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Neuroscience

एक उपन्यास इन विट्रो लाइव-इमेजिंग Astrocyte की परख-मध्यस्थता Phagocytosis का उपयोग पीएच संकेतक-संयुग्मित Synaptosomes

doi: 10.3791/56647 Published: February 5, 2018

Summary

इस प्रोटोकॉल एक इन विट्रो लाइव इमेजिंग phagocytosis परख के लिए astrocytes की phagocytic क्षमता को मापने प्रस्तुत करता है । शुद्ध चूहा astrocytes और microglia पीएच संकेतक के साथ प्रयोग किया जाता है-संयुग्मित synaptosomes । इस विधि वास्तविक समय समाई और क्षरण कैनेटीक्स का पता लगाने और astrocyte phagocytosis संग्राहक कारकों की पहचान करने के लिए एक उपयुक्त स्क्रीनिंग मंच प्रदान करता है कर सकते हैं ।

Abstract

Astrocytes मस्तिष्क में प्रमुख कोशिका प्रकार के होते हैं और सीधे synapses और रक्त वाहिकाओं से संपर्क करते हैं । यद्यपि microglial कोशिकाओं प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर विचार किया गया है और केवल मस्तिष्क में फ़ैगोसाइट, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि astrocytes भी विभिन्न phagocytic प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं, जैसे विकासात्मक synapse उन्मूलन और की मंजूरी अल्जाइमर रोग (AD) में amyloid बीटा पट्टिकाएं । इन निष्कर्षों के बावजूद, astrocyte समाई और उनके लक्ष्य की गिरावट की क्षमता microglia के साथ तुलना में स्पष्ट नहीं है । जानकारी का यह अभाव अधिकांशतः एक परख प्रणाली की कमी के कारण होता है जिसमें astrocyte-और microglia-मध्यस्थता phagocytosis की कैनेटीक्स आसानी से तुलनीय होती हैं. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए हमने एक दीर्घकालिक लाइव-इमेजिंग इन विट्रो phagocytosis परख में विकसित किया है जो शुद्ध astrocytes और microglia की phagocytic क्षमता का मूल्यांकन करते हैं । इस परख में, समाई और क्षरण का वास्तविक समय का पता लगाने के पीएच संकेतक का उपयोग संभव है-संयुग्मित synaptosomes, जो अम्लीय organelles में चमकदार लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन, ऐसे lysosomes के रूप में । हमारे उपंयास परख लाइव इमेजिंग के माध्यम से phagocytosis का सरल और प्रभावी पता लगाने प्रदान करता है । इसके अलावा, इस इन विट्रो phagocytosis परख एक स्क्रीनिंग के लिए रसायनों और यौगिकों कि बढ़ाने या astrocytes की phagocytic क्षमता को बाधित कर सकते है की पहचान मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में synaptic छंटाई खराबी और रोगजनक प्रोटीन संचय के लिए मानसिक विकारों या neurodegenerative रोगों, रसायनों और यौगिकों कि glial कोशिकाओं की phagocytic क्षमता मिलाना विभिंन उपचार में सहायक होना चाहिए कारण दिखाया गया है मस्तिष्क संबंधी विकार ।

Introduction

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Glial कोशिकाओं है, जो मस्तिष्क में गैर उत्तेजित कोशिकाओं को देखें, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में प्रमुख कोशिका प्रकार हैं । पहले, glial कोशिकाओं को केवल समर्थन कोशिकाओं के रूप में माना जाता है कि मुख्य रूप से ंयूरॉंस अस्तित्व और बेसल synaptic गुणों को बनाए रखने में निष्क्रिय भूमिकाओं खेलते हैं । हालांकि, उभरते सबूत से पता चला है कि glial कोशिकाओं तंत्रिका के विभिन्न पहलुओं में अधिक सक्रिय भूमिका निभाते हैं, मस्तिष्क homeostasis बनाए रखने के रूप में, मध्यस्थता synapse गठन1,2,3 और synapse उंमूलन4,5, और मॉडुलन synaptic प्लास्टिक6,7। सीएनएस में Glial कोशिकाओं में astrocytes, microglia और oligodendrocytes शामिल हैं । इन कोशिकाओं के अलावा, astrocytes और microglia synapses4,5, अपोप्तोटिक कोशिकाओं8, तंत्रिका मलबे9, और रोगजनक प्रोटीन, amyloid बीटा के रूप में छा द्वारा phagocytic भूमिकाओं खेलने के लिए दिखाया गया है सजीले टुकड़े10,11। विकासशील मस्तिष्क में, astrocytes MERTK के माध्यम से पृष्ठीय पार्श्व geniculate नाभिक (dLGN) में synapses को खत्म करने-और MEGF10-निर्भर phagocytosis4। इसी प्रकार, microglia भी C1q-लेपित synapses को खत्म करने के माध्यम से विकासात्मक चरणों के माध्यम से शास्त्रीय झरना5पूरक । दिलचस्प है, यह सुझाव दिया गया है कि synapse छंटाई में दोष कई स्नायविक विकारों के सर्जक में से एक हो सकता है । उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि घटक 4 (C4), जो पूरक-microglia द्वारा छंटाई synapse बढ़ जाती है पूरक में उत्परिवर्तनों, दृढ़ता से12मनुष्यों में एक प्रकार का पागलपन की व्यापकता के साथ जुड़े रहे हैं । हाल के एक पत्र में यह भी पता चला है कि शास्त्रीय पूरक मार्ग विज्ञापन के दीक्षा चरणों में hyperactivated है और इस रोग में जल्दी synapse नुकसान लाती है13.

microglia-मध्यस्थता phagocytosis के साथ तुलना में, चाहे astrocyte मध्यस्थता phagocytosis दीक्षा और विभिन्न स्नायविक विकारों की प्रगति के लिए योगदान कम स्पष्ट है. हालांकि, हाल के एक पत्र में पता चलता है कि कारकों है कि सामांय synapse astrocytes द्वारा छंटाई की दर में परिवर्तन मस्तिष्क homeostasis बाधित हो सकता है और विज्ञापन संवेदनशीलता और विकृति विज्ञान के लिए योगदान14। astrocytes द्वारा synapse छंटाई की दर शक्तिशाली ApoE isomers द्वारा नियंत्रित किया जाता है, विज्ञापन (एलील) के लिए एक सुरक्षात्मक ApoE2 के साथ दृढ़ता से दर बढ़ाने और विज्ञापन के लिए एक जोखिम एलील (ApoE4) काफी कम दर । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों पर नियंत्रण या ApoE2 चूहों14से ज्यादा synaptic C1q जमा ApoE4 व्यक्त । इन आंकड़ों का सुझाव है कि बिगड़ा astrocyte मध्यस्थता phagocytosis प्रारंभिक विज्ञापन मस्तिष्क में होनेवाला C1q-लेपित synapses के संचय के लिए प्रेरित हो सकता है/synaptic मलबे कि पूरक मध्यस्थता microglial phagocytosis, ड्राइविंग synaptic अध: पतन . ApoE4 वाहकों में astrocytes की बिगड़ी phagocytic क्षमता भी विज्ञापन-प्रभावित दिमाग में amyloid बीटा पट्टिकाओं के अनियंत्रित संचय में योगदान दे सकती है.

इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि Drosophila मस्तिष्क में glial कोशिकाएं ड्रेपर के कम अनुवाद के कारण अपनी phagocytic क्षमता खो देती हैं, एक homolog का Megf10 जो astrocytes phagocytosing के लिए उपयोग synapses है. ड्रेपर स्तर बहाल glial कोशिकाओं है, जो कुशलतापूर्वक युवा मस्तिष्क में है कि के रूप में एक ही हद तक वृद्ध मस्तिष्क में क्षतिग्रस्त axonal मलबे को मंजूरी दी की phagocytic क्षमता बचाया, यह दर्शाता है कि उंर बढ़ने प्रेरित phagocytic की क्षमता में परिवर्तन astrocytes मस्तिष्क के विघटन में योगदान दे सकता है homeostasis15.

इन नए निष्कर्षों के आधार पर, astrocytes की phagocytic क्षमता नियमन एक आकर्षक उपचारात्मक रणनीति को रोकने और विभिंन स्नायविक विकारों के इलाज हो सकता है । इस संबंध में, astrocytes की phagocytic क्षमता को बढ़ाने के लिए कई प्रयास किए गए हैं, उदाहरण के लिए, अम्लीय नैनोकणों के साथ lysosomes के अंलीकरण उत्प्रेरण द्वारा16 और प्रतिलेखनी कारक EB (TFEB), जो एंहांस कर सकते हैं lysosome उत्पत्ति17. इन प्रयासों के बावजूद, यह अभी भी अस्पष्ट है कि कैसे astrocytes और microglial कोशिकाओं को अपने phagocytic कैनेटीक्स में अलग है और क्या हम वृद्धि या विभिंन रोगों में अपनी phagocytic क्षमता में कमी करनी चाहिए ।

इस पत्र में, हम वास्तविक समय में astrocytes की phagocytic क्षमता का पता लगाने के लिए इन विट्रो परख में एक उपंयास प्रस्तुत करते हैं । डेटा astrocytes और microglia में समाई और गिरावट के विभिंन कैनेटीक्स दिखाते हैं । Astrocyte-वातानुकूलित मध्यम (ACM), जो astrocytes से स्रावित कारक होते हैं, दोनों astrocytes और microglia के प्रभावी phagocytosis के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, Megf10, astrocytes में एक phagocytic रिसेप्टर और सीईडी-1 और ड्रेपरके एक homolog, astrocyte-मध्यस्थता phagocytosis8,18में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।

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Protocol

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यहां वर्णित सभी विधियों को कोरिया एडवांस्ड इंस्टिट्यूट ऑफ साइंस एण्ड टेक्नोलॉजी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एण्ड फीमेल कमेटी (IACUC), KA2016-08 द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. Synaptosome शुद्धिकरण

नोट: इन प्रक्रियाओं को शुद्ध synaptosomes (चित्रा 1) की उपज में सुधार करने के लिए कई संशोधनों के साथ एक पहले से प्रकाशित पेपर19 से अनुकूलित कर रहे हैं ।

  1. सतत घनत्व ढाल मीडिया तैयार करते हैं ।
    1. बर्फ पर निंनलिखित प्लेस: 3%, 10%, और ढाल बफर में 23% घनत्व ढाल समाधान (सुक्रोज के १०९.५४ जी, Tris के ६०६ मिलीग्राम के साथ पानी की २५० मिलीलीटर लाने के लिए, और ०.२ एम EDTA के 5 मिलीलीटर, पीएच ७.४); अनुमन्य बफर (4x ढाल बफर के 25 मिलीलीटर और ५० मिमी डीटीटी के ५०० µ एल पानी की ७४.५ मिलीलीटर में जोड़ें); homogenizer मोर्टार और मूसल ।
      नोट: घनत्व ढाल समाधान और तैयारी तालिका 1में प्रस्तुत कर रहे हैं । 3%, 10%, और 23% घनत्व ढाल समाधान तैयार करने के लिए, कच्चे घनत्व ढाल समाधान का उपयोग करें ।
    2. तीन वयस्क चूहों प्रति छह अल्ट्रा स्पष्ट केंद्रापसारक ट्यूबों तैयार करते हैं ।
    3. एक 1 एमएल पिपेट के साथ प्रत्येक केंद्रापसारक ट्यूब के तल पर 23% घनत्व ढाल समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें । फिर, धीरे से एक चराई पिपेट और 1 एमएल पिपेट के साथ 23% घनत्व ढाल समाधान के शीर्ष पर 10% घनत्व ढाल समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ एक परत बना । अंत में, शीर्ष पर 3% घनत्व ढाल समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें । इस चरण में, बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए सावधानी का उपयोग करें ।
    4. कवर प्लास्टिक लपेटो के साथ केंद्रापसारक ट्यूबों और बर्फ पर ट्यूबों रखो ।
  2. शांत एक उच्च गति केंद्रापसारक और ultracentrifuge के लिए 4 डिग्री सेल्सियस ।
  3. ७०% इथेनॉल के साथ सर्जिकल उपकरण (ऑपरेटिंग कैंची, Castroviejo स्प्रिंग कैंची, और घुमावदार संदंश) निष्फल । बर्फ पर अनुमन्य बफर के 25 मिलीलीटर के साथ एक छोटा गिलास चोंच तैयार करें और चोंच को तौल लें ।
  4. तीन वयस्क (लगभग 12 सप्ताह पुराने) पुरुष चूहों से दिमाग निकालें ।
    1. गर्भाशय ग्रीवा ग्रीवा का पता लगाने और संचालन कैंची के साथ गर्दन काट । midline के साथ सिर और खोपड़ी की त्वचा को छीलकर ऑपरेटिंग कैंची और घुमावदार संदंश का प्रयोग करें । एक्साइज ने घ्राण बल्ब्स और सेरिबैलम को Castroviejo स्प्रिंग कैंची से भरा ।
  5. बचे हुए दिमाग को घुमावदार संदंश के साथ यूरिन में डालिये और दिमाग को तौलना. दिमाग की सतह पर खून निकालने के लिए कई बार आइस-कोल्ड अनुमन्य बफर से कुल्ला करें ।
    नोट: पहले, 1 ग्राम के मस्तिष्क के ऊतकों को अनुमन्य बफर की 9 मिलीलीटर की सिफारिश की गई थी ।
  6. homogenizer मोर्टार के लिए अनुमन्य बफर और 1 ग्राम के मस्तिष्क के ऊतकों में 4 मिलीलीटर डालें । जबकि दिमाग को अनुमन्य, 8 मिलीलीटर तक अनुमन्य बफर जोड़ें ।
  7. २ ५०-एमएल उच्च गति केंद्रापसारक ट्यूबों में homogenate विभाजित । ताजा अनुमन्य बफर के 1 मिलीलीटर के साथ मोर्टार धो और ट्यूबों को जोड़ने ।
    चेतावनी: के रूप में जल्दी संभव के रूप में 1.3-1.7 कदम के माध्यम से आगे बढ़ें । 20 मिनट से कम की सिफारिश की है ।
  8. उच्च गति केंद्रापसारक ट्यूबों में homogenates १,००० x जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस धीमी ब्रेक के साथ में केंद्रापसारक ।
    नोट: मंदी की अधिकतम दर नौ है जब मंदी दर (ब्रेक) दो या तीन पर सेट करें ।
  9. ध्यान से एक नया ५०-एमएल ट्यूब करने के लिए supernatant जोड़ने और अनुमन्य बफर के 12 मिलीलीटर को जोड़ने ।
  10. ध्यान से और धीरे पिपेट एक 1 एमएल पिपेट के साथ 3% घनत्व ढाल समाधान पर पतला supernatant के 2 मिलीलीटर और बर्फ पर ट्यूबों जगह है ।
  11. कोई ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३१,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    नोट: एक (शूंय) या तट पर मंदी दर निर्धारित करें ।
  12. बर्फ पर ट्यूबों प्लेस और 23% घनत्व ढाल समाधान और 10% एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में एक 2 मिलीलीटर पिपेट के साथ घनत्व ढाल समाधान के बीच synaptosome अंश इकट्ठा । बर्फ जोड़ें-शीत सुक्रोज/EDTA ८० मिलीलीटर तक बफर और यह ४ ५० मिलीलीटर उच्च गति केंद्रापसारक ट्यूबों में विभाजित ।
    नोट: लेबल किए गए ग्रेडिएंट्स के साथ fractionated synaptosomes के लिए आरेख 3 देखें ।
  13. कम टूटता के साथ 4 ˚ सी में 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    नोट: मंदी की अधिकतम दर नौ है जब दो या तीन पर मंदी दर सेट करें ।
  14. 1-एमएल पिपेट के साथ supernatant को सावधानीपूर्वक निकालें, isotonic शारीरिक बफर के 1 मिलीलीटर (१४० mm NaCl, 3 मिमी KCl, १.२ मिमी MgCl2, १.२ मिमी2पीओ4, 10 मिमी HEPES, और 10 मिमी ग्लूकोज, पीएच ७.४) के साथ synaptosome गोली reसस्पेंड20। isotonic शारीरिक बफर में 10% DMSO की 1 मिलीलीटर जोड़ें (DMSO की अंतिम एकाग्रता: 5%) और १ ५०-एमएल उच्च गति केंद्रापसारक ट्यूब में synaptosomes इकट्ठा ।
  15. Aliquot 1 मिलीलीटर में १.५-एमएल ट्यूबों । ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर synaptosomes के प्रोटीन एकाग्रता उपाय ।
  16. जल्दी ट्यूबों फ्रीज और एक में ट्यूबों की दुकान-८० ° c डीप फ्रीजर जब तक पीएच संकेतक विकार ।

