Summary
この研究では、新生児マウス内耳遺伝子送達のための信頼性の高い方法として後半規管のアプローチについて述べる。後半規管を介して遺伝子デリバリーが全体の内耳を灌流することができることを示します。
Abstract
内耳遺伝子治療は、難聴やめまいの潜在的な治療としての偉大な約束を提供しています。内耳遺伝子療法の成功の重要な要因の 1 つは聴力損失を最小限に抑えながら標的細胞のタイプの一貫性のある伝達効率で起因する配信方法を見つけることです。この研究では、新生児マウス内耳遺伝子送達のための現実的な方法として後半規管のアプローチについて述べる。後半規管を介して遺伝子デリバリーが全体の内耳を灌流することができることを示します。後半規管の簡単な解剖学的同定と同様、必要な側頭骨の最小限の操作、make この手術アプローチ内耳遺伝子送達のための魅力的なオプションです。
Introduction
内耳遺伝子治療の調査の急速に発展途上の分野です。それは戦闘の難聴、騒音外傷、遺伝性難聴の損失1に様々 な動物モデルで適用されています。いくつかの最近の研究の後内耳遺伝子療法配信2,3,4,5,6,変異マウスにおける聴覚と平衡機能の機能回復を示されています。7。 内耳遺伝子治療の成功は、手術アプローチは内耳にアクセスするために使用を決定要因のキーの 1 つ。理想的には、外科的アプローチが実行には簡単だろう、一貫性があり、わかりやすい解剖学的ランドマークになるし、標的細胞の種類の結果の伝達は高いでしょう。
最近の研究で示した舞踏変異マウス (難聴、前庭機能不全のモデル) の後半規管から注入するウイルスの遺伝子療法、感覚毛の細胞の効率的な伝達が、前庭に見られました。器官蝸牛5と同様。感覚毛の細胞の情報伝達の効率はこれらの突然変異体のマウスの聴覚と前庭の機能の改善で起因しました。
この記事で新生児マウス内耳に接近する後半規管で詳しく述べる。
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Protocol
動物のすべてのプロシージャは、動物愛護と難聴および他のコミュニケーション無秩序 (NIDCD ASP1378-15) の国立研究所利用委員会によって承認されました。
1. 手順セットアップおよび準備
- すべての楽器を実験の初めにエチレンオキ サイドで滅菌します。動物、間ビーズ滅菌を使用して楽器をきれいに。
- マイクロ インジェクターのマイクロ ピペットにウイルスの遺伝子療法を含むソリューションを読み込みます。本研究で使用されるウイルスのベクトルは AAV2/8 有 (1 x 1013ゲノム コピー、1 ミリリットルあたりは、材料の表を参照)。
注: 通常、1.1 μ L の総ボリュームは、ピペットに読み込まれます。
2. 麻酔
注: この研究で使用されるマウスの緊張はベーキング マウスです。ホモ接合体変異体 (送受信を行って無線/無線) とヘテロ同腹子 (送受信を行って+/無線) 使用されました。
- 場所別ケージ (ゴミとは別) の母。
- マウスを暖かく保つために循環熱パッド (37.5 ° c セット) ごみ (P0 - P5 子犬) を含むホーム ケージを配置します。
- ラテックス グローブの親指部分をカットし、子犬を配置します。
- ラテックス グローブの親指に ~ 2 分の氷のバケツに子犬を配置します。
- 4"× 4" ガーゼ子犬とパックの表面の間で大きな正方形商業プラスチック フリーズ パックに麻酔下の子犬を配置します。
- 押しつぶされた氷、頑丈なラテックス手袋を埋めるし、子犬の周りアイス グローブを配置します。
- 子犬は適切に (しっかりつま先ピンチを含む) さまざまな刺激への応答の完全な欠如によって麻酔かどうかを確認してください。氷パックに子犬を残して手術 (約 5-10 分) の持続期間のため。
注: 手術中に 15 分以上の氷パックに子犬を残してをお勧めします。
3. 外科的アプローチ (図 1)
- 動物の麻酔後は、ヨウ素拭くアルコール ワイプと耳の後ろの皮膚をきれいに。
- 耳介後部切開 ~ 2 mm マイクロ-はさみを使って耳の後ろを行い、マイクロはさみで胸鎖乳突筋を分割します。
- 顔面神経とブラを識別します。ブラは軟骨と半透明なこの時代であり、顔面神経の内側。アブミ骨動脈は、便利なランドマークは、この年齢でブラを見ることができます。
- 上方や後方に顔面神経を従う後半規管 (PSCC) を検索します。筋線維とマイクロはさみを使って後半規管を覆う軟組織を削除します。
注: この年齢で、PSCC は軟骨です。 - ガラス マイクロ ピペット (〜 10 μ m の直径) を用いたマイクロ インジェクター PSCC に浸透します。
- 内耳へのウイルスの遺伝子療法を注入します。
注: 合計 49 の 20 注射遺伝子療法の nL を後半規管以上 〜 40 に配信する通常、s (総量 ~ 1 μ L)。使用ウイルスの力価は、1 mL あたり 1 x 1013ゲノム コピーだった。 - 5-0 polyglactin の縫合糸を使用して皮膚切開を閉じる。
4. 術後のケア
- 定数手動刺激/ローリングと手袋をはめた手指と麻酔からの回復の間に正常な体温を復元する温暖化パッドに子犬を配置します。
- 子犬が目を覚まし、その家のケージに配置します。
- 家敷にさらされている綿棒を使ってそれぞれの子犬を愛撫します。
注: この目的は再手術を後彼女のごみを受け入れる母親の可能性を高める術前と同様の匂いを嗅ぐマウスを持っていることです。可能であれば、母親から尿を収集し、拒絶反応の可能性をさらに減らすために綿棒を使用して子犬にこすりことができます。 - 8、彼女を鈍感に母の鼻に鉱物油を適用し、ホームのケージに母を再導入します。
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Representative Results
後半規管を介して新生児舞踏マウスに遺伝子治療を AAV8 有の注入は 53.1% の感染効率と有小嚢の有毛細胞 (図 2) に式 (緑) の結果 (SD 38.1、n = 28)5.導入された有毛細胞は不動 (赤) 非注入側の耳から有毛細胞に比較して伸長いた (μ m ± 2.11 5.35 3.20 ± 0.34 μ m、対それぞれ)5。
AAV8 有の後半規管注入はまたベーキング マウス (図 3) における蝸牛の有毛細胞の伝達で起因しました。内部の有毛細胞を平均感染効率は 77.1% (SD 12.7、n = 8)5。導入された有毛細胞有 (グリーン) 不動のヒントを表明し、不動 (赤) 非注入側の耳から有毛細胞と比較していた細長い (μ m ± 0.72 5.04 蝸牛頂で 1.01 ± 0.08 μ m 対それぞれ)5。
図 1: 術中画像。
術中画像 P0 マウスで後半規管 (PSCC) への外科を示します。左の耳が表示されます。PSCC は黒の破線で囲まれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 前庭有毛細胞は PSCC 遺伝子配信を使用して導入されます。
AAV8 有、PSCC を介して配信されるアプローチは小嚢の毛細胞感染の高レベルで起因しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 蝸牛有毛細胞は PSCC 遺伝子配信を使用して導入されます。
AAV8 有、PSCC を介して配信されるアプローチが内耳有毛細胞感染の高レベルで起因しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
いくつかの外科的アプローチは、齧歯動物の内耳にアクセスに記載されています。後半規管と内リンパ嚢のアプローチは通常前庭器官1をアクセスに使用されるに対し、Cochleostomy と丸い窓のアプローチは、蝸牛にアクセスするよく使用されます。最近の研究では、ウイルスの遺伝子療法の注射は、前庭器官と蝸牛殻5有毛細胞伝達の高効率の結果、後半規管を示した。実際、蝸牛の有毛細胞の情報伝達は、遺伝性難聴、前庭機能不全5,9の同じマウスモデルで丸い窓の注射と比較すると後半規管注射を通してより高いだった。丸い窓と蝸牛の間解剖学的な近接を考えると、丸い窓の注射が後半規管注射に比べて低いの内耳有毛細胞伝達につながることを逆説的なようです。この発見は、蝸牛の水道橋近くに丸い窓があるという事実によって説明されるかもしれない。したがって、丸い窓からウイルスの遺伝子療法を注入すると、その濃度が蝸牛水道10から脳脊髄液で希釈しました。
後半規管注入結果蝸牛と前庭有毛細胞伝達の発見は、他の研究11,12で報告されています。岡田らによる、AAV GFP による蝸牛と前庭有毛細胞の伝達が報告されました。ただし、数値の定量化は実行されませんでした。鈴木ら、による成体における後半規管アプローチを用いた AAV-Anc80-GFP と蝸牛と前庭有毛細胞伝達の高レベルの報告。成体マウスの小さなカテーテルで後半規管のカテーテル留置が望ましい、後半規管の骨の覆いは完全に硬直した12。成体マウスの後半規管のカテーテルは、伝達効率を減らすことができるが噴射逆流を最小限に抑えるために役立ちます。この手順は、後半規管の骨の覆いはその年齢でまだ軟骨なので新生児マウスの必要はありません。
後半規管注入の欠点の 1 つは、1 つすることはできません特定内リンパ、外リンパに挿入された遺伝子治療を配信するかどうかという事実です。この欠点にもかかわらず後半規管が解剖学的に簡単に見つけ、その識別のため頭骨の最小限の操作が必要です。これは外科的外傷による内耳の損傷のチャンスを減らします。後半規管注入は、内耳遺伝子療法配信にとって魅力的なオプションです。
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Disclosures
作者に関連する開示があります。
Acknowledgments
この作品は、高度なイメージング コアに、NIDCD 部の学内研究/NIH (W.W.C. へ DC000082-02) だけでなく、DC000081 からの資金によって支えられました。私たちの動物を気遣うため NIDCD 動物施設スタッフに感謝しております。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 and #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision Instruments | ||
| Heating pad | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sutures | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glass pipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilicate glass |
References
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