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Neuroscience

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

doi: 10.3791/56647 Published: February 5, 2018

Summary

이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.

Abstract

이다 두뇌에 있는 주요한 세포 유형 고 시 냅 스 및 혈관에 직접 문의. Microglial 세포는 주요 면역 세포와 뇌의 식 세포만 간주 되었습니다, 하지만 최근의 연구 이다 또한 개발 시 냅 스 제거 등의 다양 한 phagocytic 프로세스에 참여 Alzheimer의 질병 (광고)에서 베타 아 밀 로이드 플 라크. 이러한 결과도 불구 하 고 사이토 engulfment의 효율성 및 그들의 목표의 명확 하지 않다 microglia의와 비교. 정보의이 부족 있는 사이토 microglia 중재 먹어서의 활동은 쉽게 비교 분석 결과 시스템의 부족 때문에 주로 이다. 이 목표를 달성 하기 위해 장기 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 순화 이다와 microglia phagocytic 용량 평가를 개발 했습니다. 이 분석 결과에 engulfment과 저하의 실시간 탐지 표시기 활용 된 synaptosomes, 리소좀과 같은 산 성 세포에 밝은 적색 형광을 방출 하는 pH를 사용 하 여 가능 하다. 우리의 새로운 분석 결과 라이브 영상 통해 식 균 작용의 간단 하 고 효과적인 검색을 제공합니다. 또한, 화학 물질 및 향상 시킬 수 또는 이다의 phagocytic 용량을 억제 하는 화합물을 식별 하이 체 외에서 먹어서 분석 결과 심사 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 화학 물질 및 화합물 glial 세포의 phagocytic 용량을 조절 하는 다양 한 치료에 도움이 될 것으로 시 냅 스 가지 치기 오작동 및 병원 성 단백질 축적 정신 장애 또는 신경 퇴행 성 질환 원인 표시 되었습니다. 신경 장애입니다.

Introduction

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두뇌에 고르기가 아닌 셀 참조, glial 세포 중앙 신경 시스템 (CNS)에 주요 셀 유형입니다. 이전, glial 세포는 시 냅 스 속성과 기저 신경 생존 유지에 수동 역할 주로 단순한 지원 세포로 간주 되었다. 그러나, glial 세포 신경 생물학, 뇌 항상성, 중재 시 냅 스 형성1,2,3 , 시 냅 스를 유지 하는 등의 다양 한 측면에서 보다 적극적인 역할을 재생할 계시는 증거를 신흥 제거4,5, 그리고 변조 시 냅 스가 소성6,7. CNS에서 glial 세포는 이다, microglia, 및 oligodendrocytes 포함 됩니다. 이러한 세포, 이다와 microglia 보였다 시 냅 스4,5, apoptotic 세포8, 신경 파편9, 그리고 병원 성 단백질, 녹말 체 beta 등을 덮어 여 phagocytic 역할을 플 라크10,11. 개발 두뇌에서 이다 MERTK 및 MEGF10 종속 먹어서4등 측면 geniculate 핵 (dLGN)에서 시 냅 스를 제거합니다. 마찬가지로, microglia 또한 C1q 코팅 시 냅 스 클래식 보완 캐스케이드5발달 단계를 제거 합니다. 흥미롭게도, 그것은 결함 시 냅 스의 가지 치기에 여러 가지 신경 장애의 시작자 중 하나 될 수 있습니다 제안 되었습니다. 예를 들어 돌연변이 보완 구성 요소 4에서에서 (C4) microglia에 의해 보완-중재 시 냅 스의 가지 치기를 증가 인간12정신 분열 증의 보급에 강하게 연관 표시 되었습니다. 최근 종이 고아 한 보충 통로 hyperactivated 광고의 개시 단계에 하 고13이 질병에서 초기 냅 손실 유도도 표시 됩니다.

먹어서 microglia 중재와 비교, 덜 분명 하다 사이토 중재 먹어서 개시와 다양 한 신경 질환의 진행에 기여 하는 여부. 그러나, 최근 종이 이다 하 여 정상적인 시 냅 스 가지 치기의 속도 변경 하는 수 있습니다 두뇌 항상성 방해 요인과 광고 민감성과 병리학14을 나왔다. ApoE 이 성체, 광고 (ApoE2)에 대 한 보호 대립 유전자와 강하게 향상 속도 위험 대립 유전자 (ApoE4) 광고에 대 한 속도 크게 낮추는 이다에 의해 시 냅 스 가지 치기의 속도 강력 하 게 제어 됩니다. 또한, 유전자 변형 마우스 ApoE4 표현 제어 또는 ApoE2 마우스14보다 훨씬 더 많은 시 냅 스 C1q 축적. 이러한 데이터는 초기에 사이토 중재 먹어서 장애인 제안 광고 두뇌 활성화 보완-중재 microglial 먹어서, 시 냅 스 변성 운전 노화 C1q 코팅 시 냅 스/시 냅 스 파편의 축적을 유발 수 있습니다 . ApoE4 운반대에 이다의 장애인된 phagocytic 용량 또한 광고 영향을 두뇌에 베타 아 밀 로이드 플 라크의 통제 축적에 기여할 수 있습니다.

또한, 그것은 세 초파리 뇌에 glial 세포 드레이퍼, Megf10 이다 phagocytosing 시 냅 스를 사용 하는의 체의 감소 번역으로 인해 그들의 phagocytic 용량을 잃게 표시 되었습니다. 효율적으로 비슷한 정도 젊은 뇌를 노화 유도 나타내는 세 뇌에 손상된 axonal 파편 삭제 glial 세포의 phagocytic 용량 구조 드레이퍼 수준을 회복의 phagocytic 용량 변경 이다 두뇌 항상성15의 파괴에 기여할 수 있습니다.