2. पीएच संकेतक विकार

  1. १.५-4 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 मिनट के लिए २१,०९२ x g पर synaptosomes के साथ मिलीलीटर ट्यूबों ।
  2. supernatant निकालें, जोड़ें २०० µ एल के ०.१ एम ना2CO3 और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
    नोट: ना2CO3 succinimidyl एस्टर के रूप में पीएच बढ़ाने के लिए जोड़ा गया था सबसे कुशलता से एक थोड़ा alkaline पीएच में प्राथमिक अमीन के साथ प्रतिक्रिया करता है ।
  3. ट्यूब और धीरे भंवर के लिए पीएच संकेतक के 2 µ एल जोड़ें ।
    चेतावनी: ०.३ मिलीग्राम synaptosome समाधान के प्रति पीएच संकेतक के 1 µ l का उपयोग करें ।
  4. एल्यूमीनियम पंनी के साथ ट्यूबों को कवर करके प्रकाश जोखिम को कम करने और उंहें 30-40 rpm पर कोमल आंदोलन के साथ एक मोड़ शेखर में कमरे के तापमान (आरटी) में 1-2 घंटे के लिए गर्मी ।
  5. आंदोलन बंद करो और DPBS के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. 1-2 मिनट के लिए २१,०९२ x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
  7. supernatant निकालें और कोमल pipetting द्वारा गोली reसस्पेंड करने के लिए DPBS के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. दोहराव पीएच संकेतक को दूर करने के लिए न्यूनतम सात बार कदम 2.6-2.7 दोहराएँ ।
  9. supernatant निकालें और 5% DMSO के साथ DPBS के २०० µ एल के साथ गोली reसस्पेंड ।
    नोट: इस बिंदु पर, सभी synaptosomes गैर-कार्यशील हैं । हम पुष्टि की है कि phosphatidylserine (पी एस) synaptosomes, जो एक "खाने के रूप में कार्य करता है की बाहरी झिल्ली को उजागर किया गया है मुझे" संकेत (चित्रा 4) ।

3. Astrocytes और Microglia शुद्धि

नोट: astrocyte शुद्धिकरण के लिए यह प्रोटोकॉल एक पहले से प्रकाशित पेपर21से अनुकूलित है । इस प्रोटोकॉल में चूहे astrocytes और microglia की शुद्धि का वर्णन किया गया है । माउस को शुद्ध करने के लिए विशिष्ट प्रक्रियाओं astrocytes और microglia भी नोटों में वर्णित हैं ।

