Summary
इस अध्ययन में, हम नवजात चूहों में भीतरी कान जीन प्रसव के लिए एक विश्वसनीय विधि के रूप में पीछे semicircular नहर दृष्टिकोण का वर्णन । हम बताते है कि पीछे semicircular नहर के माध्यम से जीन प्रसव के लिए पूरे भीतरी कान perfuse करने में सक्षम है ।
Abstract
भीतरी कान जीन चिकित्सा सुनवाई हानि और चक्कर आना के लिए एक संभावित उपचार के रूप में महान वादा करता है । भीतरी कान जीन थेरेपी की सफलता के महत्वपूर्ण निर्धारकों में से एक के लिए एक वितरण विधि है जो लक्षित सेल प्रकार के सुसंगत transduction दक्षता में परिणाम मिल रहा है, जबकि सुनवाई हानि ंयूनतम । इस अध्ययन में, हम नवजात चूहों में भीतरी कान जीन प्रसव के लिए एक व्यवहार्य विधि के रूप में पीछे semicircular नहर दृष्टिकोण का वर्णन । हम बताते है कि पीछे semicircular नहर के माध्यम से जीन प्रसव के लिए पूरे भीतरी कान perfuse करने में सक्षम है । पीछे semicircular नहर के आसान शारीरिक पहचान, साथ ही लौकिक हड्डी की आवश्यकता के ंयूनतम हेरफेर, इस शल्य दृष्टिकोण भीतरी कान जीन प्रसव के लिए एक आकर्षक विकल्प बनाते हैं ।
Introduction
भीतरी कान जीन थेरेपी जांच के एक तेजी से विकासशील क्षेत्र है । यह ototoxicity, शोर आघात, और वंशानुगत सुनवाई हानि1का मुकाबला करने के लिए विभिंन जानवरों के मॉडलों में लागू किया गया है । कई हाल के अध्ययनों से पता चला है कार्यात्मक सुधार और उत्परिवर्ती चूहों में संतुलन कार्य इनर कान जीन थेरेपी डिलिवरी के बाद2,3,4,5,6, 7. भीतरी कान जीन थेरेपी की सफलता का निर्धारण करने में प्रमुख कारकों में से एक सर्जिकल भीतरी कान का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है । आदर्श रूप में, शल्य दृष्टिकोण प्रदर्शन करने के लिए आसान होगा, शारीरिक स्थलों सुसंगत और पहचान करने के लिए आसान हो जाएगा, और लक्षित सेल प्रकार के परिणामस्वरूप transduction उच्च होगा ।
हाल के एक अध्ययन में, हमें पता चला है कि जब वायरल जीन थेरेपी के पीछे semicircular नहर के माध्यम से इंजेक्शन था भंवर उत्परिवर्ती माउस (हानि और vestibular रोग सुनवाई का एक मॉडल), संवेदी बाल कोशिकाओं के कुशल transduction vestibular में देखा गया था अंगों के रूप में अच्छी तरह के रूप में कोक्लीअ5। संवेदी बाल कोशिका transduction की उच्च दक्षता इन उत्परिवर्ती चूहों में श्रवण और vestibular कार्यों के सुधार में हुई ।
इस अनुच्छेद में, हम विस्तार में वर्णन पीछे semicircular नहर दृष्टिकोण नवजात माउस भीतरी कान का उपयोग करने के लिए ।
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय संस्थान में बहरापन और अंय संचार विकारों (NIDCD ASP1378-15) पर पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. प्रक्रिया सेटअप और तैयारी
- प्रयोग की शुरुआत में ईथीलीन ऑक्साइड द्वारा सभी साधनों को निष्फल करते हैं. जानवरों के बीच, मनका नसबंदी का उपयोग कर स्वच्छ उपकरणों ।
- माइक्रो इंजेक्टर पर एक micropipette में वायरल जीन थेरेपी युक्त समाधान लोड । वायरल वेक्टर इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था AAV2/8-whirlin (1 x 1013 जीनोम प्रति milliliter, सामग्री की तालिका देखें) ।
