Summary
במחקר זה, אנו מתארים את הגישה תעלת semicircular האחורי בתור שיטה אמינה למסירה גן באוזן הפנימית בעכברים neonatal. אנו מראים כי המסירה הגן דרך תעלת semicircular האחורי הוא היכולת perfuse האוזן הפנימית כולה.
Abstract
ריפוי גנטי באוזן הפנימית מציע הבטחה גדולה בתור טיפול פוטנציאלי עבור אובדן שמיעה וסחרחורות. אחת גורמים קריטיים של ההצלחה של טיפול גנטי באוזן הפנימית היא למצוא שיטת משלוח אשר התוצאות היעילות התמרה חושית עקבית של סוגי תאים ממוקד תוך מזעור אובדן שמיעה. במחקר זה, אנו מתארים את הגישה תעלת semicircular האחורי כשיטה מעשית למסירה גן באוזן הפנימית בעכברים neonatal. אנו מראים כי המסירה הגן דרך תעלת semicircular האחורי הוא היכולת perfuse האוזן הפנימית כולה. זיהוי אנטומיים קלה של תעלת semicircular אחורי, כמו גם מניפולציה מינימלי של העצם הטמפורלית הנדרש, לעשות ניתוח זה הגישה אופציה אטרקטיבית עבור המסירה הגן באוזן הפנימית.
Introduction
ריפוי גנטי באוזן הפנימית הוא שדה המתפתחת של החקירה. זה הוחל במודלים בבעלי חיים שונים ototoxicity לחימה, טראומת רעש של אובדן שמיעה תורשתי1. מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שחזור פונקציונלי של שמיעה ופונקציות לאיזון בעכברים המוטנטים לאחר באוזן הפנימית ג'ין טיפול משלוח2,3,4,5,6, 7. אחת של המפתח גורמים בקביעת ההצלחה של טיפול גנטי באוזן הפנימית היא גישה כירורגית המשמשים לגישה האוזן הפנימית. באופן אידיאלי, הגישה כירורגי יהיה קל לביצוע, ציוני הדרך אנטומיים יהיה עקבי וקל לזיהוי, ו התמרה חושית וכתוצאה מכך של סוגי תאים יישוב יהיה גבוה.
במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי כאשר הטיפול הגנטי הנגיפי הוזרק דרך תעלת semicircular האחורי של העכבר מוטציה whirler (דגם של אובדן שמיעה, בעיות בתפקוד שיווי המשקל), התמרה חושית יעילה של תאי חישה השיער נראה את שיווי המשקל כמו גם איברים כמו שבלול5. יעילות גבוהה של התמרה חושית החישה תא שיער הביאו לשיפור של פונקציות השמיעה ואת שיווי המשקל בעכברים המוטנטים האלה.
במאמר זה, נתאר בפירוט את הגישה תעלת semicircular האחורי כדי לגשת האוזן הפנימית העכבר neonatal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה במכון הלאומי על חירשות והפרעות אחרות תקשורת (NIDCD ASP1378-15).
1. הליך ההתקנה והכנות
- לעקר את כל הכלים על ידי אתילן אוקסיד בתחילת הניסוי. בין בעלי החיים, לנקות כלים באמצעות עיקור חרוז.
- לטעון את הפתרון הכולל ריפוי גנטי ויראלי לתוך micropipette על המיקרו-מזרק. וקטור ויראלי השתמשו במחקר זה היה AAV2/8-whirlin ' (עונה 1 פרק 10-13 הגנום עותקים למיליליטר, ראה את הטבלה של חומרים).
הערה: בדרך כלל, µL 1.1 הנפח הכולל נטען את micropipette.
2. הרדמה
הערה: המתח העכבר השתמשו במחקר זה הוא העכבר whirler. Homozygous מוטציות (Whrnאינטרנט/אינטרנט) והן הארנבונים מאותה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים (Whrnבחיבור אינטרנט) שימשו.
- מקם את האמא בכלוב נפרד (נפרד מן הגורים).
- למקם את הכלוב הביתה המכילה את הגורים (P0 - P5 הגורים) על משטח חום recirculating (ערכה ב 37.5 מעלות צלזיוס) כדי לחמם את העכברים.
- לגזור את החלק האגודל של כפפת לייטקס, ולמקם גור בתוכו.
- מקום הכלבלב כפפת לייטקס האגודל לתוך דלי קרח ~ 2 דקות.
- במקום הכלבלב anesthetized על חבילת ההקפאה פלסטיק מרובע מסחרי גדול עם גזה 4 "x 4" בין הגורים השטח של הלהקה.
