Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

إنشاء نموذج الفأر الاعتلال العصبي الألياف صغيرة نقية مع مؤثر أولترابوتينت من نوع فانيلويد المحتملة مستقبلات عابر 1

Published: February 13, 2018 doi: 10.3791/56651
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Department of Anatomy, School of Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, 2Department of Medical Research, Kaohsiung Medical University Hospital, 3Department of Medical Research, Ultrastructural Laboratory, Kaohsiung Medical University Hospital

Summary

تحدد هذه الدراسة نموذج تجريبي للاعتلال العصبي الألياف صغيرة نقية مع ريسينيفيراتوكسين (RTX). جرعة فريدة من RTX (50 ميكروغرام/كغ) الأمثل لوضع نموذج للاعتلال العصبي ألياف صغيرة الذي يحاكي خصائص المريض، ويمكن أن تساعد التحقيق nociceptive أهمية الجزيئية الكامنة وراء الأم الأعصاب.

Abstract

المرضى الذين يعانون من مرض البول السكري (مارك ألماني) أو تلك التي تعاني من آثار سمية عصبية من وكلاء العلاج الكيميائي قد وضع اضطرابات الإحساس بسبب الانحطاط وإصابة الخلايا العصبية الحسية الصغيرة-قطر، يشار إلى الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة. نماذج حيوانية هذا الاعتلال العصبي الألياف صغيرة تؤثر على الألياف الحسية القطر الكبيرة والصغيرة على حد سواء ومما خلق أمراض الأعصاب معقدة للغاية لتقييم آثار إصابة الألياف الحسية الصغيرة-قطر بشكل صحيح. ولذلك، من الضروري وضع نموذج تجريبي للاعتلال العصبي الألياف صغيرة نقية لدراسة هذه المسائل على نحو كاف. ويصف هذا البروتوكول نموذج تجريبي للاعتلال العصبي الألياف الصغيرة على وجه التحديد التي تؤثر على الأعصاب الحسية الصغيرة-قطر مع ريسينيفيراتوكسين (RTX)، مؤثر أولترابوتينت مستقبلات عابر المحتملة فانيلويد النوع 1 (TRPV1)، عن طريق جرعة واحدة من الحقن داخل، يشار إلى الاعتلال العصبي RTX. وأظهر هذا الاعتلال العصبي RTX المظاهر المرضية والتشوهات السلوكية التي تحاكي الخصائص السريرية للمرضى الذين يعانون من اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة، بما في ذلك إينترايبيديرمال تنكس الألياف العصبية (إيينف)، على وجه التحديد من إصابة في قطره صغيرة من الخلايا العصبية، وتحريض هيبوالجيسيا الحرارية والميكانيكية اللودينيا. اختبار هذا البروتوكول ثلاث جرعات من RTX (200 و 50، و 10 ميكروغرام/كغ، على التوالي)، وخلصت إلى أن جرعة حرجة من RTX (50 ميكروغرام/كغ) المطلوبة لتطوير مظاهر الاعتلال العصبي الألياف صغيرة نموذجية، وإعداد إجراء تعديل إيمونوستينينج إلى التحقيق انحطاط إيينف وإصابة الخلايا العصبية سوما. الإجراء المعدل سريعة ومنتظمة، والاقتصادية. التقييم السلوكي لآلام الأعصاب أمر بالغ الأهمية للكشف عن وظيفة الأعصاب الحسية الصغيرة-قطر. تقييم عتبات الميكانيكية في القوارض التجريبية يشكل تحديا كبيرا، ويصف هذا البروتوكول شبكة معدنية مخصصة التي مناسبة لهذا النوع من التقييم في القوارض. وخلاصة القول، الاعتلال العصبي RTX نموذج تجريبية جديدة وراسخة بسهولة لتقييم أهمية الجزيئية وتدخل الكامنة وراء الأم الأعصاب لتطوير العوامل العلاجية.