नोट: सामान्यतया, १.१ µ l कुल वॉल्यूम micropipette में लोड किया गया है ।
2. संज्ञाहरण
नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त माउस तनाव के भंवर माउस है । दोनों homozygous म्यूटेंट (Whrnwi/) और heterozygous littermates (Whrn+/wi) का प्रयोग किया गया ।
- मां को एक अलग पिंजरे में रखें (कूड़े से अलग) ।
- घर पिंजरे (P0-P5 पिल्ले) युक्त एक पुनर्संचारी हीट पैड पर (३७.५ डिग्री सेल्सियस पर सेट) चूहों गर्म रखने के लिए रखें ।
- एक लेटेक्स दस्ताने के अंगूठे भाग में कटौती, और उस में एक पिल्ला जगह है ।
- के लिए बर्फ की एक बाल्टी में लेटेक्स दस्ताने अंगूठे में पिल्ला प्लेस ~ 2 मिनट ।
- एक बड़ा वर्ग वाणिज्यिक प्लास्टिक फ्रीज पैक पर एक 4 "पिल्ला और पैक की सतह के बीच 4 x" धुंध के साथ anesthetized पिल्ला प्लेस ।
- कुचल बर्फ के साथ एक भारी शुल्क लेटेक्स दस्ताने भरें, और पिल्ला के आसपास बर्फ दस्ताने जगह है ।
- अगर पिल्ला पर्याप्त रूप से विभिंन उत्तेजनाओं के लिए किसी भी प्रतिक्रिया की पूरी कमी (एक फर्म पैर की अंगुली चुटकी सहित) द्वारा anesthetized है देखने के लिए जांच करें । सर्जरी की अवधि के लिए बर्फ पैक पर पिल्ला छोड़ दो (लगभग 5-10 मिनट) ।
नोट: हम सर्जरी के दौरान 15 मिनट से अधिक नहीं के लिए बर्फ पैक पर पिल्ले छोड़ने की सलाह देते हैं ।
3. शल्य दृष्टिकोण (चित्रा 1)
- एक आयोडीन पोंछे और एक शराब पोंछे के साथ कान के पीछे त्वचा साफ एक बार पशु anesthetized है ।
- एक postauricular चीरा ~ माइक्रो कैंची का उपयोग कर कान के पीछे 2 मिमी, और माइक्रो कैंची के साथ sternocleidomastoid मांसपेशी विभाजित करें ।
- चेहरे की तंत्रिका और bulla की पहचान करें । bulla उपास्थि और अर्द्ध इस उंर में पारदर्शी है और यह चेहरे तंत्रिका के लिए औसत दर्जे का है । stapedial धमनी इस उम्र में bulla के माध्यम से देखा जा सकता है, जो एक उपयोगी मील का पत्थर है ।
- चेहरे की हिंमत बेहतर का पालन करें और पीछे semicircular नहर (PSCC) का पता लगाने के लिए । मांसपेशी फाइबर और कोमल ऊतक निकालें पीछे semicircular माइक्रो कैंची का उपयोग कर नहर ।
नोट: PSCC इस उम्र में उपास्थि है । - एक ग्लास micropipette का उपयोग कर PSCC घुसना (~ व्यास में 10 माइक्रोन) माइक्रो इंजेक्टर पर ।
- भीतरी कान में वायरल जीन थेरेपी इंजेक्षन ।
नोट: आमतौर पर, जीन थेरेपी के ४९ nL के 20 इंजेक्शन की कुल के पीछे semicircular नहर में वितरित कर रहे है ~ ४० s (कुल मात्रा ~ 1 µ एल) । वायरल titer का इस्तेमाल प्रति एमएल 1 x 1013 जीनोम प्रतियां था । - बंद करो त्वचा एक 5-0 polyglactin टांका का उपयोग चीरा ।
4. पश्चात की देखभाल
- एक वार्मिंग पैड पर पिल्ला प्लेस लगातार मैनुअल उत्तेजना के साथ संज्ञाहरण से वसूली के दौरान एक सामांय शरीर के तापमान को बहाल/
- एक बार पिल्ला जाग रहा है, इसे वापस अपने घर पिंजरे में जगह है ।
- एक कपास झाड़ू है कि घर पिंजरे बिस्तर को उजागर किया गया है के साथ प्रत्येक पिल्ला लाड़ ।