  1. दिन पहले शुद्धिकरण
    1. पूर्व लेपित सेल संस्कृति व्यंजन और समाधान तैयार करते हैं ।
    2. ५० एमएम Tris-एचसीएल (पीएच ९.५) के 25 एमएल के साथ ५ १४५ एमएम x 20 एमएम पेट्री डिश तैयार करें । पेट्री व्यंजन में प्राथमिक या द्वितीयक एंटीबॉडी उपचार रखें, जैसा कि नीचे बताया गया है । रात भर फ्रीजर में पकवानों की मशीन ।
      बीएसएल-1 डिश: 20 µ एल के 5 मिलीग्राम/एमएल बीएसएल-1 (Griffonia simplicifolia लेक्टिन)
      माध्यमिक केवल पकवान: ६० µ एल के २.४ मिलीग्राम/एमएल बकरी विरोधी माउस आईजीजी + आईजीएम (एच + एल)
      CD45 पकवान: ६० µ एल के २.४ मिलीग्राम/एमएल बकरी विरोधी माउस आईजीजी + आईजीएम (एच + एल)
      O4 पकवान: ६० µ एल के २.४ मिलीग्राम/एमएल बकरी विरोधी माउस आईजीएम (µ-श्रृंखला विशिष्ट)
      Itgb5 (Integrin β5) चूहा astrocytes के लिए पकवान: ६० µ एल के २.४ मिलीग्राम/एमएल बकरी विरोधी माउस आईजीजी + आईजीएम (एच + एल)
      नोट: पेट्री डिश की hydrophobic सतह के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी अनुलग्न करने के लिए, कम तापमान पर धीमी अनुलग्नक अनुशंसित है । हालांकि, यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पेट्री डिश कोट करने के लिए संभव है । astrocyte panning के लिए एंटीबॉडी अलग जानवर प्रजातियों के आधार पर इस्तेमाल किया जाता है; उदाहरण के लिए, माउस astrocytes के लिए HepaCAM डिश: ६० µ एल के २.४ मिलीग्राम/एमएल बकरी विरोधी माउस आईजीजी + आईजीएम (एच + एल)
  2. शुद्धि के दिन
    1. immunopanning के लिए तैयार है ।
    2. तैयार ५०-मिलीलीटर ट्यूबों और ट्यूबों के लिए शेयर जोड़ें । विस्तृत स्टॉक समाधान तैयारी तालिका 1में प्रस्तुत की गई है ।
      1. तैयार ट्यूब 1 (एंजाइम): एंजाइम स्टॉक की 22 मिलीलीटर (एंजाइम स्टॉक: 1x अर्ल है संतुलित नमक समाधान (EBSS) + 0.46% D (+)-ग्लूकोज + 26 मिमी NaHCO3 और०.५ mm EDTA) ।
      2. तैयार ट्यूब 2 (कम Ovo): ४२ अवरोधक स्टॉक (अवरोध करनेवाला स्टॉक: 1x EBSS + 0.46% D (+)-ग्लूकोज + 26 मिमी NaHCO3) की मिलीलीटर.
      3. ट्यूब 3 तैयार (उच्च Ovo): अवरोधक शेयर के 10 मिलीलीटर ।
    3. एक सह2 (९५% हे2 और 5% co2) टैंक से कनेक्टेड 2-एमएल पिपेट के सुझावों के लिए ०.२२-µm सिरिंज फ़िल्टर अनुलग्न करें । बुलबुला सह2 में ट्यूब 1-3. बंद bubbling जब समाधान नारंगी बारी है ।
    4. समाधानों को पूरा करें ।
      चेतावनी: पूर्ण और ट्यूब में समाधान की मशीन 1 ३४ ° c पर 15 मिनट के लिए एंजाइम सक्रियण के लिए उपयोग करने से पहले ।
      1. तैयार ट्यूब 1 (एंजाइम): एंजाइम स्टॉक के 22 मिलीलीटर + १८० U of papain + ०.००४ g L-cysteine.
      2. तैयार ट्यूब 2 (कम Ovo): अवरोधक स्टॉक के ४२ मिलीलीटर + कम Ovo के 3 मिलीलीटर + २०० µ DNase के एल ।
      3. ट्यूब 3 तैयार (उच्च Ovo): अवरोधक स्टॉक के 10 मिलीलीटर + उच्च Ovo के 2 मिलीलीटर + DNase के 20 µ एल ।
      4. ट्यूब 4 तैयार (०.२% BSA): 19 एमएल के 1x DPBS + 1 मिलीलीटर की 4% BSA + 8 µ l की DNase ।
      5. तैयार ट्यूब 5 (०.०२% BSA): ४५ एमएल के 1x DPBS + 5 एमएल के ट्यूब 4 + ५० µ l की DNase ।
    5. ३४ ° c पर एक जल स्नान और गर्मी ब्लॉक कचौरी ।
  3. चूहा प्रांतस्था निकालें ।
    1. ७०% इथेनॉल के साथ सर्जिकल उपकरण निष्फल और DPBS के साथ १०० मिमी पेट्री व्यंजन तैयार करते हैं ।
    2. एक एक्रिलिक बॉक्स तैयार करें । बॉक्स के नीचे ऊतक के दो से तीन परतों रखो और बॉक्स में isoflurane के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. बॉक्स में 20-40 एस के लिए Anesthetize पिल्ले और संदंश के साथ पैर चुटकी द्वारा anesthetization की पुष्टि करें । दिल22 और perfuse एक 10 मिलीलीटर DPBS के साथ सिरिंज का उपयोग कर पिल्ले बेनकाब ।
      नोट: छिड़काव microglia panning कदम के दौरान रक्त कोशिका संदूषण से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    4. है पिल्ला ऑपरेटिंग कैंची के साथ गर्दन के ऊपरी ग्रीवा लाइन में कटौती और midline साथ सिर त्वचा काटकर । midline के साथ खोपड़ी पर एक चीरा बनाओ और घुमावदार संदंश के साथ खोपड़ी खोलें ।
    5. Castroviejo स्प्रिंग कैंची के साथ सेरिबैलम आबकारी । शेष मस्तिष्क बाहर ले जाओ और यह एक १०० मिमी पेट्री DPBS से भरा पकवान में जगह है ।
    6. midbrain के रूप में अंय क्षेत्रों को हटा दें और माइक्रोस्कोप के तहत Castroviejo स्प्रिंग कैंची के साथ प्रांतस्था से हिप्पोकैंपस । मेनिन्जेस को महीन संदंश से निकाल दें ।
    7. प्रांतस्था को एक नए ६०-mm डिश में ट्रांसफर करें और डिश में बचे हुए DPBS को हटा दें । एक नंबर 10 ब्लेड के साथ ऊतक काटना ।
  4. अलग एकल कक्ष निलंबन में प्रांतस्था
    1. एक ६० मिमी पकवान में फ़िल्टर्ड ट्यूब 1 समाधान डालो और DNase1 के ५० µ एल जोड़ें । डिश में हल घूमता है ।
      नोट: DNase टूटना कोशिकाओं से डीएनए के एकत्रीकरण को बाधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    2. एक ३४ डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में पकवान प्लेस और यह एक ढक्कन है कि बीच में एक छेद है के साथ कवर । ६०-mm पेट्री डिश के ढक्कन में छेद करने के लिए एक टांका लोहे का प्रयोग करें ।
    3. एक सह2 टैंक ट्यूब के लिए 22-µm सिरिंज फिल्टर कनेक्ट और छेद में फिल्टर टिप जगह है ।
    4. ४५ मिनट के लिए ३४ ° c पर पकवान गर्मी । पकवान में हल भंवर हर 10 से 15 मिनट ।
  5. panning व्यंजन की तैयारी समाप्त करें ।
    1. समय से आगे एक दिन फ्रीजर से माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेपित किया गया है कि panning व्यंजन निकालें. आरटी में बीएसएल-1 पकवान और माध्यमिक एंटीबॉडी-केवल पकवान छोड़ दो ।
    2. दूसरे व्यंजन को तीन बार DPBS के 20 मिलीलीटर के साथ धो लें ।
    3. बर्तन में ०.०२% BSA की एक पर्याप्त राशि डालो । इसी व्यंजन में विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी रखें:
      CD45 डिश: 12 मिलीलीटर की ०.०२% BSA + 20 µ एल के ०.५ मिलीग्राम/एमएल चूहा विरोधी माउस CD45
      Itgb5 डिश: 12 मिलीलीटर की ०.०२% BSA + 20 µ एल के ०.५ मिलीग्राम/एमएल Itgb5
      O4 डिश: ०.०२% BSA के 8 मिलीलीटर और O4 एंटीबॉडी के 4 मिलीलीटर