Introduction

الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة التي تنطوي على الألم الأعصاب، والذي يتضح من انحطاط إيينفس، أمر شائع في أنواع مختلفة من الشروط، مثل مارك ألماني، ونتيجة للتأثيرات السمية العصبية من وكلاء العلاج الكيميائي1،2، 3،،من45. إيينفس المحطات الطرفية الصغيرة-قطر الخلايا العصبية الموجودة في العقد الجذرية الظهرية (DRG)، وتتأثر بالتوازي في حالات تنكس إيينف6. على سبيل المثال، قد أثبتت النسخ الجينية المنبع غيرت من الخلايا العصبية سوماتا upregulation من تفعيل النسخ عامل-3 (ATF3)6،7. علاوة على ذلك، يتم تقييم تعصيب إيينفس مع خزعة الجلد مفيدة لتشخيص الألياف الصغيرة الاعتلال العصبي5،،من89. تقليديا، لمحات إيينفس على خزعة الجلد قد يتوقف على مظاهرة المناعي للبروتين الجين المنتج 9.510،،من1(PGP 9.5)11. أخذت معا، الملامح المرضية للرسم وإيينفس تعكس الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة الكامنة في حالة وظيفية وقد يكون مؤشرا عن النتائج الفنية لهذا النوع من الاعتلال العصبي في الخلايا العصبية الصغيرة-قطر.

سابقا، والعديد من النماذج التجريبية قد تناول مسألة الانحطاط إيينف في حالات الاعتلال العصبي الناجم عن العلاج الكيميائي12،13 والأعصاب الضرر الناجم عن ضغط أو ترانسيكتيون14،15 , 16-هذه النماذج التجريبية كما تتأثر الأعصاب كبيرة قطرها؛ ولذلك، لا يمكن استبعاد مساهمة المتضررة كبيرة قطرها الأعصاب في الأعصاب الملاحظة الألياف الصغيرة؛ على سبيل المثال، النظر في اضطراب ثيرموسينسيشن بانسحاب الضارة تعتمد على ألياف الأعصاب الحركية الوظيفية17،،من1819. وبالتالي، يتم إنشاء نموذج الاعتلال العصبي ألياف صغيرة نقية والتحقيق بصورة منهجية في حالة المرضية سوماتا الخلايا العصبية وهذه الألياف العصبية الجلدية الطرفية في الخلايا العصبية الصغيرة-قطر ضرورية وحتمية.

هو RTX التماثلية كبخاخات ومؤثر قوية لمستقبلات عابر المحتملة فانيلويد مستقبلات 1 (TRPV1)، الذي يتوسط تجهيز nociceptive20،،من2122. في الآونة الأخيرة، الطرفية RTX العلاج يزول الألم العصبية23،،من2425 وحقن إينتراجانجليونيك RTX الناجم عن فقدان الخلايا العصبية DRG22لا رجعة فيه. تأثير الطرفية RTX الإدارة هو تعتمد على جرعة20،26،27، التي أسفرت عن الحساسية عابرة أو تنكس إيينفس. الفضول، ومنهجية العلاج RTX جرعة عالية أدت إلى الألم الأعصاب28، أعراض الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة. وتوحي هذه النتائج أن وضع العلاج وجرعة RTX تنتج الآثار المرضية متميزة والاستجابات العصبية؛ ، إدارة الأجهزة الطرفية منع انتقال الألم من الآثار المحلية29 والمتضررة سوماتا الخلايا العصبية التي وضعت السلوك الأعصاب6. جماعياً، تشير هذه النتائج إلى أن RTX له تأثير مولتيبوتينسي، وأثيرت المسألة ما إذا كان هناك جرعة محددة من RTX التي يمكن أن تؤثر بشكل منهجي في الأعصاب المحيطية، مثل إيينفس المحيطية والمركزية سوماتى الخلايا العصبية. إذا كان الأمر كذلك، قد يكون RTX عامل محتمل لتؤثر على الخلايا العصبية الصغيرة-قطر على وجه التحديد وتقليد الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة في العيادة. على سبيل المثال، مارك ألماني في العيادة هي قضية معقدة بما في ذلك الاضطرابات الأيضية وأمراض الأعصاب للأعصاب المحيطية، وهي الخصائص الرئيسية للاعتلال العصبي الألياف الصغيرة. لا يمكنها استبعاد آليات الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة المرتبطة بالبلدية بمساهمة الاضطرابات الأيضية التي قد لا تكون العامل الرئيسي التي تؤثر على الأعصاب المحيطية. ولذلك، يتطلب الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة المرتبطة بمارك ألماني محض نموذج حيوانية التي يمكن استبعاد آثار الاضطرابات الأيضية المنهجي. ويصف هذا البروتوكول جرعة RTX لوضع نموذج الاعتلال العصبي ألياف صغيرة نموذجية، بما في ذلك انحطاط إيينف وإصابة الخلايا العصبية الصغيرة القطر، كما يتضح من تحليل إيمونوستاينينج تعديل العامل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الإجراءات المذكورة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية ل الحيوانات المختبرية30، وقد أقرها البروتوكول "الحيوان اللجنة في كاوشيونغ الطبية جامعة" كاوشيونج بتايوان.

