Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En roman In Vitro Live-imaging test av Astrocyten-medierad fagocytos med pH-indikator-konjugerad Synaptosomes

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/56647
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

Summary

Detta protokoll presenterar ett in vitro- live-imaging fagocytos test för att mäta fagocytos kapacitet av astrocyter. Renat råtta astrocyter och mikroglia används tillsammans med pH-indikator-konjugerad synaptosomes. Denna metod kan upptäcka realtid omvälvning och nedbrytning kinetik och ger en lämplig screening plattform för att identifiera faktorer som modulerande Astrocyten fagocytos.

Abstract

Astrocyter är den stora Celltypen i hjärnan och direkt kontakta synapser och blodkärl. Trots mikrogliaceller har betraktat den stora immunceller och endast fagocyter i hjärnan, har nyligen genomförda studier visat att astrocyterna också delta i olika fagocytos processer, såsom utvecklingsmässiga synaps eliminering och clearance av beta-amyloid plack vid Alzheimers sjukdom (AD). Trots dessa fynd är effektiviteten i Astrocyten omvälvning och nedbrytning av deras mål oklart jämfört med mikroglia. Denna brist på information är mestadels på grund av en analyssystem där kineticsen av Astrocyten - och mikroglia-medierad fagocytos enkelt jämförbara. För att uppnå detta mål, har vi utvecklat en långsiktig live-imaging i vitro fagocytos analys för att utvärdera renat astrocyter och mikroglia fagocytos kapacitet. I denna analys är realtid detektering av omvälvning och nedbrytning möjligt med hjälp av pH-indikator-konjugerad synaptosomes, som avger ljus röd fluorescens i sura organeller, såsom lysosomer. Våra roman analys ger enkel och effektiv upptäckt av fagocytos genom live-imaging. Denna i vitro fagocytos analys kan dessutom användas som screening plattform för att identifiera kemikalier och föreningar som kan förbättra eller hämmar astrocyter fagocytos kapacitet. Synaptic beskärning fel och patogena protein ackumulering har visat sig orsaka psykiska störningar eller neurodegenerativa sjukdomar, kemikalier och föreningar som modulerar gliaceller fagocytos kapacitet bör vara till hjälp vid behandling av olika neurologiska störningar.

Introduction

Gliaceller, som hänvisar till icke-retbara celler i hjärnan, är den stora Celltypen i det centrala nervsystemet (CNS). Tidigare betraktades gliaceller som enbart stödjande celler som främst spelar passiva roller att upprätthålla neuronal överlevnad och basala synaptic egenskaper. Nya bevis har emellertid avslöjat att gliaceller spelar en mer aktiv roll i olika aspekter av neurobiologi, såsom att upprätthålla hjärnan homeostas, medla synaps bildas1,2,3 och synapsen eliminering4,5, och modulerande synaptisk plasticitet6,7. Glial celler i CNS är astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter. Bland dessa celler, astrocyter och mikroglia har visat sig spela fagocytos roller genom omvärvande synapser4,5, apoptotiska celler8, neurala skräp9och patogena proteiner, såsom beta-amyloid plack10,11. I hjärnans utveckling eliminera astrocyter synapser i dorsala laterala geniculate kärnan (dLGN) genom MERTK - och MEGF10-beroende fagocytos4. På samma sätt eliminera mikroglia också C1q-belagda synapser under utvecklingsstadier genom den klassiska komplement cascade5. Intressant, har det föreslagits att defekter i synapsen beskärning kan vara en av initiativtagarna till flera neurologiska sjukdomar. Det har exempelvis visat att mutationer i komplement komponent 4 (C4), vilket ökar komplement-medierad synaps beskärning av mikroglia, är starkt förknippat med förekomsten av schizofreni i människor12. En nyligen papper har också visat att den klassiska komplementbanan är hyperactivated i de inledande stadierna av AD och inducerar tidig synaps förlust i denna sjukdom13.

Jämfört med mikroglia-medierad fagocytos, är huruvida Astrocyten-medierad fagocytos bidrar till initiering och progression av olika neurologiska sjukdomar mindre tydlig. En nyligen papper antyder dock att faktorer som ändrar frekvensen av normal synaps beskärning av astrocyter kan störa hjärnan homeostas och bidrar till AD känslighet och patologi14. Graden av synaps beskärning av astrocyter styrs kraftfullt av ApoE isomerer, med en skyddande allel för AD (ApoE2) starkt förbättra hastigheten och en risk-allel för AD (ApoE4) avsevärt sänka hastigheten. Transgena möss uttrycker ApoE4 ackumulerade dessutom mycket mer synaptic C1q än kontroll eller ApoE2 möss14. Dessa data tyder på att nedsatt Astrocyten-medierad fagocytos i början AD hjärna kan inducera ackumulering av senescent C1q-belagda synapser/synaptic skräp som aktiverar komplement-medierad mikrogliala fagocytos, körning synaptic degeneration . Astrocyter i ApoE4 bärare nedsatt fagocytos kapacitet kan också bidra till okontrollerad ansamling av beta-amyloid plack i AD-drabbade hjärnor.

