Summary
Neste estudo, descrevemos a abordagem de canal semicircular posterior como um método confiável para a entrega de gene do ouvido interno em camundongos neonatais. Mostramos que a entrega do gene através do canal semicircular posterior é capaz de perfundir toda orelha interna.
Abstract
Terapia de gene do ouvido interno uma grande promessa como um potencial tratamento para perda de audição e tontura. Um dos determinantes essenciais do sucesso da terapia de gene do ouvido interno é encontrar um método de entrega que resulta em eficiência de transdução consistente dos tipos de célula alvo, minimizando a perda de audição. Neste estudo, descrevemos a abordagem de canal semicircular posterior como um método viável para a entrega de gene do ouvido interno em camundongos neonatais. Mostramos que a entrega do gene através do canal semicircular posterior é capaz de perfundir toda orelha interna. A fácil identificação anatômica do canal semicircular posterior, bem como, manipulação mínima do osso temporal exigido, fazer neste cirúrgico aproximar-se uma opção atraente para entrega de gene do ouvido interno.
Introduction
Terapia de gene do ouvido interno é um campo de rápido desenvolvimento de investigação. Aplicação em vários modelos animais para combate ototoxicidade, trauma de ruído e de perda de audição hereditária1. Vários estudos recentes têm mostrado recuperação funcional da audição e funções de equilíbrio em camundongos mutantes após ouvido interno gene terapia entrega2,3,4,5,6, 7. um dos principais fatores na determinação do sucesso da terapia do gene de orelha interna é a abordagem cirúrgica utilizada para acessar o ouvido interno. Idealmente, a abordagem cirúrgica seria fácil de executar, os marcos anatômicos seria consistente e fácil de identificar e a transdução resultante de tipos de células alvo seria alta.
Em um estudo recente, mostramos que, quando a terapia do gene viral foi injectada através do canal semicircular posterior do rato mutante whirler (um modelo de perda auditiva e disfunção vestibular), transdução eficiente de células sensoriais do cabelo foi vista nos vestibulares órgãos, assim como a cóclea5. A alta eficiência de transdução sensorial cabelo célula resultou em melhora das funções auditivas e vestibulares nestes ratos mutantes.
Neste artigo, descrevemos em detalhe a abordagem de canal semicircular posterior para acessar o ouvido interno do rato neonatal.
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Protocol
Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Instituto Nacional de surdez e outros distúrbios de comunicação (NIDCD ASP1378-15) e cuidado Animal.
1. preparação e instalação do procedimento
- Esterilize todos os instrumentos com óxido de etileno no início do experimento. Entre os animais, limpe instrumentos usando a esterilização do grânulo.
- Carrega a solução contendo terapia genética viral em uma micropipeta no micro-injector. O vector viral utilizado neste estudo foi AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genoma cópias por mililitro, consulte a tabela de materiais).
Nota: Normalmente, o volume total de 1,1 µ l é carregado na micropipeta.
2. anestesia
Nota: A tensão de rato utilizada neste estudo é o mouse whirler. Ambos homozigotos mutantes (quandowi/wi) e littermates heterozigotos (quando+ / wi) foram utilizados.
- Coloca a mãe em uma gaiola separada (separar o lixo).
- Coloque a gaiola em casa contendo a ninhada (P0 - P5 filhotes) sobre uma almofada de calor recirculação (conjunto a 37,5 ° C) para aquecer os ratos.
- Cortar a parte de dedo de uma luva de látex e coloque um filhote nele.
- Coloque o filhote no polegar da luva de látex em um balde de gelo para ~ 2 min.
- Coloque o filhote anestesiado em um pacote grande praça comercial congelamento de plástico com uma gaze 4 "x 4" entre o filhote e superfície do pacote.
- Encha uma luva de látex resistente com gelo picado e coloque a luva de gelo ao redor o filhote.
- Verificar se o filhote é devidamente anestesiado pela completa falta de resposta a estímulos diversos (incluindo uma pitada de dedo firme). Deixe o filhote na calota de gelo para a duração da cirurgia (aproximadamente 5-10 min).
Nota: Recomendamos deixar os filhotes na calota de gelo para não mais de 15 min durante a cirurgia.
3. abordagem cirúrgica (Figura 1)
- Limpe a pele atrás da orelha com uma compressa com iodo e uma compressa com álcool, uma vez que o animal é anestesiado.
- Faça uma incisão postauricular ~ 2 mm atrás da orelha usando microtesoura e dividir o músculo esternocleidomastoideo com microtesoura.
- Identifica o nervo facial e o bulla. O bulla é cartilaginoso e semi transparente nesta idade e situa-se medial ao nervo facial. A artéria estapédica pode ser vista através do bulla nesta idade, o que é um ponto de referência útil.
- Siga o nervo facial, superiormente e posteriormente para localizar o canal semicircular posterior (PSCC). Retire as fibras musculares e tecidos moles sobrejacentes o canal semicircular posterior usando microtesoura.
Nota: O PSCC é cartilaginoso nesta idade. - Penetra o PSCC usando uma micropipeta de vidro (~ 10 μm de diâmetro) na micro-injector.
- Terapia do gene viral Injete no ouvido interno.
Nota: Normalmente, um total de 20 injeções de 49 nL da terapia do gene são entregues para o canal semicircular posterior mais de 40 ~ s (volume total ~ 1 µ l). O título viral utilizado foi de 1 x 1013 genoma cópias / mL. - Feche a incisão de pele usando uma sutura de Poliglactina 5-0.
