Summary
Bu çalışmada, iç kulak gen teslim yenidoğan farelerde için güvenilir bir yöntem olarak posterior semisirküler kanal yaklaşım tarif. Gen teslim posterior semisirküler kanal aracılığıyla tüm iç kulakta sıvı mümkün olduğunu göstereceğiz.
Abstract
İç kulak gen tedavisi büyük söz işitme kaybı ve baş dönmesi için potansiyel bir tedavi olarak sunmaktadır. İç kulak gen terapisi başarısı önemli belirleyicileri işitme kaybı en aza indirerek tutarlı iletim verimliliği hedef hücre tiplerinin sonuçları bir teslimat yöntemi bulmak için biridir. Bu çalışmada, iç kulak gen teslim yenidoğan farelerde için uygun bir yöntem olarak posterior semisirküler kanal yaklaşım tarif. Gen teslim posterior semisirküler kanal aracılığıyla tüm iç kulakta sıvı mümkün olduğunu göstereceğiz. Posterior semisirküler kanal kolay anatomik tanımlanması, hem de en az gerekli temporal kemik manipülasyon, iç kulak gen teslim için cazip bir seçenek yapmak bu cerrahi yaklaşım.
Introduction
İç kulak gen terapisi araştırma çalışmaları hızla gelişmekte olan bir alandır. Bu savaş ototoksisite, gürültü travma ve kalıtsal işitme kaybı1çeşitli hayvan modellerinde uygulanmıştır. Birkaç son çalışmalar mutant farelerde iç kulak gen terapisi teslim2,3,4,5,6sonra, işitme ve denge işlevlerini fonksiyonel iyileşme göstermiştir 7. bir anahtar faktörler iç kulak gen terapisi başarı iç kulak erişmek için kullanılan cerrahi yaklaşım olduğunu belirleme. İdeal olarak, cerrahi yaklaşım gerçekleştirmek kolay olurdu, anatomik işaretlerini tutarlı ve kolay tanımlamak olurdu ve hedeflenen hücre tiplerinin elde edilen iletim yüksek olacaktır.
Bir son çalışmada, viral gen terapisi whirler mutant fare (işitme kaybı ve Vestibüler disfonksiyon bir model) posterior semisirküler kanalından enjekte edildiğinde duyusal saç hücrelerinin verimli iletim Vestibüler içinde görülmüş gösterdi organları de olduğu gibi koklea5. Duyusal saç hücre iletim yüksek verimlilik iyileştirme bu mutant farelerde işitsel ve Vestibüler fonksiyonların sonuçlandı.
Bu makalede, Yenidoğan fare iç kulak erişmek için posterior semisirküler kanal yaklaşım biz ayrıntılı olarak tarif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan yordamları hayvan bakım ve kullanım Komitesi Ulusal Enstitüsü sağırlık ve diğer iletişim bozuklukları (NIDCD ASP1378-15) tarafından kabul edildi.
1. yordam kurulum ve hazırlık
- Etilen oksit denemenin başında tarafından tüm aletleri sterilize. Hayvanlar arasında boncuk sterilizasyon kullanarak aletleri temiz.
- Bir micropipette üzerinde mikro-enjektör içine viral gen terapisi içeren çözüm yükleyin. Bu çalışmada kullanılan viral vektör AAV2/8-whirlin yapıldı (1 x 1013 genom kopya sayısı mililitre, malzemelerin tabloya bakın).
Not: Genellikle, 1.1 µL Toplam hacim micropipette yüklenir.
2. anestezi
Not: Bu çalışmada kullanılan fare zorlanma whirler faredir. Homozigoz mutantlar (okulwi/kablosuz) ve heterozigoz littermates (okul+/ wi) kullanılmıştır.
- Anne ayrı kafese (çöp ayrıdır) yerleştirin.
- Fareler sıcak tutmak için bir dolaşım ısı yastık (set 37,5 ° c) üzerinde çöp (P0 - P5 pups) içeren ev kafes yerleştirin.
- Lateks eldiven başparmak kısmı keser ve bir yavru içine yerleştirir.
- Yavru bir kova dolusu buz ~ 2 min için lateks eldiven başparmak yerleştirin.
- İmzalat yavru bir 4 "x 4" gazlı bez pup ve pack'ın yüzeyi arasında büyük kare ticari plastik donma paketiyle yerleştirin.
- Ağır bir lateks eldiven ezilmiş buz ile doldurun ve buz eldiveni yavru fok çevresinde yer.
- Yavru fok (bir firma ayak çimdik dahil) çeşitli uyaranlara karşı bir yanıt tam eksikliği ile yeterli anestezi Eğer görmek için kontrol edin. Yavru fok buz torbası (yaklaşık 5-10 dk) ameliyat süresince bırakın.
Not: Belgili tanımlık pups ameliyat sırasında en fazla 15 dakika buz torbası açık bırakmak öneririz.
3. cerrahi yaklaşım (şekil 1)
- Hayvan anestezi bir kez deri bir iyot temizleme işlemi ve bir alkol silme ile kulak arkasında temiz.
- Postauricular kesik ~ 2 mm mikro-makas kullanarak kulağının arkasında olun ve mikro-makas ile boyun kas bölün.
- Yüz sinir ve bulla tanımlar. Bulla kıkırdak ve yarı saydam bu yaşta ve bu yüz sinir medial yatıyor. Stapedial arter bulla ile yararlı bir dönüm noktası olduğunu bu yaşta görülebilir.
- Yüz sinir konumlanmıştır ve özafagusu izleyin posterior semisirküler kanal (bundan) bulmak için. Kas lifleri ve yumuşak doku posterior semisirküler kanal mikro-makas kullanarak örten kaldırın.
Not: Bundan bu yaşta kıkırdak. - Bir cam micropipette (~ 10 mikron çapında) mikro-enjektörü kullanarak bundan nüfuz.
- Viral gen terapisi iç kulak enjekte.
Not: Genellikle, Toplam 49 20 enjeksiyonlari nL gen tedavisi teslim edilir posterior semisirküler kanal 40 ~ s (Toplam hacim ~ 1 µL). Kullanılan viral titresi mL başına 1 x 1013 genom kopya oldu. - 5-0 polyglactin dikiş kullanarak cilt kesi kapatın.
4. ameliyat sonrası bakım
- Yavru fok anestezi sürekli manuel stimülasyon/haddeleme ile eldivenli insan parmak ile kurtarma sırasında normal vücut ısısı geri yüklemek için Isınma bir yastık yerleştirin.
- Yavru fok uyanık olduğunda, geri onun ev kafesin içine yerleştirin.
- Her yavru için eve kafes yatak maruz bir pamuk bez ile okşadı.
Not: Bunun amacı onu çöp ameliyat sonrası yeniden kabul anne olasılığını artırır ameliyat öncesi yaptıkları gibi kokuyorsun fareler sahip olmaktır. Mümkünse, idrar anneden toplanan ve daha fazla reddedilme olasılığını azaltmak için bir pamuklu çubukla kullanarak pups ovuşturdu. - Onun8duyarsızlaştırmak için annenin Burun madeni yağ uygulayın ve ev kafesin içine annesinin reintroduce.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enjeksiyon AAV8 whirlin gen tedavisi yenidoğan whirler fareler posterior semisirküler kanal aracılığıyla içine %53.1 genel enfeksiyon verimliliği ile sonuçlandı (yeşil) ifadesinde utricular saç hücreleri (Resim 2), whirlin (SD 38,1, n = 28)5 . Transduced saç hücreleri uzamış kontralateral sigara enjekte kulaklarından saç hücrelerine göre stereocilia (kırmızı) (5.35 ± 2.11 µm 3.20 ± 0.34 µm, vs sırasıyla)5.
AAV8 whirlin posterior semisirküler kanal enjeksiyon da iletim (şekil 3) whirler farelerde koklear saç hücrelerinin sonuçlandı. Ortalama iç saç hücresi enfeksiyon verimliliği %77,1 idi (SD 12,7, n = 8)5. Transduced saç hücreleri stereocilia ucunda whirlin (yeşil) ifade ve kontralateral sigara enjekte kulaklarından saç hücrelerine göre stereocilia (kırmızı) uzamış (5,04 ± 0,72 µm 1,01 ± 0,08 µm koklear tepe, vs sırasıyla)5.
Resim 1 : İntraoperatif görüntüler.
İntraoperatif görüntüleri posterior semisirküler kanal (bundan) cerrahi erişim P0 fare içinde gösterilen. Sol kulak gösterilir. Bundan kesik siyah çizgiler gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Vestibüler saç hücreleri transduced bundan gen teslim kullanma.
AAV8 whirlin teslim yolu ile bundan yaklaşım utricular saç hücre enfeksiyon yüksek düzeyde sonuçlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Koklear saç hücreleri transduced bundan gen teslim kullanma.
AAV8 whirlin teslim yolu ile bundan yaklaşım koklear saç hücre enfeksiyon yüksek düzeyde sonuçlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birkaç cerrahi yaklaşım kemirgen iç kulak erişmek için tarif edilmistir. Posterior semisirküler kanal ve endolymphatic kesesi yaklaşımlar genellikle Vestibüler organları1erişmek için kullanılır, ancak Cochleostomy ve yuvarlak pencere yaklaşımlar en sık koklea, erişmek için kullanılır. Bir son çalışmada, o posterior semisirküler kanal enjeksiyonları viral gen tedavisi saç hücre iletim Vestibüler organ veya koklea5yüksek verimliliği sonuçlandı gösterdik. Aslında, koklear saç hücre iletim yuvarlak pencere enjeksiyonları kalıtsal işitme kaybı ve Vestibüler disfonksiyon5,9, aynı fare modeli ile karşılaştırıldığında posterior semisirküler kanal enjeksiyon, daha yüksek. Yuvarlak pencere ve koklea arasındaki anatomik yakınlığı göz önüne alındığında, yuvarlak pencere Enjeksiyonlar posterior semisirküler kanal enjeksiyonlar için karşılaştırıldığında daha düşük koklear saç hücre iletim neden olabilir paradoksal görünüyor. Bu bulgu, yuvarlak pencere yakın koklear su kemeri bulunur Aslında tarafından açıklanabilir. Viral gen terapisi yuvarlak pencereden enjekte edildiğinde, bu nedenle, onun konsantrasyonu koklear su kemeri10' dan gelen beyin omurilik sıvısı tarafından seyreltilmiş.
Posterior semisirküler kanal enjeksiyon koklear ve Vestibüler saçlı hücre iletim sonuç bulma Ayrıca diğer çalışmalar11,12' bildirdi. Çalışmayla Okada vd., iletim koklear ve Vestibüler saçlı hücre AAV GFP tarafından bildirildi. Ancak, sayısal miktar gerçekleştirilmedi. Suzuki vd., çalışmayla AAV-Anc80-GFP yetişkin fareler posterior semisirküler kanal yaklaşımı kullanarak ile koklear ve Vestibüler saçlı hücre iletim yüksek düzeyde bildirdi. Yetişkin fareler, posterior semisirküler kanal kemikli kapsayan tamamen kemikleşmiş12olduğu küçük bir kateter ile posterior semisirküler kanal cannulation iyidir. Kateterizasyon posterior semisirküler kanal yetişkin farelerde iletim verimliliği düşürebilir enjeksiyon geri tepme en aza indirmek için yardımcı olabilir. Posterior semisirküler kanal kemikli kapsayan bu yaşta hala kıkırdak olduğundan bu adımı yenidoğan farelerde, gerekli değildir.
Posterior semisirküler kanal enjeksiyon dezavantajları biridir gerçeği bir enjekte gen tedavisi perilymph veya endolymph teslim edilir emin olamayız ki. Bu kusur rağmen posterior semisirküler kanal anatomik olarak bulmak kolaydır ve temporal kemik en az manipülasyon için onun kimlik gerektirir. Bu iç kulak zarar cerrahi travma neden olasılığını azaltır. Posterior semisirküler kanal enjeksiyon iç kulak gen terapisi teslimat için cazip bir seçenektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar yapmak için hiçbir ilgili açıklamalar var.
Acknowledgments
Bu eser NIDCD bölümü, Intramural araştırma /NIH (DC000082-02 W.W.C.) yanı sıra DC000081 fonlarından için gelişmiş görüntüleme çekirdek tarafından desteklenmiştir. Bizim hayvanlar için bakım için NIDCD hayvan tesis personel için sana şükrediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 and #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision Instruments | ||
| Heating pad | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sutures | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glass pipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilicate glass |
References
- Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
- Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295 (2015).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
- Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
- Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
- Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48 (2004).
- Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
- Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
