Summary
Dans cette étude, nous décrivons l’approche postérieure canal semicirculaire comme une méthode fiable pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales. Nous montrons que la livraison de gène par l’intermédiaire du canal semicirculaire postérieur est capable de perfuse l’ensemble oreille interne.
Abstract
Thérapie génique oreille interne offre très prometteur comme traitement potentiel pour la perte d’audition et des vertiges. Un des déterminants essentiels de la réussite de la thérapie génique oreille interne est de trouver une méthode de livraison qui se traduit par l’efficacité de transduction cohérente de types cellulaires ciblés tout en minimisant la perte d’audition. Dans cette étude, nous décrivons l’approche postérieure canal semicirculaire comme une méthode viable pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales. Nous montrons que la livraison de gène par l’intermédiaire du canal semicirculaire postérieur est capable de perfuse l’ensemble oreille interne. L’identification facile anatomique du canal semicirculaire postérieur, ainsi qu’une manipulation minimale de l’OS temporal requis, faire cette chirurgie approcher une option attrayante pour la livraison de gène oreille interne.
Introduction
Thérapie génique oreille interne est un champ connaissent un développement rapide de l’enquête. Il a été appliqué dans divers modèles animaux d’ototoxicité combattre trauma de bruit et de perte auditive héréditaire1. Plusieurs études récentes ont montré une récupération fonctionnelle de l’audition et équilibre des fonctions chez des souris mutantes après oreille interne gene therapy livraison2,3,4,5,6, 7. un des principaux facteurs pour déterminer le succès de la thérapie génique oreille interne est l’approche chirurgicale utilisée pour accéder à l’oreille interne. Idéalement, l’approche chirurgicale serait facile à réaliser, les repères anatomiques serait cohérente et facile à identifier, et la transduction résultante de types de cellules ciblées serait élevée.
Dans une étude récente, nous avons montré que, lorsque la thérapie génique virale a été injectée par l’intermédiaire du canal semicirculaire postérieur de la souris mutante danseur (un modèle de perte auditive et de dysfonctionnement vestibulaire), transduction efficace des cellules sensorielles de cheveux a été observée dans le vestibulaire organes ainsi que dans la cochlée5. La grande efficacité de la transduction des cellules ciliées sensorielles conduit à une amélioration des fonctions auditives et vestibulaires chez ces souris mutantes.
Dans cet article, nous décrivons en détail l’approche postérieure canal semicirculaire pour accéder à l’oreille interne de souris néonatales.
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Protocol
Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Institut National sur la surdité et d’autres troubles de la Communication (NIDCD ASP1378-15) et animalier.
1. préparation et installation de procédure
- Stériliser tous les instruments à l’oxyde d’éthylène dans le début de l’expérience. Entre les animaux, nettoyer les instruments utilisant la stérilisation de la perle.
- Chargez la solution contenant la thérapie génique virale dans une micropipette sur le micro-injecteur. Le vecteur viral utilisé dans cette étude était AAV2/8-whirlin (1 x 1013 copies de génome par millilitre, voir la table des matières).
Remarque : En général, 1.1 volume total µL est chargé dans une micropipette.
2. anesthésie
Remarque : La souche de souris utilisée dans cette étude est la souris de danseur. Les mutants homozygotes (Whrnwi/wi) et même portée hétérozygote (Whrn+ / wi) ont été utilisés.
- Placer la mère dans une cage séparée (séparé de la litière).
- Placez la cage contenant de la litière (P0 - chiots P5) sur une bouillote recirculation (préréglée à 37,5 ° C) pour garder les souris chaude.
- Découper la partie de pouce d’un gant en latex et placez un chiot dedans.
- Placez le chiot au pouce gant en latex dans un seau de glace pendant environ 2 min.
- Placez le chiot anesthésié sur un pack de grande place commerciale gel en plastique avec de la gaze 4 "x 4" entre le chiot et de la surface de la meute.
- Remplissez un gant en latex lourds avec de la glace pilée, puis le gant de glace autour du chiot.
