Summary
在本研究中, 我们描述了后半圆管方法作为一种可靠的方法, 为内耳基因分娩的新生小鼠。我们表明, 通过后半规管的基因传递能够灌注整个内耳。
Abstract
内耳基因治疗提供了一个伟大的承诺, 作为一种潜在的治疗听力损失和头晕。内耳基因治疗成功的关键决定因素之一是找到一种分娩方法, 从而使靶细胞类型的传导效率保持在最小, 同时最大限度地减少听力损失。在本研究中, 我们描述了后半规管方法作为一种可行的方法, 为内耳基因分娩的新生小鼠。我们表明, 通过后半规管的基因传递能够灌注整个内耳。简单的解剖鉴定的后半圆管, 以及最低限度的操作所需的颞骨, 使这种手术方法是一个有吸引力的选择内耳基因传递。
Introduction
内耳基因治疗是一个快速发展的研究领域。它已应用于各种动物模型, 以对抗耳毒性, 噪音损伤和遗传性听力损失1。最近的几项研究表明, 在内耳基因治疗后突变小鼠听力和平衡功能的功能恢复2,3,4,5,6,7. 确定内耳基因治疗成功与否的关键因素之一, 是用于进入内耳的手术方法。理想的做法是, 手术方法很容易执行, 解剖标志将是一致的, 易于辨认, 并由此产生的定向细胞类型的转导是很高的。
在最近的一项研究中, 我们表明, 当病毒基因治疗是通过 whirler 突变小鼠的后半规管注射 (一种听觉丧失和前庭功能障碍模型), 在前庭中看到的感觉毛细胞的有效传导器官并且在耳蜗5。感觉毛细胞转导的高效性导致了这些突变小鼠听觉和前庭功能的改善。
在本文中, 我们详细描述了后半圆管的方法, 以获得新生小鼠内耳。
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Protocol
所有动物程序均经国家耳聋和其他传播疾病研究所 (NIDCD ASP1378-15) 动物护理和使用委员会批准。
1. 程序设置和准备
- 实验开始时用环氧乙烷消毒所有仪器。动物之间, 清洁的仪器使用珠杀菌。
- 将含有病毒基因治疗的溶液载入微注射器的微中。本研究使用的病毒载体是 AAV2/8-whirlin (每毫升 1 x 1013基因组拷贝, 见材料表)。
注意: 通常, 1.1 µL 总卷加载到微中。
2. 麻醉
注: 本研究使用的鼠标应变是 whirler 鼠。使用了纯合突变体 (Whrnwi-fi) 和异型窝 (Whrn+/无线)。
- 把母亲放在一个独立的笼子里 (与垃圾分开)。
- 将含有垃圾 (P0 P5 幼崽) 的家庭笼子放在循环热垫上 (设置在37.5 摄氏度) 以保持老鼠的体温。
- 切掉一只乳胶手套的拇指部分, 然后在里面放一只小狗。
- 将小狗用乳胶手套拇指放入一桶冰中2分钟。
- 将麻醉的小狗放在一个大广场商业塑料冷冻包装上, 幼崽和包表面之间有 4 "x 4" 纱布。
- 用碎冰填充一只重型乳胶手套, 并将冰手套放在幼崽周围。
- 检查小狗是否有充分的麻醉, 完全缺乏对各种刺激的反应 (包括坚定的脚趾捏)。在手术期间把幼崽留在冰袋上 (大约 5-10 分钟)。
注意: 我们建议在手术期间将幼崽放在冰包上不超过15分钟。
3. 手术方法 (图 1)
- 当动物被麻醉后, 用碘擦拭和酒精擦拭来清洁耳后的皮肤。
- 用微剪刀在耳后2毫米耳后切口, 用微剪刀将胸锁乳突肌分开。
- 识别脸部神经和泡。泡在这个年龄是软骨和半透明的, 它位于面神经的内侧。stapedial 动脉可以通过泡在这个年龄看到, 这是一个有用的里程碑。
- 遵循面部神经优和向后定位后半圆管 (PSCC)。用微剪刀去除后半规管上的肌纤维和软组织。
注意: PSCC 在这个年龄是软骨的。 - 在微喷油器上使用玻璃微 (直径10微米) 穿透 PSCC。
- 将病毒基因治疗注入内耳。
注: 通常, 20 注射 49 nL 的基因治疗被交付到后半圆运河超过四十年代 (总容量 ~ 1 µL)。使用的病毒滴度为每毫升 1 x 1013基因组拷贝。 - 用 5-0 polyglactin 缝合闭合皮肤切口。
4. 术后护理
- 将小狗放在暖垫上, 以恢复从麻醉中恢复正常体温, 经常手动刺激/滚动与戴手套的人的手指。
- 一旦小狗醒了, 把它放回它的笼子里。
- 爱抚每一个小狗, 棉花拭子已经暴露在家庭笼床上用品。
注意: 这样做的目的是让老鼠的气味, 因为他们在手术前, 这增加了母亲再次接受她的垃圾后手术的可能性。如果可能的话, 母亲的尿液可以用棉签来收集和揉在幼崽身上, 以进一步降低拒绝的可能性。 - 将矿物油应用到母亲的鼻子上, 脱敏她的 8, 并将母亲重新引入家庭笼子.