1-إنشاء RTX الاعتلال العصبي

تنبيه: و RTX الأعصاب وخطرة. في الاتصال، فإنه يعمل كمصدر إزعاج للعيون والأغشية المخاطية، والجهاز التنفسي العلوي. تجنب استنشاق وارتداء نظارات مختبر ومعاطف أثناء إعداد RTX. شطف مع الكثير من الماء في حالة تماس الجلد أو بعد المعالجة.

  1. إضافة 1 ملغ مسحوق RTX 200 ميليلتر من خليط من تساوي حجم توين 80 والإيثانول المطلق (100 ميليلتر لكل مذيب).
  2. قاسمة الحل RTX (12 ميليلتر في قنينة) وتخزينها في-20 درجة مئوية، لمدة تصل إلى 3 أشهر. ويشكل هذا المخزون RTX؛ تجاهل الحل RTX المتبقية على انتهاء الصلاحية.
  3. تمييع الأسهم RTX مع المحلول الملحي العادي إلى وحدة تخزين نهائي من 600 ميليلتر. ينبغي أن يكون التركيز النهائي للحل RTX 0.01 ٪، الذي يساوي 1 ميكروغرام RTX في 10 ميليلتر السيارة الحل.
  4. استخدام عمرها 8 الأسبوع الكبار ذكور الفئران الممثل المدني الدولي (35-40 غ) كالحيوانات التجريبية وإدارة جرعة واحدة لحل RTX (الجرعة: 200 و 50، و 10 ميكروغرام/كغ، على التوالي) إينترابيريتونيلي (القائمة) بحقنه microinjection للفئران. تم تخديره الفئران بالاستنشاق مع إيسوفلوراني 5% لتخدير عميق. إذا أظهرت الفئران انسحاب العمل من الأطراف أثناء حقن RTX، ينبغي أن الفئران استنشاق أطول من التخدير.
    على سبيل المثال: إذا كان الماوس يزن 40 غ، ثم أنها سوف تتلقى 20 ميليلتر من الحل RTX، تمثل جرعة 50 ميكروغرام/كغ.
  5. إعطاء مجموعة من الفئران بتساوي حجم المركبة (10 ٪ توين 80 و 10% المطلق الإيثانول في المحلول الملحي)، كعنصر تحكم.
  6. بعد حقن RTX، إعادة دورة الفئران إلى قفص بلاستيك في 12-ح ضوء/12-ح الظلام وتوفير الغذاء والمياه libitum الإعلانية.

2-تقييم السلوك الأعصاب

ملاحظة: الحفاظ على الحيوانات في بيئة مريحة (الخطوة 1.6) للسماح للانتعاش بعد الحقن. في يوم 7 وظيفة RTX الحقن (D7)، ينفذ كل الحيوانات صفيحة وفري فون الشعر الشعيرة الاختبارات في نفس اليوم الحد من التحيز الوقت وتعزيز كفاءة الاختبارات السلوكية. جلب الحيوانات لغرفة هادئة التي يتم الاحتفاظ بالرطوبة مستقرة (40 في المائة) ودرجة حرارة (27 درجة مئوية) لتحسين تأقلم الحيوان وتقليل الآثار البيئية أثناء اختبار سلوكية. عدم الإزعاج الحيوانات خلال فترات الاختبار؛ تتم جدولة الاختبارات السلوكية أسبوعيا.