- Vérifier si le chiot est suffisamment anesthésié par une absence totale de réponse à divers stimuli (y compris une pincée de pied ferme). Laissez le chiot sur la banquise pendant la durée de l’intervention (environ 5-10 min).
Remarque : Nous recommandons de laisser les bébés phoques sur la banquise pendant pas plus de 15 min pendant la chirurgie.
3. abord chirurgical (Figure 1)
- Nettoyer la peau derrière l’oreille avec une lingette d’iode et un imbibé d’alcool une fois que l’animal est anesthésié.
- Faire une incision postauricular ~ 2 mm derrière l’oreille à l’aide de micro-ciseaux et diviser le muscle sternocléidomastoïdien avec micro-ciseaux.
- Identifier le nerf facial et la bulle tympanique. La bulle tympanique est cartilagineux et semi-transparents à cet âge et il se trouve vers le nerf facial. L’artère stapédiens transparaît à travers la bulle tympanique à cet âge, qui est un point de repère utile.
- Suivez le nerf facial supérieurement et postérieurement pour localiser le canal postérieur de semi-circulaires (PSCC). Retirer les fibres musculaires et des tissus mous, recouvrant le canal semicirculaire postérieur à l’aide de micro-ciseaux.
Remarque : Le PSCC est cartilagineux à cet âge. - Pénétrer le PSCC à l’aide d’une micropipette de verre (~ 10 μm de diamètre) sur la micro-injecteur.
- Injecter la thérapie génique virale dans l’oreille interne.
Remarque : En règle générale, un total de 20 injections de 49 nL de la thérapie génique sont livrés dans le canal de semi-circulaires postérieur plus de ~ 40 s (volume total ~ 1 µL). Le titre viral utilisé a été de 1 x 1013 génome copies / mL. - Refermer l’incision de la peau à l’aide d’une suture de polyglactin 5-0.
4. postopératoire soins
- Placez le chiot sur un coussin chauffant pour rétablir une température corporelle normale au cours de l’anesthésie avec constante stimulation/roulant manuel avec des doigts humains gantés.
- Une fois que le chiot est éveillé, il remettre dans sa cage maison.
- Caressent chaque chiot avec un coton tige qui a été exposé à la literie maison cage.
Remarque : Le but de ce est que les souris sentir comme ils le faisaient avant l’opération, ce qui augmente la probabilité de la mère re-accepter son post-chirurgie de la litière. Si possible, urine de la mère peut être collecté et frotté sur les chiots à l’aide d’un coton-tige pour réduire davantage le risque de rejet. - Appliquez l’huile minérale au nez de la mère pour désensibiliser sa8et réintroduire la mère dans la cage.
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Representative Results
Injection de AAV8-whirlin de thérapie génique chez la souris néonatales danseur à travers le canal semicirculaire postérieur a entraîné whirlin expression (vert) dans les cellules de cheveux utriculaire (Figure 2), avec l’efficacité globale de l’infection de 53,1 % (SD 38.1, n = 28)5 . Transduite cellules ciliées avait allongé stéréocils (rouge) par rapport aux cellules ciliées controlatérale oreilles non injectés (5,35 µm ± 2.11 vs 3,20 ± 0,34 µm, respectivement)5.
Injection de postérieur canal semicirculaire de AAV8-whirlin a aussi entraîné dans la transduction des cellules cochléaires chez les souris de danseur (Figure 3). L’efficacité de l’infection interne moyen de cellules de cheveux était 77,1 % (SD 12.7, n = 8)5. Transduite cellules ciliées exprimé whirlin (vert) à stéréocils conseils et avait allongé stéréocils (rouge) par rapport aux cellules ciliées controlatérale oreilles non injectés (5,04 µm ± 0,72 vs 1.01 ± 0.08 µm à l’apex cochléaire, respectivement)5.
Figure 1 : Images peropératoires.
Peropératoires images montrant un accès chirurgical au canal semi-circulaires postérieur (PSCC) chez une souris de P0. L’oreille gauche est montré. Le PSCC est décrite en pointillés noirs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Des cellules ciliées vestibulaires sont transduites avec livraison de gène PSCC.