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Representative Results
注射 AAV8-whirlin 基因治疗新生儿 whirler 小鼠通过后半规管导致 whirlin 表达 (绿色) 在 utricular 毛细胞 (图 2), 整体感染效率为 53.1% (SD 38.1, n = 28)5.转基因毛细胞有拉长的张图片 (红色) 与对侧非注射耳朵的毛细胞 (5.35 @ 2.11 µm vs 3.20 @ 0.34 µm, 分别) 5.
AAV8-whirlin 后半圆管注射液也导致 whirler 小鼠耳蜗毛细胞的转导 (图 3)。平均内毛细胞感染效率为 77.1% (SD 12.7, n = 8)5。转基因毛细胞表达 whirlin (绿色) 在张图片提示和有拉长张图片 (红色) 相比, 从对侧非注射耳朵的毛细胞 (5.04) 0.72 µm vs 1.01 @ 0.08 µm 在耳蜗顶点, 分别)5。
图 1: 术中图像.
术中图像显示 P0 小鼠手术进入后半圆管 (PSCC)。显示左耳。PSCC 用虚线黑线勾勒出来。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 前庭毛细胞转基因使用 PSCC 基因传递.
AAV8-whirlin 通过 PSCC 方法交付, 导致 utricular 毛细胞感染的高水平。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 耳蜗毛细胞转基因使用 PSCC 基因传递.
AAV8-whirlin 通过 PSCC 的方法, 导致了高水平的耳蜗毛细胞感染。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
几种手术方法被描述为进入啮齿动物内耳。Cochleostomy 和圆形窗口的方法是最常用的进入耳蜗, 而后半圆管和淋巴囊方法通常用于访问前庭器官1。在最近的一项研究中, 我们发现, 后半规管注射的病毒基因治疗导致高效率的头发细胞转导的前庭器官和耳蜗5。事实上, 耳蜗毛细胞转导是通过后半圆管注射更高, 当与圆形窗口注射相比, 同一鼠遗传性听力损失和前庭功能障碍的模型5,9。考虑到圆窗与耳蜗的解剖距离, 与后半圆管注射相比, 圆窗注射可能导致耳蜗毛细胞转导下降, 这似乎自相矛盾。这一发现可以解释为一个事实, 即圆形窗口位于靠近耳蜗渡槽。因此, 当病毒基因治疗通过圆形窗口注射时, 其浓度可能会被来自耳蜗渡槽10的脑脊液稀释。
其他研究报告11,12, 发现后半圆管注射液导致耳蜗和前庭毛细胞转导。在 AAV 的研究中, 报道了耳蜗和前庭毛细胞的转导. 但是, 没有进行数值量化。铃木 (AAV-Anc80-GFP) 的研究表明, 在成年小鼠的后半规管方法中, 有高水平的耳蜗和前庭毛细胞转导. 在成年小鼠中, 由于后半圆管的骨覆盖完全僵化,12, 采用小导管插管是比较可取的。成年小鼠后半规管插管可减少注射回流, 降低转导效率。这一步骤是不需要在新生小鼠, 因为骨覆盖的后半圆管仍然软骨在那个年龄。
后半圆管注射的缺点之一是, 不能确定注射基因治疗是否交付外淋巴液或 endolymph。尽管有这个缺点, 后半圆运河解剖上很容易定位, 需要对颞骨进行最小的操作来识别。这就减少了因手术外伤而导致内耳损伤的几率。后半圆管注射液是内耳基因治疗分娩的一个很有吸引力的选择。
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Disclosures
作者没有相关的披露。
Acknowledgments
这项工作得到了来自 NIDCD 司内研究/NIH (DC000082-02 到 W.W.C., 以及 DC000081 先进成像核心) 的资金支持。我们感谢 NIDCD 动物设施的工作人员照顾我们的动物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 and #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision Instruments | ||
| Heating pad | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sutures | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glass pipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilicate glass |
References
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