이러한 새로운 발견을 바탕으로, 이다의 phagocytic 용량 변조 수 방지 하 고 다양 한 신경 질환을 치료 하는 매력적인 치료 전략. 이와 관련, 산 성 나노16 리소좀의 산성화를 유발 및 녹음 방송 요인 EB (TFEB), 향상 시킬 수 있는 overexpressing 이다, 예를 들어의 phagocytic 능력을 향상 시키는 몇 가지 시도 되었습니다. 리소좀 속17. 이러한 시도도 불구 하 고 그것은 여전히 확실치있지 않습니다 어떻게 이다 및 microglial 셀 phagocytic 그들의 활동에 다 우리가 해야 증가 여부 등 다양 한 질병에 그들의 phagocytic 용량 감소.

이 논문에서는, 소설 체 외에서 분석 결과 실시간으로 이다의 phagocytic 용량을 탐지 하기 위한 선물이. 데이터 이다에 microglia engulfment과 저하의 다른 활동을 보여줍니다. 사이토 조절 매체 (ACM), 포함 이다에서 분 비 요인, 이다와 microglia의 효과적인 먹어서 필수적입니다. 또한, Megf10, 이다에 Ced-1드레이퍼, 체 phagocytic 수용 체 중재 하는 사이토 먹어서8,18에 중요 한 역할을 재생 합니다.

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Protocol

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여기에 설명 된 모든 메서드는 한국 고급 연구소의 과학 및 기술 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC), KA2016-08에 의해 승인 되었습니다.

1. synaptosome 정화

참고:이 절차는 이전에 게시 종이19 순화 synaptosomes (그림 1)의 수확량을 개선 하기 위해 몇 가지 수정 적응.

  1. 불연속 밀도 그라데이션 미디어를 준비 합니다.
    1. 얼음에 다음 장소: 그라데이션 버퍼에 3%, 10%, 그리고 23% 밀도 그라데이션 솔루션 (자당의 109.54 g, 트라이앵글, 606 mg와 0.2 M EDTA, pH 7.4의 5 mL 물 250 mL를가지고); 균질 화 버퍼 (추가 그라데이션 버퍼 x 4의 25 mL 및 물 74.5 mL로 50 m m DTT의 500 µ L); 균질 화기 박격포와 유 봉
      참고: 밀도 그라데이션 솔루션 및 준비 표 1에 선물 된다. 3%, 10%와 23% 밀도 그라데이션 솔루션을 준비 하려면 원시 밀도 그라데이션 솔루션을 사용 합니다.
    2. 3 성인 쥐 당 6 매우 명확한 원심 분리기 튜브를 준비 합니다.
    3. 1 mL 피 펫 각 원심 분리기 튜브의 하단에 23% 밀도 그라데이션 솔루션의 3 mL를 추가 합니다. 다음, 천천히 레이어 목장 피 펫 및 1 mL 피 펫은 23% 밀도 그라데이션 솔루션의 위에 10% 밀도 그라데이션 솔루션의 3 mL를 확인 합니다. 마지막으로, 위에 3% 밀도 그라데이션 솔루션의 3 mL를 추가 합니다. 이 단계에서 소개 하는 거품을 피하기 위해 주의 사용 합니다.
    4. 원심 분리기 튜브 플라스틱 포장으로 커버 하 고 얼음에 튜브를 유지.
  2. 고속 원심 분리기 및 4 ° c.에 ultracentrifuge 쿨
  3. 70% 에탄올 (가 위, Castroviejo 봄이 위, 그리고 곡선된 겸 자 운영) 외과 장비를 소독. 얼음에 균질 화 버퍼의 25 mL와 함께 작은 유리 비 커를 준비 하 고 비 커의 무게.
  4. 3 성인 (약 12 주 오래 된) 남자 쥐에서 두뇌를 추출 합니다.
    1. 자 궁 경부 척추 탈 구 그리고가 위 운영으로 목. 머리와 운영가 위 및 곡선된 겸 자 사용 하 여 중간에 따라 두개골의 피부를 벗기십시오. Castroviejo 봄이 위 후 각 전구 및 소 뇌를 삭제할.
  5. 곡선된 겸 자 비 커에 넣어 나머지 두뇌와 두뇌 무게. 두뇌의 표면에 혈액을 제거 하 차가운 균질 화 버퍼와 여러 번 머리를 헹 굴.
    참고: 이전에 뇌 조직의 1 g을 균질 화 버퍼의 9 mL 권장 했다.
  6. 균질 버퍼 및 뇌 조직의 균질 화기 박격포 1 g의 4 개 mL를 추가 합니다. 두뇌 조직, 하는 동안 추가 8 mL 최대 버퍼 조직.
  7. 2 개의 50 mL 고속 원심 분리기 관으로는 homogenate를 나눕니다. 신선한 균질 화 버퍼의 1 mL와 박격포를 세척 하 고 관에 그것을 추가.
    주의: 가능한 한 빨리 1.3-1.7 단계를 진행 합니다. 20 분 미만 것이 좋습니다.
  8. 느린 브레이크와 4 ° C에서 10 분 1000 x g에서 고속 원심 분리기 튜브에 homogenates 원심.
    참고: 때 감속의 최대 속도가 9 2 또는 3에서 감속 속도 (브레이크)를 설정 합니다.
  9. 신중 하 게 새로운 50 mL 튜브에는 상쾌한 추가 고 균질 화 버퍼의 최대 12 mL를 추가 합니다.
  10. 신중 하 고 천천히 1 mL 피 펫을 3% 밀도 그라데이션 솔루션을 통해 희석된 상쾌한의 2 개 mL를 플라스틱 하 고 얼음에 튜브를 놓습니다.
  11. 4 ° C에서 5 분 동안 아무 브레이크와 함께 31000 x g에서 원심.
    참고: 하나 (0)에서 감속 속도 설정 또는 해안.
  12. 얼음에 튜브를 놓고 50 mL 튜브에 23% 밀도 그라데이션 솔루션 10% 밀도 그라데이션 솔루션 2 mL 피 펫 사이 synaptosome 분수를 수집 합니다. 얼음 처럼 차가운 자당/EDTA를 추가 최대 80 mL를 버퍼링 하 고 4 50 mL 고속 원심 분리기 튜브로 나눕니다.
    주: 레이블이 지정 된 그라디언트 분류 한 synaptosomes에 대 한 그림 3 을 참조 하십시오.
  13. 적은 휴식 4 ˚C에서 30 분 동안 20000 x g에서 원심.
    참고: 때 감속의 최대 속도가 9 2 또는 3에서 감속 속도 설정 합니다.
  14. 조심 스럽게 제거 1 mL 피 펫과 상쾌한, isotonic 생리 버퍼 (140 mM NaCl, KCl 3mm, 1.2 m m MgCl2, 1.2 m m NaH24, 10 mM HEPES, 그리고 10 mM 포도 당, pH 7.4)20의 1 mL와 함께 synaptosome 펠 릿 resuspend. Isotonic 생리 버퍼에 10 %DMSO 1 mL을 추가 (DMSO의 최종 농도: 5%)는 synaptosomes 한 50 mL 고속 원심 분리기 튜브에 수집.
  15. 1.5 mL 튜브에 aliquot 1 mL입니다. Bradford 분석 실험을 사용 하 여 synaptosomes의 단백질 농도 측정 합니다.
  16. 신속 하 게 튜브를 고정 하 고 pH 지시자 활용까지-80 ° C 냉동에 튜브를 저장 합니다.

2입니다. pH 지표 활용

  1. 1.5 mL 튜브 4 ° c.에 3-4 분 21,092 x g에서 synaptosomes 원심
  2. 제거는 상쾌한, 잘 pipetting으로 0.1 m M 나2CO3 및 혼합의 200 µ L를 추가 합니다.
    참고: 없음2CO3 알칼리 pH에서 1 차 아민과 반응 하는 succinimidyl 에스테 르로 pH를 가장 효율적으로 마련 하기 위해 추가 되었습니다.
  3. 튜브와 부드럽게 소용돌이를 pH 지시자의 2 µ L를 추가 합니다.
    주의: 1 µ L 당 0.3 m g synaptosome 솔루션의 pH 지시자의 사용.
  4. 알루미늄 호 일 튜브를 취재 하 여 가벼운 노출을 최소화 하 고 실내 온도 (RT)에 1-2 시간 30 ~ 40 rpm에서 부드러운 동요와 트위스트 통에 그들을 품 어.
  5. 동요를 중지 하 고 DPBS의 1 mL를 추가 합니다.
  6. 1-2 분 21,092 x g에서 튜브 원심
  7. 제거는 상쾌한 고 부드러운 pipetting으로 펠 릿을 resuspend 하는 DPBS의 1 mL를 추가 합니다.
  8. 바인딩되지 않은 산도 표시기를 제거 하려면 단계 2.6-2.7 적어도 7 번을 반복 합니다.
  9. 상쾌한을 제거 하 고 5 %DMSO DPBS의 200 µ L와 펠 릿을 resuspend.
    참고:이 시점에서, 모든 synaptosomes는 작동 하지 않습니다. 우리 그 phosphatidylserine (PS)으로 synaptosomes의 외부 막에 노출 되었습니다 확인 한 "먹고-나" 신호 (그림 4).

3. 이다 및 Microglia 정화

참고: 사이토 정화에 대 한이 프로토콜은 이전에 게시 종이21에서 적응. 이 프로토콜에서 쥐 이다 microglia의 정화를 설명 합니다. 마우스 이다 고 microglia 정화에 대 한 구체적인 절차는 또한 노트에 설명 됩니다.

