Summary
Denne undersøgelse fastslår en eksperimentel model af ren lille fiber neuropati med resiniferatoxin (RTX). En unik dosis af RTX (50 µg/kg) er optimal til at udvikle en lille fiber neuropati model, der efterligner patient egenskaber og kan hjælpe med at undersøge de nociceptive molekylære betydning underliggende neuropatiske smerter.
Abstract
Patienter med diabetes mellitus (DM), eller dem, der oplever de neurotoksiske virkninger af kemoterapeutiske stoffer kan udvikle sensation lidelser på grund af degeneration og skade for lille diameter sensoriske neuroner, omtales som lille fiber neuropati. Nuværende dyremodeller for lille fiber neuropati påvirker både store - og lille diameter sensoriske fibre og dermed skabe en neuropatologiske alt for komplekse til korrekt vurdering af virkningerne af tilskadekomne lille diameter sensoriske fibre. Det er derfor nødvendigt at udvikle en eksperimentel model af ren lille fiber neuropati tilstrækkeligt undersøge disse spørgsmål. Denne protokol beskriver en eksperimentel model af lille fiber neuropati især berører lille diameter sensoriske nerver med resiniferatoxin (RTX), en ultrapotent agonist af forbigående receptor potentielle vanilloid type 1 (TRPV1), gennem en enkelt dosis intraperitoneal injektion, omtales som RTX neuropati. Denne RTX neuropati viste patologiske manifestationer og adfærdsmæssige abnormiteter, der efterligner de kliniske karakteristika for patienter med lille fiber neuropati, herunder intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specielt skade i lille diameter neuroner, og induktion af termiske hypoalgesia og mekanisk allodyni. Denne protokol testet tre doser af RTX (200, 50 og 10 µg/kg, henholdsvis) og konkluderede, at en kritisk dosis af RTX (50 µg/kg) er nødvendige for udviklingen af typiske lille fiber neuropati manifestationer, og forberedt en modificeret immunfarvning procedure til undersøge IENF degeneration og neuronal soma skade. Den ændrede procedure er hurtig, systematisk og økonomisk. Adfærdsmæssige evaluering af neuropatiske smerter er kritisk at afsløre funktionen af lille diameter sensoriske nerver. Evaluering af mekaniske tærskler i eksperimentel gnavere er særligt udfordrende og denne protokol beskriver en tilpasset metalnet, der er egnet til denne type af vurdering i gnavere. Sammenfattende er RTX neuropati en ny og let etablerede eksperimentel model til at vurdere den molekylære betydning og intervention underliggende neuropatiske smerter for udviklingen af terapeutiske agenter.
Introduction
Lille fiber neuropati med neuropatisk smerte, hvilket er tydeligt af degeneration af IENFs, er fælles i forskellige former for betingelser, såsom DM, og som følge af de neurotoksiske virkninger af kemoterapeutika1,2, 3,4,5. IENFs er lille diameter neuroner beliggende i dorsalrodsganglier (DRG) perifere terminaler, og påvirkes parallelt i tilfælde af IENF degeneration6. For eksempel, er den ændrede opstrøms genetiske transskription af neuronal somata blevet påvist ved opregulering af aktivering transskription faktor-3 (ATF3)6,7. Desuden er evaluering af IENFs innervation med hudbiopsi nyttig til diagnosticering af lille fiber neuropati5,8,9. Traditionelt, har profiler af IENFs på hudbiopsi afhang af immunhistokemisk påvisning af protein gen produkt 9,5 (PGP 9.5)1,10,11. Tilsammen, de patologiske profiler af DRG og IENFs afspejler funktionelle tilstand underliggende lille fiber neuropati og kan være en indikator for de funktionelle konsekvenser af denne type af neuropati på lille diameter neuroner.
Tidligere, flere eksperimentelle modeller har behandlet spørgsmålet om IENF degeneration i tilfælde af kemoterapi-induceret neuropati12,13 og nerve skade forårsaget af kompression eller transection14,15 , 16. disse eksperimentelle modeller også påvirket store diameter nerver; Det var derfor ikke muligt at udelukke bidrag af berørte store diameter nerver i observerede lille fiber neuropati; for eksempel, afhænger behandlingen af thermosensation lidelse af skadelige tilbagetrækning funktionelle motor nervefibre17,18,19. Således, om oprettelse af en ren lille fiber neuropati model og systematisk undersøger den patologiske status af både neuronal somata og deres perifere kutane nervefibre i lille diameter neuroner er nødvendig og afgørende.