Det har dessutom visat att gliaceller i åldern Drosophila hjärnan förlorar sin fagocytos kapacitet på grund av minskad översättning av Draper, en homolog av Megf10 som astrocyter använder för phagocytosing synapser. Återställa Draper nivåer räddade fagocytos kapacitet av gliaceller, som effektivt rensas skadade axonal skräp i år hjärnan i liknande utsträckning som i den unga hjärnan, som anger att åldrande-inducerad förändringar i fagocytos kapacitet astrocyter kan bidra till störningar av hjärnans homeostas15.

Baserat på dessa nya rön, kan modulerande astrocyter fagocytos kapacitet vara en attraktiv terapeutiska strategi att förebygga och behandla olika neurologiska sjukdomar. I detta avseende har förekommit flera försök att öka fagocytos kapacitet av astrocyter, exempelvis genom att inducera försurning av lysosomer med sura nanopartiklar16 och överuttryck transkriptionsfaktor EB (TFEB), vilket kan öka Lysosomen biogenes17. Trots dessa försök är det fortfarande oklart hur astrocyter och mikrogliaceller skiljer sig i deras fagocytos kinetik och huruvida vi bör öka eller minska sin fagocytos kapacitet i olika sjukdomar.

I detta papper presentera vi en roman in vitro- test för att påvisa fagocytos kapacitet av astrocyter i realtid. Uppgifterna visar olika kinetik av omvälvning och nedbrytning i astrocyter och mikroglia. Astrocyten denvillkorade medium (ACM), som innehåller utsöndrade faktorer från astrocyter, är avgörande för effektiv fagocytos av både astrocyter och mikroglia. Dessutom spelar Megf10, en fagocytos receptor i astrocyter och en homolog Ced-1 och Draper, avgörande roller i Astrocyten-medierad fagocytos8,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av The Korea Advanced Institute of Science och Technology institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC), KA2016-08.

1. synaptosome rening

Obs: Dessa förfaranden är anpassade från en tidigare publicerade papper19 med flera ändringar för att förbättra avkastningen av renat synaptosomes (figur 1).

  1. Förbered diskontinuerligt täthet lutning.
    1. Placera följande på isen: 3%, 10% och 23% täthet lutning lösningar i gradient buffert (ta till 250 mL vatten med 109.54 g sackaros, 606 mg Tris och 5 mL 0,2 M EDTA, pH 7,4); homogeniserande buffert (tillsätt 25 mL 4 x gradient buffert och 500 µL av 50 mM DTT i 74,5 mL vatten); Homogenisatorer mortel och stöt.
      Obs: Täthet lutning lösning och förberedelse presenteras i tabell 1. För att förbereda 3%, 10% och 23% täthet lutning lösningar, använder du rå densitet gradient lösningen.
    2. Förbereda sex Ultra klart centrifugrör per tre vuxna möss.
    3. Lägga till 3 mL 23% täthet lutning lösning på undersidan av varje centrifugrör med 1 mL pipett. Långsamt gör därefter ett lager med 3 mL 10% täthet lutning lösning ovanpå 23% täthet lutning lösningen med en betesmark pipetten och 1 mL pipett. Slutligen tillsätts 3 mL 3% täthet lutning lösning på toppen. I det här steget försiktig för att undvika att införa bubblor.
    4. Täck Centrifugera rören med plastfolie och hålla rören på is.
  2. Precool en höghastighets centrifug och ultracentrifugen till 4 ° C.
  3. Sterilisera Kirurgiska utrustning (drift sax, Castroviejo våren sax och böjd pincett) med 70% etanol. Förbereda en litet glasbägare med 25 mL homogeniserande buffert på is och väger bägaren.
  4. Extrahera hjärnor från tre vuxna (cirka 12 veckor gamla) manliga möss.
    1. Rubba halskotan och skär halsen med sax. Dra av huden på huvudet och skalle längs mittlinjen använder operativa sax och böjd pincett. Punktskatt på luktsinnet lökar och lillhjärnan med Castroviejo våren sax.
  5. Att sätta återstående hjärnor i bägaren med böjda pincetten och väger hjärnan. Skölj hjärnor flera gånger med iskall homogeniserande buffert att ta bort blod på ytan av hjärnor.
    Obs: Tidigare, 9 mL homogeniserande buffert till 1 g av hjärnans vävnader rekommenderades.
  6. Tillsätt 4 mL homogenisering buffert och 1 g av hjärnans vävnader till Homogenisatorer murbruk. Lägga till medan homogenisering hjärnor, homogenisering buffert upp till 8 mL.
  7. Dela upp blandningen i två 50 mL höghastighetståg centrifugrör. Tvätta morteln med 1 mL färsk homogeniserande buffert och lägga till den i rören.
    Försiktighet: Gå igenom steg 1,3-1,7 så snabbt som möjligt. Mindre än 20 min rekommenderas.
  8. Centrifugera i homogenates i höghastighetståg centrifugrör vid 1 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C med långsammare bromsar.
    Obs: Ange retardation (broms) på två eller tre när maximal retardation är nio.
  9. Försiktigt lägga supernatanten till en ny 50 mL tub och lägga till upp till 12 mL homogeniserande buffert.
  10. Försiktigt och långsamt pipett 2 mL utspädd supernatanten över 3% täthet lutning lösningen med en 1 mL pipett och placera rören på is.
  11. Centrifugera vid 31.000 x g i 5 minuter vid 4 ° C med inga bromsar.
    Obs: Ange retardation på en (noll) eller kusten.
  12. Placera rören på is och samla in den synaptosome fraktionen mellan 23% täthet lutning lösning och 10% täthet lutning lösning med pipett 2 mL i en 50 mL tub. Lägg till iskall sackaros/EDTA buffra upp till 80 mL och dela den i fyra 50 mL höghastighetståg centrifugrör.
    Obs: Se figur 3 för fraktionerade synaptosomes med märkta lutningar.
  13. Centrifugera vid 20 000 x g under 30 minuter vid 4 ° c med färre avbrott.
    Obs: Ange retardation på två eller tre när maximal retardation är nio.
  14. Försiktigt avlägsna supernatanten med 1 mL pipett, återsuspendera pelleten synaptosome med 1 mL isoton fysiologisk buffert (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES och 10 mM glukos, pH 7,4)20. Tillsätt 1 mL 10% DMSO i isoton fysiologisk buffert (slutlig koncentration av DMSO: 5%) och samla synaptosomes i en 50 mL höghastighetståg centrifugrör.
  15. Alikvotens 1 mL i 1,5 mL rör. Mätning av protein koncentrationen av de synaptosomes med Bradford-analys.
  16. Snabbt frysa rören och förvara rören i en-80 ° C frys tills pH indikatorn konjugation.