      नोट: माउस immunopanning के लिए, उपयोग माउस एंटी-रैट CD45 (०.५ मिलीग्राम/एमएल) के लिए microglia और HepaCAM (०.५ मिलीग्राम/एमएल) astrocytes के लिए ।
    4. neurobasal मीडिया और 1x EBSS के 10 मिलीलीटर के साथ 30% FBS के 30 मिलीलीटर तैयार करें । एक ३४ ° c पानी स्नान में दोनों समाधान गर्म ।
  6. papain प्रतिक्रिया को बाधित ।
    1. papain-उपचारित ऊतकों को एक नई ५०-एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें । ऊतकों बसने के लिए रुको । सक्शन द्वारा तरल महाप्राण ।
    2. ट्यूब को कम Ovo समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को धोने के लिए हल भंवर ।
    3. दोहराएं कदम 3.6.1-3.6.2 तीन बार एंजाइम प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ।
  7. प्रांतस्था ऊतकों को Triturate ।
    1. टब के लिए कम Ovo के 6 मिलीलीटर जोड़ें । महाप्राण और ऊतकों जल्दी से एक 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ जारी ।
      चेतावनी: बुलबुले परिचय नहीं है ।
    2. एक नया ५०-एमएल ट्यूब तैयार है और कम Ovo के 5 मिलीलीटर जोड़ें । एक नई ट्यूब में एक कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    3. दोहराएं चरण 3.6.1-3.6.2 दो बार और 5-एमएल पिपेट 1-एमएल पिपेट के लिए बदल जाते हैं ।
    4. दोहराएं trituration जब तक ऊतकों के ९५ से अधिक% दिखाई नहीं दे रहे हैं ।
    5. कम Ovo युक्त असंबद्ध कोशिकाओं के नीचे 10 मिलीलीटर पिपेट के साथ ट्यूब 3 से उच्च Ovo समाधान की एक परत बनाओ ।
    6. कुछ ब्रेक के साथ 6 मिनट के लिए १९० x g पर केंद्रापसारक ।
      नोट: मंदी की अधिकतम दर नौ है जब एक या दो पर मंदी दर सेट करें ।
  8. एकल कोशिकाओं को छानने का ।
    1. ध्यान से सक्शन द्वारा supernatant महाप्राण, तो एक 1 एमएल पिपेट के साथ ०.०२% BSA समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ गोली reसस्पेंड ।
    2. 9 मिलीलीटर के लिए ०.०२% BSA समाधान जोड़ें ।
    3. एक नया ५०-एमएल ट्यूब और 20-µm सेल छलनी ट्यूब के शीर्ष पर तैयार करें । गीला ०.०२% BSA समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ सेल छलनी ।
    4. सेल छलनी में एकल सेल निलंबन स्थानांतरण । एक बार में 1 मिलीलीटर फ़िल्टर करें ।
    5. ०.०२% BSA समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ सेल छलनी धो लें । फ़िल्टर्ड एकल कक्ष के 15 मिलीलीटर से अधिक मत बनाओ निलंबन ।
    6. सेल वसूली के लिए 45-60 मिनट के लिए एक ३४ ° c जल स्नान में ट्यूब मशीन । कोशिका वसूली कदम झिल्ली के लिए कोशिका की सतह प्रोटीन के स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है ।
  9. कोशिकाओं की panning प्रदर्शन.
    1. DPBS के 20 मिलीलीटर के साथ तीन बार CD45 panning पकवान धो लें । हर डिश को तीन बार DPBS के 20 मिलीलीटर के साथ तुरंत इस्तेमाल करने से पहले धो लें ।
    2. CD45 panning पकवान में एक सेल निलंबन डालो । 28 मिनट के लिए पकवान छोड़ दो और 14 मिनट के लिए पकवान हिला । नीचे से अनबाउंड कोशिकाओं को हटाने के लिए, ध्यान से पकवान हिला ।
    3. सेल निलंबन माध्यमिक केवल डिश के लिए स्थानांतरण । 20 मिनट के लिए रुको और ध्यान से 10 मिनट के लिए पकवान शेक । CD45 डिश से microglia प्राप्त करने के लिए, कदम 3.9.2 पर जाएं ।
    4. बीएसएल-1 डिश में सेल सस्पेंशन स्थानांतरित । 10 से 12 मिनट के लिए पकवान छोड़ दें ।
    5. O4 डिश में स्थानांतरण । 20 मिनट के लिए रुको और 10 मिनट के लिए हिला ।
    6. Itgb5 डिश में स्थानांतरण । ४० मिनट के लिए पकवान छोड़ दो और धीरे से हिला हर 10 मिनट ।
      ध्यान दें: माउस panning के लिए, HepaCAM डिश में सेल निलंबन स्थानांतरण ।
  10. डिश से कोशिकाओं को अलग ।
    1. EBSS में trypsin (३०,००० यू/एमएल) के ४०० µ एल का मिश्रण 1x EBSS के 8 मिलीलीटर के साथ मिलाएं ।
    2. पकवान में एक बेकार बाल्टी में अलग सेल निलंबन डालो ।
    3. डिश को DPBS के साथ आठ बार धोएं ।
    4. पकवान में trypsin के साथ EBSS के 8 मिलीलीटर डालो ।
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में 5 से 10 मिनट के लिए पकवान की मशीन । CD45 पकवान और Itgb5 और HepaCAM व्यंजन के लिए 5 मिनट के लिए 10 मिनट के लिए मशीन ।
    6. पकवान नल और एक खुर्दबीन के नीचे पकवान का निरीक्षण ।
      नोट: यदि astrocytes के अधिकांश अलग नहीं किया है, पकवान एक और 5 मिनट के लिए मशीन में वापस डाल दिया ।
    7. trypsin बेअसर करने के लिए डिश में 30% FBS के 10 मिलीलीटर डालो ।
    8. astrocytes या microglia को अलग करने के लिए पूरी डिश में ऊपर और नीचे पिपेट ।
    9. एक ५०-एमएल ट्यूब में समाधान स्थानांतरण ।
    10. डिश में DNase के 30% FBS और २०० µ एल के 10 मिलीलीटर जोड़ें । कक्षों को फिर से अलग कर । DNase टूटना कोशिकाओं से डीएनए के एकत्रीकरण को बाधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    11. ट्यूब में समाधान स्थानांतरण । यदि कक्ष डिश में रहते हैं, 30% FBS के एक और 10 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से अलग ।
  11. कोशिकाओं को प्लेट ।
    1. 10 मिनट के लिए २१३ x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
    2. महाप्राण supernatant और मीडिया के साथ सेल गोली reसस्पेंड ।
      नोट: MBM के लिए immunopanned astrocyte-कंडीशन्ड मीडिया (ip-ACM) के साथ astrocytes और रेटिना microglia बेसिक मीडिया (microglia) के लिए immunopanned astrocyte बेसिक मीडिया (ip-एबीएम) का उपयोग करें । आईपी-एबीएम और MBM रचनाएं सामग्री की तालिकामें प्रस्तुत की गई हैं ।
    3. किसी hemocytometer के साथ कक्षों की गणना करना.
    4. प्लेट astrocytes और microglia अलग PDL-लेपित प्लेटों में ।
      नोट: उपयोग करने से पहले PDL-लेपित प्लेट तैयार करें । PDL-लेपित प्लेटें तैयार करने के लिए, जोड़ें ५० µ एल के 1 मिलीग्राम/एमएल पाली-डी-lysine आसुत पानी की 5 मिलीलीटर में और अच्छी तरह से थाली में समाधान की एक पर्याप्त राशि डालना/थाली धो लो आसुत जल के साथ तीन बार प्लेट/.. ।
    5. थाली मशीन । बदलें मीडिया के astrocytes के लिए हर 7 दिन और microglia के लिए 3 दिन ।