  1. القياس الحراري الاختفاء مع اختبار صفيحة
    1. ضع الحيوان برفق على صفيحة معدنية (27 سم × 29 سم) مع قفص زجاجي شفاف (الطول × العرض × الارتفاع: 22 سم × 22 سم × 25 سم؛ الشكل 1A). تعيين درجة حرارة صفيحة معدنية إلى 52 درجة مئوية.
    2. بدء قياس فترة الكمون الحراري للحيوان على صفيحة مع توقيت الخطوة على، الذي بني من صفيحة بمجرد لمس صفيحة هيندباوس للحيوان، ومراقبة ردود هيندباوس للحيوان. إذا كان هذا الحيوان يظهر الهز، لعق من هيندباوس، أو القفز بينما على صفيحة، إزالته وتسجيل مدة بقاء الحيوان على صفيحة. وتعرف هذه المدة الزمنية الكمون الحراري للحيوان الفردية. تسجيل الكمون الحرارية إلى 0.1 أقرب s.
    3. لكل جلسة الاختبار، إجراء ثلاث تجارب مع فواصل 30 دقيقة للتطبيع استجابة بعد آخر اختبار صفيحة. إذا كان هذا الحيوان يظهر أي رد على صفيحة، وقف الدورة بعد 25 ثانية لتجنب احتمال حدوث تلف في الأنسجة.
  2. اختبار قياس عتبة الميكانيكية مع خيوط الشعر فري فون
    1. وضع الحيوان على شبكة معدنية مخصصة (مش الحجم: 5 مم × 5 مم) مع قفص زجاجي شبه شفاف اسطوانة (القطر: 13 سم؛ الارتفاع: 12 سم) (الشكل 1B) للتأقلم على الأقل ح 2.
    2. تطبيق الكوادر المختلفة من خيوط الشعر فري فون إلى منطقة اللفافة هيندباو على أسلوب صعودا ونزولاً31. بدء تشغيل التطبيق الأولى من قوة وسط مجموعة من خيوط الشعر فري فون لمدة تطبيق خيوط s 5-8.
    3. استخدام فاصل 2 دقيقة بين تطبيقات خيوط لتحسين تطبيع الحيوان. تغيير قوة الشعيرة التطبيقي استناداً إلى استجابة الأخير للحيوان.
      ملاحظة: مجموعة من خيوط الشعر فري فون يتكون من 0.064 و 0، 085، 0.145، 0.32، 0.39، 1.1 و 1.7 غ حيز التطبيق. على سبيل المثال، إذا حدث انسحاب هيندباو مع قوة أولية من ز 0.32، ثم تطبيق 0.145 ز. في حالة عدم انسحاب مخلب، ثم يتم تطبيق قوة ز 0.39. ثم أربعة خيوط إضافية من قوات مختلفة يتم تطبيقها استناداً إلى الردود السابقة ويحسب على عتبة الميكانيكية وفقا صيغة منشورة31.
    4. لكل جلسة الاختبار، وتشمل هيندباوس الثنائية. أداء ثلاث محاكمات لكل هيندباو. التعبير عن متوسط هذه العتبات الميكانيكية ستة كعتبة الميكانيكية يعني (mg) كل حيوان.

Figure 1
رقم 1. مش قفص زجاجي ومعدني مصنوعة خصيصا لتقييم ألم الأعصاب في نموذج ماوس ريسينيفيراتوكسين (RTX)-التي يسببها اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة- (أ، ب) وتظهر هذه الرسوم البيانية المعدات المستخدمة لقياس (A) الاختفاء الحرارية بلوحة معدنية ساخنة (27 سم × 29 سم) مع قفص زجاجي شفاف (الطول × العرض × الارتفاع: 22 سم × 22 سم × 25 سم) وتقييم (ب) عتبة الميكانيكية ميتا مخصصة مش ل (مش الحجم: 5 مم × 5 مم) مع قفص زجاجي شبه شفاف اسطوانة (القطر: 13 سم؛ الارتفاع: 12 سم) في الفئران مع الاعتلال العصبي الناجم عن RTX الألياف الصغيرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

3-الجلد خزعة إعداد وتقييم تعصيب إيينفس

  1. وبعد اختبار السلوك، تخدير الحيوانات مع إيسوفلوراني 5% والتضحية بالحيوانات نضح intracardiac مع المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (PB) (الرقم الهيدروجيني 7.4) تليها بارافورمالدهيد 4% (ف 4) في الجريدة الرسمية م 0.1.
  2. قطع فوتبادس الأولى من هيندباوس اثنين بعد نضح وبعدها ثبت لهم في ف 4 لآخر 6 حاء نقل الأنسجة قاطع للجريدة الرسمية 0.1 متر عند 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  3. كريوبروتيكت فوتبادس مع السكروز 30% في الجريدة الرسمية بين عشية وضحاها، وقطع في رأسي إلى أخمص القدم الطريقة السطحية في شرائح سميكة 30-ميكرومتر. تسمية أقسام قاطع التتابع، ومن ثم تخزين في التجمد عند-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: تكوين التجمد كما يلي: المقطر المياه، والغليسيرول الإثيلين، الجلسرين، والجريدة الرسمية، x 2 في نسبة 3:3:3:1.
  4. لضمان أخذ العينات كافية، حدد كل القسم الثالث من قاطع.
    1. وضع المقاطع المختارة قاطع على الشرائح المغلفة الزجاج وأيردري لهم.
    2. تغطية كوبربلت بلاستيك على الشريحة وعملية مع الإجراءات القياسية إيمونوستينينج.
      1. إخماد المقاطع قاطع مع 1 ح2س2 في الميثانول لمدة 30 دقيقة وكتلة مع اللبن المجفف الخالي 0.5% و 0.1% X-100 تريتون في 0.5 "م تريس" المخزن المؤقت (تريس) لح 1.
      2. احتضان الفروع قاطع مع أنتيسيرا ضد عموم محواري ماركر، 9.5 بغب (الأرنب التي أثيرت في؛ 1:1، 000)، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      3. احتضان الفروع قاطع مع بيوتينيلاتيد ماعز أرنب المضادة مفتش ثانوي جسم في درجة حرارة الغرفة (RT) ح 1، واحتضان ثم مع المجمع عبدين-البيوتين في RT لمدة 45 دقيقة.
      4. تصور رد فعل المنتج مع 0.05% 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB) حل ل 45 s. ثم تغسل الأجزاء قاطع مع الماء المقطر وأيردري لهم للتركيب.
        ملاحظة: يتم المخفف أنتيسيرا الأولية والثانوية مع اللبن المجفف الخالي 0.5% في 0.5 "م تريس".