RTX er en capsaicin analoge og en potent agonist til forbigående receptor potentielle vanilloid receptor 1 (TRPV1), der medierer nociceptive forarbejdning20,21,22. For nylig perifere RTX behandling lettet neurogen smerte23,24,25 , og en intraganglionic indsprøjtning af RTX induceret uoprettelige tab af DRG neuroner22. Effekten af perifere RTX administration er dosisafhængig20,26,27, hvilket resulterede i forbigående desensibilisering eller degeneration af IENFs. Intriguingly, systematisk højdosis RTX behandling førte til neuropatisk smerte28, et symptom på lille fiber neuropati. Disse resultater tyder på, at behandling tilstand og dosis af RTX producere forskellige patologisk virkninger og neuronale reaktioner; nemlig perifere administration forhindret smerte transmission af lokale virkninger29 og påvirket af neuronal somata, der udviklede neuropatiske adfærd6. Kollektivt, viser disse resultater, at RTX har en multipotency effekt og rejste spørgsmålet, om der er en bestemt dosis af RTX, som systematisk kan påvirke de perifere nerver, såsom den perifere IENFs og centrale neuronal somata. I så fald kunne RTX være en potentiel agent til specifikt påvirker lille diameter neuroner og efterligne lille fiber neuropati i klinikken. For eksempel, er DM i klinikken et kompliceret spørgsmål, herunder stofskiftesygdom og neuropatologiske af perifere nerver, som er de vigtigste karakteristika ved lille fiber neuropati. Mekanismerne i DM-associerede lille fiber neuropati kunne ikke udelukke bidrag af stofskiftesygdom, der ikke muligvis er den vigtigste agent påvirker perifere nerver. DM-associerede lille fiber neuropati kræver derfor, en ren dyremodel, der kunne udelukke virkningerne af systematisk stofskiftesygdom. Denne protokol beskriver den arbejdende dosis af RTX at udvikle en typisk lille fiber neuropati model, herunder IENF degeneration og lille diameter neuron skade, som det fremgår af modificerede immunfarvning analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurerne er i overensstemmelse med etiske retningslinjer for laboratoriet dyr30, og protokollen er blevet godkendt af de dyr Udvalget af Kaohsiung medicinske universitet, Kaohsiung, Taiwan.
1. etablering af RTX neuropati
Forsigtighed: RTX er neurotoksiske og farlige. På kontakt virker det irriterende på øjne, slimhinder og øvre luftveje. Undgå indånding og bære lab briller og frakker under RTX forberedelse. Skyl med rigeligt vand i tilfælde af hudkontakt eller efter håndtering.
- Tilføje 1 mg RTX pulver til en 200 µL af blanding af lige saa stort volumen af Tween 80 og absolut ethanol (100 µL for hvert opløsningsmiddel).
- Alikvot RTX løsning (12 µL/vial) og opbevares ved-20 ° C, for op til 3 måneder. Dette udgør RTX materiel; Kassér den resterende RTX løsning ved udløb.
- Fortynd RTX bestanden med normal saltvand til en endelige mængden af 600 µL. Den endelige koncentration af RTX løsning bør være 0,01%, hvilket svarer til 1 µg RTX i 10 µL køretøj løsning.
- Bruge 8-uge-forhenværende voksne mandlige ICR mus (35-40 g) som forsøgsdyr og administrere en enkelt dosis af RTX løsning (dosis: 200, 50 og 10 µg/kg, henholdsvis) intraperitoneal (i.p.) med en mikroinjektion sprøjte til mus. Mus var bedøvede af inhalator med 5% isofluran til dyb anæstesi. Hvis mus viste tilbagetrækning handling af ekstremiteterne under RTX injektion, bør mus tage længere indånding af anæstesi.
Eksempel: Hvis musen vejer 40 g, så det vil modtage 20 µL af opløsningen RTX, der repræsenterer dosis af 50 µg/kg. - Give én gruppe mus et lige saa stort volumen af køretøjet (10% Tween 80 og 10% absolut ethanol i saltopløsning), som et kontrolelement.
- Efter RTX injektion, returnere mus til en plast bur på en 12-lys/12 Hansen mørke cyklus og giver mad og vand ad libitum.