  1. 하루 전에 정화
    1. 미리 코팅된 셀 문화 요리와 솔루션을 준비 합니다.
    2. 50 mm Tris HCl (pH 9.5) 25 mL와 5 145 m m x 20 m m 접시를 준비 합니다. 페 트리 접시에 주 또는 보조 항 체 치료를 별도로 아래와 같이 배치 합니다. 밤새 냉동 실에 요리를 품 어.
      BSL-1 접시: 20 µ L 5 mg/ml BSL-1 (Griffonia simplicifolia lectin)
      2 차 전용 접시: 2.4 mg/mL 염소 반대로 마우스 IgG + IgM (H + L)의 60 µ L
      CD45 요리: 2.4 mg/mL 염소 반대로 마우스 IgG + IgM (H + L)의 60 µ L
      O4 요리: 2.4 mg/mL 염소 반대로 마우스 IgM (µ-체인 관련)의 60 µ L
      쥐 이다에 대 한 Itgb5 (β5 Integrin) 요리: 2.4 mg/mL 염소 반대로 마우스 IgG + IgM (H + L)의 60 µ L
      참고: 페 트리 접시의 소수 성 표면에 이차 항 체에 연결, 낮은 온도에서 천천히 첨부 것이 좋습니다. 그러나, 그것은 코트 2 h 37 ° c.에 대 한 2 차 항 체로 페 트리 요리 가능 사이토 팬에 대 한 항 체는 동물 종;에 따라 다르게 사용 되 고 마우스 이다에 대 한 예를 들어 HepaCAM 요리: 2.4 mg/mL 염소 반대로 마우스 IgG + IgM (H + L)의 60 µ L
  2. 정화의 날
    1. Immunopanning에 대 한 준비.
    2. 50 mL 튜브를 준비 하 고 관에 주식을 추가 합니다. 자세한 재고 솔루션 준비는 표 1에 표시 됩니다.
      1. 준비 관 1 (효소): 효소 주식 22 mL (효소 주식: 얼의 균형 소금 솔루션 x 1 (EBSS)+0.46% D (+)-포도 당 + 26 m m NaHCO30.5 mM EDTA).
      2. 억제제 주식의 42 mL 튜브 2 (낮은 비켜) 준비: (억제제 주식: EBSS+0.46% D (+) x 1-포도 당 + 26 m m NaHCO3).
      3. 튜브 3 (높은 비켜) 준비: 억제제 주식의 10 mL.
    3. CO2 (95% O2 와 5% CO2) 탱크에 연결 된 2 mL 펫의 팁 0.22 μ m 주사기 필터를 연결 합니다. 거품 CO2 튜브 1-3. 솔루션 설정 오렌지 버블링 중지 합니다.
    4. 솔루션을 완료 합니다.
      주의: 고 효소 활성화에 대 한 사용 하기 전에 15 분 동안 34 ° C에서 튜브 1에서 솔루션을 품 어.
      1. 준비 관 1 (효소): 효소 주식 + 180 U papain + 0.004 g L-시스테인의 22 mL.
      2. 튜브 2 (낮은 비켜) 준비: 42 mL 억제제 재고 + 낮은 비켜의 3 mL + DNase의 200 µ L.
      3. 튜브 3 (높은 비켜) 준비: 10 mL 억제제 재고 + 높은 비켜의 2 mL + DNase의 20 µ L.
      4. 튜브 4 (0.2 %BSA) 준비: 19 mL 1 X DPBS의 + 4 %BSA 1 mL + DNase의 8 µ L.
      5. 튜브 5 (0.02 %BSA) 준비: 1 X DPBS의 45 mL +의 5 mL 튜브 4 + 50 µ L DNase의.
    5. 34 ° c.에 물 목욕과 열 블록 예 열
  3. 쥐 피를 추출 합니다.
    1. 70% 에탄올과 수술 장비를 소독 하 고 DPBS 100 mm 페 트리 요리를 준비.
    2. 아크릴 상자를 준비 합니다. 상자 아래에 직물의 2 ~ 3 층을 넣어 하 고 상자에 isoflurane의 1 mL를 추가 합니다.
    3. 강아지에 대 한 20-40 상자에서 anesthetize 고 anesthetization 발 핀치 집게와 함께 합니다. 심장22 고 새끼 DPBS 10 mL 주사기를 사용 하 여 perfuse.
      참고: 관류 microglia 패닝 단계 혈액 세포 오염을 방지 하는 데 사용 됩니다.
    4. 강아지의 목의 위 자 궁 경부 라인 운영가 위로 잘라 고 중간 선 따라 머리 피부를 incise. 중간 선 따라 두개골에 절 개를 만들고 곡선된 겸 자와 두개골을 열고.
    5. Castroviejo 봄이 위 소 뇌를 삭제할. 나머지 뇌를 꺼내와 DPBS 가득 100 mm 페 트리 접시에 놓습니다.
    6. Castroviejo 봄이 위 현미경 midbrain 해 마 등 다른 지역 피 질에서 제거 합니다. Meninges 미세 집게로 제거 합니다.
    7. 새로운 60 mm 접시에는 피를 전송 하 고 접시에 나머지 DPBS를 제거 합니다. 10 번 블레이드와 함께 조직을 잘라.
  4. 단일 셀 서 스 펜 션으로 피 질 해리
    1. 60 mm 접시에 필터링 된 튜브 1 솔루션을 부 어 고 DNase1의 50 µ L를 추가 합니다. 접시에 솔루션을 소용돌이 친다.
      참고: DNase 파열된 세포에서 DNA의 집계를 억제 하기 위해 사용 됩니다.
    2. 34 ° C 열 블록으로 접시를 놓고 중간에 구멍이 있는 뚜껑으로 커버 합니다. 60 mm 페 트리 접시의 뚜껑에 구멍을 납땜을 사용 합니다.
    3. 22-µ m 주사기 필터 CO2 탱크 튜브를 연결 하 고 필터 팁을 구멍에 넣습니다.
    4. 접시 마다 10 ~ 15 분에에서 솔루션 45 분 소용돌이에 34 ° C에서 접시를 품 어.
  5. 패닝 요리 준비 완료.
    1. 패닝 요리 하루 미리 냉동 실에서 2 차 항 체로 코팅을 제거 합니다. BSL-1 접시와 실시간에 2 차 항 체 전용 접시
    2. 다른 요리 DPBS의 20 mL를 세 번 씻는 다.
    3. 요리에 0.02 %BSA 적절 한 금액을 붓는 다. 해당 요리에 기본 특정 항 체를 장소:
      CD45 요리: 0.02 %BSA + 0.5 mg/ml 쥐 반대로 마우스 CD45 20 µ L의 12 mL
      Itgb5 요리: 0.02 %BSA + 0.5 mg/mL Itgb5의 20 µ L의 12 mL
      O4 요리: 0.02 %BSA O4 항 체의 4 mL 8 mL
      참고: 마우스 immunopanning, 사용 마우스 반대로 쥐 CD45 (0.5 mg/mL) microglia 및 HepaCAM (0.5 mg/mL) 이다.
    4. 30%의 30 mL 준비 FBS neurobasal 미디어와 1 X EBSS의 10 mL. 34 ° C 물 욕조에 두 솔루션을 따뜻한.
  6. Papain 반응 억제.
    1. 새로운 50 mL 튜브 papain 처리 조직 전송. 정착을 조직에 대 한 기다립니다. 흡입에 의해 액체를 발음.
    2. 튜브에 낮은 비켜 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 셀을 씻어 솔루션 소용돌이.
    3. 효소 반응을 중지 하 단계 3.6.1-3.6.2 세 번을 반복 합니다.
  7. 피 질 조직 triturate
    1. 욕조의 낮은 비켜 6 mL를 추가 합니다. 발음을 5 mL 피 펫으로 신속 하 게 조직 합니다.
      주의: 거품을 소개 하지 않습니다.
    2. 새로운 50 mL 튜브를 준비 하 고 낮은 비켜의 5 mL을 추가. 새로운 관에 있는 단일 셀을 수집 합니다.
    3. 반복 단계 3.6.1-3.6.2 두 번 하 고 1 mL 피 펫을 5 mL 피 펫을 변경.
    4. 분쇄를 반복 하 여 직물의 95% 이상 표시 되지 않습니다.
    5. 해리 10 mL 피 펫 아래 낮은 비켜-포함 된 튜브 3 셀에서 높은 비켜 솔루션의 레이어를 확인 합니다.
    6. 몇 가지 브레이크와 함께 6 분 190 x g에서 원심.
      참고: 때 감속의 최대 속도가 9에서 하나 또는 두 개의 감속 속도 설정 합니다.
  8. 여과 액 단일 셀입니다.
    1. 신중 하 게 흡입, 여는 상쾌한 발음 다음 0.02 %BSA 솔루션 1 mL 피 펫의 3 mL와 펠 릿을 resuspend.
    2. 0.02 %BSA 솔루션 추가 최대 9 mL.
    3. 새로운 50 mL 튜브와 튜브 위에 20 µ m 셀 스 트레이너를 준비 합니다. 젖은 0.02 %BSA 솔루션의 1 mL와 함께 셀 스 트레이너.
    4. 셀 스 트레이너로 단일 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 한 번에 1 mL를 필터링 합니다.
    5. 0.02 %BSA 솔루션의 3 mL와 함께 셀 여과기를 세척. 필터링 된 단일 셀 서 스 펜 션의 15 mL 이상 만들지 마십시오.
    6. 34 ° C 물 목욕 셀 복구를 위한 45-60 분에 튜브를 품 어. 셀 복구 단계 막에 세포 표면 단백질의 relocalization 수 있습니다.
  9. 셀의 회전을 수행 합니다.
    1. CD45 패닝 접시 DPBS의 20 mL로 세 번 세척. 세 번 사용 직전 DPBS의 20 mL와 함께 모든 접시를 씻어.
    2. 단일 셀 현 탁 액은 CD45에 접시를 팬에 부 어. 28 분 동안 접시를 두고 14 분 접시를 흔들어. 하단에서 바인딩되지 않은 셀을 제거 하려면 신중 하 게 접시를 흔들.
    3. 2 차 전용 접시에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 20 분 동안 기다려야 하 고 신중 하 게 10 분 동안 요리를 흔들. CD45 접시에서 microglia를 얻으려면 3.9.2 단계로 이동 합니다.
    4. BSL-1 접시에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 10 ~ 12 분 동안 접시를 남겨 주세요.
    5. O4 접시에 전송 합니다. 20 분 동안 기다려와 10 분 동안 흔들어.
    6. Itgb5 요리에 전송 합니다. 40 분 동안 접시를 두고 부드럽게 흔들어 마다 10 분.
      참고: 마우스 이동에 대 한 HepaCAM 접시에 세포 현 탁 액을 전송.
  10. 접시에서 세포를 분리 합니다.
    1. 믹스 400 µ L의 트립 신 (EBSS에서 30000 U/mL) 1 X EBSS의 preincubated 8 mL와 함께.
    2. 폐기물 통에 접시에서 분리 된 세포 현 탁 액을 부 어.
    3. 8 번 DPBS와 접시 세척.
    4. 접시에 트립 신으로 EBSS의 8 mL를 붓으십시오.
    5. 37 ° C 배양 기에서 5 ~ 10 분 요리를 품 어. CD45 요리 및 Itgb5 및 HepaCAM 요리에 대 일 분 10 분 동안 품 어.
    6. 접시를 누르고 접시 현미경으로 관찰 합니다.
      참고: 경우에 이다의 대부분을 분리 하지 했으면 넣고 접시 다시 다른 5 분 동안 인큐베이터.
    7. 30%의 10 mL를 붓고 trypsin 중화 요리에 FBS.
    8. 위쪽 및 아래쪽 이다 microglia를 분리 하려면 전체 접시에 플라스틱.
    9. 솔루션 50 mL 튜브로 전송 합니다.
    10. 30%의 10 mL을 추가 FBS 및 200 µ L DNase의 접시에. 셀을 다시 분리 합니다. DNase 파열된 세포에서 DNA의 집계 하는 데 사용 됩니다.
    11. 튜브에 솔루션을 전송 합니다. 세포는 접시에 남아 있으면 추가 30%의 또 다른 10 mL FBS 및 셀을 다시 분리.
  11. 셀 접시
    1. 10 분 213 x g에서 튜브 원심
    2. 상쾌한 발음 하 고 미디어와 셀 펠 릿 resuspend.
      참고: microglia에 대 한 immunopanned 사이토 조절 미디어 (IP-ACM) 이다 및 망막 microglia 기본 미디어 (MBM) immunopanned 사이토 기본 미디어 (IP-ABM)를 사용 합니다. IP ABM 및 MBM 구성 재료의 테이블에에서 표시 됩니다.
    3. hemocytometer 셀을 계산 합니다.
    4. 이다와 PDL 코팅 판에 별도로 microglia 접시.
      참고: 사용 하기 전에 PDL 코팅 접시를 준비 합니다. PDL 코팅 접시를 준비 하려면 증류수 5 mL로 신의 1 mg/mL 폴 리-D-50 µ L을 추가 하 고 잘 플레이트/접시에 솔루션의 적절 한 금액을 부 어 30 분 세척 접시/접시 세 번 증류수와 함께 기다립니다.
    5. 접시를 품 어. 모든 이다 7 일 및 3 일 microglia 미디어의 절반을 변경 합니다.