4-الرسم قسم إعداد وتقييم إصابة الخلايا العصبية الصغيرة-قطر

  1. تشريح 4th و 5th القطني الرسم والإصلاح اللاحقة لآخر ح 2.
  2. الأنسجة DRG كريوبروتيكت مع السكروز 30% في الجريدة الرسمية بين عشية وضحاها وقطع بسمك 8-ميكرومتر التتابع، ومكان على شرائح المجهر، والتسمية. تخزين المقاطع الرسم في ثلاجة-80 درجة مئوية.
  3. مقاطع الرسم إيمونوستاين في 80 ميكرومتر-فواصل لضمان أخذ العينات كافية.
    1. تنفيذ إجراءات immunostaining الرسم كتلك الأقسام قاطع، باستثناء الإجراءات إيمونوفلوريسسينت وسم مزدوج. وبدلاً من ذلك، تتضمن ATF3 (الأرنب التي أثيرت في؛ 1: 100)، علامة إصابة، وبيريفيرين (التي أثيرت في الماوس؛ 1:800)، وعلامة الخلايا العصبية الصغيرة-قطر في أنتيسيرا الأولية.
    2. احتضان مقاطع الرسم مع خليط أنتيسيرا الأساسي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  4. احتضان مقاطع الرسم مع أما تكساس الأحمر أو fluorescein isothiocyanate (فيتك)-مترافق أنتيسيرا الثانوي (1: 200)، تقابل أنتيسيرا الأولية المناسبة على RT ح 1، ومن ثم تحميل للقياس الكمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويصف هذا البروتوكول نموذج الفأر رواية RTX الاعتلال العصبي، مما يؤثر على وجه التحديد الخلايا العصبية الصغيرة القطر، بما في ذلك الانحطاط إيينف، المرتبطة باضطرابات حسية (الشكل 2). في أعقاب البروتوكول الموضحة هنا، أظهرت الحيوانات هيبوالجيسيا الحرارية والميكانيكية اللودينيا في حقن RTX بوست D7. لإنشاء هذا النموذج العصبي الألياف الصغيرة، ثلاث جرعات من RTX: 200 و 50، و 10 ميكروغرام/كغ كانت تدار عن طريق القائمة. واعتبر جرعة RTX (50 ميكروغرام/كغ) الحرجة والدراسة الأولية أظهرت أن جرعة العالية RTX (200 ميكروغرام/كغ) بسبب الفتك الماوس عالية (الشكل 3).