4. लीजिए आईपी-ACM

  1. एक १००-mm पकवान तैयार जब astrocytes पीढ़ी धाराप्रवाह हैं ।
  2. मीडिया को त्यागें और DPBS के 10 मिलीलीटर के साथ डिश को तीन बार धोएं ।
  3. पकवान में कम प्रोटीन मीडिया के 15 मिलीलीटर डालो ।
    नोट: कम प्रोटीन मीडिया संरचना सामग्री की तालिकामें प्रस्तुत किया जाता है ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में 7 से 10 दिनों के लिए पकवान मशीन ।
  5. लीजिए और 10k (या 30k) केंद्रापसारक फिल्टर ट्यूबों के साथ मीडिया ध्यान केंद्रित ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर ८५१ x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
    नोट: ट्यूबों के केंद्रापसारक जब तक शेष मीडिया से कम 1 मिलीलीटर है ।
  7. एक नया १.५-एमएल ट्यूब में केंद्रित मीडिया (आईपी-ACM) ले लीजिए ।
  8. मात्रात्मक विश्लेषण का उपयोग कर आईपी-ACM की एकाग्रता को मापने

5. Phagocytosis लाइव-इमेजिंग परख (चित्रा 2)

  1. 24-अच्छी तरह से थाली तैयार करें (या किसी भी थाली/डिश है कि लाइव इमेजिंग के लिए तैयार है) जिसमें astrocytes धाराप्रवाह है (आम तौर पर, 7 से 10 दिन की गर्मी के बाद शुद्धि कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए आदर्श है) ।
  2. प्रत्येक कुआं में मीडिया को निकालें और कुओं को DPBS की 1 मिलीलीटर, तीन बार धो लें । हवा के जोखिम को कम करने के लिए, कुओं को जल्दी धो लें ।
  3. आईपी-एबीएम के ३०० µ एल जोड़ें पीएच संकेतक के 5 µ एल के साथ-संयुग्मित synaptosomes और ऐसे आईपी के रूप में अतिरिक्त कारकों-ACM कि glial सेल phagocytosis मिलाना कर सकते हैं ।
  4. ४० मिनट के लिए एक सह2 मशीन में थाली मशीन । यह चरण पीएचई संकेतक-संयुग्मित synaptosomes को प्लेटों के नीचे तक बसाने की अनुमति देता है ।
  5. असीम पीएच संकेतक के साथ मीडिया निकालें-संयुग्मित synaptosomes और DPBS के 1 मिलीलीटर, तीन बार के साथ एक अच्छी तरह से धो लें ।
    सावधानी: कठोरता से न धोएं । हवा के जोखिम को कम करने के लिए, कुओं को जल्दी धो लें ।
  6. जोड़ें ५०० µ आईपी के एल-अतिरिक्त कारकों के साथ एबीएम के कुओं में परीक्षण ।
  7. एक लाइव-इमेजिंग साधन के लिए थाली ले लो और पदों का चयन करें । फोकस, एक्सपोजर टाइम, चमक, और एलईडी पावर समायोजित करें ।
    नोट: जोखिम समय, चमक, और एलईडी शक्ति के लिए सेटिंग्स प्रतिदीप्ति तीव्रता और प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर चर रहे हैं । live-पीएच संकेतक के साथ इमेजिंग परख-संयुग्मित synaptosomes में, हम आम तौर पर इस प्रकार के रूप में उन मूल्यों सेट: एक्सपोजर: ~ 150-200 ms, चमक: 15, और एलईडी शक्ति: 4-6 ।
  8. छवि प्रारूप, समय अंतराल, और लाइव इमेजिंग के लिए चक्र की कुल संख्या निर्धारित करें । कितने पदों पर चुना जाता है के आधार पर 1 या 2 एच के लिए समय अंतराल सेट करें । 2 घंटे के अंतराल की सिफारिश की है जब १५० से अधिक पदों के लिए लाइव इमेजिंग चुना जाता है ।
  9. लाइव-इमेजिंग प्रयोगों को प्रारंभ करें.
  10. डेटा का विश्लेषण करें ।
    1. फिजी प्रोग्राम खोलें ।
    2. कोई छवि अनुक्रम आयात करें । छवियों को 8-बिट ग्रेस्केल में कनवर्ट करें ।
    3. ५० पिक्सेल के एक रोलिंग बार त्रिज्या के साथ पृष्ठभूमि घटाव प्रदर्शन ।
    4. प्रारंभ समय श्रृंखला विश्लेषक V3 plugins ।
      नोट: समय श्रृंखला विश्लेषक V3 plugins के लिए पता सामग्री की तालिकामें प्रस्तुत किया जाता है ।
    5. रुचि के क्षेत्र (roi) को छवि में खींचें और ROI प्रबंधक में जोड़ें पर क्लिक करें.
    6. क्लिक करें "कुल तीव्रता प्राप्त" समय श्रृंखला V3_0 में ।
    7. परिणामों को सहेजें और डेटा को एकीकृत करें ।

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Representative Results

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इस में इन विट्रो phagocytosis परख लंबी अवधि के लाइव इमेजिंग के साथ, हम वयस्क माउस मस्तिष्क homogenates, जो 23% ढाल समाधान और 10% ultracentrifugation द्वारा ढाल समाधान के बीच ढाल समाधान में अलग थे synaptosomes से इस्तेमाल किया ( चित्र 3) । तैयारी के बाद, synaptosomes उनके बाहरी झिल्ली में पुनश्च उजागर (चित्रा 4), सुझाव है कि वे अपने कार्य खो दिया है और astrocytes और microglia में पुनश्च रिसेप्टर्स द्वारा पहचाना जा सकता है. के रूप में चित्रा 5में दिखाया गया है, पीएच संकेतक-संयुग्मित synaptosomes चमकीले लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जित जब वे astrocytes से घिरा हुआ था । glial कोशिकाओं की समाई और क्षरण की क्षमता की वास्तविक समय तुलना एक रॉय के कई छवियों हर 1 या 2 एच (अनुपूरक फिल्म 1, अनुपूरक फिल्म 2) लेने के द्वारा संभव है । इस विधि के साथ, हम astrocyte के विभिंन कैनेटीक्स-और microglia मध्यस्थता phagocytosis (चित्रा 6) का प्रदर्शन किया । glial कोशिकाओं के phagocytosis का अंदाजा लगाने के लिए, लाल प्रतिदीप्ति संकेत के क्षेत्र (µm2) मापा गया था, जो चित्रा घमण्ड और चित्रा 7में phagocytic सूचकांक के लिए भेजा गया है. यद्यपि astrocytes पीएच संकेतक के phagocytosing बड़ी मात्रा में कुशल प्रकट-संयुग्मित synaptosomes, microglia छा और अपमानजनक synaptosomes (चित्रा घमण्ड) में तेजी से थे । Microglia पीएच संकेतक-संयुग्मित synaptosome उपचार के बाद 26 ज में अधिकतम पीएच संकेतक तीव्रता दिखाया, जबकि astrocytes ४५ ज (p-मान < ०.०५, दो-तरफा ANOVA 1x astrocyte के साथ ACM और Microglia के बीच 1x ACM) पर अधिकतम दिखाया । इसी तरह, microglial कोशिकाओं पीक बिंदु के बाद कुल पीएच संकेतक तीव्रता ४० ज में एक २०.७% की कमी दिखाई दिया, जबकि astrocytes एक ही समय अवधि के दौरान कुल पीएच संकेतक तीव्रता में एक 17% कमी दिखाई । दिलचस्प है कि हमारे आंकड़ों से पता चला कि astrocyte स्रावित कारकों, जो ACM में निहित थे, दोनों astrocyte-और microglia मध्यस्थता phagocytosis (चित्रा घमण्ड) को बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं । Astrocytes इस तरह के MFGE8, GAS6, और प्रोटीन, जो पुल और phagocytic रिसेप्टर्स के बीच बातचीत के लिए प्रेरित कर सकते हैं और "खाने के लिए मुझे" पुनश्च23के रूप में संकेत के रूप में अणुओं, पाटन जारी करने के लिए दिखाया गया है. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, astrocytes MERTK और MEGF10 रास्ते4के माध्यम से synapses को खत्म । MEGF10 केवल मस्तिष्क में astrocytes द्वारा व्यक्त की है और पहचानने के माध्यम से synapse समाई में भाग लेता है "खाओ मुझे" अज्ञात पहचान के साथ संकेत । पिछले निष्कर्षों के साथ समझौते में, परख कि जंगली के साथ तुलना में पता चला (WT) माउस astrocytes, Megf10 नॉक आउट (KO) माउस astrocytes काफी बिगड़ा phagocytic क्षमता (चित्रा 7) के पास । WT astrocytes के साथ तुलना में, Megf10 KO astrocytes पीक प्वाइंट (31 एच) (चित्रा 7) में कुल पीएच संकेतक तीव्रता में एक लगभग ४०% की कमी दिखाई ।

Figure 1
चित्र 1. immunopanning तरीकों का उपयोग कर astrocyte शुद्धिकरण की योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. phagocytosis लाइव इमेजिंग परख के योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. प्रतिनिधि मस्तिष्क ढाल समाधान में homogenate अंश । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. पुनश्च-उजागर synaptosomes के प्रतिनिधि छवियां । () synaptosomes के साथ astrocytes की एक उज्जवल क्षेत्र छवि । Synaptosomes astrocytes से जुड़ी हैं । () tdTomato की एक फ्लोरोसेंट छवि-सकारात्मक synaptosomes है, जो tdTomato-व्यक्त माउस दिमाग से शुद्ध कर रहे हैं । () pSIVA के पीएस को बांधता है, जो synaptosome की बाहरी झिल्ली को उजागर करता है, और हरी प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है । (D) PS द्वारा पता लगाया गया pSIVA (हरा) tdTomato-धनात्मक synaptosomes (लाल) के साथ सह-अनुवादित है । स्केल बार: 20 µm कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5। प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र और पीएच संकेतक के साथ astrocytes के फ्लोरोसेंट छवियां-दो समय अंक में संयुग्मित synaptosomes । पर 11 उपचार के बाद एच (नीचे पैनल), पीएच संकेतक-संयुग्मित synaptosomes astrocytes से घिरा हुआ है और लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन जबकि वे 1 में नहीं उपचार के बाद एच (ऊपरी पैनल) । स्केल बार: ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6। लंबी अवधि के लाइव-इमेजिंग के माध्यम से चूहे astrocytes और microglia के Phagocytic कैनेटीक्स । () एक योजनाबद्ध आरेख का एक इन विट्रो phagocytosis परख शुद्ध astrocytes और पीएच संकेतक के साथ microglia-संयुग्मित synaptosomes का उपयोग कर । ध्यान दें कि इससे पहले कि लाइव छवियां ले रहे हैं, असीम synaptosomes दूर गर्मी के ४० मिनट के बाद धोया जाता है । () प्रतिनिधि रेखांकन astrocytes और microglia के समाई और क्षरण कैनेटीक्स दिखा । ACM, जिसमें astrocyte-स्रावित कारक होते हैं, काफी astrocyte-और microglia-मध्यस्थता synaptosome दोनों को बढ़ाता है । Astrocyte: ACM 1x, * * * *, Tukey के कई तुलना परीक्षण के साथ नियंत्रण बनाम Astrocyte । Microglia: ACM 1x के साथ नियंत्रण बनाम Microglia, * * * *, Tukey की एकाधिक तुलना परीक्षण । त्रुटि पट्टियां इंगित S.E.M. *p ≤ ०.०५, * * * * p ≤ ०.०००१, दो-तरफ़ा ANOVA । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7. 1x ACM के साथ की तुलना में Megf10 KO माउस astrocytes की phagocytic क्षमता में कमी आई WT माउस astrocytes के साथ 1x ACM. WT बनाम Megf10 KO astrocytes with 1x ACM, * * * *, दो तरह से ANOVA । त्रुटि पट्टियां S.E.M. * p ≤ ०.०५, * * p ≤ ०.०१, * * * p ≤ ०.००१ दो-तरफ़ा ANOVA इंगित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1: समाधान रेसिपी. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक फिल्म 1. एक प्रतिनिधि लाइव-इमेजिंग वीडियो दिखा पीएच संकेतक के phagocytosis-संयुग्मित synaptosomes द्वारा astrocytes । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फिल्म 2. एक प्रतिनिधि लाइव-इमेजिंग वीडियो के phagocytosis दिखा पीएच संकेतक-संयुग्मित synaptosomes द्वारा microglial कोशिकाओं । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

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इस अनुच्छेद में, हम एक लंबे समय तक रहने के लिए तरीकों वर्तमान इन विट्रो में phagocytosis परख शुद्ध glial कोशिकाओं और पीएच संकेतक का उपयोग कर-संयुग्मित synaptosomes । हम बताते है कि microglia के साथ तुलना में, astrocytes synaptosomes के phagocytosis के दौरान अलग समाई और गिरावट की क्षमता के अधिकारी । इसके अलावा, हमारे डेटा का सुझाव है कि astrocyte स्रावित कारक है, जो ऐसे GAS6, प्रोटीन के रूप में अणु पाटने होते हैं, और MEGE8, कुशल पी एस मस्तिष्क में glial कोशिकाओं के आश्रित phagocytosis के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, Megf10 KO astrocytes synaptosomes के दोषपूर्ण phagocytosis दिखाओ ।

इस प्रयोग को सफलतापूर्वक करने के लिए, मीडिया और DPBS को वॉशिंग स्टेप्स (सेक्शन 5) के दौरान सावधानीपूर्वक अदला-बदली करने की जरूरत है । प्राथमिक संस्कृतिपूर्ण astrocytes और microglia, विशेष रूप से microglia, हवा जोखिम की चपेट में हैं । इसलिए, धोने चरणों के बीच समय अंतराल को कम करने रहते कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । लंबे समय तक लाइव इमेजिंग उपकरणों के साथ इमेजिंग स्थापित करने के लिए, मैनुअल ध्यान ऑटो फोकस लेजर वृद्धि हो सकती है के बाद से सिफारिश की है/एलईडी जोखिम समय है, जो कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है ।

इस विधि में, synaptosome शुद्धि प्रोटोकॉल19 थोड़ा संशोधित किया गया है । मूल कागज 3%, 10%, 15%, और 23% में ढाल समाधान अलग । हालांकि, हम 3%, 10% और 23% ढाल समाधान स्थापित करने के लिए शुद्ध synaptosomes की उपज में वृद्धि । इस विधि में astrocytes और microglial कक्षों को immunopanning के लिए निर्देश भी संशोधित किए गए हैं । मूल panning प्रोटोकॉल का लक्ष्य21 केवल astrocytes को शुद्ध करने और बीएसएल-1, द्वितीयक-केवल, CD45, O4, और Itgb5 (माउस के लिए HepaCAM) immunopanning क्रम के रूप में उपयोग करने के लिए है । के बाद से बीएसएल-1 और माध्यमिक केवल प्लेटें endothelial कोशिकाओं को दूर करने के साथ ही microglia, हम CD45, माध्यमिक केवल, बीएसएल-1, O4, और Itgb5 (माउस के लिए HepaCAM) microglia panning पकवान से CD45 की उपज बढ़ाने के लिए आदेश बदल दिया । इस प्रोटोकॉल में, हम भी perfused एसडी चूहे पिल्ले (~ P7-P10) संचार प्रणाली के माध्यम से DPBS के साथ CD45-सकारात्मक गैर microglial आबादी से संदूषण को कम करने के लिए विभिंन रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए ।

इन विट्रो phagocytosis परख के कई फायदे हैं । synaptosome विकार में प्रयुक्त पीएच संकेतक केवल कम पीएच स्थितियों में लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है । इसलिए, जब डेटा प्रसंस्करण, हम सीधे एक शमन प्रक्रिया के बिना phagocytic घटनाओं के एक संकेत के रूप में लाल प्रतिदीप्ति को बढ़ाता है पृष्ठभूमि संकेतों या जटिल इमेजिंग विश्लेषण को दूर करने के लिए सह के अंदर छा सामग्री के स्थानीयकृत संकेतों को प्राप्त कर सकते है फ़ैगोसाइट. इसके अलावा, इस विधि की अनुमति देता है glial phagocytosis के वास्तविक समय पर नज़र रखने के एक कई समय अंक में दिया रॉय के भीतर पीएच संकेतक तीव्रता की छवियों को लेकर । १०० एच तक पीएच संकेतक तीव्रता के साथ एक ग्राफ पैदा करके, समाई के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्षरण क्षमता विभिन्न कोशिकाओं और शर्तों के बीच आसानी से निगरानी की जा सकती है । एक अंय लाभ synaptosomes का उपयोग है । के बाद से astrocytes ensheathe उनके ठीक प्रक्रियाओं के साथ हर समय synapses है और vivo4में synapses निगल लिया गया है, synaptosomes का उपयोग कर phagocytic के इन विट्रो astrocytes क्षमता को मापने के लिए बहुत उपयुक्त है । अंत में, इस इन विट्रो phagocytosis परख में myelin मलबे या amyloid बीटा, जो विभिंन स्नायविक विकारों से संबंधित है के glial phagocytosis अध्ययन करने के लिए विकसित होने की क्षमता है ।

वृद्धि हुई जीवन प्रत्याशा के साथ, neurodegenerative रोगों के साथ रोगियों की संख्या में एक नाटकीय वृद्धि अपरिहार्य है । glial कोशिकाओं के माध्यम से Synapse हानि कई neurodegenerative रोगों में प्रमुख कारकों में से एक है13,14. इसके अलावा, असामान्य synapse छंटाई और मस्तिष्क homeostasis के एक असंतुलन glial phagocytosis दोषों के साथ जुड़ा हो सकता है । इसलिए, कारकों और यौगिकों कि astrocytes की समाई और गिरावट को नियंत्रित कर सकते हैं की पहचान विभिन्न स्नायविक विकारों के लिए सफल उपचार खोजने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. के बाद से इस इन विट्रो phagocytosis परख आसानी से multiwell प्लेटों के साथ बढ़ाया जा सकता है, इस विधि विभिंन स्क्रीन के लिए एक उपयुक्त मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ऐसे कारकों की पहचान ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक येयून-जोओ जंग उसके प्रायोगिक समर्थन के लिए synaptosome शोधन और Jungjoo पार्क के दौरान पुनश्च जोखिम के साथ synaptosomes की छवियों के लिए धंयवाद । इसके अलावा, हम सहायक चर्चा के लिए चुंग प्रयोगशाला में सभी सदस्यों को धंयवाद । यह काम कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित अनुदान कोरियाई सरकार (MSIP) (एनआरएफ-2016M3C7A1905391 और एनआरएफ-2016R1C1B3006969) (डब्ल्यू.-एस. के द्वारा समर्थित किया गया था । ग).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synaptosome purification
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 BIO-RAD 5000202
pH indicator conjugation
Dimethyl sulfoxide(DMSO) LPS solution DMSO100
pHrodo red, succinimidyl ester Molecula probes P36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) Sigma E7510
Bovine serum albumin Bovogen BSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase) Worthington Is002007
(DMEM) Gibco 11960-044
(dPBS) Welgene LB001-02
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) Vector Labs L-1100
Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) Jackson ImmunoResearch 115-005-044
Goat anti-mouse IgM (μ-chain) Jackson ImmunoResearch 115-005-020
Heparin-binding epidermal growth factor Sigma E4643
Human HepaCAM antibody R&D systems MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) eBioscience 14-0497-82
L-cysteine Sigma C7880
L-glutamate Gibco 25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC) Sigma A8199
Neurobasal media Gibco 21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) Bansal et al.23
Papain Worthington Is003126
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Pluristrainer 20 μm PluriSelect 43-50020-03
Poly-D-lysine Sigma P6407
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Purified rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen 550539
Purified mouse anti-rat CD45 BD Pharmingen 554875
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sodium selenite Sigma S5261
Transferrin Sigma T1147
Trypsin Sigma T9935
Trypsin inhibitor Worthington LS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) Beckman Coulter 344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) PALL MAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) PALL MAP030C37
Phagocytosis live imaging assay
Juli stage NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164, (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486, (7403), 410-414 (2012).
  3. Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13, (1), 22-24 (2010).
  4. Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504, (7480), 394-400 (2013).
  5. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, (4), 691-705 (2012).
  6. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539, (7629), 428-432 (2016).
  7. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155, (7), 1596-1609 (2013).
  8. Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36, (19), 5185-5192 (2016).
  9. Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28, (1), 20-33 (2014).
  10. Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8, (1), 301-311 (2013).
  11. Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160, (6), 1061-1071 (2015).
  12. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530, (7589), 177-183 (2016).
  13. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352, (6286), 712-716 (2016).
  14. Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (36), 10186-10191 (2016).
  15. Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
  16. Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. (2015).
  17. Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34, (29), 9607-9620 (2014).
  18. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
  19. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, (11), 1718-1728 (2008).
  20. Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96, (3), 656-668 (2006).
  21. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, (5), 799-811 (2011).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, (1), 264-278 (2008).
एक उपन्यास इन <em>विट्रो</em> लाइव-इमेजिंग Astrocyte की परख-मध्यस्थता Phagocytosis का उपयोग पीएच संकेतक-संयुग्मित Synaptosomes
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Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).More

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).

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