4. IP ACM 수집

  1. 때 이다 지나치게 confluent 100 mm 접시를 준비 합니다.
  2. 미디어를 삭제 하 고 세 번 DPBS의 10 mL와 함께 접시를 씻어.
  3. 접시에 낮은 단백질 미디어의 15 mL를 붓으십시오.
    참고: 낮은 단백질 미디어 구성 재료의 테이블에에서 표시 됩니다.
  4. 37 ° C 배양 기에서 7 ~ 10 일 동안 접시를 품 어.
  5. 수집 하 고 10 k 미디어 집중 (30 k) 원심 필터 튜브.
  6. 4 ° c.에 851 x g에서 튜브 원심
    참고: 나머지 매체 1 mL 미만 때까지 튜브 원심.
  7. 수집 집중된 미디어 (IP-ACM) 새로운 1.5 mL 튜브에.
  8. 양적 분석을 사용 하 여 IP ACM의 농도 측정

5. 먹어서 라이브 이미징 분석 결과 (그림 2)

  1. 이다 confluent에 24-잘 접시 (접시/접시는 라이브 영상에 대 한 준비)를 준비 (일반적으로, 부 화 후 정화는 세포를 안정화의 7 ~ 10 일).
  2. 각 우물에서 미디어를 제거 하 고 세척 DPBS의 1 mL와 함께 우물 세 번. 공기 노출을 최소화 하기 위해 우물을 신속 하 게 세척.
  3. PH 지시자 활용 된 synaptosomes 및 IP-ACM glial 세포 식 균 작용을 조절할 수 있는 등 추가적인 요인의 5 µ L로 IP-ABM의 300 µ L를 추가 합니다.
  4. 40 분 CO2 인큐베이터에 접시를 품 어. 이 단계는 pH 표시기 활용 된 synaptosomes를 격판덮개의 바닥에 정착을 수 있습니다.
  5. 언바운드 pH 지시자 활용 된 synaptosomes와 함께 미디어를 제거 하 고 각 잘 DPBS의 1 mL, 세 번 세척.
    주의: 가혹 하 게 씻지 않는. 공기 노출을 최소화 하기 위해 우물을 신속 하 게 세척.
  6. 우물에 테스트를 추가 요소와 IP ABM의 500 µ L를 추가 합니다.
  7. 라이브 이미징 악기에 접시를가지고 하 고 위치를 선택 합니다. 초점, 노출 시간, 밝기, 및 LED 전원 조정 합니다.
    참고: 노출 시간, 밝기, LED 전원에 대 한 설정은 형광 강도 따라 변수 및 실험의 목적입니다. 산도 표시기 활용 된 synaptosomes와 라이브 이미징 분석 결과, 우리가 일반적으로 그 값 다음과 같이 설정: 노출: ~ 150-200 ms, 밝기: 15, 그리고 LED 전원: 4-6.
  8. 이미지 형식, 시간 간격, 그리고 라이브 이미징 사이클의 총 수를 설정 합니다. 1 시간 간격을 설정 하거나 얼마나 많은 위치에 따라 2 시간을 선택 합니다. 2 시간 간격으로 150 개 이상의 위치 라이브 이미징 선택 때 권장 됩니다.
  9. 라이브 이미징 실험을 시작 합니다.
  10. 데이터를 분석 합니다.
    1. 피지 프로그램을 엽니다.
    2. 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 8 비트 회색조 이미지를 변환 합니다.
    3. 으로 50 픽셀의 반경을 바 배경 빼기를 수행 합니다.
    4. 시간 시리즈 분석기 V3 플러그인을 시작 합니다.
      참고: 시간 시리즈 분석기 V3 플러그인에 대 한 주소 테이블의 자료제공.
    5. 관심 (ROI) 클릭 하 고 이미지에서 영역을 드래그 하 여 ROI 관리자에 추가 합니다.
    6. 시계열 V3_0에서에서 "총 강도 얻을"을 클릭 합니다.
    7. 결과 저장 하 고 데이터 통합.