Figure 2
رقم 2. مخطط نموذج ماوس ريسينيفيراتوكسين (RTX)-التي يسببها اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة. المخطط يوضح البروتوكول المعمول الألياف الصغيرة التي يسببها RTX الاعتلال العصبي. لتقييم منتظم وتقييم السلوك ودراسة لاثيل، تضمينه صفيحة وفري فون الاختبارات، ودراسات مزدوجة المسمى إيمونوستينينج، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. تأثير جرعة من ريسينيفيراتوكسين (RTX) في هلاك الحيوانات والخلل السلوكي. (A) جرعات متنوعة من RTX تدار عن طريق الحقن داخل (القائمة). وكان فتك تأثير الجرعة الجرعة المعتمدة؛ على سبيل المثال، جرعة عالية من RTX (200 ميكروغرام/كغ) بسبب الفتك 100%. (ب، ج) وقيمت الحرارية الاختفاء وعتبات الميكانيكية مع صفيحة (ب) واختبارات الشعيرة فراي فون (ج)، على التوالي. جرعة 50 ميكروغرام/كغ من RTX التي يسببها هيبوالجيسيا الحرارية والميكانيكية اللودينيا مقارنة بالسيارة و 10 ميكروغرام/كغ-إدارة الفريق. سيارة ساحة مفتوحة؛ فتح دائرة، 50 ميكروغرام/كغ؛ فتح الماس، 10 ميكروغرام/كغ. خط متقطع في (ب)، ونقطة استقطاع وقت من صفيحة اختبار. ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مرضية، وكان هناك انحطاط إيينف وتميز ATF3 التعريفي. التسمية المزدوجة الدراسات أظهرت أن إصابة الخلايا العصبية peripherin(+) الصغيرة-قطر العصبية على وجه التحديد. في التباين، جرعة المنخفضة من RTX (10 ميكروغرام/كغ) لم تثبت الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة، بما في ذلك لا تغييرات في تعصيب إيينف (الشكل 4) وأي إصابة الخلايا العصبية (ATF3 التعريفي) (الشكل 5). تبعاً لذلك، يعتبر هذا البروتوكول جرعة 50 ميكروغرام/كغ الحاسمة لإنشاء نموذج الفأر من الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة.

وباختصار، المتأثرة منهجية الإدارة RTX بجرعة 50 ميكروغرام/كغ على وجه التحديد الألياف العصبية الصغيرة. على سبيل المثال، فإنه أدى إلى إصابة سوما الخلايا العصبية وانحطاط إيينف الطرفية، التي ترتبط باضطرابات حسية.

Figure 4
الشكل 4. تنكس الألياف العصبية إينترايبيديرمال (إيينفس) في ريسينيفيراتوكسين (RTX) اعتلال الأعصاب- (أ-ج) أقسام الأنسجة من الجلد قاطع من الفئران كانت إيمونوستينيد مع الجينات المضادة البروتين المنتج 9.5 (PGP 9.5) أنتيسيرا في السيارة ()، 50 ميكروغرام/كغ-(ب)، ومجموعات 10 ميكروغرام/كغ-التي تديرها (ج). بغب 9.5(+) إيينفس تنشأ من الضفيرة العصبية سوبيبيديرمال مع ظهور دوالي نموذجية. وتخفض إيينفس بغب 9.5 (+) ملحوظ في 50 ميكروغرام/كغ، ولكن ليس في مجموعة 10 ميكروغرام/كغ. كانت كوانتيتاتيد إيينفس (د) وفقا لنتائج المناعي A-C. سيارة ساحة مفتوحة؛ فتح دائرة، 50 ميكروغرام/كغ؛ فتح الماس، 10 ميكروغرام/كغ. ف < 0.001 مقارنة بمجموعة مركبة. مقياس بار، 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5. خصوصية للإصابة العصبية الصغيرة-قطر في الاعتلال العصبي ريسينيفيراتوكسين (RTX)- (أ-ج) وسم مزدوج إيمونوفلوريسسينت تلطيخ أجرى مع النسخ المضادة تفعيل عامل-3 (ATF3؛ أ-ج، باللون الأخضر) وبيريفيرين (أ-ج، باللون الأحمر) في السيارة (A)، 50 ميكروغرام/كغ-(ب)، ومجموعات 10 ميكروغرام/كغ-التي تديرها (ج). (د) الرسم التخطيطي يشير إلى تغيرات كثافة الخلايا العصبية ATF3(+). وزادت ATF3(+) الخلايا العصبية في 50 ميكروغرام/كغ، ولكن ليس في السيارة و 10 ميكروغرام/كغ المجموعات. سيارة ساحة مفتوحة؛ فتح دائرة، 50 ميكروغرام/كغ؛ فتح الماس، 10 ميكروغرام/كغ. ف < 0.001 مقارنة بمجموعة مركبة. مقياس بار، 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

علاج ناجع للاعتلال العصبي الألياف الصغيرة في العيادة مطلوب لتعزيز الانتعاش وظيفية ونوعية الحياة للمرضى. حاليا، هناك عدم توفر دليل العلاجي استهداف اضطراب الحسية المرتبطة بالاعتلال العصبي الألياف الصغيرة نظراً لعدم وجود فهم شامل للآليات الجزيئية الكامنة وراء إصابة الخلايا العصبية الصغيرة-قطر. النماذج السابقة من الاعتلال العصبي عادة ما تتأثر كل كبيرة وصغيرة قطرها الأعصاب الحسية؛ على سبيل المثال، النماذج من الاعتلال العصبي الناجم عن العلاج الكيميائي12،،من3233 و34،العصبي الناجم عن الميكانيكية35. وهكذا، لا يمكن استبعاد مساهمة الضعف الحركي وتلف الأعصاب الحسية كبيرة قطرها تماما في اختبار سلوكية لهذه النماذج الاعتلال العصبي. ويصف هذا البروتوكول نموذج جديد للاعتلال العصبي الألياف الصغيرة في الفئران، الذي يؤثر على الأعصاب الحسية الصغيرة-قطر فقط بتوفير الأدلة المرضية والوظيفية لانحطاط إيينفس.