AAV8-whirlin envoyées par l’intermédiaire de la PSCC approche a entraîné des niveaux élevés d’infection des cellules ciliées utriculaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Des cellules ciliées cochléaires sont transduites avec livraison de gène PSCC.
AAV8-whirlin envoyées par l’intermédiaire de la PSCC approche a entraîné des niveaux élevés d’infection des cellules ciliées cochléaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Plusieurs approches chirurgicales ont été décrites pour accéder aux rongeurs des oreilles internes. Cochleostomy et approches de la fenêtre ronde sont utilisés couramment pour accéder à la cochlée, tandis que le postérieur canal semicirculaire et approches du sac endolymphatique sont généralement utilisés pour accéder les organes vestibulaires1. Dans une étude récente, nous avons montré que canal semicirculaire postérieur des injections de thérapie génique virale a donné lieu à un rendement élevé de transduction cellulaire cheveux à la fois les organes vestibulaires et la cochlée5. En fait, transduction des cellules ciliées cochléaire était supérieure à travers les apports de postérieur canal semicirculaire, en comparaison avec des injections de fenêtre ronde dans le même modèle de souris de surdité héréditaire et dysfonctionnement vestibulaire5,9. Compte tenu de la proximité anatomique entre la fenêtre ronde et la cochlée, il semble paradoxal que des injections de fenêtre ronde peuvent conduire à transduction de cochléaire cellules ciliées inférieure par rapport aux injections postérieure canal semicirculaire. Cette constatation peut s’expliquer par le fait que la fenêtre ronde est située à proximité de l’aqueduc cochléaire. Donc, quand la thérapie génique virale est injectée à travers la fenêtre ronde, sa concentration peut être diluée par le liquide céphalorachidien provenant de l' aqueduc cochléaire10.
La conclusion selon laquelle postérieure canal semicirculaire injection se traduit par des cellules ciliées cochléaire et vestibulaire transduction a aussi signalée par d’autres études11,12. L’étude par Okada et al., transduction de cochléaires et vestibulaires des cellules ciliées de l’AAV-GFP a été signalée. Cependant, la quantification numérique n’a pas été effectuée. L’étude réalisée par Suzuki et al., a signalé des niveaux élevés de transduction cellulaire cheveux cochléaire et vestibulaire avec l’AAV-Anc80-GFP en utilisant l’approche postérieure canal semicirculaire chez la souris adulte. Chez la souris adulte, canulation du canal semicirculaire postérieure avec un petit cathéter est préférable puisque la couverture osseuse du canal semicirculaire postérieure est complètement ossifiée12. Cathétérisme du canal semicirculaire postérieur chez la souris adulte peut aider à minimiser les reflux d’injection, qui peut diminuer l’efficacité de la transduction. Cette étape n’est pas nécessaire chez les souris néonatales, puisque la couverture osseuse du canal semicirculaire postérieure est encore cartilagineuse à cet âge.
Un des inconvénients de l’injection de postérieur canal semicirculaire est le fait qu’on ne peut pas être certain que la thérapie de gène injecté soit remise dans le périlymphe ou l’endolymphe. Malgré cette lacune, le canal semicirculaire postérieur est anatomiquement facile à localiser et nécessite une manipulation minimale de l’OS temporal pour son identification. Cela diminue les risques de dommages d’oreille interne provoqué par un traumatisme chirurgical. L’injection de postérieur canal semicirculaire est une option intéressante pour la livraison de la thérapie de gène oreille interne.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucune divulgation pertinente à faire.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds provenant du NIDCD Division d’intra-muros recherche /NIH (DC000082-02 à W.W.C.), ainsi que des DC000081 à base d’imagerie avancées. Nous sommes reconnaissants pour le personnel d’animalerie NIDCD pour prendre soin de nos animaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 and #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision Instruments | ||
| Heating pad | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sutures | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glass pipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilicate glass |
References
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