2. pH indikatorn konjugation

  1. Centrifugera 1,5 mL rör med synaptosomes vid 21,092 x g under 3-4 minuter vid 4 ° C.
  2. Ta bort supernatanten, tillsätt 200 µL 0,1 M Na2CO3 och blanda väl genom pipettering.
    Obs: Na2CO3 lades för att höja pH som succinimidyl ester mest effektivt reagerar med primära aminer vid svagt alkaliskt pH.
  3. Tillsätt 2 µL pH-indikator i röret och försiktigt vortex.
    Varning: Använd 1 µL pH-indikator per 0,3 mg av synaptosome lösning.
  4. Minimera ljus exponering genom att täcka rören med aluminiumfolie och inkubera i 1-2 h i rumstemperatur (RT) dem i en twist shaker med mild agitation vid 30-40 rpm.
  5. Stoppa agitation och tillsätt 1 mL DPBS.
  6. Centrifugera rören vid 21,092 x g för 1-2 min.
  7. Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 mL av DPBS till återsuspendera pelleten av mild pipettering.
  8. Upprepa steg 2,6-2,7 minst sju gånger att ta bort obundna pH-indikator.
  9. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med 200 µL DPBS med 5% DMSO.
    Obs: vid denna punkt, alla synaptosomes är icke-funktionella. Vi har bekräftat att Fosfatidylserin (PS) har varit utsatt för yttre membranet i synaptosomes, som fungerar som en ”äta-mig” signal (figur 4).

3. astrocyter och mikroglia rening

Obs: Detta protokoll för Astrocyten rening är anpassade från en tidigare publicerade papper21. I detta protokoll beskrivs rening av råtta astrocyter och mikroglia. Särskilda förfaranden för renande mus astrocyter och mikroglia beskrivs också i noterna.