नोट: इस का उद्देश्य है चूहों गंध के रूप में वे सर्जरी से पहले किया था, जो मां की संभावना बढ़ जाती है फिर से उसे कूड़े के बाद सर्जरी स्वीकार । यदि संभव हो, मां से मूत्र एकत्र किया जा सकता है और एक कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए आगे अस्वीकृति की संभावना कम पिल्ले पर मला । - मां की नाक में खनिज तेल लागू करने के लिए उसे8संवेदनशील, और घर पिंजरे में मां को फिर से शुरू ।
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Representative Results
AAV8 के इंजेक्शन के पीछे semicircular नहर के माध्यम से नवजात भंवर चूहों में whirlin जीन थेरेपी utricular बाल कोशिकाओं (चित्रा 2) में whirlin अभिव्यक्ति (हरी) के परिणामस्वरूप, समग्र संक्रमण दक्षता के साथ ५३.१% (एसडी ३८.१, एन = 28)5 . Transduced बाल कोशिकाओं stereocilia (लाल) contralateral गैर इंजेक्शन कान से बाल कोशिकाओं की तुलना में लंबा था (५.३५ ± २.११ µm बनाम ३.२० ± ०.३४ µm, क्रमशः)5।
AAV8-whirlin के पीछे semicircular नहर इंजेक्शन भी transduction में कॉकलियर बालों की कोशिकाओं के परिणामस्वरूप चूहों (चित्रा 3) । औसत आंतरिक बाल कोशिका संक्रमण दक्षता ७७.१% (एसडी १२.७, एन = 8)5था । Transduced बाल कोशिकाओं stereocilia सुझावों पर whirlin (हरी) व्यक्त की थी और लंबी stereocilia (लाल) से बाल कोशिकाओं की तुलना में contralateral गैर इंजेक्शन कान (५.०४ ± ०.७२ µm बनाम १.०१ ± ०.०८ µm शीर्ष पर, क्रमशः)5।
चित्र 1 : Intraoperative छवियां.
Intraoperative एक P0 माउस में पीछे semicircular नहर (PSCC) के लिए शल्य चिकित्सा का उपयोग दिखा छवियां । बाएं कान दिखाया गया है । PSCC डैश्ड काली रेखाओं में उल्लिखित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : Vestibular हेयर सेल PSCC जीन डिलिवरी का प्रयोग transduced हैं ।
AAV8-whirlin PSCC दृष्टिकोण के माध्यम से दिया utricular बाल कोशिका संक्रमण के उच्च स्तर के परिणामस्वरूप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : कॉकलियर हेयर सेल PSCC जीन डिलिवरी का प्रयोग transduced हैं ।
AAV8-whirlin PSCC दृष्टिकोण के माध्यम से दिया कॉकलियर बाल कोशिका संक्रमण के उच्च स्तर के परिणामस्वरूप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
कई शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण को चूहे के भीतरी कान तक पहुंचने के लिए वर्णित किया गया है । Cochleostomy और दौर खिड़की दृष्टिकोण सबसे अधिक कोक्लीअ का उपयोग करने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि पीछे semicircular नहर और endolymphatic सैक दृष्टिकोण आम तौर पर vestibular अंगों का उपयोग करने के लिए उपयोग किया जाता है1। हाल के एक अध्ययन में, हम वायरल जीन थेरेपी के पीछे semicircular नहर इंजेक्शन दोनों vestibular अंगों और कोक्लीअ5में बाल कोशिका transduction की उच्च दक्षता के परिणामस्वरूप पता चला । वास्तव में, कॉकलियर बाल कोशिका transduction पीछे semicircular नहर इंजेक्शन के माध्यम से उच्च था, जब वंशानुगत सुनवाई हानि और vestibular रोग के एक ही माउस मॉडल