4. pós-operatório cuidados
- Coloque o filhote em uma almofada de aquecimento para restaurar uma temperatura normal do corpo durante a recuperação da anestesia com constante manual estimulação/rolamento com luvas dedos humanos.
- Uma vez que o filhote está acordado, colocá-lo volta para sua gaiola em casa.
- Acaricie cada filhote com um cotonete de algodão que tem sido exposto para a roupa de cama de gaiola em casa.
Nota: O propósito disto é ter os ratos cheirar como fizeram antes da cirurgia, o que aumenta a probabilidade da mãe re-aceitando seu pós-operatório de maca. Se possível, urina da mãe pode ser coletada e esfregada sobre os filhotes usando um cotonete para diminuir ainda mais a probabilidade de rejeição. - Aplicar óleo mineral para o nariz da mãe para dessensibilizar a8e reintroduzir a gaiola em casa com a mãe.
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Representative Results
Injeção de AAV8-whirlin de terapia gênica em camundongos whirler neonatal através do canal semicircular posterior resultou em whirlin expressão (verde) em células ciliadas utricular (Figura 2), com a eficiência global de infecção de 53,1% (SD 38,1, n = 28)5 . Células de cabelo transduzidas tinha alongado Estereocílio (vermelho) em comparação com células ciliadas de orelhas não injectada contralaterais (5,35 ± 2.11 µm vs 3,20 ± 0,34 µm, respectivamente)5.
Canal semicircular posterior injeção de AAV8-whirlin também resultou na transdução de células cocleares nos ratos whirler (Figura 3). A eficiência de infecção interna média cabelo célula era 77,1% (SD 12,7, n = 8)5. Transduzidas células ciliadas expresso whirlin (verde) no Estereocílio dicas e tinha alongado Estereocílio (vermelho) em comparação com células ciliadas de orelhas não injectada contralaterais (5,04 ± 0.72 µm vs 1.01 ± 0,08 µm no ápice coclear, respectivamente)5.
Figura 1 : Imagens intra-operatória.
Intra-operatória imagens mostrando o acesso cirúrgico para o canal semicircular posterior (PSCC) em um rato de P0. A orelha esquerda é mostrada. O PSCC é descrito em tracejado linhas pretas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Vestibulares células ciliadas são transfectadas usando entrega do gene PSCC.
AAV8-whirlin entregue via o PSCC abordagem resultou em altos níveis de infecção de célula utricular do cabelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Células cocleares são transfectadas usando entrega do gene PSCC.
AAV8-whirlin entregue via o PSCC abordagem resultou em altos níveis de infecção de células cocleares do cabelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Várias abordagens cirúrgicas têm sido descritas para acessar roedor ouvido interno. Cochleostomy e janela redonda abordagens são mais comumente usadas para acessar a cóclea, Considerando que o canal semicircular posterior e saco endolinfático abordagens são normalmente usadas para acessar os órgãos vestibulares1. Em um estudo recente, nós mostramos aquele canal semicircular posterior injeções da terapia do gene viral resultaram em alta eficiência de transdução celular cabelo em ambos os órgãos vestibulares e a cóclea5. Na verdade, transdução coclear cabelo célula foi maior através de injeções o canal semicircular posterior, quando comparado com injeções de janela redonda no mesmo modelo do rato da surdez hereditária e disfunção vestibular5,9. Dada a proximidade anatómica entre a janela redonda e a cóclea, parece paradoxal que a janela redonda injeções podem levar à transdução de coclear cabelo célula inferior em comparação com injeções de canal semicircular posterior. Este achado pode ser explicado pelo fato de que a janela redonda está localizada perto do aqueduto coclear. Portanto, quando a terapia do gene viral é injectada através da janela redonda, sua concentração pode ser diluída pelo fluido cerebrospinal vindo do aqueduto coclear10.
A conclusão de que o canal semicircular posterior injeção resulta em transdução de célula de cabelo coclear e vestibular também tem sido relatada por outros estudos11,12. No estudo por Okada et al, transdução células cocleares e vestibulares por AAV-GFP foi relatada. No entanto, a quantificação numérica não foi realizada. O estudo pela Suzuki et al., relataram altos níveis de transdução celular de cabelo coclear e vestibular com o AAV-Anc80-GFP usando a abordagem de canal semicircular posterior em ratos adultos. Em ratos adultos, canulação do canal semicircular posterior com um pequeno cateter é preferível, uma vez que o revestimento ósseo do canal semicircular posterior é completamente ossificada12. Cateterismo do canal semicircular posterior em ratos adultos pode ajudar a minimizar o refluxo de injeção, que pode diminuir a eficiência de transdução. Este passo não é necessário nos ratos neonatais, desde que a cobertura óssea do canal semicircular posterior é ainda cartilaginosa nessa idade.
Uma das desvantagens da injeção canal semicircular posterior é o fato de que um não pode ser determinado se a terapia de gene injetado é entregue na perilinfa ou endolinfa. Apesar desta lacuna, o canal semicircular posterior é anatomicamente fácil de localizar e requer manipulação mínima do osso temporal para a sua identificação. Isto diminui a chance de danos no ouvido interno causado por trauma cirúrgico. A canal semicircular posterior injeção é uma opção atraente para entrega de terapia de gene de orelha interna.
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Disclosures
Os autores têm sem divulgações relevantes para fazer.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por fundos do NIDCD divisão de Intramural Research /NIH (DC000082-02 para W.W.C.), bem como DC000081 para núcleo avançado de imagem. Agradecemos a equipe de instalação animal NIDCD por cuidar de nossos animais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 and #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision Instruments | ||
| Heating pad | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sutures | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glass pipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilicate glass |
References
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