2. evaluering af neuropatisk adfærd
Bemærk: Fastholde dyr i et behageligt miljø (trin 1,6) at tillader opsving efter injektion. På dag 7 indlæg RTX injektion (D7) udfører hvert dyr varmeplade og von Frey hår glødetrådens testene på samme dag at reducere tid bias og fremme effektiviteten af de adfærdsmæssige test. Bringe dyr til et stille rum, der er opretholdt ved en stabil fugtighed (40%) og temperatur (27 ° C) til optimering af animalske akklimatisering og reducere miljøvirkninger i løbet af de adfærdsmæssige test. Forstyr ikke dyrene i test perioder; de adfærdsmæssige test planlægges ugentligt.
- Måling af termisk ventetid med varmeplade test
- Placere dyret forsigtigt på en metal varmeplade (27 cm × 29 cm) med en gennemsigtig Plexiglas bur (længde × bredde × højde: 22 cm × 22 cm × 25 cm; Figur 1A). Indstil temperaturen af metal varmepladen til 52 ° C.
- Begynde at måle varigheden af dyrets termisk latency på varmepladen med de skridt, indbygget timer af varmepladen, når dyrets hindpaws touch varmepladen, og observere svar af dyrets hindpaws. Hvis dyret ryster, slikke af hindpaws, eller hoppe på varmepladen, fjerne det og registrere den varighed, dyret forblev på varmepladen. Denne varighed definerer den termiske latenstid af enkelte dyr. Optage den termiske ventetid til den nærmeste 0,1 s.
- For hver test session, skal du udføre tre forsøg med 30-min mellemrum for svar normalisering efter den sidste varmeplade test. Hvis dyret viser ingen svar på varmepladen, stopper sessionen efter 25 s for at undgå potentielle vævsskader.
- Måling af mekaniske tærskel med von Frey hår glødetråden test
- Sætte dyret på den tilpassede metalnet (mesh størrelse: 5 mm × 5 mm) med en semi-gennemsigtige cylinder Plexiglas bur (diameter: 13 cm, højde: 12 cm) (figur 1B) til akklimatisering i mindst 2 timer.
- Anvende de forskellige calibers af von Frey hår filamenter til plantar regionen af hindpaw med up-and-down metode31. Start første ansøgning fra et sæt af von Frey hår filamenter midterste kraft for en varighed af glødetrådens anvendelse af 5-8 s.
- Brug 2 min interval mellem glødetrådens applikationer til at optimere animalske normalisering. Ændre den anvendte glødetrådens kraft baseret på dyrets sidste svar.
Bemærk: Et sæt af von Frey hår filamenter består af 0.064, 0.085, 0,145, 0,32, 0,39, 1.1 og 1,7 g force ansøgning. For eksempel, hvis hindpaw tilbagetrækning skete med en initial kraft på 0,32 g, derefter anvende 0.145 g. I mangel af pote tilbagetrækning, er en 0,39 g force derefter anvendt. Derefter fire ekstra filamenter af varierende styrker anvendes baseret på de foregående svar og den mekaniske tærskel er beregnet efter en offentliggjort formel31. - For hver test session, omfatte de bilaterale hindpaws. Udføre tre forsøg for hvert hindpaw. Express gennemsnittet af disse seks mekaniske tærskler som den gennemsnitlige mekaniske tærskel (mg) af hvert dyr.
Figur 1. Skræddersyede Plexiglas bur og metal mesh for evaluering af neuropatisk smerte i musemodel af resiniferatoxin (RTX)-induceret lille fiber neuropati. (A, B) Disse grafer viser det udstyr, der anvendes til at måle (A) de termiske ventetid af en metal varmeplade (27 cm × 29 cm) med en gennemsigtig Plexiglas bur (længde × bredde × højde: 22 cm × 22 cm × 25 cm) og evaluere (B) den mekaniske tærsklen af en brugerdefineret meta l mesh (mesh størrelse: 5 mm × 5 mm) med en semi-gennemsigtige cylinder Plexiglas bur (diameter: 13 cm, højde: 12 cm) i mus med RTX-induceret lille fiber neuropati. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
3. hud biopsi forberedelse og evaluering af IENFs Innervation
- Efter opførsel test, bedøver dyr med 5% isofluran og ofre dyr af intracardiac perfusion med 0,1 M fosfat buffer (PB) (pH 7,4) efterfulgt af 4% PARAFORMALDEHYD (4P) i 0,1 M PB.
- Skær de første trædepuder af de to hindpaws efter perfusion og post fiksere dem i 4 P til en anden 6 h. overførsel footpad væv til 0,1 M PB ved 4 ° C til langtidsopbevaring.