  1. Dagen innan rening
    1. Förbereda pre-belagda cell kultur rätter och lösningar.
    2. Förbereda fem 145 mm x 20 mm petriskålar med 25 mL av 50 mM Tris-HCl (pH 9,5). Placera primär eller sekundär antikropp behandling i Petriskålarna separat som beskrivs nedan. Inkubera rätter i frysen över natten.
      BSL-1 maträtt: 20 µL av 5 mg/mL BSL-1 (Griffonia simplicifolia lektin)
      Endast sekundärt maträtt: 60 µL av 2,4 mg/mL get antimus IgG + IgM (H + L)
      CD45 maträtt: 60 µL av 2,4 mg/mL get antimus IgG + IgM (H + L)
      O4 maträtt: 60 µL av 2,4 mg/mL get antimus IgM (µ-kedjan specifik)
      Itgb5 (Integrin β5) maträtt för råtta astrocyter: 60 µL av 2,4 mg/mL get antimus IgG + IgM (H + L)
      Obs: Om du vill bifoga sekundär antikropp hydrofoba ytan av petriskål, rekommenderas långsam fastsättning vid låga temperaturer. Det är dock möjligt att belägga petriskål med sekundär antikropp för 2 h vid 37 ° C. Antikroppar för Astrocyten panorering används på olika sätt beroende på vilken djurart; exempelvis HepaCAM maträtt för mus astrocyter: 60 µL av 2,4 mg/mL get antimus IgG + IgM (H + L)
  2. Dag för rening
    1. Förbereda för immunopanning.
    2. Förbereda 50 mL rör och lägga till lager i rören. Detaljerade stamlösning preparatet presenteras i tabell 1.
      1. Förbereda Tube 1 (enzym): 22 mL enzym lager (enzym stock: 1 x Earle balanserad saltlösning (EBSS)+0.46% D (+)-glukos + 26 mM NaHCO3 och0,5 mM EDTA).
      2. Förbereda Tube 2 (låg Ovo): 42 mL hämmare lager (hämmare stock: 1 x EBSS+0.46% D (+)-glukos + 26 Mm NaHCO3).
      3. Förbereda Tube 3 (hög Ovo): 10 mL hämmare lager.
    3. Fäst 0,22 µm spruta filter tips av 2 mL pipetter ansluten till en CO2 (95% O2 och 5% CO2) tank. Bubbla CO2 i rör 1-3. Stoppa bubblande när lösningarna av orange.
    4. Slutföra lösningarna.
      Försiktighet: Komplett och Inkubera röret 1 lösningen på 34 ° C under 15 minuter innan du använder enzym aktivering.
      1. Förbereda Tube 1 (enzym): 22 mL av enzymet lager + 180 U papain + 0,004 g L-cystein.
      2. Förbereda Tube 2 (låg Ovo): 42 mL av hämmare lager + 3 mL låg Ovo + 200 µL av DNAS.
      3. Förbereda Tube 3 (hög Ovo): 10 mL av hämmare lager + 2 mL hög Ovo + 20 µL av DNAS.
      4. Förbereda Tube 4 (0,2% BSA): 19 mL av 1 X DPBS + 1 mL 4% BSA + 8 µL av DNAS.
      5. Förbereda Tube 5 (0,02% BSA): 45 mL 1 X DPBS + 5 mL tub 4 + 50 µL av DNAS.
    5. Värm ett vatten bad och värme block på 34 ° C.
  3. Extrahera råtta cortex.
    1. Sterilisera Kirurgiska utrustning med 70% etanol och förbereda 100 mm petriskålar med DPBS.
    2. Förbereda en akryl box. Lägg två till tre lager av vävnader i botten av lådan och tillsätt 1 mL av isofluran i rutan.
    3. Söva pups för 20-40 s i rutan och bekräfta anesthetization av foten nypa med pincett. Utsätta den hjärta22 och BEGJUTA valpar med en 10 mL spruta med DPBS.
      Obs: Perfusion används för att undvika blodkroppar kontaminering under mikroglia panorering steg.
    4. Skär den pup övre cervikal raden av halsen med operativa sax och incisionsfilm huvud huden längs mittlinjen. Gör ett snitt på skallen längs mittlinjen och öppna skallen med böjd pincett.
    5. Punktskatt lillhjärnan med Castroviejo våren sax. Ta ut resterande hjärnan och placera den i en 100 mm petriskål fylld med DPBS.
    6. Ta bort andra områden såsom mitthjärnan och hippocampus från cortex med Castroviejo våren sax under mikroskopet. Ta bort hjärnhinnor med fin pincett.
    7. Överför cortex till en ny maträtt som 60 mm och ta bort den återstående DPBS i skålen. Hacka vävnaden med nr 10 blad.
  4. Separera cortex till en enda cellsuspension
    1. Filtrerade Tube 1 lösningen i en 60 mm skål och tillsätt 50 µL av DNase1. Snurra lösningen i skålen.
      Obs: DNAS används för att hämma aggregering av DNA från brusten celler.
    2. Placera skålen i ett 34 ° C värme block och täck med ett lock med ett hål i mitten. Använd en lödkolv för att göra hålet i locket på 60 mm petriskål.
    3. Anslut 22-µm spruta filter till en CO2 tank röret och placera filter spetsen i hålet.
    4. Inkubera skålen på 34 ° C i 45 min. virvel lösningen i skålen var 10-15 min.
  5. Slut beredningen av panorering rätter.
    1. Ta bort de panorering rätter som har belagts med sekundära antikroppar från frysen dagen före tid. Lämna BSL-1 maträtt och sekundär antikropp-bara maträtt på RT.
    2. Diska andra tre gånger med 20 mL DPBS.
    3. Häll en tillräcklig mängd 0,02% BSA i rätterna. Placera specifika primära antikroppar i de motsvarande rätterna:
      CD45 maträtt: 12 mL 0,02% BSA + 20 µL 0,5 mg/ml råtta antimus CD45
      Itgb5 maträtt: 12 mL 0,02% BSA + 20 µL 0,5 mg/ml Itgb5
      O4 maträtt: 8 mL 0,02% BSA och 4 mL O4 antikropp