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Representative Results

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생체 외에서 먹어서 분석 결과 장기 라이브 이미징,에서는 사용 하는 ultracentrifugation (23% 그라데이션 솔루션 및 10% 그라데이션 솔루션 사이의 그라데이션 솔루션에서 분리 했다 성인 마우스 뇌 homogenates에서 synaptosomes 그림 3)입니다. 준비 후에, synaptosomes는 그들은 그들의 기능을 잃은 것 이다 및 microglia PS 수용 체에 의해 인식 될 수 있는 제안 하는 그들의 외부 막 (그림 4)에서 PS 노출. 그림 5에서 보듯이 pH 지시자 활용 synaptosomes 그들은 이다에 의해 잠겼습니다 했다 때 밝은 빨간색 형광 방출. Glial 세포의 engulfment 및 저하 용량의 실시간 비교 (보충 영화 1, 보충 영화 2) 마다 1 개 또는 2 h는 투자 수익의 여러 개의 이미지를 복용 하 여 가능 하다. 이 방법으로 우리는 사이토와 microglia 중재 먹어서 (그림 6)의 다른 활동을 시연 했다. 척도 glial 세포의 식 균 작용, 붉은 형광 신호 영역 (µ m2) 측정 했다는 그림 6B 에서 phagocytic index 라고 하 고 그림 7. 이다 많은 양의 산도 표시기 활용 된 synaptosomes phagocytosing에서 효율적으로 등장, microglia 덮어 및 synaptosomes (그림 6B) 저하에 더 빨리 했다. Microglia 보여주 최대 산도 표시기 강도 26 h에서 pH 지시자 활용 synaptosome 치료 후, 반면 이다 45 h에서 그들의 최대를 보였다 (p-값 < 0.05, 사이토 ACM X 1 1 X ACM와 microglia 사이 양방향 ANOVA). 마찬가지로, microglial 셀은 피크 포인트 후 이다는 같은 기간 동안 총 산도 표시기 강도에 17% 감소를 보여주었다 반면 총 산도 표시기 강도 40 h 20.7% 감소를 보여주었다. 흥미롭게도, 우리의 데이터를 보였다는 사이토 분 비 요인, ACM에 포함 된 두 사이토 microglia 중재 식 균 작용 (그림 6B) 증가에 필수적인. 이다 MFGE8, GAS6, 및 다리 및 phagocytic 수용 체 사이 상호 작용을 일으킬 수 있는 단백질 같은 브리징 분자 출시 표시 되었습니다 및 "먹고-나" PS23같은 신호. 위에서 설명 했 듯이, 이다 MERTK 및 MEGF10 경로4를 통해 시 냅 스를 제거 합니다. MEGF10는만 이다 두뇌에 의해 표현과 인식 통해 냅 engulfment 참가 "먹고-나" 알 수 없는 id 신호. 이전 연구 결과와 분석 결과 야생-타입 (WT) 마우스 이다, Megf10 녹아웃 (KO) 마우스 이다 보유 크게 장애인된 phagocytic 용량 (그림 7)와 비교 했다. 비해 WT 이다, Megf10 코 이다 보여주었다는 총 산도 표시기 강도 피크 지점 (31 h) (그림 7)에서 약 40% 감소.

Figure 1
그림 1입니다. 사이토 정화 immunopanning 방법을 사용 하 여의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 먹어서 라이브 이미징 분석 결과의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 대표적인 뇌 homogenate 분류 그라데이션 솔루션에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. PS 노출 synaptosomes의 대표 이미지. (A) A 이다 synaptosomes와의 이미지를 밝은 필드. Synaptosomes는 이다에 연결 됩니다. (B) 형광 이미지 tdTomato 표현 마우스에서 순화 된다 tdTomato-긍정적인 synaptosomes의 두뇌. (C) pSIVA PS, synaptosome의 외부 막에 노출 되 고 녹색 형광을 방출에 바인딩합니다. PSIVA (녹색)에 의해 감지 (D) PS tdTomato-긍정적인 synaptosomes (빨간색)와 함께 공동 지역화입니다. 눈금 막대: 20 µ m 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5. 대표적인 밝은 필드 및 두 개의 시간 지점에서 산도 표시기 활용 된 synaptosomes와 이다의 형광 이미지. 치료 (하단 패널) 후 11 h, pH 지시자 활용 된 synaptosomes 이다에 의해 잠겼습니다 하 고 그들은 치료 (위 패널) 후 1 시간에 하지 않습니다 반면 빨간색 형광을 방출. 눈금 막대: 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6. 쥐 이다 및 장기 라이브 이미징 통해 microglia 반응 하 속도 phagocytic 론 (A) A 시험관에서 먹어서 분석 결과의 순화 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 microglia를 사용 하 여 회로도. 참고는 라이브 이미지는 촬영 전에 언바운드 synaptosomes는 멀리 세척 외피의 40 분 후. (B) 대표 그래프 이다 microglia의 engulfment과 저하 속도 보여주는. ACM, 사이토 분 비 요소를 포함 하는 크게 두 사이토 microglia 중재 synaptosome 이해를 향상 시킵니다. ACM 1 X와 함께 사이토: 사이토 제어 대 * * *, Tukey의 다중 비교 테스트. ACM 1 X와 함께 Microglia: Microglia 제어 대 * * *, Tukey의 다중 비교 테스트. 오차 막대 표시 S.E.M. *p ≤ 0.05, * * * p ≤ 0.0001, 양방향 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7입니다. Megf10 KO 마우스 이다 1의 감소 phagocytic 용량 X ACM WT 마우스 이다 1 X ACM와의 비교. Megf10 코 이다 1 X ACM와 대 WT * * *, 양방향 ANOVA. 오차 막대 표시 S.E.M. * p ≤ 0.05, * * p ≤ 0.01, * * * p ≤ 0.001 양방향 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 솔루션 조리법. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 1입니다. 대표 라이브 영상 비디오 보여주는 pH의 먹어서 표시기 활용 된 synaptosomes 이다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 2입니다. 대표 라이브 영상 동영상을 보여주는 먹어서 pH의 microglial 세포에 의해 지표 활용 synaptosomes. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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이 문서에서 우리는 장기 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 정제 glial 세포 및 pH 지시자 활용 된 synaptosomes를 사용 하 여 위한 방법을 제시. 우리 microglia와 비교 하는 표시 이다 synaptosomes의 식 균 작용 동안 다른 engulfment 저하 용량을가지고. 또한, 우리의 데이터 사이토 분 비 요인, GAS6, 단백질, 및 MEGE8 같은 브리징 분자를 포함 하는 두뇌에 있는 glial 세포의 효율적인 PS 종속 먹어서 필수적입니다 것이 좋습니다. 또한, Megf10 코 이다 synaptosomes의 결함이 먹어서를 보여줍니다.

이 실험을 성공적으로 수행 하려면 미디어와 DPBS 세척 단계 (5) 교환 신중 하 게 해야 합니다. 기본 교양 이다 고 microglia, 특히 microglia, 공기 노출에 취약. 따라서 세척 단계 사이의 시간 간격을 줄이는 것은 라이브 세포를 유지 하기 위한 중요 한입니다. 라이브 영상 장비와 장기 라이브 영상 설정, 수동 초점 것이 좋습니다 이후 자동 초점 세포를 손상 될 수 있습니다 레이저/LED 노출 시간을 증가 시킬 수 있습니다.