में गोल खिड़की इंजेक्शन के साथ तुलना में5,9। गोल खिड़की और कोक्लीअ के बीच शारीरिक निकटता को देखते हुए यह उलटा लगता है कि दौर खिड़की इंजेक्शन के पीछे semicircular नहर इंजेक्शन की तुलना में कम कॉकलियर बाल कोशिका transduction के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस खोज तथ्य यह है कि दौर खिड़की कॉकलियर जलसेतु के पास स्थित है द्वारा समझाया जा सकता है । इसलिए, जब वायरल जीन थेरेपी गोल खिड़की के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है, इसकी एकाग्रता मस्तिष्कमेरु द्रव कॉकलियर जलसेतु10से आने वाले द्वारा पतला हो सकता है ।
ढूंढना है कि पीछे semicircular नहर इंजेक्शन कॉकलियर और vestibular हेयर सेल transduction में परिणाम भी अंय अध्ययन द्वारा सूचित किया गया है11,12। ओकादा एट अलद्वारा अध्ययन में, AAV-GFP द्वारा कॉकलियर और vestibular बाल कोशिकाओं के transduction की सूचना दी गई. हालांकि, संख्यात्मक ठहराव नहीं किया गया । सुजुकी एट अलद्वारा अध्ययन, AAV के साथ कॉकलियर और vestibular हेयर सेल transduction के उच्च स्तर की सूचना दी-Anc80-GFP वयस्क चूहों में पीछे semicircular नहर दृष्टिकोण का उपयोग कर । वयस्क चूहों में, एक छोटे कैथेटर के साथ पीछे semicircular नहर के cannulation बेहतर है, पीछे semicircular नहर के बोनी कवर के बाद से पूरी तरह से12ossified है. वयस्क चूहों में पीछे semicircular नहर के कैथीटेराइजेशन इंजेक्शन backflow, जो transduction दक्षता कम कर सकते हैं कम करने में मदद कर सकते हैं. इस कदम नवजात चूहों में आवश्यक नहीं है, पीछे semicircular नहर के बोनी कवर के बाद से उस उम्र में अभी भी उपास्थि है.
पीछे semicircular नहर इंजेक्शन की कमियां में से एक तथ्य यह है कि एक निश्चित नहीं किया जा सकता है कि क्या इंजेक्शन जीन थेरेपी perilymph या endolymph में दिया जाता है । इस कमी के बावजूद, पीछे semicircular नहर का पता लगाने के लिए आसान anatomically है और इसकी पहचान के लिए लौकिक हड्डी के ंयूनतम हेरफेर की आवश्यकता है । यह शल्य आघात की वजह से भीतरी कान क्षति की संभावना कम हो जाती है । पीछे semicircular नहर इंजेक्शन भीतरी कान जीन चिकित्सा प्रसव के लिए एक आकर्षक विकल्प है ।
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Disclosures
लेखकों को कोई प्रासंगिक खुलासे करने के लिए है ।
Acknowledgments
यह काम अंदर रिसर्च/NIH के NIDCD डिवीजन (DC000082-02 से W.W.C., साथ ही एडवांस्ड इमेजिंग कोर को DC000081) के फंड से सपोर्ट किया गया । हम अपने पशुओं की देखभाल के लिए NIDCD पशु सुविधा कर्मचारियों के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 and #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision Instruments | ||
| Heating pad | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sutures | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glass pipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilicate glass |
References
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