      Obs: För mus immunopanning, använda musen anti råtta CD45 (0,5 mg/mL) för mikroglia och HepaCAM (0,5 mg/mL) för astrocyter.
    4. Förbereda 30 mL 30% FBS med neurobasal media och 10 mL 1 X EBSS. Värm upp båda lösningarna i 34 ° C vattenbad.
  6. Hämma papain reaktionen.
    1. Överföra papain-behandlade vävnader till en ny 50 mL tub. Vänta på vävnaderna sedimentera. Aspirera vätska genom undertryck.
    2. Tillsätt 4 mL låg Ovo lösning till röret och snurra lösningen för att tvätta cellerna.
    3. Upprepa steg 3.6.1-3.6.2 tre gånger för att stoppa reaktionen enzym.
  7. Pulverisera cortex vävnader.
    1. Tillsätt 6 mL låg Ovo till badkaret. Aspirera och släpp vävnader snabbt med 5 mL pipett.
      Försiktighet: Inte införa bubblor.
    2. Förbered en ny 50 mL tub och tillsätt 5 mL av låg Ovo. Samla in enstaka celler i en ny tub.
    3. Upprepa steg 3.6.1-3.6.2 två gånger och ändra den 5-mL pipetten till 1 mL pipett.
    4. Upprepa trituration tills mer än 95% av vävnaderna inte syns.
    5. Gör ett lager av hög Ovo lösning från röret 3 med 10 mL pipett nedanför låg Ovo-innehållande separerade celler.
    6. Centrifugera vid 190 x g i 6 min med några bromsar.
      Obs: Ange retardation på en eller två när maximal retardation är nio.
  8. Filtratet enstaka celler.
    1. Aspirera supernatanten genom sug försiktigt och återsuspendera pelleten med 3 mL 0,02% BSA lösning med en 1 mL pipett.
    2. Tillsätt 0,02% BSA lösning upp till 9 mL.
    3. Förbered en ny 50 mL tub och 20 µm cell silen ovanpå röret. Våta cellen silen med 1 mL 0,02% BSA lösning.
    4. Över enda cell till cell Silen. Filtrera 1 mL i taget.
    5. Tvätta cell silen med 3 mL 0,02% BSA lösning. Gör inte mer än 15 mL av den filtrerade enda cellsuspensionen.
    6. Inkubera röret i 34 ° C vattenbad för 45-60 min för cell återhämtning. Det cell återhämtning steget möjliggör relocalization av cellen ytproteiner till membranet.
  9. Utföra panorering av cellerna.
    1. Tvätta CD45 panorering skålen tre gånger med 20 mL DPBS. Tvätta varje maträtt tre gånger med 20 mL av DPBS omedelbart före användning.
    2. Häll den enda cellsuspension i CD45 panorering maträtt. Låt skålen för 28 min och skaka skålen för 14 min. Ta bort obundna celler från botten, försiktigt skaka skålen.
    3. Överföra cellsuspensionen till endast sekundär-skålen. Vänta i 20 min och försiktigt skaka skålen för 10 min. Hämta mikroglia från CD45 maträtt, gå till steg 3.9.2.
    4. Överföra cellsuspensionen i BSL-1 skålen. Låt skålen för 10-12 min.
    5. Överför till O4 skålen. Vänta i 20 min och skaka i 10 min.
    6. Överföra till Itgb5 skålen. Låt skålen för 40 min och skaka försiktigt varje 10 min.
      Obs: För muspanorering, överföra cellsuspensionen i HepaCAM skålen.
  10. Lossa cellerna från skålen.
    1. Blanda 400 µL av trypsin (30.000 U/mL i EBSS) med teststamman 8 mL 1 X EBSS.
    2. Häll en avfall hink fristående cellsuspensionen i skålen.
    3. Tvätta skålen åtta gånger med DPBS.
    4. Häll 8 mL EBSS med trypsin i skålen.
    5. Inkubera skålen för 5 till 10 minuter i 37 ° C inkubatorn. Inkubera i 10 min för CD45 skålen och 5 min för de Itgb5 och HepaCAM rätterna.
    6. Tryck på skålen och observera skålen under ett mikroskop.
      Obs: Om de flesta av astrocyterna inte har lossnat, placera skålen i inkubatorn för en annan 5 min.
    7. Häll 10 mL 30% FBS i skålen att neutralisera trypsin.
    8. Pipettera upp och ner i hela skålen att lösgöra astrocyterna eller mikroglia.
    9. Över lösningen till en 50 mL tub.
    10. Tillsätt 10 mL 30% FBS och 200 µL av DNAS i skålen. Lossa cellerna igen. DNAS används för att hämma aggregering av DNA från brusten celler.
    11. Över lösningen till röret. Om cellerna finns kvar i skålen, tillsätt en annan 10 mL 30% FBS och lossa cellerna igen.
  11. Platta celler.
    1. Centrifugera röret på 213 x g i 10 min.
    2. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med media.
      Obs: Använd immunopanned Astrocyten grundläggande media (IP-ABM) för astrocyter och retinal mikroglia grundläggande media (MBM) med immunopanned Astrocyten denvillkorade media (IP-ACM) för mikroglia. IP-ABM och MBM kompositioner presenteras i Tabell för material.
    3. Räkna cellerna med en hemocytometer.
    4. Tallrik av astrocyter och mikroglia separat i PDL-belagda plattor.
      Obs: Förbereda PDL-belagd plattan innan användning. För att förbereda PDL-belagda plattor, tillsätt 50 µL av 1 mg/mL poly-D-lysin i 5 mL destillerat vatten och häll en tillräcklig mängd lösning i väl plattan/skålen, och vänta 30 min. Tvätta plattan/skålen tre gånger med destillerat vatten.
    5. Inkubera plattan. Ändra hälften av media varje 7 dagar för astrocyter och 3 dagar för mikroglia.

4. samla IP-ACM

  1. Förbereda en 100 mm maträtt när astrocyter är alltför konfluenta.
  2. Ignorera media och tvätta skålen tre gånger med 10 mL DPBS.
  3. Häll 15 mL låg protein media i skålen.
    Observera: Låg protein media sammansättning presenteras i Tabell för material.
  4. Inkubera skålen i 7-10 dagar i 37 ° C inkubatorn.
  5. Samla och koncentrera media med 10k (eller 30k) centrifugal filter tubes.
  6. Centrifugera rören vid 851 x g vid 4 ° C.
    Obs: Centrifugera rören tills återstående media är mindre än 1 mL.
  7. Samla koncentrerad media (IP-ACM) in i en ny 1,5 mL tub.
  8. Mätning av koncentrationen av IP-ACM använder kvantitativ analys

5. fagocytos Live-imaging test (figur 2)

  1. Förbereda en 24-well platta (eller någon tallrik/maträtt som är förberedd för live-imaging) i vilken astrocyter är konfluenta (generellt, 7 till 10 dagar för inkubation efter rening är idealisk för att stabilisera cellerna).
  2. Ta bort media i varje brunn och Tvätta brunnarna med 1 mL DPBS, tre gånger. För att minimera luft exponering, Tvätta brunnarna snabbt.
  3. Tillsätt 300 µL av IP-ABM med 5 µL av pH-indikator-konjugerad synaptosomes och ytterligare faktorer såsom IP-ACM som kan modulera glial cell fagocytos.
  4. Inkubera plattan i en CO2 inkubator för 40 min. Detta steg kan pH indikatorn-konjugerad synaptosomes sedimentera till botten av plattorna.
  5. Ta bort media med obundna pH-indikator-konjugerad synaptosomes och tvätta varje brunn med 1 mL DPBS, tre gånger.
    Försiktighet: Tvätta inte hårt. För att minimera luft exponering, Tvätta brunnarna snabbt.
  6. Tillsätt 500 µL av IP-ABM med ytterligare faktorer att testa i brunnar.
  7. Ta plattan till ett live-imaging instrument och välj positioner. Justera fokus, exponeringstid, ljusstyrka och LED power.
    Obs: Inställningar för exponeringstid, ljusstyrka och LED power är variabel beroende på fluorescensintensiteten och syftet med experimentet. I live-imaging analysen med pH-indikator-konjugerad synaptosomes, vi brukar ställa in dessa värden enligt följande: exponering: ~ 150-200 ms, ljusstyrka: 15, och LED power: 4-6.
  8. Ställa in bildformat, tidsintervall och det totala antalet cykler för live-imaging. Ange tidsintervallet till 1 eller 2 h beroende på hur många positioner väljs. 2 timmars intervaller rekommenderas när mer än 150 positioner väljs för live-imaging.
  9. Starta live-imaging experimenten.
  10. Analysera data.
    1. Öppna programmet Fiji.
    2. Importera en bildsekvens. Konvertera bilder till 8-bitars gråskala.
    3. Utföra bakgrund subtraktion med en rullande bar radie på 50 pixlar.
    4. Start tid serien analyzer V3 plugins.
      Observera: Adressen för tiden serien analyzer V3 plugins presenteras i Tabell för material.
    5. Drar regionen av intresse (ROI) i bilden och klicka på Lägg till i ROI manager.
    6. Klicka på ”få total intensitet” i tidsserien V3_0.
    7. Spara resultaten och integrera data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denna i vitro fagocytos analys med långsiktiga live-imaging använde vi synaptosomes från vuxen mus hjärnan homogenates, som avskildes i gradient lösningen mellan 23% lutning lösning och 10% lutning lösning genom ultracentrifugering ( (Se figur 3). Efter beredning exponerade synaptosomes PS i deras yttre membran (figur 4), vilket tyder på att de förlorat sin funktion och kunde kännas igen av PS receptorer i astrocyter och mikroglia. I figur 5visas som pH-indikator-konjugerad synaptosomes avges ljus röd fluorescens när de var uppslukas av astrocyter. Realtid jämförelse av gliaceller omvälvning och nedbrytning kapacitet är möjligt genom att ta flera bilder av en ROI varje 1 eller 2 h (kompletterande film 1, kompletterande Movie 2). Med den här metoden visat vi olika kinetik för Astrocyten - och mikroglia-medierad fagocytos (figur 6). För att kvantifiera fagocytos av gliaceller, mättes området (µm2) röd fluorescens signal, som kallas phagocytic index i figur 6B och figur 7. Även om astrocyterna verkade vara effektiva i phagocytosing stora mängder pH-indikator-konjugerad synaptosomes, mikroglia var snabbare på omvärvande och förnedrande synaptosomes (figur 6B). Mikroglia visade maximal pH indikatorn intensitet på 26 h efter pH-indikator-konjugerad synaptosome behandling, medan astrocyter visade deras maximum på 45 h (p-värde < 0,05, tvåvägs ANOVA mellan Astrocyten med 1 X ACM och mikroglia med 1 X ACM). Jämväl, mikrogliaceller visade en 20,7% minskning av totala pH indikatorn intensitet 40 h efter peak, medan astrocyter visade en minskning på 17% i totala pH indikatorn intensitet under samma tidsperiod. Intressant, visade vår data att Astrocyten-utsöndras faktorer, som innehölls i ACM, är avgörande för att öka både Astrocyten - och mikroglia-medierad fagocytos (figur 6B). Astrocyterna har visat att släppa överbryggande molekyler, såsom MFGE8, GAS6 och proteiner, som kan överbrygga och inducera interaktioner mellan fagocytos receptorer och ”äta-mig” signaler såsom PS23. Som nämnts ovan, eliminera astrocyter synapser via MERTK och MEGF10 vägar4. MEGF10 uttrycks endast av astrocyter i hjärnan och medverkar i synapsen omvälvning genom igenkännande ”äta-mig” signaler med okänd identitet. Överens med tidigare rön visade analysen att jämfört med vildtyp (WT) mus astrocyter, Megf10 knock-out (KO) mus astrocyter besatt signifikant försämrad fagocytos kapacitet (figur 7). Jämfört med WT astrocyter, Megf10 KO astrocyter visade en cirka 40% minskning av totala pH indikatorn intensitet vid den högsta punkten (31 h) (figur 7).

Figure 1
Figur 1. Schematisk av Astrocyten rening med immunopanning metoder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Schematisk av fagocytos live-imaging assay. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Representativa hjärnan Homogenatet fraktionering i gradient lösningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Representativa bilder av PS-exponerade synaptosomes. (A) A ljusa fältet bild av astrocyter med synaptosomes. Synaptosomes är kopplade till astrocyter. (B) en fluorescerande bild av tdTomato-positiva synaptosomes, som renas från tdTomato-uttryckande mus brains. (C) pSIVA binder till PS, som är utsatt för yttre membran av synaptosome, och avger grön fluorescens. (D) PS detekteras av pSIVA (grön) är samtidig lokaliserade med tdTomato-positiva synaptosomes (röd). Skalstapeln: 20 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Representativa ljusa fält och fluorescerande bilder av astrocyter med pH-indikator-konjugerad synaptosomes vid två tidpunkter. På 11 h efter behandling (nedre panelen), pH-indikator-konjugerad synaptosomes är uppslukade av astrocyter och avger röd fluorescens medan de gör inte på 1 h efter behandling (övre panel). Skalstapeln: 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Fagocytos kinetik av råtta astrocyter och mikroglia genom långsiktiga live-imaging. (A) A Schematisk bild av ett in vitro- fagocytos test med renat astrocyter och mikroglia tillsammans med pH-indikator-konjugerad synaptosomes. Observera att innan levande bilderna tas, obundna synaptosomes tvättas bort efter 40 min inkubering. (B) representativa grafer visar omvälvning och nedbrytning kineticsen av astrocyter och mikroglia. ACM, som innehåller Astrocyten-utsöndras faktorer, avsevärt förbättrar både Astrocyten - och mikroglia-medierad synaptosome upptag. Astrocyten: Kontroll vs. Astrocyten med ACM 1 X, ***, Tukey är flera jämförelser test. Mikroglia: Kontroll vs. mikroglia med ACM 1 X, ***, Tukey är flera jämförande test. Felstaplar visar S.E.M. *p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,0001, tvåvägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. Minskad fagocytos kapacitet av Megf10 KO mus astrocyter med 1 X ACM jämfört med WT mus astrocyter med 1 X ACM. WT vs Megf10 KO astrocyter med 1 X ACM, ***, tvåvägs ANOVA. Felstaplar visar S.E.M. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p≤0, 001 tvåvägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: lösning recept. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande film 1. En representativ live-imaging video visar fagocytos av pH-indikator-konjugerad synaptosomes av astrocyter. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande film 2. En representativ live-imaging video visar fagocytos av pH-indikator-konjugerad synaptosomes av mikrogliaceller. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna artikel presenterar vi metoder för en långsiktig live-imaging i vitro fagocytos analys med hjälp av renat gliaceller och pH-indikator-konjugerad synaptosomes. Vi visar att jämfört med mikroglia, astrocyter besitter olika omvälvning och nedbrytning kapacitet under fagocytos av synaptosomes. Dessutom tyder våra data på att Astrocyten-utsöndras faktorer, som innehåller överbryggande molekyler såsom GAS6, proteiner och MEGE8, är avgörande för effektiv PS-beroende fagocytos av gliaceller i hjärnan. Megf10 KO astrocyter visar dessutom defekt fagocytos av synaptosomes.

För att framgångsrikt utföra detta experiment, behöver media och DPBS bytas försiktigt under tvätt stegen (avsnitt 5). Primära odlade astrocyter och mikroglia, särskilt mikroglia, är sårbara för luft exponering. Därför är att minska tidsintervallen mellan tvätt steg kritiska för att upprätthålla levande celler. För att upprätta långsiktiga live-imaging med live-imaging instrument, rekommenderas manuell fokus eftersom autofokus kan öka laser/LED exponeringstid, vilket kan skada cellerna.

