée de rat sont utilisées avec synaptosomes conjugué indicateur de pH. Cette méthode peut détecter la cinétique de dégradation et d’une durée de temps réel et fournit une plate-forme de dépistage approprié pour identifier les facteurs modulant la phagocytose astrocyte.

Abstract

Les astrocytes sont le type de grandes cellules dans le cerveau et contacter directement les synapses et les vaisseaux sanguins. Bien que les cellules microgliales ont été considérés comme les principales cellules immunitaires et seulement les phagocytes dans le cerveau, les études récentes ont montré que les astrocytes participent également dans divers processus phagocytaires, telles que l’élimination de synapse développement et apurement des plaques de bêta-amyloïde dans la maladie d’Alzheimer (ma). Malgré ces résultats, l’efficacité d’une durée d’astrocyte et la dégradation de leurs cibles ne sont pas claires comparé à celui des cellules microgliales. Ce manque d’information est principalement en raison de l’absence d’un système de test dans lequel la cinétique de l’astrocyte et la microglie-médiée par phagocytose sont facilement comparables. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé à long terme d’imagerie live in vitro phagocytose des tests afin d’évaluer la capacité phagocytaire des astrocytes purifiées et la microglie. Dans ce test, détection en temps réel d’enlisement et d’avilissement est possible à l’aide de synaptosomes conjugué indicateur pH, qui émettent une fluorescence rouge vif dans les organites acides, tels que les lysosomes. Notre nouveau dosage fournit la détection simple et efficace de phagocytose par le biais d’images en direct. En outre, cet essai in vitro phagocytose avec utilisable comme une plate-forme de dépistage pour identifier les produits chimiques et des composés qui peuvent renforcer ou inhiber la capacité phagocytaire des astrocytes. Comme l’ont démontré des dysfonctionnement synaptique de l’élagage et l’accumulation de protéine pathogène provoque des troubles mentaux ou maladies neurodégénératives, produits chimiques et composés qui modulent la capacité phagocytaire des cellules gliales devraient être utiles dans le traitement de diverses troubles neurologiques.

Introduction

Les cellules gliales, qui font référence à des cellules non excitables dans le cerveau, sont le type de cellule majeur dans le système nerveux central (CNS). Auparavant, les cellules gliales étaient considérées comme des cellules de soutien simples qui principalement jouent un rôle passif dans le maintien de la survie neuronale et propriétés synaptiques basales. Cependant, des preuves nouvelles a révélé que les cellules gliales jouent un rôle plus actif dans divers aspects de la neurobiologie, comme le maintien de l’homéostasie du cerveau, médiation synapse formation1,2,3 et synapse élimination de4,5et moduler la plasticité synaptique6,7. Les cellules gliales dans le SNC comprennent les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Parmi ces cellules, les astrocytes et les cellules microgliales auraient dû être divulgués à jouer un rôle phagocytaire en engloutissant des synapses4,5, de cellules apoptotiques8, débris neural9et protéines pathogènes, comme la bêta-amyloïde plaques de10,11. Dans le développement du cerveau, astrocytes éliminent des synapses dans le noyau géniculé latéral (dLGN) dorsal à MERTK - et MEGF10-dependent phagocytose4. De même, la microglie également éliminer C1q-enduite synapses au cours des stades de développement par le biais de la cascade de complément classique5. Fait intéressant, il a été suggéré que des défauts d’élagage synapse peuvent être l’un des initiateurs de plusieurs troubles neurologiques. Par exemple, il a été démontré que des mutations dans le composant de complément 4 (C4), qui augmente l’élagage synapse médiée par le complément de la microglie, sont fortement associées à la prévalence de la schizophrénie chez les humains,12. Une étude récente a également montré que la voie classique de complément est hyperactivé dans les étapes de l’initiation de AD et induit la perte précoce de synapse dans cette maladie13.

Par rapport à la phagocytose médiée par les cellules microgliales, si phagocytose médiée par les astrocytes contribue à l’initiation et la progression de divers troubles neurologiques est moins claire. Cependant, une étude récente suggère que les facteurs qui modifient le taux d’élagage de la synapse normale par les astrocytes peuvent perturber l’homéostasie du cerveau et contribuer à AD susceptibilité et pathologie14. Le taux d’élagage de la synapse par les astrocytes est fortement contrôlé par isomères de l’ApoE , possédant un allèle protecteur pour AD (ApoE2) fortement améliorer la vitesse et un allèle risque d’Alzheimer (ApoE4) abaisser significativement le taux. En outre, des souris transgéniques exprimant le gène ApoE4 accumulent beaucoup plus C1q synaptique que contrôle ou ApoE2 souris14. Ces données suggèrent qui réduisaient la phagocytose médiée par les astrocytes au début du cerveau peut provoquer l’accumulation de débris sénescentes C1q-enduite synapses/synaptique qui active la phagocytose médiée par le complément des microglies, dégénérescence synaptique au volant . La capacité phagocytaire altération des astrocytes chez les porteurs du gène ApoE4 peut aussi contribuer à l’accumulation incontrôlée des plaques bêta-amyloïdes dans le cerveau touchées par AD.

En outre, il a été démontré que les cellules gliales du cerveau âgé de Drosophila perdent leur capacité phagocytaire due à une diminution traduction de Draper, un homologue de Megf10 qui utilisent des astrocytes pour phagocytants des synapses. Rétablissement des taux de Draper a sauvé la capacité phagocytaire des cellules gliales, qui a éliminé efficacement les débris axonale endommagées du cerveau âgé dans une mesure similaire que celle du cerveau jeune, indiquant que vieillissement induit par des altérations dans la capacité phagocytaire des les astrocytes peuvent contribuer à la perturbation de l’homéostasie du cerveau15.