- Cryoprotect trædepuder med 30% saccharose i PB natten over og skæres i en lodret til plantar overflade måde i 30 µm tykke skiver. Mærke footpad afsnit sekventielt, og derefter gemme i frostvæske på-20 ° C.
Bemærk: Frostvæske sammensætning er som følger: destilleret vand, ethylen glycerol, glycerol, og 2 x PB i forholdet 3:3:3:1. - For at sikre tilstrækkelig prøveudtagning, markere hver tredje afsnit af footpad.
- Sæt den valgte footpad sektioner på coatede glas lysbilleder og lufttørre dem.
- Dække en plastik coverplate på dias og processen med standard immunfarvning procedurer.
- Dæmpning footpad sektioner med 1% H2O2 i methanol i 30 min og blokere med 0,5% nonfat tørt mælk og 0,1% Triton X-100 i 0,5 M Tris buffer (Tris) i 1 time.
- Inkuber footpad sektioner med antiserum mod pan cytoskeletale markør, PGP 9,5 (hævet i kanin; 1:1, 000), natten over ved 4 ° C.
- Inkuber footpad sektioner med et biotinylated gede anti-kanin IgG sekundær antistof ved stuetemperatur (RT) for 1 time, og derefter inkuberes med begærlighed-biotin kompleks på RT for 45 min.
- Visualisere reaktionsprodukt med 0,05% 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) løsning til 45 s. Derefter vaskes footpad sektioner med destilleret vand og lufttørre dem til montering.
Bemærk: De primære og sekundære antisera fortyndes med 0,5% nonfat tørt mælk i 0,5 M Tris.
4. DRG afsnittet forberedelse og evaluering af tilskadekomne lille diameter neuroner
- Dissekere den 4th og 5th lumbal DRG og efter rettelse til en anden 2 h.
- Cryoprotect DRG væv med 30% saccharose i PB natten over og skær til en 8-µm tykkelse sekventielt, sted på objektglas, og etiketten. Gemme DRG sektioner i en-80 ° C fryser.
- Immunostain DRG sektioner i 80 µm-mellemrum for at sikre passende stikprøver.
- Udføre DRG immunfarvning procedurer som dem af footpad sektioner, bortset fra de mærkning af dobbelt foretages procedurer. Alternativt, omfatter ATF3 (hævet i kanin; 1: 100), en skade markør, og peripherin (hævet i mus; 1:800), en lille diameter neuronal markør i de primære antisera.
- Inkuber DRG sektioner med blanding af primære antisera natten over ved 4 ° C.
- Inkuber DRG sektioner med enten Texas rød eller fluorescein isothiocyanat (FITC)-konjugeret sekundære antisera (1:200), svarende til de passende primære antisera på RT for 1 time, og derefter montere for kvantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver en roman musemodel af RTX neuropati, som specielt påvirker lille diameter neuroner, herunder IENF degeneration, forbundet med sensoriske forstyrrelser (figur 2). Efter den protokol, der er beskrevet heri, udstillede dyr termisk hypoalgesia og mekanisk allodyni på D7 post RTX injektion. At etablere denne lille fiber neuropati model, tre doser af RTX: 200, 50 og 10 µg/kg blev administreret af ruten i.p.. RTX dosis (50 µg/kg) blev anset for kritiske og den foreløbige undersøgelse viste, at høj-dosis RTX (200 µg/kg) forårsagede høje mus dødelighed (figur 3).
Figur 2. Ordningen af musemodel af resiniferatoxin (RTX)-induceret lille fiber neuropati. Ordningen viser protokollen af etablerede RTX-induceret lille fiber neuropati. For systematisk vurdering, opførsel evaluering og Neuropatologisk undersøgelse omfattede det varmeplade og von Frey tests og dobbelt-mærket immunfarvning undersøgelser, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Dosis-effekt af resiniferatoxin (RTX) på animalsk dødelighed og adfærdsmæssige dysfunktion. (A) forskellige doser af RTX blev administreret af intraperitoneal (i.p.) injektion. Dødelighed af dosis-effekt er dosis-afhængige; for eksempel, en høj-dosis af RTX (200 µg/kg) forårsagede 100% dødelighed. (B, C) Termisk ventetid og mekaniske tærskler blev vurderet med varmeplade (B) og von Frey glødetrådens tests (C), henholdsvis. En 50 µg/kg dosis af RTX induceret termisk hypoalgesia og mekanisk allodyni i forhold til køretøjet og de 10 µg/kg-administreret gruppe. Åbne firkantede, motorkøretøjet Åbn cirkel, 50 µg/kg. Åbn diamant, 10 µg/kg. Stiplet linje i (B), cutoff tidspunkt af varmeplade test. p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Patologisk, fandtes IENF degeneration og markeret ATF3 induktion. Dobbelt-mærkning undersøgelser viste, at tilskadekomne neuroner var specifikt peripherin(+) lille diameter neuroner. I kontrast, lav-dosis af RTX (10 µg/kg) ikke opstille lille fiber neuropati, herunder ingen ændringer i IENF innervation (figur 4) og ingen neuronal skade (ATF3 induktion) (figur 5). Derfor finder denne protokol 50 µg/kg dosis kritisk at etablere musemodel af lille fiber neuropati.
I Resumé påvirket systematisk RTX administration med en 50 µg/kg dosis specielt lille nervefibre. For eksempel, førte det til neuronal soma skade og perifere IENF degeneration, der er forbundet med sensoriske forstyrrelser.
Figur 4. Degeneration af intraepidermal nervefibre (IENFs) i resiniferatoxin (RTX) neuropati. (A-C) Væv sektioner fra footpad huden af mus blev immunostained med anti-genet produkt 9,5 (PGP 9.5) antisera i køretøjet (A), 50 µg/kg-(B), og 10 µg/kg-administreret (C) grupper. PGP 9.5(+) IENFs opstår fra subepidermal nerve plexus med en typisk åreknuder udseende. PGP 9,5 (+) IENFs er markant reduceret i de 50 µg/kg, men ikke i gruppen 10 µg/kg. (D) IENFs var quantitated i henhold til immunhistokemiske resultaterne af A-C. Åbne firkantede, motorkøretøjet Åbn cirkel, 50 µg/kg. Åbn diamant, 10 µg/kg. p < 0,001 i forhold til gruppen køretøj. Skala bar, 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Specificitet for lille diameter neuron skade i resiniferatoxin (RTX) neuropati. (A-C) Dobbelt-mærkning immunfluorescent farvning blev udført med anti-aktiverende transskription faktor-3 (ATF3; A-C, med grønt) og peripherin (A-C, i rød) i køretøjet (A), 50 µg/kg-(B), og 10 µg/kg-administreret (C) grupper. (D) i diagrammet angiver tæthed ændringer af ATF3(+) neuroner. ATF3(+) neuroner blev øget i 50 µg/kg, men ikke i køretøjet og 10 µg/kg grupper. Åbne firkantede, motorkøretøjet Åbn cirkel, 50 µg/kg. Åbn diamant, 10 µg/kg. p < 0,001 i forhold til gruppen køretøj. Skala bar, 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virkningsfuldt terapi af lille fiber neuropati i klinikken er nødvendig for at fremme funktionel genopretning og livskvalitet for patienterne. I øjeblikket, er der mangel på en terapeutisk vejledning målretning sensorisk forstyrrelse forbundet med lille fiber neuropati skyldes manglende forståelse for de molekylære mekanismer bag lille diameter neuronal skade. Tidligere modeller af neuropati påvirket normalt både store - og lille diameter sensoriske nerver; for eksempel, modellerne af kemoterapi-induceret neuropati12,32,33 og mekanisk-induceret neuropati34,35. Således kunne motor svaghed og stor diameter sensoriske nerveskader bidrag ikke helt udelukkes i den adfærdsmæssige test af disse neuropati modeller. Denne protokol beskriver en ny model for lille fiber neuropati hos mus, som påvirker kun lille diameter sensoriske nerver af patologisk og funktionelle dokumentation af IENFs degeneration.
RTX er en ultrapotent agonist af TRPV1 og en capsaicin analog, hvilket kan medføre tab af peptidergic DRG neuroner i kultur36 og i vivo systemer18,19. Tidligere undersøgelser på RTX og capsaicin har primært fokuseret på de morfologiske eller funktionelle tab af DRG neuronal celle organer, som afslørede TRPV1 rolle i den termiske transmission svar37,38,39. Desuden, en tidligere undersøgelse viste systematisk højdosis RTX behandling (200 µg/kg) i rotter, induceret mekanisk allodyni og termiske hypoalgesia, muligvis på grund af patologi af stor diameter nervefibre28. Dosis på 200 µg/kg, men er en dødelig dosis i mus og denne aktuelle protokol udviklet en ren lille fiber neuropati model ved at reducere RTX dosis (50 µg/kg). Denne dosis af RTX (50 µg/kg) er afgørende for at etablere en ren lille fiber neuropati model, som er overlegen i forhold til det tidligere rapporterede28, det skåner store fibre18. Det vil sige, påvirker det kun små nerve fibre; nemlig blev kun lille diameter neuroner såret, som bekræftet af induktion af ATF3 Opregulering6,40 på lille diameter DRG neuroner og IENFs degeneration6,18,19 ,41, forbundet med sensoriske forstyrrelser. Disse patologiske manifestationer efterligne udførligt de kliniske symptomer på lille fiber neuropati. Desuden, denne aktuelle model induceret den typiske neuropatologiske og neuropatiske smerter profil af lille fiber neuropati og virkningerne varet i 8 uger post RTX behandling6,18,19. Varigheder af neuropatologiske og neuropatiske smerter var tilsvarende og kunne vendes ved at fremme syntesen af nerve vækstfaktor (NGF)18,40,41. Kollektivt, denne protokol både etableret en ren lille fiber neuropati model og fremhævet NGF mulige terapeutiske potentiale.
Klinisk, er guldstandarden for at undersøge neuropatier påvirker lille diameter nociceptive nerver8,9 biopsying lemmer hud for at vurdere hud innervation. Vores nuværende rapport anvendt denne teknik til footpad huden af forsøgsdyr til at evaluere hud innervation af en lille fiber neuropati model, som kunne efterligne patologi af IENFs i klinikken, og også undersøgt de morfologiske profiler af DRG sektioner med skade markør, ATF3, til at afsløre den patologiske status af neuronal somata. Især de rumlige fordelinger af IENFs inden for epidermis forgrening yderst og optællingskriterierne er den vigtigste faktor, der fører til statistiske forskelle mellem grupperne. For eksempel optalt vores aktuelle protokol hver IENF med forgrening punkter kun i dermis og IENFs med forgrening punkter i epidermis som en enkelt IENF14,18,19. Dette kriterium kan have forårsaget en lavere tæthed af IENFs i vores undersøgelser end i de andre grupper. Vi tilberedte og forarbejdede hud og DRG sektioner af forsøgsdyr i en systematisk og bulk-evaluering mode med vores nuværende ændrede protokol. Således, disse systematiske undersøgelser af IENF degeneration og neuronal skade kunne undgå den stereological skævhed af funktionelle og patologiske betingelser for lille diameter neuroner i lille fiber neuropati.
Funktionel evaluering af lille diameter nerver med adfærdsmæssige har test, især med innoxious von Frey hår glødetrådens ansøgning, traditionelt anvendt patienter hud til at diagnosticere den underliggende lille fiber mekaniske følsomhed neuropati. Observation af mekanisk allodyni i forsøgsdyr er udfordrende på grund af foden grundstødning på metalnet, der anses for at være udefrakommende mekanisk stimulation, og dyrene er meget aktive under test. Den nuværende protokol optimeret en bestemt størrelse mesh wire gulv (5 mm × 5 mm) i en semi-gennemsigtig plast bur for miljømæssig tilpasning af forsøgsdyr for de adfærdsmæssige test. Denne størrelse af trådnet gulvet kunne reducere den eksogene stimulation af mund grundstødning og undgå mund-slippe.
Denne RTX musemodel af neuropati kan anvendes til forskellige typer af små fiber neuropati, såsom diabetes, som er forbundet med IENF degeneration1,42. Men denne model er stadig begrænset. For eksempel kan dyremodel af spinal nerve ligatur43 med Karakteristik af lille fiber neuropati, kaldet radiculopathy i klinikken, også påvirke de store fibre i den spinal rootlet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra ministeriet for videnskab og teknologi (106-2320-B-037-024), Kaohsiung medicinske universitet (KMU-M106028, KMU-S105034) og mål for Top universiteter Grant (TP105PR15), Kaohsiung medicinske universitet, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
- Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
- Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
- Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
- Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
- Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
- Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
- Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
- Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
- Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
- Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
- Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
- Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
- Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
- Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
- Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
- Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
- Neubert, J. K., et al. Peripherally induced resiniferatoxin analgesia. Pain. 104 (1-2), 219-228 (2003).
- Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
- Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
- Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Jr Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), table of contents 1253-1258 (2002).
- Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
- Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
- Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
- Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
- Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
- Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
- Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
- Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
- Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
- Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
- Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
- Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