I denna metod, är synaptosome rening protokoll19 något modifierad. Ursprungliga papperet separerar gradient lösningar till 3%, 10%, 15% och 23%. Men satt vi upp 3%, 10% och 23% lutning lösningar att öka avkastningen av renat synaptosomes. Instruktionerna för immunopanning astrocyter och mikrogliaceller ändras också i denna metod. Målet med den ursprungliga panorering protokoll21 är att rena endast astrocyter och använda BSL-1, sekundär-bara, CD45, O4 och Itgb5 (HepaCAM för mus) som den immunopanning ordningen. Eftersom BSL-1 och endast för sekundära plattor kommer att ta bort endothelial celler samt mikroglia, vi ändrat ordningen till CD45, sekundär-bara, BSL-1, O4 och Itgb5 (HepaCAM för mus) att öka avkastningen av mikroglia från CD45 panorering maträtt. I detta protokoll, vi också perfusion SD råttungar (~ P7-P10) med DPBS via det cirkulatoriska systemet att ta bort olika blodkroppar för att minimera kontaminering från CD45-positiv icke-mikrogliala populationer.

I området i närheten finns det flera fördelar för fagocytos in vitro- analys. Den pH-indikator som används i synaptosome konjugation avger endast röd fluorescens i lågt pH förhållanden. Därför, när du bearbetar data, kan vi direkt kvantifiera röd fluorescens som en signal av fagocytos händelser utan ett släcka förfarande att ta bort bakgrunden signaler eller komplicerade bildanalys för att få samtidig lokaliserade signaler uppslukas material inuti fagocyter. Denna metod kan dessutom realtidsspårning av gliaceller fagocytos genom att ta bilder av pH indikatorn intensitet inom en given ROI vid flera tidpunkter. Genom att generera en graf med pH indikatorn intensitet upp till 100 h, den omvälvning liksom nedbrytning kan kapacitet övervakas enkelt mellan olika celler och villkor. En annan fördel är användningen av synaptosomes. Eftersom astrocyter ensheathe synapser hela tiden med sin fina processer och har visat att uppsluka synapser i vivo4, använda synaptosomes är mycket lämplig för att mäta in vitro- fagocytos kapacitet astrocyter. Slutligen, denna i vitro fagocytos analys har potential att utvecklas för att studera gliaceller fagocytos av myelin skräp eller amyloid beta, vilket är relaterat till olika neurologiska sjukdomar.

Med ökad medellivslängd är en dramatisk ökning av antalet patienter med neurodegenerativa sjukdomar oundvikligt. Synaps förlust genom gliaceller är en av de ledande faktorerna i flera neurodegenerativa sjukdomar13,14. Dessutom, kan onormal synaps beskärning och en obalans i hjärnan homeostas associeras med gliaceller fagocytos defekter. Därför kan identifierar faktorer och föreningar som kan styra omvälvning och nedbrytning kapacitetarna av astrocyter vara kritiska för att hitta framgångsrika behandlingar för olika neurologiska sjukdomar. Eftersom denna i vitro fagocytos analys kan enkelt skalas upp med rundbottnade plattor, kan denna metod användas som en lämplig plattform för olika filmvisningar för att identifiera sådana faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Yeon-Joo Jung för hennes experimental stöd under synaptosome rening och Jungjoo Park för bilder av synaptosomes med PS exponering. Dessutom, tackar vi alla medlemmar i Chungs laboratorium för bra diskussion. Detta arbete stöds av National Research Foundation av Korea (NRF) bidrag finansieras av den koreanska regeringen (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 och NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. (C).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synaptosome purification
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 BIO-RAD 5000202
pH indicator conjugation
Dimethyl sulfoxide(DMSO) LPS solution DMSO100
pHrodo red, succinimidyl ester Molecula probes P36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) Sigma E7510
Bovine serum albumin Bovogen BSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase) Worthington Is002007
(DMEM) Gibco 11960-044
(dPBS) Welgene LB001-02
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) Vector Labs L-1100
Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) Jackson ImmunoResearch 115-005-044
Goat anti-mouse IgM (μ-chain) Jackson ImmunoResearch 115-005-020
Heparin-binding epidermal growth factor Sigma E4643
Human HepaCAM antibody R&D systems MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) eBioscience 14-0497-82
L-cysteine Sigma C7880
L-glutamate Gibco 25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC) Sigma A8199
Neurobasal media Gibco 21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) Bansal et al.23
Papain Worthington Is003126
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Pluristrainer 20 μm PluriSelect 43-50020-03
Poly-D-lysine Sigma P6407
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Purified rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen 550539
Purified mouse anti-rat CD45 BD Pharmingen 554875
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sodium selenite Sigma S5261
Transferrin Sigma T1147
Trypsin Sigma T9935
Trypsin inhibitor Worthington LS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) Beckman Coulter 344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) PALL MAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) PALL MAP030C37
Phagocytosis live imaging assay
Juli stage NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  3. Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
  4. Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
  5. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  6. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
  7. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  8. Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
  9. Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
  10. Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
  11. Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
  12. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  13. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  14. Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
  15. Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
  16. Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
  17. Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
  18. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
  19. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
  20. Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
  21. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).

Tags

Neurovetenskap fråga 132 astrocyt mikroglia synaptosome pH-indikator fagocytos omvälvning nedbrytning live-imaging
En roman <em>In Vitro</em> Live-imaging test av Astrocyten-medierad fagocytos med pH-indikator-konjugerad Synaptosomes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel… More

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter