Summary
En este estudio, describimos el enfoque del canal semicircular posterior como un método confiable para la entrega del gene de oído interno en ratones neonatales. Mostramos que entrega del gene a través del canal semicircular posterior es capaz de inundar todo oído interno.
Abstract
Oído interno la terapia génica ofrece gran promesa como tratamiento potencial para la pérdida de oído y mareos. Uno de los determinantes críticos del éxito de la terapia génica de oído interno debe encontrar un método de entrega que se traduce en eficiencia de transducción consistente de tipos celulares específicos y reducir al mínimo pérdida de la audición. En este estudio, describimos el enfoque del canal semicircular posterior como un método viable para la entrega del gene de oído interno en ratones neonatales. Mostramos que entrega del gene a través del canal semicircular posterior es capaz de inundar todo oído interno. La fácil identificación anatómica del canal semicircular posterior, así como mínima manipulación del hueso temporal necesario, hacer este quirúrgico acercarse una opción atractiva para la entrega del gene de oído interno.
Introduction
Oído interno la terapia génica es un campo de rápido desarrollo de la investigación. Se ha aplicado en varios modelos de animales para combate ototoxicidad, traumatismo de ruido y de pérdida de audición hereditaria1. Varios estudios recientes han demostrado la recuperación funcional de la audición y las funciones de balance en ratones mutantes después de oído interno gene terapia entrega2,3,4,5,6, 7. uno de los principales factores en determinar el éxito de la terapia génica de oído interno es el método quirúrgico utilizado para acceder el oído interno. Idealmente, el acercamiento quirúrgico sería fácil de realizar, los hitos anatómicos sería consistente y fácil de identificar y la transducción resultante de tipos celulares específicos sería alta.
En un estudio reciente, demostró que cuando la terapia génica viral fue inyectada a través del canal semicircular posterior del ratón mutante whirler (un modelo de pérdida de la audición y la disfunción vestibular), transducción eficiente de células de pelo sensoriales fue visto en el vestibular órganos, así como en la cóclea5. La alta eficiencia de transducción de la célula de pelo sensorial dio lugar a la mejora de las funciones auditivas y vestibulares en estos ratones mutantes.
En este artículo, describimos en detalle el enfoque del canal semicircular posterior para tener acceso al oído interno de ratón neonatal.
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Protocol
Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el cuidado Animal y uso en el Instituto Nacional en sordera y otros trastornos de la comunicación (NIDCD ASP1378-15).
1. preparación y configuración del procedimiento
- Esterilizar todos los instrumentos de óxido de etileno en el inicio del experimento. Entre los animales, limpiar instrumentos usando esterilización del grano.
- Cargar la solución con terapia génica viral en una micropipeta en el inyector de micro. Los vectores virales utilizados en este estudio fue AAV2/8-whirlin (1 x 1013 copias de genoma por mililitro, consulte la tabla de materiales).
Nota: Típicamente, volumen total de 1,1 μl se carga en la micropipeta.
2. anestesia
Nota: La cepa de ratón utilizada en este estudio es el ratón whirler. Mutantes homocigóticos (Whrnwi/wi) y hermanos de camada heterozigóticos (Whrn+ wi) fueron utilizados.
- Lugar de la madre en una jaula separada (separada de la basura).
- Coloque la jaula casera que contiene basura (P0 - P5 PUP) sobre una almohadilla de calor recirculación (set a 37,5 ° C) para mantener calientes los ratones.
- Cortar la parte del pulgar de un guante de látex y colocar un cachorro en el mismo.
- Ponga el cachorro en pulgar guante de látex en un cubo de hielo durante 2 minutos.
- Coloque el cachorro anestesiado en un paquete de congelación plástico plaza comercial grande con una gasa de 4 "x 4" entre el cachorro y la superficie del paquete.
- Llenar un guante de látex resistente con hielo picado y coloque el guante de hielo alrededor de la cría.
- Verifique si el cachorro está adecuadamente anestesiado por la completa falta de respuesta a diversos estímulos (incluyendo una pizca del dedo del pie firme). Dejar el cachorro en el paquete de hielo para la duración de la cirugía (aproximadamente 5-10 min).
Nota: Se recomienda dejar los cachorros en el paquete de hielo para no más de 15 minutos durante la cirugía.
3. vía de abordaje (figura 1)
- Limpiar la piel detrás del oído con un paño de yodo y un paño con alcohol una vez que el animal está anestesiado.
- Haga una incisión postauricular ~ 2 mm detrás de la oreja usando micro tijeras y dividir el músculo esternocleidomastoideo con micro tijeras.
- Identificar el nervio facial y la bulla. La bulla es cartilaginosa y semitransparente a esta edad y se encuentra medial al nervio facial. La arteria stapedial puede verse a través de la bulla a esta edad, que es un punto de referencia útil.
- Seguir el nervio facial superior y posteriorly para localizar el canal semicircular posterior (PSCC). Quitar las fibras musculares y tejido blando que cubre el canal semicircular posterior con micro tijeras.
Nota: La PSCC es cartilaginosa a esta edad. - Penetrar la PSCC utilizando una micropipeta de vidrio (~ 10 μm de diámetro) en el inyector de micro.
- Inyectar la terapia génica viral en el oído interno.
Nota: Por lo general, un total de 20 inyecciones de 49 nL de la terapia del gene se entregan en el canal semicircular posterior más de ~ 40 s (μL volumen total ~ 1). El título viral utilizado era 1 x 1013 copias de genoma / mL. - Cerrar la incisión de piel con una sutura de poligalactina 5-0.
4. posoperatorio cuidado
- Colocar el cachorro sobre una almohadilla calentadora para restablecer la temperatura normal del cuerpo durante la recuperación de la anestesia con el manual constante estimulación/balanceo con guantes dedos humanos.
- Una vez que el cachorro está despierto, colocar en su jaula casera.
- Acariciar cada cachorro con un hisopo de algodón que ha sido expuesto a las camas jaula casera.
Nota: El propósito de esto es que los ratones huelen como lo hicieron antes de la cirugía, lo que aumenta la probabilidad de que la madre vuelva a aceptar después de la cirugía de su camada. Si es posible, orina de la madre puede ser recogido y frotado en los cachorros con un hisopo de algodón para disminuir aún más la probabilidad de rechazo. - Aplicar aceite mineral al nariz de la madre a desensibilizar su8y reintroducir a la madre en la jaula de la casa.
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Representative Results
Inyección de whirlin AAV8 terapia génica en ratones neonatales whirler a través del canal semicircular posterior dio lugar a whirlin expresión (verde) en células de pelo utricular (figura 2), con la eficiencia global de la infección del 53,1% (SD 38.1, n = 28)5 . Células transduced había alargado estereocilios (rojo) en comparación con las células de pelo de orejas no contralaterales (5.35 μm ± 2.11 vs 3,20 ± 0.34 μm, respectivamente)5.
Canal semicircular posterior inyección de whirlin AAV8 también resultó en la transducción de células de pelo cocleares en los ratones whirler (figura 3). La eficiencia de infección de la célula de pelo interna promedio fue de 77.1% (SD 12,7, n = 8)5. Células transduced expresó whirlin (verde) en las puntas de los estereocilios y había alargado estereocilios (rojo) en comparación con las células de pelo de orejas no contralaterales (5,04 μm ± 0,72 vs 1.01 ± 0.08 μm en el ápex coclear, respectivamente)5.
Figura 1 : Imágenes intraoperatorias.
Imágenes intraoperatorias mostrando acceso quirúrgico al canal semicircular posterior (PSCC) en un ratón de P0. El oído izquierdo se muestra. La PSCC está delineado en las líneas punteadas de negro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Células de pelo vestibulares son transduced mediante entrega del gene PSCC.
Whirlin AAV8 entregados vía la PSCC acercamiento dio lugar a altos niveles de infección de la célula de pelo utricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Células de pelo cocleares son transduced mediante entrega del gene PSCC.
Whirlin AAV8 entregados vía la PSCC acercamiento dio lugar a altos niveles de infección de células ciliadas cocleares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se han descrito varios abordajes quirúrgicos para tener acceso a roedores interior de orejas. Cochleostomy y enfoques de ventanas redondas son más utilizados para acceder a la cóclea, mientras que el canal semicircular posterior y el saco endolinfático enfoques se suelen utilizar para acceder a los órganos vestibulares1. En un estudio reciente, mostramos canal semicircular posterior inyecciones de terapia génica viral dio lugar a la alta eficacia de transducción de la célula de pelo en los órganos vestibulares y la cóclea5. De hecho, la transducción de células ciliadas cocleares fue mayor a través de las inyecciones del canal semicircular posterior, en comparación con las inyecciones de la ventana redonda en el mismo modelo de ratón de hipoacusia hereditaria y disfunción vestibular5,9. Dada la proximidad anatómica entre la ventana redonda y la cóclea, parece paradójico que las inyecciones de la ventana redonda pueden conducir a la transducción de células ciliadas cocleares inferior en comparación con las inyecciones del canal semicircular posterior. Este hallazgo puede explicarse por el hecho de que la ventana redonda está situada cerca del acueducto coclear. Por lo tanto, cuando la terapia génica viral se inyecta a través de la ventana redonda, su concentración puede ser diluida por el líquido cefalorraquídeo desde el acueducto coclear10.
El hallazgo de que los resultados del canal semicircular posterior inyección en la transducción de células ciliadas cocleares y vestibulares también se han descrito otros estudios11,12. En el estudio de Okada et al., informó de transduction de las células de pelo cocleares y vestibulares por AAV-GFP. Sin embargo, no se realizó la cuantificación numérica. El estudio realizado por Suzuki et al., reportó altos niveles de transducción de células ciliadas cocleares y vestibulares con el AAV-Anc80-GFP utilizando el enfoque del canal semicircular posterior en ratones adultos. En ratones adultos, canulación del canal semicircular posterior con un pequeño catéter es preferible, ya que la cubierta huesuda del canal semicircular posterior es totalmente osificado12. Cateterización del conducto semicircular posterior en ratones adultos puede ayudar a minimizar el reflujo de la inyección, que puede disminuir la eficacia de transducción de señales. Este paso no es necesario en ratones neonatales, ya que la cubierta huesuda del canal semicircular posterior es aún cartilaginosa a esa edad.
Uno de los inconvenientes de la inyección del canal semicircular posterior es el hecho de que uno no puede ser cierto si la terapia del gene inyectado se entrega en la perilinfa o endolinfa. A pesar de esta carencia, el canal semicircular posterior es anatómicamente fácil de localizar y requiere mínima manipulación del hueso temporal para su identificación. Esto disminuye la probabilidad de daño del oído interno causada por trauma quirúrgico. La inyección del canal semicircular posterior es una opción atractiva para la entrega de terapia de gen de oído interno.
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Disclosures
Los autores no tienen ninguna divulgación pertinentes para hacer.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de la NIDCD División de intramuros investigación /NIH (DC000082-02 para W.W.C.), así como DC000081 a base de proyección de imagen avanzada. Estamos agradecidos por el personal de Animalario NIDCD para el cuidado de nuestros animales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 and #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision Instruments | ||
| Heating pad | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sutures | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glass pipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilicate glass |
References
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