- למלא את כפפת גומי עבות עם קרח כתוש, ולמקם את הכפפה קרח סביב הכלבלב.
- בדוק אם הכלבלב שלמאחה מורדם על ידי חוסר מוחלט של כל תגובה לגירויים שונים (כולל קמצוץ הבוהן המשרד). להשאיר את הגור הקרח משך זמן הניתוח (כ 5-10 דקות).
הערה: מומלץ להשאיר את הגורים על חבילת קרח למשך לא יותר מ 15 דקות במהלך הניתוח.
3. ניתוח בגישה (איור 1)
- לנקות את העור מאחורי האוזן עם המחיקה של יוד ולנגב עם אלכוהול, ברגע החיה. הוא מורדם.
- עושים חתך postauricular ~ 2 מ מ מאחורי האוזן באמצעות מיקרו-מספריים, לחלק את שריר שריר הצוואר עם מיקרו-מספריים.
- לזהות את עצב הפנים של בועה. בולה הסחוס ושקוף למחצה בגיל הזה, היא שוכנת המדיאלי לעצב הפנים. ניתן לראות את העורק stapedial דרך של בולה בגיל הזה, המהווה נקודת ציון שימושית.
- בצע את עצב הפנים עליונית ו posteriorly כדי לאתר את התעלה semicircular האחורי (PSCC). הסר את סיבי השריר ואת רקמות רכות המכסים את התעלה semicircular האחורי באמצעות מיקרו-מספריים.
הערה: PSCC זה הסחוס בגיל הזה. - לחדור את PSCC באמצעות micropipette של זכוכית (~ 10 μm בקוטר) על המיקרו-מזרק.
- מזריקים נגיפי והמוצגים לתוך האוזן הפנימית.
הערה: בדרך כלל, סכום כולל של 20 זריקות של 49 nL של הטיפול הגנטי מועברים לתוך התעלה semicircular אחורי מעל 40 ~ s (הנפח הכולל ~ 1 µL). כייל ויראלי בשימוש היה עונה 1 פרק 10-13 הגנום עותקים בכל mL. - סגירת החתך בעור באמצעות בתפר polyglactin 5-0.
4. לאחר הניתוח טיפול
- במקום הכלבלב על כרית חימום כדי לשחזר את טמפרטורת גוף נורמלית במהלך ההתאוששות מן ההרדמה עם קבוע ידנית גירוי/מתגלגל עם האצבעות בכפפה אנושי.
- לאחר הכלבלב הוא ער, מקם אותו בחזרה לכלוב שלה הביתה.
- לטפו כל pup באמצעות מקלון צמר גפן זה נחשף מצעים כלוב הביתה.
הערה: המטרה של זה הוא צריך העכברים להריח כפי שעשו לפני הניתוח, אשר מגבירה את הסבירות של האמא מחדש קבלת שהניתוח שלאחר המלטה. במידת האפשר, שתן מהאם ניתן לאסוף ולהשתמש מרח על הגורים באמצעות מקלון צמר גפן כדי להקטין עוד יותר את הסיכוי של דחייה. - חלות שמן מינרלי האף של האם כדי desensitize שלה8, להציג מחדש את האמא לתוך הכלוב הביתה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזרקה של טיפול גנטי AAV8 whirlin לתוך neonatal whirler עכברים דרך תעלת semicircular אחורי, גרמו whirlin ביטוי תאים שיער utricular (איור 2), (ירוק) עם היעילות הכוללת של זיהום של 53.1% (SD 38.1, n = 28)5 . תאים שיער transduced היה מוארך stereocilia (אדום) לעומת תאים שיער מהאוזניים ללא הזרקת contralateral (מיקרומטר ± 2.11 5.35 לעומת ± 0.34 3.20 מיקרומטר, בהתאמה)5.
הזרקה תעלת semicircular האחורי של AAV8-whirlin הביאה גם התמרה חושית של תאים שיער שבלולי בעכברים whirler (איור 3). היעילות זיהום ממוצע תא שיער הפנימי היה 77.1% (SD 12.7, n = 8)5. תאים שיער transduced מבוטא whirlin (ירוק)-טיפים stereocilia ולא היה מוארך stereocilia (אדום) לעומת תאים שיער מהאוזניים ללא הזרקת contralateral (מיקרומטר ± 0.72 5.04 לעומת מיקרומטר ± 0.08 1.01-השיא שבלול, בהתאמה)5.
איור 1 : פוסט תמונות-
פוסט תמונות מציג גישה כירורגית תעלת semicircular האחורי (PSCC) בעכבר P0. האוזן השמאלית מוצג. PSCC המותווה בקווים שחורים מקווקו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : שיווי המשקל תאים שיער הם transduced באמצעות המסירה הגן PSCC.
AAV8-whirlin מועברת באמצעות PSCC הגישה, גרמו רמות גבוהות של זיהום utricular תא שיער. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : שבלולי תאים שיער הם transduced באמצעות המסירה הגן PSCC.
AAV8-whirlin מועברת באמצעות PSCC הגישה, גרמו רמות גבוהות של זיהום תא שיער שבלול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר גישות כירורגיות תוארו לגשת לאוזניים הפנימיות מכרסמים. Cochleostomy וגישות חלון עגול הנפוץ ביותר לגישה שבלול, ואילו התעלה semicircular האחורי ועל גישות שק endolymphatic משמשים בדרך כלל כדי לגשת את אברי שיווי המשקל1. במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי תעלת semicircular האחורי זריקות של טיפול גנטי ויראלי, גרמו יעילות גבוהה של התמרה חושית תא שיער של אברי שיווי המשקל והן שבלול5. למעשה, התמרה חושית תא שיער שבלול היה גבוה באמצעות זריקות תעלת semicircular אחורי, כאשר לעומת זריקות חלון עגול במודל עכבר זהה של אובדן שמיעה תורשתי, תפקוד לקוי של שיווי המשקל5,9. בשל הקרבה הגדולה אנטומי בין החלון העגול שבלול, נראה פרדוקסלי כי זריקות חלון עגול עשוי להוביל התחתון התמרה חושית תא שיער שבלולי לעומת זריקות תעלת semicircular אחורי. ממצא זה עשוי להיות מוסברת על ידי העובדה כי החלון העגול ממוקם קרוב האמה שבלול. לכן, כאשר הטיפול הגנטי הנגיפי מוזרק דרך החלון העגול, עשוי להיות מדולל הריכוז שלו על ידי הנוזל השדרתי בא ה האמה שבלולי10.
הממצא כי תעלת semicircular האחורי הזרקת התוצאות התמרה חושית תא שיער שבלולי ואת שיווי המשקל גם דווח על ידי מחקרים אחרים,11,12. במחקר על ידי אוקאדה. et al., דווח התמרה חושית של תאים שיער שבלולי ואת שיווי המשקל על ידי AAV-GFP. עם זאת, כימות מספרית לא בוצעה. המחקר על ידי סוזוקי. et al., דיווחו על רמות גבוהות של התמרה חושית תא שיער שבלולי ואת שיווי המשקל עם AAV-Anc80-GFP באמצעות גישה תעלת semicircular האחורי בעכברים בוגרים. בעכברים בוגרים, תעלות של התעלה semicircular האחורי עם צנתר קטן עדיפה, כיוון הקירוי הגרמי של התעלה semicircular האחורי הוא לחלוטין שביב12. צנתור של התעלה semicircular האחורי בעכברים מבוגרים יכול לעזור כדי למזער את הזרקת זרם אחורי, אשר יכול להפחית את יעילות התמרה חושית. שלב זה לא נדרש בעכברים neonatal, מאז הקירוי הגרמי של התעלה semicircular האחורי הוא עדיין הסחוס בגיל הזה.
אחד החסרונות של הזריקה תעלת semicircular האחורי היא העובדה כי אי אפשר להיות בטוח אם מוזרק הגנטי מועבר לתוך perilymph או endolymph. למרות זה חסרון, תעלת semicircular האחורי הוא אנטומית קל לאתר ואינה דורשת מניפולציה מינימלי של העצם הטמפורלית לזיהוי שלו. זה מקטין את הסיכוי של האוזן הפנימית הנזק שנגרם על ידי ניתוחי טראומה. הזריקה תעלת semicircular האחורי הוא אופציה אטרקטיבית למסירה טיפול גנטי באוזן הפנימית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין גילויים הרלוונטיים להכין.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי כספים NIDCD חלוקה של מגזר מחקר /NIH (DC000082-02 כדי W.W.C.), כמו גם DC000081 אל ליבה הדמיה מתקדמות. . אנחנו אסירי תודה על הצוות מתקן בעלי חיים NIDCD על הדאגה לבעלי-חיים שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 and #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision Instruments | ||
| Heating pad | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sutures | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glass pipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilicate glass |
References
- Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
- Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295 (2015).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
- Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
- Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
- Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48 (2004).
- Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
- Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