RTX هو مؤثر أولترابوتينت TRPV1 كبخاخات التماثلية، مما قد يسبب خسائر بيبتيديرجيك DRG الخلايا العصبية في الثقافة36 و في فيفو نظم18،19. الدراسات السابقة على RTX كبخاخات قد ركزت أساسا على فقدان الهيئات الخلية العصبية الرسم، التي كشفت عن دور TRPV1 في38،37،استجابة الإرسال الحرارية39المورفولوجية أو وظيفية. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسة سابقة لمعالجة RTX جرعة عالية منهجية (200 ميكروغرام/كغ) في الفئران المستحث اللودينيا الميكانيكية والحرارية هيبوالجيسيا، ربما بسبب أمراض من الألياف العصبية كبيرة قطرها28. الجرعة من 200 ميكروغرام/كغ، ولكن جرعة مميتة في الفئران وهذا البروتوكول الحالي وضع نموذج للاعتلال العصبي ألياف صغيرة نقية بتخفيض الجرعة RTX (50 ميكروغرام/كغ). هذه الجرعة من RTX (50 ميكروغرام/كغ) أمر بالغ الأهمية لإنشاء نموذج الاعتلال العصبي ألياف صغيرة نقية، الذي أعلى من ذلك المبلغ عنها سابقا28، كما أنه قطع غيار ألياف كبيرة18. فإنه يؤثر فقط على الألياف العصبية الصغيرة؛ إلى الطرافة، أصيب فقط الخلايا العصبية الصغيرة القطر، كما أكدته استحثاث ATF3 upregulation6،40 في قطر الصغيرة DRG الخلايا العصبية وإيينفس تنكس6،18،19 ،41، المرتبطة باضطرابات حسية. شاملة تحاكي هذه الظواهر المرضية أعراض سريرية للاعتلال العصبي الألياف الصغيرة. وعلاوة على ذلك، هذا النموذج الحالي الناجم عن أمراض الأعصاب النموذجية والشخصية الأعصاب الألم العصبي الألياف الصغيرة والآثار واستمرت لمدة 8 أسابيع بعد RTX المعاملة6،،من1819. كانت تعادل المدد من أمراض الأعصاب والأم الأعصاب ويمكن أن ينعكس بتعزيز توليف عامل نمو العصب (ستموت)18،،من4041. جماعياً، هذا البروتوكول على حد سواء وضعت نموذجا الاعتلال العصبي ألياف صغيرة نقية وسلط الضوء على إمكانات ستموت العلاجية الممكنة.

سريرياً، هو معيار الذهب للتحقيق في اعتلالات الأعصاب التي تؤثر على الأعصاب nociceptive الصغيرة قطرها8،9 بيوبسيينج أطرافهم الجلد لتقييم تعصيب الجلد. تقريرنا الحالي تطبيق هذا الأسلوب على الجلد قاطع من الحيوانات التجريبية لتقييم تعصيب الجلد نموذج الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة، التي يمكن أن تحاكي علم الأمراض إيينفس في العيادة، وحققت أيضا الملامح المورفولوجية للرسم مقاطع مع علامة الإصابة، ATF3، للكشف عن الحالة المرضية للخلايا العصبية سوماتى. جدير بالذكر أن الغاية هي المتفرعة التوزيعات المكانية من إيينفس داخل البشرة ومعيار الحساب هي العوامل الرئيسية التي تؤدي إلى الفروق الإحصائية بين المجموعات. على سبيل المثال، لدينا البروتوكول الحالي عد كل إيينف مع نقاط التفريع فقط في الأدمة وإيينفس مع النقاط المتفرعة داخل البشرة كواحد إيينف14،،من1819. وقد تسببت هذا المعيار أقل كثافة من إيينفس في تحقيقاتنا مما في الفئات الأخرى. نحن إعداد وتجهيز الجلد ومقاطع الرسم الحيوانات التجريبية بطريقة منتظمة وتقييم الجزء الأكبر مع لدينا البروتوكول المعدل الحالي. تبعاً لذلك، هذه التحقيقات المنتظمة لانحطاط إيينف وإصابة الخلايا العصبية يمكن أن تجنب التحيز ستيريولوجيكال الظروف الوظيفية والمرضية للخلايا العصبية الصغيرة-قطر في الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة.