이 방법에서는, synaptosome 정화 프로토콜19 약간 수정 됩니다. 원래 종이 3%, 10%, 15%와 23%로 그라데이션 솔루션을 분리합니다. 그러나, 우리는 정화 synaptosomes의 수확량을 증가 3%, 10%와 23% 그라데이션 솔루션을 설정 합니다. Immunopanning 이다 및 microglial 세포에 대 한 지침 또한이 방법에서 수정 됩니다. 원래 프로토콜21 패닝의 목표 정화만 이다 BSL-1, 2 차 전용, CD45, O4, 및 Itgb5를 사용 하는 (마우스에 대 한 HepaCAM) immunopanning 주문으로. 우리 CD45, 보조 전용, BSL-1, O4, 및 Itgb5 순서 변경 이후 BSL-1, 2 차 전용 접시는 내 피 세포 뿐만 아니라 microglia 제거 됩니다, (마우스에 대 한 HepaCAM) microglia는 CD45에서 접시를 팬의 수익률 증가. 이 프로토콜에서 우리는 또한 SD 쥐 새끼를 끼얹는다 (~ P7-P10) CD45 양성 비 microglial 인구에서 오염을 최소화 하기 위해 다양 한 혈액 세포를 제거 하는 순환 시스템을 통해 DPBS와.

생체 외에서 먹어서 분석 결과의 몇 가지 이점이 있다. Synaptosome 활용에 사용 되는 산도 표시기만 낮은 pH 조건에서 빨간색 형광을 방출 한다. 따라서, 데이터를 처리할 때 우리 수 있습니다 직접 계량 배경 신호 또는 복잡 한 이미징 분석의 내부 몸부림치 소재의 공동 화 된 신호를 제거 하는 냉각 절차 없이 phagocytic 이벤트의 신호로 빨간 형광 식 세포입니다. 또한,이 메서드는 여러 개의 시간 지점에서 주어진된 수익 내 pH 지시자 강도의 이미지를 복용 하 여 폐해 먹어서의 실시간 추적을 수 있습니다. PH 지시자 강도 저하 뿐만 아니라 engulfment 100 h, 그래프를 생성 하 여 능력 조건과 다른 세포 사이 쉽게 모니터링할 수 있습니다. 또 다른 이점은 synaptosomes의 사용 이다. 때문에 이다 ensheathe synapses 그들의 벌금과 함께 모든 시간을 처리 하 고 되었습니다 아마 vivo에서시 냅 스4를 표시, 생체 외에서 phagocytic 용량의 이다 측정 하는 데 매우 적합은 synaptosomes를 사용 하 여. 마지막으로,이 생체 외에서 먹어서 분석 결과 다양 한 신경 장애 관련 있는 myelin 파편 또는 아 밀 로이드 베타의 폐해 먹어서 연구 개발 될 가능성이 있다.

증가 평균 수명, 신경 퇴행 성 질환 환자 수 증가 불가피 하다. Glial 세포를 통해 시 냅 스 손실 여러 신경 질환13,14에서 선도 하는 요인 중 하나입니다. 또한, 비정상적인 시 냅 스 가지 치기와 뇌 항상성의 불균형은 폐해 먹어서 결함와 연결할 수 있습니다. 따라서 요소와 화합물 이다의 engulfment 및 저하 용량을 제어할 수 있는 다양 한 신경 질환에 대 한 성공적인 치료를 찾는 중요 한 수 있습니다. 이후이 생체 외에서 먹어서 분석 결과 multiwell 격판덮개로 쉽게 확장할 수,이 방법은 식별 등의 요소를 다양 한 검 진을 위해 적합 한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자 감사 연-주 정 그녀의 실험적인 지원에 대 한 synaptosome 정화와 Jungjoo 공원 동안 PS 노출 synaptosomes의 이미지. 또한, 우리는 유용한 토론에 대 한 정의 실험실에서 모든 회원을 감사합니다. 이 작품은 한국 정부 (MSIP) (NRF 2016M3C7A1905391와 NRF-2016R1C1B3006969)에 의해 투자 하는 한국 (NRF) 부여의 국립 연구 재단에 의해 지원 되었다 (W. S. C)입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synaptosome purification
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 BIO-RAD 5000202
pH indicator conjugation
Dimethyl sulfoxide(DMSO) LPS solution DMSO100
pHrodo red, succinimidyl ester Molecula probes P36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) Sigma E7510
Bovine serum albumin Bovogen BSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase) Worthington Is002007
(DMEM) Gibco 11960-044
(dPBS) Welgene LB001-02
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) Vector Labs L-1100
Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) Jackson ImmunoResearch 115-005-044
Goat anti-mouse IgM (μ-chain) Jackson ImmunoResearch 115-005-020
Heparin-binding epidermal growth factor Sigma E4643
Human HepaCAM antibody R&D systems MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) eBioscience 14-0497-82
L-cysteine Sigma C7880
L-glutamate Gibco 25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC) Sigma A8199
Neurobasal media Gibco 21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) Bansal et al.23
Papain Worthington Is003126
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Pluristrainer 20 μm PluriSelect 43-50020-03
Poly-D-lysine Sigma P6407
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Purified rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen 550539
Purified mouse anti-rat CD45 BD Pharmingen 554875
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sodium selenite Sigma S5261
Transferrin Sigma T1147
Trypsin Sigma T9935
Trypsin inhibitor Worthington LS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) Beckman Coulter 344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) PALL MAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) PALL MAP030C37
Phagocytosis live imaging assay
Juli stage NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

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References

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Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).More

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).

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