Summary
Este estudio establece un modelo experimental de neuropatía de fibra pequeña pura con la resiniferatoxina (RTX). Una dosis única de RTX (50 μg/kg) es óptimo para el desarrollo de un modelo de neuropatía de fibra pequeña que imita las características de los pacientes y podría ayudar a investigar el significado molecular nociceptivo subyacente dolor neuropático.
Abstract
Pacientes con diabetes mellitus (DM) o experimentar los efectos neurotóxicos de los agentes quimioterapéuticos pueden desarrollar trastornos de la sensibilidad debido a la degeneración y lesión de las neuronas sensoriales de pequeño diámetro, conocido como neuropatía de fibra pequeña. Modelos animales actuales de neuropatía de fibra pequeña afectan tanto las fibras sensoriales de diámetro grande y pequeño y así crean una neuropatología demasiado complejos para evaluar correctamente los efectos de heridas fibras sensoriales de pequeño diámetro. Por lo tanto, es necesario desarrollar un modelo experimental de neuropatía de fibra pequeña pura para examinar adecuadamente estas cuestiones. Este protocolo describe un modelo experimental de neuropatía de fibra pequeña que específicamente afectan nervios sensoriales de pequeño diámetro con resiniferatoxina (RTX), un agonista ultrapotent del receptor transitorio potencial vaniloides tipo 1 (TRPV1), a través de una sola dosis de inyección intraperitoneal, se denomina neuropatía RTX. Esta neuropatía RTX mostró manifestaciones patológicas y anormalidades del comportamiento que imitan las características clínicas de los pacientes con neuropatía de fibra pequeña, incluyendo la degeneración de la fibra del nervio (IENF) de intraepidermal, específicamente lesiones en las neuronas de pequeño diámetro y la inducción de hipoalgesia térmica y alodinia mecánica. Este protocolo probado tres dosis de RTX (200, 50 y 10 μg/kg, respectivamente) y concluyeron que una dosis crítica de RTX (50 μg/kg) es necesaria para el desarrollo de manifestaciones de neuropatía de fibra pequeña típica y preparado un procedimiento modificado de la inmunotinción para investigar IENF degeneración y lesión del soma neuronal. El procedimiento modificado es rápida, sistemática y económica. Evaluación conductual del dolor neuropático es fundamental para revelar la función de los nervios sensoriales de pequeño diámetro. La evaluación de los umbrales mecánicos en roedores experimentales es particularmente desafiante y este protocolo describe una malla metálica modificada para requisitos particulares que es conveniente para este tipo de evaluación en los roedores. En Resumen, la neuropatía RTX es un modelo experimental nuevo y fácilmente establecido para evaluar la significación molecular e intervención subyacente dolor neuropático para el desarrollo de agentes terapéuticos.
Introduction
Neuropatía de fibra pequeña que implicaba el dolor neuropático, que es evidente por la degeneración de IENFs, es común en varios tipos de condiciones, como la DM y como resultado de los efectos neurotóxicos de los agentes quimioterapéuticos1,2, 3,4,5. IENFs son los terminales periféricos de diámetro pequeño de neuronas localizadas en los ganglios de raíz dorsal (GRD) y son afectados en paralelo en los casos de IENF degeneración6. Por ejemplo, la transcripción genética upstream alterada de Somas neuronales ha demostrado por el upregulation de activar la transcripción factor-3 (ATF3)6,7. Por otra parte, la evaluación de la inervación IENFs con biopsia de la piel es útil para el diagnóstico de neuropatía de fibra pequeña5,8,9. Tradicionalmente, los perfiles de las IENFs en la biopsia de la piel han dependido de demostración immunohistochemical del producto del gene de la proteína 9.5 (PGP 9.5)1,10,11. Tomados en conjunto, los perfiles patológicos de DRG y IENFs reflejan la neuropatía de fibra pequeña subyacente condición funcional y pueden ser un indicador de las consecuencias funcionales de este tipo de neuropatía en las neuronas de pequeño diámetro.
Previamente, varios modelos experimentales han abordado el tema de la degeneración IENF en casos de neuropatía inducida por quimioterapia12,13 y nervio lesión causada por compresión o sección transversal14,15 , 16. estos modelos experimentales también afectaron los nervios de gran diámetro; por consiguiente, no es posible excluir la contribución de los nervios afectados de gran diámetro en la neuropatía de fibra pequeña observada; por ejemplo, el examen de thermosensation trastorno por retiro nocivo depende de las fibras del nervio de motor funcional17,18,19. Por lo tanto, establecer un modelo de neuropatía de fibra pequeña pura e investigar sistemáticamente el estado patológico de Somas neuronales y sus fibras nerviosas cutáneas periféricas en las neuronas de pequeño diámetro son necesario e imperioso.
RTX es un análogo de la capsaicina, un potente agonista del receptor transitorio potencial vaniloides receptor 1 (TRPV1), que media el proceso nociceptivo20,21,22. Recientemente, periférica tratamiento RTX relevó dolor neurogénico23,24,25 y una inyección intraganglionic de RTX indujo la pérdida irreversible de neuronas DRG22. El efecto de la administración de RTX periférica es dosis dependiente20,26,27, que dio lugar a la desensibilización transitoria o degeneración de IENFs. Curiosamente, tratamiento sistemático de RTX de la alto-dosis llevó a dolor neuropático28, un síntoma de neuropatía de fibra pequeña. Estos resultados sugieren que el modo de tratamiento y la dosis de RTX producen distintos efectos patológicos y respuestas neuronales; a saber, administración periférica impidió la transmisión del dolor por los efectos locales29 y afectado los Somas neuronales que desarrollado comportamiento neuropático6. Colectivamente, estos resultados indican que el RTX tiene un efecto de multipotencia y planteó la cuestión de si existe una dosis determinada de RTX que sistemáticamente puede afectar los nervios periféricos, como la IENFs periféricas y central Somas neuronales. Si es así, el RTX puede ser un agente potencial que específicamente afectan a las neuronas de pequeño diámetro y mímico neuropatía de fibra pequeña en la clínica. Por ejemplo, DM en la clínica es un tema complicado como desorden metabólico y neuropatología de nervios periféricos, que son las principales características de la neuropatía de fibra pequeña. Los mecanismos de la neuropatía de fibra pequeña asociada a DM no podrían excluir la contribución de desorden metabólico que puede no ser el principal agente que afectan a los nervios periféricos. Por lo tanto, neuropatía de fibra pequeña asociada a la DM requiere de un modelo animal puro que podría excluir los efectos del desorden metabólico sistemático. Este protocolo describe la dosis de trabajo de RTX para desarrollar un modelo de neuropatía de fibra pequeña típica, como IENF degeneración y lesión de la neurona de pequeño diámetro, según lo demostrado por análisis de immunostaining modificado.
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Protocol
Todos los procedimientos descritos están conforme a normas éticas para los animales de laboratorio30, y el protocolo ha sido aprobado por la Animal Comité de Kaohsiung Universidad médica, Kaohsiung, Taiwan.
1. establecimiento de la neuropatía RTX
PRECAUCIÓN: RTX es neurotóxica y peligrosos. En contacto, que actúa como un irritante a los ojos, membranas mucosas y tracto respiratorio superior. Evitar la inhalación y gafas de laboratorio y capas durante la preparación de RTX. Enjuague con abundante agua en caso de contacto con la piel o después de manipular.
- Añadir 1 mg de RTX polvo a 200 μL de mezcla de igual volumen de Tween 80 y etanol absoluto (100 μL para cada solvente).
- Alícuota de la solución RTX (12 μl/frasco) y almacenar a-20 ° C, por hasta 3 meses. Esto constituye la acción RTX; desechar la solución restante de RTX en la expiración.
- Diluir el caldo RTX con suero fisiológico hasta un volumen final de 600 μl. La concentración final de la solución RTX debe ser 0.01%, que equivale a 1 μg RTX en solución de vehículo de 10 μl.
- Como animales de experimentación ratones ICR machos adultos 8 semanas de edad (35-40 g) y administrar una sola dosis de solución RTX (dosis: 200, 50 y 10 μg/kg, respectivamente) por vía intraperitoneal (i.p.) con una jeringa de microinyección para los ratones. Ratones fue anestesiado por inhalador con isoflurano de 5% para la anestesia profunda. Si los ratones mostraron acción de retiro de las extremidades durante la inyección del RTX, ratones deben tomar mayor inhalación de la anestesia.
Ejemplo: Si el ratón pesa 40 g, lo que recibirá 20 μl de la solución RTX, representando a la dosis de 50 μg/kg. - Dar a un grupo de ratones un volumen igual de vehículo (10% Tween 80 y 10% etanol absoluto en solución salina), como un control.
- Después de la inyección de RTX, devolver los ratones en una jaula de plástico en un 12 h luz/12 h oscuro ciclarán y proporcionan alimento y agua ad libitum.
2. evaluación del comportamiento neuropático
Nota: Mantener los animales en un entorno cómodo (criterio 1.6) para permitir la recuperación después de la inyección. En el día 7 post RTX de la inyección (D7), cada animal realiza las pruebas de filamento de pelo placa y von Frey en el mismo día para reducir el sesgo de tiempo y promover la eficiencia de las pruebas de comportamiento. Llevar los animales a una habitación tranquila que es mantenida a una humedad estable (40%) y temperatura (27 º C) para optimización de aclimatación del animal y reducir los efectos ambientales durante la prueba de comportamiento. No molestes a los animales durante los períodos de prueba; las pruebas de comportamiento se programan semanalmente.
- Medición de latencias termal con el test de placa caliente
- Coloque al animal suavemente sobre una placa de metal caliente (27 cm x 29 cm) con una jaula de plexiglás transparente (largo × ancho × alto: 22 cm x 22 cm x 25 cm; Figura 1A). Ajuste la temperatura de la placa de metal caliente a 52 ° C.
- Comenzar a medir la duración de la latencia térmica del animal en la placa con el temporizador en el paso, integrado de la placa una vez fursuit de animal toque la placa y observa las respuestas de fursuit del animal. Si el animal muestra agitación, lamiendo de fursuit, o saltar mientras que en la placa caliente, retírela y registrar el tiempo que el animal permaneció en la placa. Esta duración de tiempo define la latencia termal de un animal individual. Grabar la latencia termal para el más cercano 0.1 s.
- Para cada sesión de la prueba, realizar tres ensayos con intervalos de 30 min para la normalización de la respuesta después de la última prueba de la placa caliente. Si el animal no muestra ninguna respuesta sobre la placa caliente, deje la sesión después de 25 s para evitar el potencial daño a los tejidos.
- Prueba de medición del umbral mecánico con los filamentos de von Frey cabello
- Poner el animal sobre la malla metálica personalizada (tamaño de acoplamiento: 5 x 5 mm) con una jaula de plexiglás semitransparente cilindro (diámetro: 13 cm, altura: 12 cm) (figura 1B) para aclimatación durante al menos 2 h.
- Aplicar los diferentes calibres de los filamentos de von Frey cabello a la región plantar de la hindpaw con el método de arriba hacia abajo31. Iniciar la aplicación inicial de la fuerza media de un conjunto de filamentos de von Frey cabello para una duración de la aplicación del filamento de s 5-8.
- Utilizar un intervalo de 2 minutos entre aplicaciones de filamento para optimizar la normalización animal. Cambiar la fuerza aplicada filamento basada en la última respuesta del animal.
Nota: Un conjunto de filamentos de von Frey cabello consiste en 0,064 0.085, 0.145, 0.32, 0.39, 1.1 y uso de la fuerza de 1,7 g. Por ejemplo, si hindpaw retiro ocurrió con una fuerza inicial de 0,32 g, luego aplicar 0,145 g. En la ausencia de retiro de la pata, se aplica una fuerza de 0,39 g. A continuación cuatro filamentos adicionales de fuerzas diferentes se aplican en base a las respuestas anteriores y el umbral mecánico se calcula según una fórmula publicado31. - Para cada sesión de prueba incluyen el fursuit bilateral. Realizar tres ensayos para cada hindpaw. Expresa el promedio de estos seis umbrales mecánicos como el umbral mecánico promedio (mg) de cada animal.
Figura 1. Malla de jaula de plexiglás y el metal a medida para la evaluación del dolor neuropático en el modelo murino de resiniferatoxina (RTX)-inducida por neuropatía de fibra pequeña. (A, B) Estos gráficos muestran los equipos utilizados para medir (A) los Estados latentes térmicos por una placa de metal caliente (27 cm x 29 cm) con una jaula de plexiglás transparente (largo × ancho × alto: 22 cm x 22 cm × 25 cm) y evaluar (B) el umbral mecánico por una meta modificada para requisitos particulares malla l (tamaño de acoplamiento: 5 x 5 mm) con una jaula de plexiglás semitransparente cilindro (diámetro: 13 cm, altura: 12 cm) en los ratones con neuropatía de fibra pequeña RTX-inducida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. biopsia de la preparación y evaluación de la inervación IENFs de la piel
- Después de pruebas de comportamiento, anestesiar los animales con 5% isoflurano y sacrificar a los animales por perfusión intracardíaca con tampón de fosfato de 0,1 M (PB) (pH 7.4) seguidos de paraformaldehído al 4% (4P) en 0,1 M de PB.
- Corte a las primera bandoleros de dos fursuit después de la perfusión y fijar después en 4P de h. 6 otra transferencia del tejido de la almohadilla a 0,1 M de PB a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.
- Cryoprotect bandoleros con sacarosa al 30% en PB durante la noche y de corte en vertical a modo superficie plantar en rebanadas gruesas de 30 μm. El bandolero de la etiqueta secciones secuencialmente y luego almacenar en anticongelante-20 ° c.
Nota: La composición de anticongelante es el siguiente: agua destilada, glicerina de etileno, glicerol y 2 PB x en una proporción de 3:3:3:1. - Para asegurar el adecuado muestreo, seleccionar cada sección tercera de la almohadilla.
- Ponga las secciones solicitadas bandolero en portaobjetos de vidrio y les deje secar al aire.
- Cubrir una cubierta de plástico sobre la diapositiva y proceso con procedimientos estándar immunostaining.
- Saciar las secciones de bandolero con 1% H2O2 en metanol por 30 min y bloque con leche descremada en polvo 0,5% y 0,1% Tritón X-100 en 0.5 M Tris buffer (Tris) durante 1 hora.
- Incubar las secciones bandolero con antisueros contra pan marcador axonal, PGP 9.5 (conejo criado en; 1:1, 000), durante una noche a 4 ° C.
- Incubar las secciones bandolero con una biotinilado cabra anti-conejo IgG anticuerpo secundario a temperatura ambiente (RT) por 1 h y luego incubar con el complejo avidina-biotina en RT por 45 min.
- Visualizar el producto de la reacción con 0.05% solución 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) para 45 s. Luego Lávese las secciones de la almohadilla con agua destilada y secar para el montaje.
Nota: El antisuero primario y secundario se diluye con leche descremada en polvo 0.5% en 0,5 M Tris.
4. DRG sección Preparación y evaluación de lesionados neuronas de pequeño diámetro
- Diseccionar el 4to y 5to lumbar DRG y la solución para otro 2 h.
- Tejidos Cryoprotect DRG con 30% de sacarosa en PB durante la noche y cortan a un grosor de 8 μm secuencialmente, colocar en portaobjetos de microscopio y la etiqueta. Almacenar las secciones DRG en un congelador de-80 ° C.
- Secciones del Immunostain DRG en 80 μm-intervalos para muestreo adecuado.
- Realizar procedimientos de immunostaining DRG como los de las secciones de bandolero, salvo los procedimientos de inmunofluorescencia doble etiquetado. Como alternativa, incluyen ATF3 (conejo criado en; 1: 100), un marcador de lesión y peripherin (levantado adentro ratón; 1: 800), un marcador neuronal de pequeño diámetro en el antisuero primario.
- Incubar las secciones DRG con la mezcla de antisueros primarios durante la noche a 4 ° C.
- Incubar las secciones DRG con ya sea tejas rojo o fluoresceína isotiocianato (FITC)-conjugados secundarios antisueros (1: 200), corresponden a los antisueros primarias apropiadas en RT para 1 h y luego montar para la cuantificación.
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Representative Results
Este protocolo describe un modelo de ratón novela de neuropatía RTX, que afecta específicamente a las neuronas de pequeño diámetro, incluyendo la degeneración IENF, asociada con los trastornos sensoriales (figura 2). Siguiendo el protocolo descrito en este documento, los animales exhiben hipoalgesia térmica y alodinia mecánica en D7 después RTX de la inyección. Para establecer este modelo de neuropatía de fibra pequeña, tres dosis de RTX: 200, 50 y 10 μg/kg se administraron por vía i.p.. La dosis RTX (50 μg/kg) se consideró crítico y el estudio preliminar demostró que altas dosis RTX (200 μg/kg) causó mortalidad alta del ratón (figura 3).
Figura 2. Esquema del modelo de ratón de resiniferatoxina (RTX)-inducida por neuropatía de fibra pequeña. El esquema muestra el protocolo de la neuropatía de fibra pequeña inducida por RTX establecido. Para la evaluación sistemática, evaluación de comportamiento y la examinación de neuropathological, incluidas pruebas de placa y von Frey los estudios de immunostaining doble etiquetado, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Efecto de dosis de resiniferatoxina (RTX) en mortalidad animal y disfunción conductual. (A) diversas dosis de RTX fueron administradas por inyección intraperitoneal (i.p.). La letalidad de los efectos de la dosis fue dependiente de la dosis; por ejemplo, altas dosis de RTX (200 μg/kg) causó mortalidad de 100%. (B, C) Termal latencias y umbrales mecánicos fueron evaluados con la placa (B) y pruebas de filamentos de von Frey (C), respectivamente. 50 μg/kg dosis de RTX inducida hipoalgesia térmica y alodinia mecánica en comparación con el vehículo y el grupo 10 μg/kg-administrado. Vehículo cuadrado, abierto; abrir el círculo, 50 μg/kg; Abra el diamante, 10 μg/kg. Línea discontinua en (B), momento de corte del test de placa caliente. p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Patológico, hubo degeneración IENF y ATF3 inducción. Etiquetado doble los estudios demostraron que las neuronas lesionadas eran específicamente peripherin(+) neuronas de pequeño diámetro. En contraste, la dosis bajas de RTX (10 μg/kg) no establecieron neuropatía de fibra pequeña, como no hay cambios en la inervación IENF (figura 4) y ninguna lesión neuronal (ATF3 inducción) (figura 5). En consecuencia, el presente Protocolo considera la dosis de 50 μg/kg fundamental para establecer el modelo de ratón de la neuropatía de fibra pequeña.
En Resumen, sistemática administración de RTX con 50 μg/kg dosis específicamente afectadas pequeñas fibras de nervio. Por ejemplo, condujo al soma neuronal lesión y degeneración de IENF periférica, que se asocian con trastornos sensoriales.
Figura 4. Degeneración de fibras nerviosas de intraepidermal (IENFs) en la neuropatía resiniferatoxina (RTX). (A-C) Las secciones de tejido de la piel del bandolero de ratones immunostained con producto del gene de la proteína 9.5 (PGP 9.5) antisueros en el vehículo (A), 50 μg/kg-(B) y grupos de 10 μg/kg-administrados (C). PGP 9.5(+) IENFs provienen del plexo de nervio subepidérmica con un aspecto típico de varices. IENFs PGP 9.5 (+) se reducen notablemente en los 50 μg/kg, pero no en el grupo de 10 μg/kg. IENFs (D) fueron cuantificados según los resultados de immunohistochemical de A-c. Vehículo cuadrado, abierto; abrir el círculo, 50 μg/kg; Abra el diamante, 10 μg/kg. p < 0,001 comparado con el grupo vehículo. Escala de la barra, 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Especificidad de lesión de la neurona de pequeño diámetro en neuropatía resiniferatoxina (RTX). (A-C) Etiquetado doble coloración inmunofluorescente fue realizada con la activación de la transcripción factor-3 (ATF3; A-C, en verde) y peripherin (A-C, en rojo) en el vehículo (A), 50 μg/kg-(B) y grupos de 10 μg/kg-administrados (C). (D) el diagrama indica los cambios de la densidad de neuronas ATF3(+). Neuronas ATF3(+) fueron aumentadas en los 50 μg/kg, pero no en el vehículo y 10 μg/kg de grupos. Vehículo cuadrado, abierto; abrir el círculo, 50 μg/kg; Abra el diamante, 10 μg/kg. p < 0,001 comparado con el grupo vehículo. Escala de la barra, 25 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Eficaz tratamiento de la neuropatía de fibra pequeña en la clínica es necesaria para promover la recuperación funcional y calidad de vida de los pacientes. En la actualidad, hay falta de una guía terapéutica a trastornos sensoriales asociados con neuropatía de fibra pequeña debido a la falta de comprensión global de los mecanismos moleculares subyacentes a lesiones neuronales de pequeño diámetro. Los modelos anteriores de la neuropatía generalmente afectaron ambos nervios sensoriales de diámetro grande y pequeño; por ejemplo, los modelos de neuropatía inducida por quimioterapia12,32,33 y34,de neuropatía inducida por la mecánica35. Así, la contribución de la debilidad de motor y daño a los nervios sensoriales de gran diámetro no se podría excluir completamente en la prueba de comportamiento de estos modelos de neuropatía. El presente Protocolo describe un nuevo modelo de neuropatía de fibra pequeña en ratones, que sólo afecta a los nervios sensoriales de pequeño diámetro por aportar pruebas patológicas y funcionales de la degeneración IENFs.
RTX es un agonista ultrapotent de TRPV1 y un análogo de la capsaicina, que puede causar pérdida de peptidérgicos las neuronas DRG en cultura36 y en vivo sistemas18,19. Estudios previos de RTX y capsaicina han centrado principalmente en la pérdida funcional o morfológica de cuerpos celulares neuronales DRG, que reveló el papel de TRPV1 en la transmisión térmica respuesta37,38,39. Por otra parte, un estudio anterior demostró sistemático tratamiento de RTX de altas dosis (200 μg/kg) en ratas, inducida por alodinia mecánica y térmica hipoalgesia, posiblemente debido a la patología de las fibras nerviosas de gran diámetro28. La dosis de 200 μg/kg, sin embargo, es una dosis letal en ratones y este protocolo actual desarrolló un modelo de neuropatía de fibra pequeña pura por reducción de la dosis RTX (50 μg/kg). Esta dosis de RTX (50 μg/kg) es fundamental para establecer un modelo de neuropatía de fibra pequeña pura, que es superior a la que previamente divulgados28, como repuestos de fibras grandes18. Es decir, sólo afecta a pequeñas fibras nerviosas; a saber, solamente las neuronas de pequeño diámetro resultaron heridas, según lo confirmado por la inducción de ATF3 upregulation6,40 en las neuronas DRG de pequeño diámetro y IENFs degeneración6,18,19 ,41, asociados con los trastornos sensoriales. Estas manifestaciones patológicas comprensivo mímico los síntomas clínicos de la neuropatía de fibra pequeña. Por otra parte, este modelo corriente inducida por la neuropatología típico y Perfil de dolor neuropático de neuropatía de fibra pequeña y los efectos duraron para 8 semanas post tratamiento de RTX6,18,19. La duración de la neuropatología y el dolor neuropático equivalente y podría revertirse mediante la promoción de la síntesis de factor de crecimiento nervioso (NGF)18,40,41. Colectivamente, este Protocolo establece un modelo de neuropatía de fibra pequeña pura y destacó el posible potencial terapéutico de NGF.
Clínicamente, el estándar de oro para la investigación de neuropatías que afectan a nervios nociceptivas de pequeño diámetro8,9 es piel de sus extremidades para la evaluación de la inervación de la piel. Nuestro actual informe aplica esta técnica a la piel del bandolero de animales de experimentación para evaluar la inervación de la piel de un modelo de neuropatía de fibra pequeña, que podría imitar la patología de la IENFs en la clínica y también investiga los perfiles morfológicos de DRG secciones con el marcador de la lesión, ATF3, para revelar el estado patológico de Somas neuronales. En particular, la distribución espacial de IENFs dentro de la epidermis es ramas altamente y los criterios de conteo son el principal factor que lleva a diferencias estadísticas entre los grupos. Por ejemplo, nuestro actual protocolo contó cada IENF con puntos de ramificación en la dermis y IENFs con puntos de ramificación dentro de la epidermis como una sola IENF14,18,19. Este criterio podría haber causado una baja densidad de IENFs en nuestras investigaciones que en los de otros grupos. Preparamos y había procesado de la piel y las secciones de la DRG de animales de experimentación de una manera sistemática y a granel-evaluación con nuestro actual protocolo modificado. Por consiguiente, estas investigaciones sistemáticas de IENF degeneración y lesión neuronal podrían evitar el sesgo estereológicos de condiciones funcionales y patológicas de las neuronas de pequeño diámetro en neuropatía de fibra pequeña.
La evaluación funcional de nervios de pequeño diámetro con comportamiento pruebas, particularmente con el uso de filamento de la pelo de von Frey inofensivo, ha sido tradicionalmente aplicada a piel de los pacientes para el diagnóstico de la fibra pequeña subyacente de la sensibilidad mecánica neuropatía. La observación de la alodinia mecánica en animales de experimentación es desafiante debido a pie a tierra en el acoplamiento del metal, que es considerada como exógena estímulo mecánico, y los animales son muy activos durante las pruebas. El actual protocolo había optimizado un piso de alambre de malla de tamaño específico (5 mm × 5 mm) en una jaula de plástico semitransparente para la adaptación al medio de animales de experimentación para las pruebas de comportamiento. Este tamaño de la planta de malla podría reducir la estimulación exógena de pie a tierra y evitar caer de pie.
Este modelo de ratón RTX de la neuropatía podría aplicarse a diferentes tipos de neuropatía de fibra pequeña, como la diabetes, que se asocia con degeneración de IENF1,42. Sin embargo, este modelo sigue siendo limitado. Por ejemplo, el modelo animal de nervio espinal ligadura43 con las características de la neuropatía de fibra pequeña, conocido como la radiculopatía en la clínica, también puede afectar las fibras grandes en raicilla espinal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de ciencia y tecnología (106-2320-B-037-024), Universidad médica de Kaohsiung (KMU-M106028, S105034 KMU) y objetivo para la concesión de las universidades Top (TP105PR15), Universidad médica de Kaohsiung, Taiwán.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
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