Selon ces nouveaux résultats, modulant la capacité phagocytaire des astrocytes peut être une stratégie thérapeutique séduisante pour prévenir et traiter divers troubles neurologiques. À cet égard, plusieurs tentatives d’améliorer la capacité phagocytaire des astrocytes, par exemple, en induisant une acidification des lysosomes avec nanoparticules acides16 et surexprimant le facteur de transcription EB (TFEB), qui peut améliorer ont été lysosome biogenèse17. Malgré ces tentatives, on ignore encore comment les astrocytes et les cellules microgliales diffèrent dans leur cinétique phagocytaire et savoir si nous devrions augmenter ou diminuer leurs capacités phagocytaires dans diverses maladies.

Dans cet article, nous présentons un roman in vitro test pour détecter la capacité phagocytaire des astrocytes en temps réel. Les données montrent différentes cinétiques de dégradation et d’une durée dans les astrocytes et les cellules microgliales. Conditionné par l’astrocyte moyen (ACM), qui contient des facteurs sécrétés d’astrocytes, est essentiel pour phagocytose efficace d’astrocytes et de cellules microgliales. En outre, Megf10, un récepteur phagocytaire dans les astrocytes et un homologue de DEC-1 et Draper, joue un rôle crucial dans la phagocytose médiée par les astrocytes8,18.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’utilisation (IACUC), KA2016-08 et The Korea Advanced Institute of Science et technologie institutionnelle animalier.

1. synaptosomes Purification

Remarque : Ces procédures sont adaptés d’un article précédemment publié19 avec quelques modifications pour améliorer le rendement des synaptosomes purifiées (Figure 1).

  1. Préparer les milieux gradient de densité discontinu.
    1. Placer ce qui suit sur la glace : 3 %, 10 % et 23 % densité gradients solutions tampon dégradé (amener à 250 mL d’eau avec 109,54 g de saccharose, 606 mg de Tris et 5 mL d’EDTA 0,2 M, pH 7,4) ; homogénéisation de tampon (ajouter 25 mL de 4 x gradient tampon et 500 µL de 50 mM DTT dans 74,5 mL d’eau) ; homogénéisateur mortier et un pilon.
      NOTE : Préparation et solution de gradient de densité sont présentées dans le tableau 1. Pour préparer 3 %, 10 % et 23 % de la densité des solutions dégradées, utilisez la solution de gradient de densité brute.
    2. Préparer six tubes de centrifugeuse ultra claire par trois chez la souris adulte.
    3. Ajouter 3 mL de solution gradient de densité 23 % sur le fond de chaque tube à centrifuger avec une pipette 1 mL. Puis, lentement faire une couche avec 3 mL de solution de gradient de densité 10 % au-dessus de la solution de gradient de densité de 23 % avec une pipette de pâturage et la pipette de 1 mL. Enfin, ajouter 3 mL de solution gradient de densité de 3 % sur le dessus. Dans cette étape, soyez prudent afin d’éviter l’introduction de bulles.
    4. Couvrir les tubes de centrifugeuse d’une pellicule plastique et conserver les tubes sur la glace.
  2. Thermoélectrique d’une centrifugeuse à grande vitesse et une ultracentrifugeuse à 4 ° C.
  3. Stérilisation de l’équipement chirurgical (ciseaux, ciseaux de printemps Castroviejo et pince courbe de fonctionnement) avec l’éthanol à 70 %. Préparer un bécher de petit verre avec 25 mL de tampon homogénéisation sur glace et peser le bécher.
  4. Extraire le cerveau de souris mâles trois adultes (environ 12 semaines).
    1. Disloquer la vertèbre cervicale et couper le cou avec les ciseaux de fonctionnement. Décollez la peau de la tête et le crâne, le long de la ligne médiane à l’aide de ciseaux d’exploitation et pince courbée. Avec des ciseaux de printemps Castroviejo l’accise les bulbes olfactifs et le cervelet.
  5. Mettre le cerveau restant dans le bol avec une pince courbée et peser le cerveau. Rincer les cerveaux plusieurs fois avec un tampon homogénéisation glacé pour enlever le sang sur la surface du cerveau.
    NOTE : Auparavant, 9 mL de tampon homogénéisation pour 1 g de tissus cérébraux a été recommandé.
  6. Ajouter 4 mL de tampon et 1 g de tissus cérébraux au mortier de homogénisateur de l’homogénéisation. Tout en homogénéisant les cerveaux, ajouter l’homogénéisation de la mémoire tampon jusqu'à 8 mL.
  7. Diviser l’homogénat en deux tubes de 50 mL centrifugeuse à grande vitesse. Laver le mortier avec 1 mL de tampon homogénéisation fraîche et ajoutez-la aux tubes.
    ATTENTION : Procéder par étapes 1,3-1,7 aussi rapidement que possible. Moins de 20 min est recommandé.
  8. Centrifuger les homogénats de tubes à centrifuger à grande vitesse à 1 000 x g pendant 10 min à 4 ° C avec des freins plus lents.
    NOTE : Fixer le taux de décélération (frein) à deux ou trois lorsque le taux de décélération maximal est neuf.
  9. Soigneusement, ajouter le liquide surnageant dans un nouveau tube de 50 mL et ajouter jusqu'à 12 mL de tampon de l’homogénéisation.
  10. Soigneusement et lentement pipette de 2 mL du surnageant dilué leur solution de gradient de densité de 3 % avec une pipette 1 mL et placer les tubes sur la glace.
  11. Centrifuger à 31 000 x g pendant 5 min à 4 ° C sans freins.
    NOTE : Fixer le taux de décélération à l’un (zéro) ou de la côte.
  12. Placer les tubes sur la glace et recueillir la fraction de synaptosomes entre la solution gradient de densité 23 % et la solution de gradient de densité 10 % avec une pipette de 2 mL dans un tube de 50 mL. Ajouter glacee saccharose/EDTA à 80 mL de tampon et diviser en quatre tubes de 50 mL centrifugeuse à grande vitesse.
    Remarque : Voir la Figure 3 pour synaptosomes fractionnés avec des pentes marquées.
  13. Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° c avec moins de pauses.
    NOTE : Fixer le taux de décélération à deux ou trois, lorsque le taux de décélération maximal est neuf.
  14. Avec précaution, retirez le surnageant avec une pipette 1 mL, resuspendre le culot de synaptosomes avec 1 mL de tampon de physiologique isotonique (140 mM NaCl, KCl 3 mM, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4et 10 mM HEPES glucose 10 mM, pH 7,4)20. Ajouter 1 mL de DMSO de 10 % dans un tampon physiologique isotonique (concentration finale de DMSO : 5 %) et de recueillir les synaptosomes dans un tube à centrifuger à grande vitesse de 50 mL.
  15. Aliquote 1 mL dans des tubes de 1,5 mL. Mesurer le taux protéique des synaptosomes à l’aide de l’analyse de Bradford.
  16. Rapidement geler les tubes et les tubes se conservent dans un congélateur à-80 ° C jusqu'à conjugaison indicateur de pH.

2. pH indicateur conjugaison

  1. Centrifuger les tubes de 1,5 mL avec synaptosomes à 21 092 g pendant 3-4 min à 4 ° C.
  2. Retirer le surnageant, ajouter 200 µL de 0,1 M Na2CO3 et mélanger bien en pipettant également.
    NOTE : Na2CO3 a été ajouté pour augmenter le pH comme succinimidyl ester plus efficacement réagit avec les amines primaires à un pH légèrement alcalin.
  3. Ajouter 2 µL d’indicateur de pH dans le tube et doucement le vortex.
    ATTENTION : Utiliser 1 µL d’indicateur de pH par 0,3 mg de solution synaptosomes.
  4. Minimiser l’exposition à la lumière en couvrant les tubes de papier d’aluminium et les incuber pendant 1-2 h à température ambiante (RT) dans un shaker de torsion avec agitation douce à 30-40 t/mn.
  5. Arrêter l’agitation et ajouter 1 mL de SPD.
  6. Centrifuger les tubes à 21 092 g pendant 1-2 min.
  7. Retirez le surnageant et ajouter 1 mL de SPD à Resuspendre le culot de pipetage doux.
  8. Répétez les étapes 2,6 à 2,7 au moins sept fois pour supprimer l’indicateur de pH non lié.
  9. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot avec 200 µL de SPD avec 5 % DMSO.
    Remarque : À ce stade, synaptosomes tous sont non fonctionnelles. Nous avons confirmé que phosphatidylsérine (PS) a été exposé à la membrane externe des synaptosomes, qui fonctionne comme un « eat-me » signal (Figure 4).

3. les astrocytes et Purification de cellules microgliales

Remarque : Ce protocole pour la purification de l’astrocyte est adapté d’un article précédemment publié21. Dans ce protocole, la purification des astrocytes de rat et de la microglie est décrite. Des procédures spécifiques pour la purification des astrocytes de souris et les cellules microgliales sont également décrites dans les notes.

  1. Veille de purification
    1. Préparer les solutions et les récipients de culture de cellules préalablement enduit.
    2. Préparer des plats de Pétri de 5 145 mm x 20 mm avec 25 mL de 50 mM Tris-HCl (pH 9,5). Placer traitement d’anticorps primaires ou secondaires dans les boîtes de Pétri séparément comme décrit ci-dessous. Incuber les plats dans le congélateur jusqu’au lendemain.
      BSL-1 plat : 20 µL de 5 mg/mL BSL-1 (Griffonia simplicifolia lectine)
      Plat secondaire uniquement : 60 µL de 2,4 mg/mL chèvre anti-souris IgG + IgM (H + L)
      CD45 plat : 60 µL de 2,4 mg/mL chèvre anti-souris IgG + IgM (H + L)
      O4 plat : 60 µL de 2,4 mg/mL chèvre anti-souris IgM (µ-chaîne spécifique)
      Itgb5 (intégrine β5) plat pour les astrocytes rat : 60 µL de 2,4 mg/mL chèvre anti-souris IgG + IgM (H + L)
      Remarque : Pour attacher les anticorps secondaire à la surface hydrophobe de la boîte de Pétri, attachement lente à basse température est recommandé. Toutefois, il est possible de recouvrir la boîte de Pétri avec l’anticorps secondaire pendant 2 h à 37 ° C. Anticorps pour astrocyte panoramique sont utilisées différemment selon les espèces animales ; par exemple, HepaCAM plat pour les astrocytes de souris : 60 µL de 2,4 mg/mL chèvre anti-souris IgG + IgM (H + L)
  2. Jour de Purification
    1. Préparer à immunopanning.
    2. Préparer les tubes de 50 mL et ajouter des stocks aux tubes. La préparation de la solution mère détaillé est présentée dans le tableau 1.
      1. Préparer 1 Tube (Enzyme) : 22 mL de stock d’enzyme (stock d’Enzyme : 1 x Solution saline équilibrée de Earle (EBSS)+0.46% D (+)-glucose + 26 mM NaHCO3 et0,5 mM EDTA).
      2. Préparer le Tube 2 (Low Ovo) : 42 mL de stock inhibiteur (stock inhibiteur : 1 x EBSS+0.46% D (+)-glucose + 26 Mm NaHCO3).
      3. Préparer 3 Tube (haute Ovo) : 10 mL de stock de l’inhibiteur.
    3. Fixer les filtres de seringue de 0,22 µm pour les pointes de pipettes de 2 mL reliés à un réservoir de CO2 (95 % O2 et 5 % de CO2). Bulles de CO2 dans des Tubes 1-3. Arrêter la propagation quand les solutions tourne orange.
    4. Toutes les solutions.
      ATTENTION : Remplissez et incuber la solution en Tube 1 à 34 ° C pendant 15 min avant de l’utiliser pour l’activation de l’enzyme.
      1. Préparer 1 Tube (Enzyme) : 22 mL de stock d’enzyme + 180 U de papaïne + 0,004 g de L-cystéine.
      2. Préparer le Tube 2 (Low Ovo) : 42 mL de stock inhibiteur + 3 mL de basse Ovo + 200 µL de DNase.
      3. Préparer 3 Tube (haute Ovo) : 10 mL de stock inhibiteur + 2 mL de haut Ovo + 20 µL de DNase.
      4. Préparer le Tube 4 (0,2 % de BSA) : 19 mL de 1 X DPBS + 1 mL de BSA 4 % + 8 µL de DNase.
      5. Préparer le Tube 5 (0,02 % de BSA) : 45 mL de 1 X DPBS + 5 mL de Tube 4 + 50 µL de DNase.
    5. Préchauffer un bloc de salle de bain et de la chaleur de l’eau à 34 ° C.
  3. Extraire le cortex de rat.
    1. Stériliser le matériel chirurgical avec 70 % d’éthanol et préparer des plats de Pétri de 100 mm avec le SPD.
    2. Préparer une boîte acrylique. Mettre deux ou trois couches de tissus dans le bas de la boîte et ajouter 1 mL d’isoflurane dans la boîte.
    3. Anesthésier les chiots pour 20 à 40 s dans la zone et confirmer anesthetization par pied pincée avec une pince. Exposer le coeur22 et perfuse les chiots à l’aide d’une seringue de 10 mL avec le SPD.
      Remarque : La Perfusion est utilisée pour éviter la contamination des cellules sanguines durant l’étape panoramique de la microglie.
    4. Couper les ligne cervicale supérieure du pup du cou avec des ciseaux d’exploitation et inciser la peau de tête le long de la ligne médiane. Faire une incision sur le crâne, le long de la ligne médiane et ouvrir le crâne avec une pince courbe.
    5. Avec des ciseaux de printemps Castroviejo l’accise du cervelet. Retirez le cerveau restant et placez-le dans une boîte de Pétri 100 mm rempli avec le SPD.
    6. Supprimer les autres domaines tels que le mésencéphale et l’hippocampe du cortex avec des ciseaux printemps Castroviejo sous le microscope. Supprimer les méninges avec une pince fine.
    7. Le cortex de transfert dans une autre boite de 60 mm et retirez le SPD restant dans le plat. Couper le tissu avec une lame n° 10.
  4. Dissocier le cortex dans une suspension monocellulaire
    1. Versez la solution filtrée du Tube 1 dans un plat de 60 mm et ajouter 50 µL de DNase1. Agiter la solution dans le plat.
      NOTE : DNase est utilisé pour inhiber l’agrégation de l’ADN des cellules de la ruptures.
    2. Placer le plat dans un bloc chauffant de 34 ° C et couvrir avec un couvercle qui a un trou au milieu. Utiliser un fer à souder pour faire le trou dans le couvercle de la boîte de Pétri 60 mm.
    3. 22-µm seringue filtres de connexion à un tube réservoir de CO2 et placez l’extrémité du filtre dans le trou.
    4. Incuber le plat à 34 ° C pendant 45 min. faire tourbillonner la solution dans le plat toutes les 10 à 15 min.
  5. Terminer la préparation des plats panoramiques.
    1. Retirer les plats panoramiques qui ont été recouverts d’anticorps secondaires du congélateur un jour en avance. Laissez la BSL-1 plat et le plat de seulement anticorps secondaire à température ambiante.
    2. Lavez les autres plats trois fois avec 20 mL de SPD.
    3. Versez une quantité suffisante de 0,02 % de BSA dans les plats. Placez les anticorps primaires spécifiques dans les plats correspondants :
      CD45 plat : 12 mL de 0,02 % de BSA + 20 µL de 0,5 mg/mL Rat anti-souris CD45
      Itgb5 plat : 12 mL de 0,02 % de BSA + 20 µL de 0,5 mg/mL Itgb5
      O4 plat : 8 mL de 0,02 % de BSA et de 4 mL d’anticorps O4
      Remarque : Pour immunopanning de la souris, utilisez souris anti-rat CD45 (0,5 mg/mL) pour les cellules microgliales et HepaCAM (0,5 mg/mL) pour les astrocytes.
    4. Préparer 30 mL 30 % FBS avec neurobasal médias et 10 mL de 1 X EBSS. Chauffer les deux solutions dans un bain d’eau de 34 ° C.
  6. Inhiber la réaction de la papaïne.
    1. Transférer les tissus traités papaïne dans un nouveau tube de 50 mL. Attendez que les tissus s’installer. Aspirer le liquide par aspiration.
    2. Ajouter 4 mL de solution faible Ovo dans le tube et agiter la solution pour laver les cellules.
    3. Répétez les étapes 3.6.1-3.6.2 trois fois pour arrêter la réaction enzymatique.
  7. Triturer les tissus du cortex.
    1. Ajouter 6 mL de basse Ovo dans la baignoire. Aspirer et libérer les tissus rapidement avec une pipette de 5 mL.
      ATTENTION : Ne pas introduire des bulles.
    2. Préparer un nouveau tube de 50 mL et ajouter 5 mL de basse Ovo. Recueillir des cellules individuelles dans un nouveau tube.
    3. Répétez les étapes 3.6.1-3.6.2 deux fois, puis changez la pipette 5 mL en une pipette 1 mL.
    4. Répétez la trituration jusqu'à ce que plus de 95 % des tissus ne sont pas visibles.
    5. Faire une couche de solution haute Ovo de cellules tube 3 avec une pipette 10 mL sous faible contenant Ovo dissociée.
    6. Centrifuger à 190 g pendant 6 min avec peu de freins.
      NOTE : Fixer le taux de décélération à un ou deux lorsque le taux de décélération maximal est neuf.
  8. Le filtrat de cellules individuelles.
    1. Soigneusement aspirer le surnageant par aspiration, puis Resuspendre le culot avec 3 mL de solution de BSA 0,02 % avec une pipette 1 mL.
    2. Ajouter la solution de BSA de 0,02 % à 9 mL.
    3. Préparer un nouveau tube de 50 mL et 20 µm crépine de cellule sur le dessus du tube. Mouiller la crépine de la cellule avec 1 mL de solution de BSA de 0,02 %.
    4. Transférer la suspension monocellulaire dans la crépine de la cellule. Filtre 1 mL à la fois.
    5. Lavez le tamis cellulaire avec 3 mL de solution de BSA de 0,02 %. Ne faites pas plus de 15 mL de la suspension cellulaire unique filtré.
    6. Incuber le tube dans un bain d’eau de 34 ° C pendant 45-60 min pour la récupération de la cellule. L’étape de récupération des cellules permettant la relocalisation des protéines de surface de cellules de la membrane.
  9. Effectuer panoramique des cellules.
    1. Laver le plat panoramique CD45 trois fois avec 20 mL de SPD. Laver tous les plats trois fois avec 20 mL de SPD immédiatement avant l’emploi.
    2. Verser la suspension monocellulaire dans le CD45 panoramique plat. Laisser le plat pendant 28 min et secouez le plat pendant 14 minutes. Pour éliminer les cellules non liés par le bas, agiter prudemment le plat.
    3. Transférer la suspension cellulaire dans le plat secondaire uniquement. Attendre 20 min et agiter prudemment le plat pendant 10 min. Pour obtenir la microglie du CD45 plat, passez à l’étape 3.9.2.
    4. Transférer la suspension cellulaire dans le plat de BSL-1. Laisser le plat pendant 10 à 12 min.
    5. Transvaser dans le plat de O4. Attendre 20 min et agiter pendant 10 min.
    6. Transvaser dans le plat de Itgb5. Laisser le plat pendant 40 min et secouez légèrement toutes les 10 min.
      Remarque : Pour souris panoramique, transférer la suspension cellulaire dans le plat de HepaCAM.
  10. Détacher les cellules du plat.
    1. Mix 400 µL de trypsine (30 000 U/mL chez EBSS) avec préincubées 8 mL de 1 X EBSS.
    2. Versez la suspension de cellules individuelles dans le plat dans un seau.
    3. Laver le plat huit fois avec le SPD.
    4. Verser 8 mL de EBSS avec la trypsine dans le plat.
    5. Incuber le plat pendant 5 à 10 min dans un incubateur à 37 ° C. Incuber pendant 10 min pour le plat de CD45 et 5 min pour les plats de Itgb5 et HepaCAM.
    6. Tapez sur le plat et observer le plat sous un microscope.
      Remarque : Si la plupart des astrocytes n'ont pas détaché, remettez le plat dans l’incubateur pendant 5 min.
    7. Verser 10 mL de 30 % FBS dans le plat pour neutraliser la trypsine.
    8. Pipetter monte et descend dans le plat entier pour détacher les astrocytes ou microglie.
    9. Transvaser la solution dans un tube de 50 mL.
    10. Ajouter 10 mL de 30 % FBS et 200 µL de DNase dans le plat. Détacher les cellules à nouveau. DNase permet d’inhiber l’agrégation de l’ADN des cellules de la ruptures.
    11. Transvaser la solution dans le tube. Si les cellules restent dans le plat, ajouter un autre 10 mL 30 % FBS et détacher les cellules à nouveau.
  11. Les cellules de la plaque.
    1. Centrifuger le tube à 213 x g pendant 10 min.
    2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot avec les médias.
      NOTE : Utiliser le multimédia de base immunopanned astrocyte (IP-ABM) d’astrocytes et multimédia de base des microglies rétinienne (MBM) avec immunopanned conditionné par l’astrocyte médias (IP-ACM) pour les cellules microgliales. Les IP-ABM et les compositions de MBM sont présentées dans la Table des matières.
    3. Compter les cellules avec un hémocytomètre.
    4. Plaque les astrocytes et les microglies séparément dans des plaques de revêtement PDL.
      NOTE : Préparer la plaque de revêtement PDL avant utilisation. Pour préparer les plaques de revêtement PDL, ajouter 50 µL de poly-D-lysine 1 mg/mL dans 5 mL d’eau distillée et verser une quantité suffisante de solution dans le plat/plat bien et attendez 30 min. laver le plat/plat trois fois avec de l’eau distillée.
    5. Incuber les plaques. Changer la moitié des médias tous les 7 jours pour les astrocytes et 3 jours pour la microglie.

4. collecter les IP-ACM

  1. Préparer un plat de 100 mm lorsque les astrocytes sont trop confluentes.
  2. Jetez les médias et laver le plat trois fois avec 10 mL de SPD.
  3. Verser 15 mL de médias de faible teneur en protéines dans le plat.
    Remarque : La composition de supports de faible teneur en protéines est présentée dans la Table des matières.
  4. Incuber le plat pendant 7 à 10 jours dans un incubateur à 37 ° C.
  5. Rassembler et concentrer les médias avec 10k (ou 30k) tubes filtre centrifuge.
  6. Centrifuger les tubes à 851 x g à 4 ° C.
    NOTE : Centrifuger les tubes jusqu'à ce que les médias restant sont inférieur à 1 mL.
  7. Frais virés médias concentrés (IP-ACM) dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  8. Mesurer la concentration de la propriété intellectuelle-ACM à l’aide de l’analyse quantitative

5. phagocytose Live-imagerie Assay (Figure 2)

  1. Préparer une plaque 24 puits (ou n’importe quel plat/plat prêt pour vivre-imagerie) dans les astrocytes sont confluentes (en général, de 7 à 10 jours d’incubation après la purification est idéale pour stabiliser les cellules).
  2. Retirez le support dans chaque puits et laver les puits avec 1 mL de SPD, trois fois. Pour minimiser l’exposition à l’air, laver rapidement les puits.
  3. Ajouter 300 µL de IP-ABM 5 µl de synaptosomes conjugué indicateur de pH et des facteurs supplémentaires, tels que IP-MCA qui peuvent moduler la phagocytose des cellules gliales.
  4. Incuber la plaque dans un incubateur à CO2 pendant 40 min. Cette étape permet le pH synaptosomes indicateur conjugué à déposer au fond des assiettes.
  5. Retirez le support avec synaptosomes conjugué indicateur de pH non lié et laver chaque puits avec 1 mL de SPD, trois fois.
    ATTENTION : Ne pas laver durement. Pour minimiser l’exposition à l’air, laver rapidement les puits.
  6. Ajouter 500 µL de IP-ABM présentant des facteurs additionnels pour tester dans les puits.
  7. Prendre la plaque à un instrument d’imagerie live et sélectionnez les postes. Ajuster la mise au point, temps d’exposition, la luminosité et LED power.
    Remarque : Les paramètres de durée d’exposition, la luminosité et la LED power sont variable selon l’intensité de la fluorescence et le but de l’expérience. Dans l’analyse d’image en direct avec synaptosomes conjugué indicateur de pH, nous avons mis habituellement ces valeurs comme suit : exposition : ~ 150-200 ms, luminosité : 15 et LED de puissance : 4-6.
  8. Définir le format d’image, intervalle de temps et le nombre total de cycles pour la création d’images en direct. Définissez l’intervalle de temps à 1 ou 2 h selon le nombre de positions sont sélectionnés. 2 heures les intervalles sont recommandés lorsque plus de 150 postes sont sélectionnés pour la création d’images en direct.
  9. Commencer les expériences de création d’images en direct.
  10. Analyser les données.
    1. Ouvrez le programme Fidji.
    2. Importer une séquence d’images. Convertir des images en niveaux de gris 8 bits.
    3. Exécuter la soustraction de fond avec un rolling bar rayon de 50 pixels.
    4. Commencer à temps, analyseur série V3 plugins.
      NOTE : L’adresse de l’analyseur de la série temps V3 plugins est présentée dans la Table des matières.
    5. Faites glisser la zone d’intérêt (ROI) dans l’image et cliquez sur Ajouter dans le gestionnaire de ROI.
    6. Cliquez sur « Obtenir l’intensité totale » de la série V3_0.
    7. Enregistrer les résultats et intégrer les données.

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Representative Results

Dans cet essai de la phagocytose dans vitro avec imagerie vivre à long terme, nous avons utilisé des synaptosomes des homogénats de cerveau de souris adultes, qui ont été séparés dans la solution dégradée entre solution dégradé de 23 % et 10 % dégradé par ultracentrifugation ( La figure 3). Après la préparation, synaptosomes exposés PS dans leur membrane externe (Figure 4), ce qui laisse croire qu’ils ont perdu leur fonction et pourraient être reconnues par les récepteurs du PS dans les astrocytes et les cellules microgliales. Comme illustré à la Figure 5, synaptosomes conjugué indicateur de pH émis une fluorescence rouge vif lorsqu’ils ont été engloutis par les astrocytes. Comparaison en temps réel les capacités d’une durée et de la dégradation des cellules gliales est possible en prenant plusieurs images d’un retour sur investissement de chaque h 1 ou 2 (supplémentaire 1 film, complémentaire Movie 2). Avec cette méthode, nous avons démontré différent cinétique de phagocytose à médiation astrocyte et la microglie (Figure 6). Afin de quantifier la phagocytose des cellules gliales, la zone (µm2) du signal de fluorescence rouge a été mesurée, ce qu’on appelle indice phagocytaire dans la Figure 6 b et Figure 7. Bien que les astrocytes semblent efficace dans phagocytants de grandes quantités de synaptosomes conjugué indicateur de pH, les microglies étaient plus rapides à engloutir et dégradants synaptosomes (Figure 6 b). La microglie ont montré intensité indicateur pH maximum à 26 h après traitement de synaptosomes conjugué indicateur de pH, tandis que les astrocytes ont montré leur maximum à 45 h (p-value < 0,05, ANOVA bidirectionnelle entre astrocytes avec 1 X ACM et la microglie avec 1 X ACM). De même, les cellules microgliales montrés une baisse de 20,7 % intensité indicateur de pH total 40 h après le point de pic, alors que les astrocytes ont montré une réduction de 17 % en intensité indicateur pH total durant la même période de temps. Fait intéressant, nos résultats montrent que les facteurs astrocyte-sécrétée, qui figurent dans les ACM, sont essentiels pour accroître les deux phagocytose à médiation astrocyte et la microglie (Figure 6 b). Astrocytes auraient dû être divulgués pour libérer des molécules ponts, comme MFGE8, GAS6 et les protéines qui peuvent combler et induire des interactions entre les récepteurs phagocytaires et « manger-me » signaux tels que PS23. Comme mentionné ci-dessus, les astrocytes éliminent synapses via les voies MERTK et MEGF10 à4. MEGF10 n’est exprimée par les astrocytes dans le cerveau et y participe à travers la reconnaissance d’une durée de synapse « manger-me » signaux avec identités inconnues. En accord avec les conclusions précédentes, l’analyse a montré que par rapport aux astrocytes de type sauvage (WT) souris, Megf10 knock out (KO) la souris astrocytes possédé significativement altérée phagocytaire capacité (Figure 7). Par rapport aux astrocytes WT, Megf10 KO astrocytes ont montré une réduction de 40 % environ en intensité indicateur pH totale au point de crête (31 h) (Figure 7).

Figure 1
Figure 1. Schéma de purification astrocyte en utilisant des méthodes d’immunopanning. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Schéma du dosage de vivre-imagerie de phagocytose. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Fractionnement d’homogénat cerveau représentatives dans les solutions dégradés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Les images représentant des synaptosomes exposés au PS. Image de champ lumineux (A) A des astrocytes avec synaptosomes. Synaptosomes accompagnent les astrocytes. (B) une image fluorescente de synaptosomes tdTomato séropositifs, qui sont purifiés de souris exprimant le tdTomato cerveau. (C) pSIVA lie au PS, qui est exposée à la membrane externe des synaptosomes et émet une fluorescence verte. (D) ch détecté par pSIVA (vert) est co localisée avec synaptosomes tdTomato positif (rouges). Barre d’échelle : 20 µm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Champ lumineux représentatif et images fluorescentes d’astrocytes avec synaptosomes conjugué indicateur de pH à deux points dans le temps. A 11 h après le traitement (panneau inférieur), synaptosomes conjugué indicateur de pH sont engloutis par les astrocytes et émettent une fluorescence rouge alors qu’ils ne le font pas 1 h après le traitement (panneau du haut). Barre d’échelle : 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
La figure 6. Phagocytaire cinétique des astrocytes de rat et de la microglie par imagerie vivre à long terme. (A) A schéma de principe d’un dosage phagocytose in vitro à l’aide des astrocytes purifiées et la microglie avec synaptosomes conjugué indicateur de pH. Notez qu’avant de prennent des images en direct, synaptosomes indépendants sont emportées après 40 min d’incubation. (B) représentation graphiques montrant la cinétique de dégradation et d’une durée d’astrocytes et les cellules microgliales. ACM, qui contient des facteurs astrocyte-sécrétée, améliore considérablement les deux absorption de synaptosomes à médiation astrocyte et la microglie. Astrocyte : Contrôle vs Astrocyte avec ACM 1 X, ***, Tukey du test de comparaisons multiples. La microglie : Contrôle vs microglie avec ACM 1 X, ***, Tukey du test de comparaison multiple. Barres d’erreur indiquent S.E.M. *p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,0001, ANOVA double sens. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
La figure 7. Une diminution des capacités phagocytaires des astrocytes de souris KO Megf10 avec 1 X ACM comparée à celle des astrocytes de souris WT avec 1 X ACM. WT vs Megf10 KO astrocytes avec 1 X ACM, ***, ANOVA double sens. Barres d’erreur indiquent S.E.M. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 ANOVA bidirectionnelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : recettes Solution. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 1. Une vidéo d’imagerie live représentative, montrant la phagocytose du pH synaptosomes indicateur conjugué par les astrocytes. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 2. Une vidéo de vivre-imagerie représentative montrant phagocytose du pH synaptosomes indicateur conjugué par les cellules microgliales. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Dans cet article, nous présentons des méthodes pour une longue durée d’imagerie live in vitro phagocytose analyse en utilisant des cellules gliales purifiées et synaptosomes conjugué indicateur de pH. Nous montrons que par rapport à la microglie, astrocytes possèdent la capacité de dégradation et d’une durée différente lors de la phagocytose des synaptosomes. En outre, nos résultats suggèrent que les facteurs astrocyte-sécrétée, qui contiennent des molécules ponts comme GAS6, des protéines et MEGE8, sont essentiels pour efficace PS-dépendante la phagocytose des cellules gliales dans le cerveau. En outre, les astrocytes KO Megf10 montrent phagocytose défectueuse des synaptosomes.

Pour réaliser cette expérience, les médias et le SPD doivent être soigneusement échangés pendant les étapes de lavage (Section 5). Primaire cultivé des astrocytes et les cellules microgliales, surtout la microglie, sont vulnérable à l’exposition à l’air. Par conséquent, réduire les intervalles entre les étapes de lavage est essentiel pour le maintien des cellules vivantes. Pour mettre en place à long terme de vivre-imagerie avec des instruments d’imagerie live, mise au point manuelle est recommandée car mise au point automatique peut augmenter le temps d’exposition laser/LED, qui peuvent endommager les cellules.

Dans cette méthode, les synaptosomes purification protocole19 est légèrement modifié. L’article original sépare les solutions dégradées en 3 %, 10 %, 15 % et 23 %. Cependant, nous avons créé solutions gradients de 3 %, 10 % et 23 % pour accroître le rendement des synaptosomes purifiées. Les instructions pour immunopanning les astrocytes et les cellules microgliales sont également modifiées dans cette méthode. L’original panoramique protocole21 vise à purifier seulement astrocytes et utiliser BSL-1 secondaire uniquement, CD45, O4 et Itgb5 (HepaCAM pour souris) que l’ordre d’immunopanning. Puisque les plaques BSL-1 et de secondaire uniquement enlèvera les cellules endothéliales ainsi que la microglie, nous avons changé l’ordre à CD45, secondaire uniquement, BSL-1, O4 et Itgb5 (HepaCAM pour la souris) pour augmenter le rendement des microglies de la CD45 panoramique plat. Dans ce protocole, nous aussi perfusé les ratons SD (~ P7-P10) avec SPD grâce au système circulatoire pour éliminer les cellules de sang diverses pour minimiser la contamination des populations non-microgliales CD45 séropositifs.

Il y a plusieurs avantages du test in vitro la phagocytose. L’indicateur de pH utilisé en conjugaison synaptosomes émet seulement une fluorescence rouge dans des conditions de pH faible. Par conséquent, lors du traitement des données, nous pouvons quantifier directement une fluorescence rouge comme un signal d’événements phagocytaires sans une procédure de désactivation pour éliminer les signaux de fond ou une analyse d’imagerie complexe afin d’obtenir des signaux co localisés du matériau engloutie à l’intérieur de phagocytes. En outre, cette méthode permet un suivi en temps réel de phagocytose glial en prenant des images d’intensité indicateur pH au sein d’un ROI donné à plusieurs points dans le temps. En générant un graphe avec intensité indicateur pH jusqu'à 100 h, l’immersion ainsi que la dégradation des capacités peuvent être facilement contrôlées entre les conditions et les différentes cellules. Un autre avantage est l’utilisation de synaptosomes. Étant donné que les astrocytes sheathe synapses traite tout le temps avec leur amende et ont été montré d’engloutir des synapses en vivo4, à l’aide de synaptosomes est très approprié pour mesurer la capacité phagocytaire in vitro des astrocytes. Enfin, cet essai in vitro phagocytose avec a le potentiel pour être développé pour étudier la phagocytose gliale de myéline débris ou amyloïde bêta, ce qui est lié à divers troubles neurologiques.

Espérance de vie accrue, une augmentation spectaculaire du nombre des personnes souffrant de maladies neurodégénératives est inévitable. Perte de la synapse par le biais de cellules gliales est l’un des principaux facteurs dans plusieurs neurodegenerative diseases13,14. En outre, élagage de synapse anormale et un déséquilibre de l’homéostasie du cerveau peuvent être associés avec des défauts de phagocytose gliales. Par conséquent, identifier les facteurs et les composés qui peuvent contrôler les capacités d’une durée et dégradation des astrocytes pourrait être critique pour la recherche de traitements efficaces pour divers troubles neurologiques. Étant donné que cet essai in vitro phagocytose avec peut être facilement transposé avec plaques multipuits, cette méthode peut servir comme une plate-forme appropriée pour les divers examens préalables pour identifier ces facteurs.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Jung Joo-Yeon pour sa prise en charge expérimentale au cours de la purification de synaptosomes et Jungjoo Park pour les images de synaptosomes bénéficiant d’une orientation du PS. En outre, nous remercions tous les membres en laboratoire de Chung pour discussion utile. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale de la recherche de subvention de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIP) (FRO-2016M3C7A1905391 et 2016R1C1B3006969-NRF) (W.-S. C).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synaptosome purification
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 BIO-RAD 5000202
pH indicator conjugation
Dimethyl sulfoxide(DMSO) LPS solution DMSO100
pHrodo red, succinimidyl ester Molecula probes P36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) Sigma E7510
Bovine serum albumin Bovogen BSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase) Worthington Is002007
(DMEM) Gibco 11960-044
(dPBS) Welgene LB001-02
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) Vector Labs L-1100
Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) Jackson ImmunoResearch 115-005-044
Goat anti-mouse IgM (μ-chain) Jackson ImmunoResearch 115-005-020
Heparin-binding epidermal growth factor Sigma E4643
Human HepaCAM antibody R&D systems MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) eBioscience 14-0497-82
L-cysteine Sigma C7880
L-glutamate Gibco 25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC) Sigma A8199
Neurobasal media Gibco 21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) Bansal et al.23
Papain Worthington Is003126
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Pluristrainer 20 μm PluriSelect 43-50020-03
Poly-D-lysine Sigma P6407
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Purified rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen 550539
Purified mouse anti-rat CD45 BD Pharmingen 554875
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sodium selenite Sigma S5261
Transferrin Sigma T1147
Trypsin Sigma T9935
Trypsin inhibitor Worthington LS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) Beckman Coulter 344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) PALL MAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) PALL MAP030C37
Phagocytosis live imaging assay
Juli stage NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurosciences numéro 132 Astrocyte microglie synaptosomes indicateur de pH phagocytose d’une durée dégradation vivre-imagerie
Un pH de Novel <em>In Vitro</em> Live-imagerie phagocytose médiée par dosage de l’Astrocyte utilisant Synaptosomes indicateur conjugué
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Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).

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