التقييم الوظيفي للأعصاب الصغيرة-قطر مع السلوكية التجارب، لا سيما مع تطبيق خيوط الشعر فري فون إينوكسيوس، تقليديا طبق على الجلد المرضى لتشخيص الحساسية الميكانيكية الألياف الصغيرة الكامنة اعتلال الأعصاب. مراقبة اللودينيا الميكانيكية في الحيوانات التجريبية صعبة بسبب القدم أسس على الشبكة المعدنية، التي يعتبر تحفيز ميكانيكية خارجية، والحيوانات نشطة للغاية أثناء الاختبارات. البروتوكول الحالي الأمثل طابق أسلاك شبكة محددة حجم (5 مم × 5 مم) في قفص بلاستيكية شبه شفافة للتكيف مع البيئة للحيوانات التجريبية للاختبارات السلوكية. هذا الحجم من الكلمة مش يمكنها أن تقلل تحفيز القدم أسس خارجية وتجنب إسقاط سيرا على الأقدام.

يمكن تطبيق هذا النموذج الماوس RTX الاعتلال العصبي لأنواع مختلفة من الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة، مثل مرض السكري، الذي يرتبط مع إيينف تنكس1،42. بيد أن هذا النموذج لا يزال محدودا. على سبيل المثال، نموذج الحيوان للعصب الشوكي ربط43 مع خصائص الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة، ويشار إلى اعتلال الجذور في العيادة، قد تؤثر أيضا على الألياف الكبيرة في روتليت العمود الفقري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

وأيد هذا العمل منح من وزارة العلوم والتكنولوجيا (106-2320-ب-037-024) والجامعة الطبية كاوسيونغ (KMU-M106028، KMU-S105034) ويهدف "منح الجامعات الأعلى" (TP105PR15)، جامعة الطب كاوشيونغ، تايوان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical reagent
Resiniferatoxin Sigma R8756
Tween 80 Sigma P1754
3,3’-diaminobenzidine Sigma D8001
avidin-biotin complex Vector PK-6100
Name Company Catalog Number Comments
Primary Antisera
Peripherin Chemicon MAB-1527
ATF3 Santa Cruz SC-188
PGP9.5 UltraClone RA95101
Name Company Catalog Number Comments
Secondary Antisera
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector BA-1000
Texas Red-conjugated goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-075-146
Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-095-152
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Hot plate IITC Model 39
von Frey filament Somedic Sales AB 10-600-0001
Name Company Catalog Number Comments
Material
Shandon coverplate Thermo scientific 72110017
Slide rack Thermo scientific 73310017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
  2. Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
  3. Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
  4. Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
  5. Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
  6. Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
  7. Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
  8. Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
  9. Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
  10. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
  11. Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
  12. Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
  13. Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
  14. Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
  15. Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
  16. Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
  17. Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
  18. Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
  19. Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
  20. Neubert, J. K., et al. Peripherally induced resiniferatoxin analgesia. Pain. 104 (1-2), 219-228 (2003).
  21. Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
  22. Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
  23. Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
  24. Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
  25. Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Jr Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), table of contents 1253-1258 (2002).
  26. Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
  27. Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
  28. Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
  29. Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
  30. Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
  31. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  32. Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
  33. Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
  34. Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
  35. Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
  36. Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
  37. Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
  38. Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
  39. Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
  40. Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
  41. Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
  42. Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
  43. Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).

Tags

علم الأعصاب، 132 قضية، ريسينيفيراتوكسين (RTX)، فراي فون الشعر الشعيرة، صفيحة اختبار، اللودينيا الميكانيكية، هيبوالجيسيا الحرارية، مستقبلات عابر المحتملة فانيلويد نوع 1 (TRPV1)، الاعتلال العصبي، والألياف الصغيرة إصابات الأعصاب، تنشيط النسخ 3-عامل (ATF3)
إنشاء نموذج الفأر الاعتلال العصبي الألياف صغيرة نقية مع مؤثر أولترابوتينت من نوع فانيلويد المحتملة مستقبلات عابر 1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y. C., Lu, S. C., Hsieh, Y. L.… More

Lee, Y. C., Lu, S. C., Hsieh, Y. L. Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1. J. Vis. Exp. (132), e56651, doi:10.3791/56651 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter