Summary
Denna studie upprättar en experimentell modell av ren liten fiber neuropati med resiniferatoxin (RTX). En unik dos av RTX (50 µg/kg) är optimal för att utveckla en liten fiber neuropati modell som härmar patientens egenskaper och kan hjälpa till att undersöka nociceptiva molekylär betydelsen bakom neuropatisk smärta.
Abstract
Patienter med diabetes mellitus (DM) eller dem som upplever de neurotoxiska effekterna av kemoterapeutiska medel kan utveckla sensation störningar på grund av degeneration och skada av liten diameter sensoriska nervceller, som små fiber neuropati. Närvarande djurmodeller av små fiber neuropati påverkar både stor - och liten diameter sensoriska fibrer och därmed skapa en neuropatologi alltför komplex för att korrekt bedöma effekterna av skadade liten diameter sensoriska fibrer. Det är därför nödvändigt att utveckla en experimentell modell av ren liten fiber neuropati på lämpligt sätt undersöka dessa frågor. Det här protokollet beskriver en experimentell modell av små fiber neuropati som specifikt påverkar liten diameter sensoriska nerver med resiniferatoxin (RTX), en ultrapotent agonist av transient receptor potential vanilloid typ 1 (TRPV1), genom en engångsdos av intraperitoneal injektion, kallad RTX neuropati. Detta RTX neuropati visade patologiska manifestationer och beteendemässiga avvikelser som efterliknar de kliniska kännetecken för patienter med små fiber neuropati, inklusive intraepidermal nerv fiber (IENF) degeneration, särskilt skada i liten diameter nervceller, och induktion av termiska hypoalgesia och mekanisk allodyni. Detta protokoll testade tre doser av RTX (200, 50 och 10 µg/kg, respektive) och drog slutsatsen att en kritisk dos av RTX (50 µg/kg) krävs för utveckling av typiska små fiber neuropati manifestationer och förberett en modifierad immunfärgning förfarande för att undersöka IENF degeneration och neuronala soma skada. Det modifierade förfarandet är snabb, systematisk och ekonomiska. Beteendemässiga utvärdering av neuropatisk smärta är kritiska att avslöja funktionen av liten diameter sensoriska nerver. Utvärdering av mekaniska trösklar i experimentell gnagare är särskilt utmanande och det här protokollet beskriver en anpassad metallnät som är lämplig för denna typ av bedömning hos gnagare. Sammanfattningsvis är RTX neuropati en enkelt etablerade och nya experimentella modell att utvärdera molekylär betydelse och ingripande underliggande neuropatisk smärta för utveckling av terapeutiska medel.
Introduction
Liten fiber neuropati som involverar neuropatisk smärta, vilket framgår av degeneration av IENFs, är vanligt i olika typer av villkor, såsom DM, och till följd av de neurotoxiska effekterna av kemoterapeutika1,2, 3,4,5. IENFs är de perifera terminalerna av liten diameter nervceller i de dorsala rotganglier (DRG), och påverkas parallellt i fall av IENF degeneration6. Exempelvis har förändrad uppströms genetisk transkription av neuronala somata visats av uppreglering av aktivera transkription faktorn-3 (ATF3)6,7. Utvärdering av IENFs innervation med hudbiopsi är dessutom användbar för diagnos av små fiber neuropati5,8,9. Traditionellt har profilerna för IENFs på hudbiopsi berodde på immunhistokemisk demonstration av protein genprodukten 9,5 (PGP 9,5)1,10,11. Sammantaget de patologiska profilerna av DRG och IENFs återspeglar den funktionella tillstånd underliggande små fiber neuropati och kan vara en indikator för de funktionella konsekvenserna av denna typ av neuropati på liten diameter neuroner.
Tidigare, flera experimentella modeller har behandlat frågan om IENF degeneration i fall av kemoterapi-inducerad neuropati12,13 och nerv skada orsakas av kompression eller transection14,15 , 16. dessa experimentella modeller påverkas också stor diameter nerver; Det var därför inte möjligt att utesluta bidrag till drabbade stor diameter nerverna i den observerade små fiber neuropati; exempelvis beror undersökningen av thermosensation störning av skadliga tillbakadragande på funktionella motoriska nervfibrer17,18,19. Således, om inrättande av en ren liten fiber neuropati modell och systematiskt undersöka patologiska status både neuronala somata och deras perifera kutan nervfibrer i liten diameter nervceller är nödvändigt och absolut nödvändigt.
RTX är ett capsaicin analoga och en potent agonist till transient receptor potential vanilloid receptor 1 (TRPV1), som medlar nociceptiva bearbetning20,21,22. Nyligen perifera RTX behandling lättad neurogen smärta23,24,25 och en intraganglionic injektion av RTX inducerad irreversibel förlust av DRG nervceller22. Effekten av perifera RTX administration är dosberoende20,26,27, vilket resulterade i övergående hyposensibilisering eller degeneration av IENFs. Spännande, systematisk högdos RTX behandling ledde till neuropatisk smärta28, ett symptom av små fiber neuropati. Dessa fynd tyder på att den behandling läge och dos av RTX producerar distinkta patologiska effekter och neuronala Svaren; nämligen perifer administrering förhindras smärta överföring av lokala effekter29 och påverkade de neuronala somata som utvecklat neuropatisk beteende6. Sammantaget visar dessa fynd att RTX har en multipotency effekt och tagit upp frågan huruvida det föreligger en viss dos av RTX som systematiskt kan påverka de perifera nerverna, som perifera IENFs och centrala neuronala somata. I så fall kanske RTX en potentiell agent att specifikt påverkar liten diameter nervceller och härma små fiber neuropati i kliniken. DM i kliniken är exempelvis en komplicerad fråga som inklusive ämnesomsättningssjukdom och neuropatologi av perifera nerver, som är de viktigaste egenskaperna av små fiber neuropati. Mekanismerna för DM-associerade små fiber neuropati kunde inte utesluta bidrag ämnesomsättningssjukdom som inte kanske är det huvudsakliga medlet påverkar perifera nerver. DM-associerade små fiber neuropati kräver därför en ren djurmodell som kunde utesluta effekterna av systematisk ämnesomsättningssjukdom. Det här protokollet beskriver den arbetande dosen av RTX att utveckla en typisk liten fiber neuropati modell, inklusive IENF degeneration och liten diameter neuron skada, vilket framgår av modifierade immunfärgning analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla de förfaranden som beskrivs är i enlighet med etiska riktlinjer för laboratorium djur30, och protokollet har godkänts av djur kommittén för Kaohsiung medicinska universitet, Kaohsiung, Taiwan.
1. inrättande av RTX neuropati
Varning: RTX är neurotoxiska och farliga. Vid kontakt och, fungerar det som en irriterande på ögon, slemhinnor och övre luftvägarna. Undvik inandning och bära lab glasögon och rockar under RTX förberedelse. Skölj med rikligt med vatten vid hudkontakt eller efter hantering.
- Lägg till 1 mg RTX pulver i en 200 µL av blandning av lika volym av Tween 80 och absolut etanol (100 µL för varje lösningsmedel).
- Alikvot RTX lösningen (12 µL/injektionsflaska) och förvaras vid-20 ° C, för upp till 3 månader. Detta utgör den RTX materielen. Kassera återstående RTX lösningen på förfallodagen.
- Späd RTX beståndet med fysiologisk koksaltlösning till en slutlig volym av 600 µL. Den slutliga koncentrationen av RTX lösningen bör 0,01%, vilket motsvarar 1 µg RTX i 10 µL fordonet lösning.
- Använd 8 veckor gamla vuxna manliga ICR möss (35-40 g) som försöksdjur och administrera en engångsdos av RTX lösning (dos: 200, 50 och 10 µg/kg, respektive) intraperitonealt (i.p.) med en Mikroskop spruta till möss. Möss var bedövas av inhalator med 5% isofluran för djup anestesi. Om möss visade återkallande handling av extremiteter under RTX injektion, bör möss ta längre inandning av anestesi.
Exempel: Om musen väger 40 g, då det får 20 µL av RTX lösningen, som representerar dosen av 50 µg/kg. - Ge en grupp möss en lika stor volym av fordon (10% Tween 80 och 10% absolut etanol i saltlösning), som en kontroll.
- Efter RTX injektion, återvända möss till en plast buren på en 12-h ljus/12-h mörka cykel och ge mat och vatten ad libitum.
2. utvärdering av neuropatisk beteende
Obs: Hålla djuren i en bekväm miljö (steg 1,6) att möjliggöra återhämtning efter injektionen. På dag 7 efter RTX injektionen (D7) utför varje djur värmeplatta och von Frey hår glödtråden testerna på samma dag att minska tid bias och främja effektiviteten i de beteendemässiga testerna. Ta djuren till ett tyst rum som hålls på en stabil luftfuktighet (40%) och temperatur (27 ° C) för att optimera djurs acklimatisering och minska miljöpåverkan under beteendemässiga testning. Stör inte djuren under testet perioder; de beteendemässiga testerna schemaläggs varje vecka.
- Mätning av termiska latenser med värmeplatta test
- Placera djuret försiktigt på en metall värmeplatta (27 cm × 29 cm) med en transparent Plexiglas bur (längd × bredd × höjd: 22 cm × 22 cm × 25 cm. Figur 1A). Ställa in temperaturen av metall värmeplattan till 52 ° C.
- Börja mäta hela djurets termisk latens på värmeplattan med steg-på, inbyggd timer av värmeplattan när djurets hindpaws tryck på värmeplattan och iaktta svaren från djurets hindpaws. Om djuret visar skakar, Slicka av hindpaws, eller hoppa på den varma plattan, bort det och spela in den varaktighet som djuret återstod på värmeplattan. Denna tid varaktighet definierar termisk fördröjning av ett enskilt djur. Registrera den termiska svarstiden till den närmaste 0,1 s.
- För varje testsession, utföra tre prövningar med 30 minuters intervall för svar normalisering efter sista värmeplatta testet. Om djuret visar inget svar på värmeplattan, stoppa sessionen efter 25 s för att undvika potentiella vävnadsskada.
- Mätning av mekaniska tröskel med von Frey hår glödtråden testa
- Lägga djuret på den anpassade metallnät (maskstorlek: 5 mm × 5 mm) med en halvtransparent cylinder Plexiglas bur (diameter: 13 cm, höjd: 12 cm) (figur 1B) för acklimatisering för minst 2 h.
- Gäller de olika kalibrarna av von Frey hår glödtrådarna plantar regionen av hindpaw med up-and-down metod31. Börja första ansökan från den mellersta kraften av en uppsättning von Frey hår glödtrådar för en varaktighet av glödtrådens tillämpningen av 5-8 s.
- Använd ett 2 minuters intervall mellan glödtråden program för att optimera djur normalisering. Ändra den tillämpliga glödtråden kraft utifrån djurets sista svar.
Obs: En uppsättning von Frey hår glödtrådar består av 0,064, 0,085, 0,145, 0,32, 0,39, 1.1 och 1,7 g kraft program. Till exempel om hindpaw uttag skett med en inledande kraft 0,32 g, applicera sedan 0,145 g. I avsaknad av tass tillbakadragande tillämpas sedan en 0,39 g-kraft. Sedan fyra ytterligare filament av varierande styrkor tillämpas baserat på de föregående svar och mekaniska tröskelvärdet beräknas enligt en publicerade formeln31. - För varje testsession, inkludera den bilaterala hindpaws. Utför tre prövningar för varje hindpaw. Express genomsnittet av dessa sex mekaniska trösklar som den genomsnittliga mekanisk tröskeln (mg) av varje djur.
Figur 1. Skräddarsydda Plexiglas bur och metal mesh för utvärdering av neuropatisk smärta i musmodell av resiniferatoxin (RTX)-inducerad små fiber neuropati. (A, B) Diagrammen visar den utrustning som används för att mäta (A) termisk latenser av en metall värmeplatta (27 cm × 29 cm) med en transparent Plexiglas bur (längd × bredd × höjd: 22 cm × 22 cm × 25 cm) och utvärdera (B), mekanisk tröskeln av en anpassad meta l mesh (maskstorlek: 5 mm × 5 mm) med en halvtransparent cylinder Plexiglas bur (diameter: 13 cm, höjd: 12 cm) i möss med RTX-inducerad små fiber neuropati. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. hud biopsi utarbetande och utvärdering av IENFs Innervation
- Efter beteende testning, söva djuren med 5% isofluran och offra djur av intrakardiellt perfusion med 0,1 M fosfatbuffert (PB) (pH 7,4) följt av 4% PARAFORMALDEHYD (4P) i 0,1 M PB.
- Skär de första trampdynorna av de två hindpaws efter perfusion och efter fixera dem i 4 P för en annan 6 h. överföring footpad vävnaden till 0,1 M PB vid 4 ° C för långsiktig lagring.
- Cryoprotect trampdynorna med 30% sackaros i PB över natten och skär i en vertikal till plantar yta sätt i 30 µm tjocka skivor. Märka footpad sektioner sekventiellt, och sedan lagra i frostskyddsmedel vid-20 ° C.
Obs: Frostskyddsvätska sammansättning är enligt följande: destillerat vatten, eten glycerol, glycerol, och 2 x PB i förhållandet 3:3:3:1. - För att säkerställa adekvat provtagning, Välj varje tredje avsnitt av footpad.
- Sätta de valda footpad avsnitten på bestruket glasskivor och lufttorka dem.
- Täcka en plast täckplatta på bild och processen med standard immunfärgning förfaranden.
- Släcka avsnitten footpad med 1% H2O2 i metanol i 30 min och blockera med 0,5% nonfat torr mjölk och 0,1% Triton x-100 i 0,5 M Tris buffert (Tris) för 1 h.
- Inkubera footpad sektioner med antiserum mot pan axonal markör, PGP 9,5 (uppvuxen i kanin; 1:1, 000), över natten vid 4 ° C.
- Inkubera footpad sektioner med en biotinylerade get-anti-kanin IgG sekundär antikropp vid rumstemperatur (RT) för 1 h, och sedan Inkubera med metoden-biotin anläggningen på RT för 45 min.
- Visualisera reaktionsprodukten med 0,05% 3, 3'-Diaminobenzidin (DAB) lösning för 45 s. Tvätta sedan footpad sektioner med destillerat vatten och lufttorka dem för montering.
Obs: De primära och sekundära antiserum är utspädda med 0,5% nonfat torr mjölk i 0,5 M Tris.
4. DRG avsnittet förberedelse och utvärdering av skadade liten diameter nervceller
- Dissekera den 4: e och 5th ländryggen DRG och efter korrigering för en annan 2 h.
- Cryoprotect DRG vävnader med 30% sackaros i PB över natten och skär till en 8 µm tjocklek sekventiellt, placera på objektglas och etikett. Förvaras DRG sektioner i-80 ° C frys.
- Immunostain DRG sektioner i 80 µm-mellanrum för att säkerställa adekvat provtagning.
- Utföra DRG immunfärgning förfaranden som footpad avsnitt, förutom de dubbel-märkning Immunofluorescerande procedurerna. Du kan också inkludera ATF3 (uppvuxen i kanin; 1: 100), en markör för skada och peripherin (uppvuxen i musen; 1:800), en liten diameter neuronala markör i de primära antiserum.
- Inkubera DRG sektioner med blandningen av primära antiserum över natten vid 4 ° C.
- Inkubera DRG sektioner med antingen Texas röd eller fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugerat sekundära antiserum (1: 200), motsvarar de lämpliga primära antiserum på RT för 1 h, och sedan montera för kvantifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det här protokollet beskriver en ny musmodell av RTX neuropati, som specifikt påverkar liten diameter nervceller, inklusive IENF degeneration, associerade med sensoriska störningar (figur 2). Efter protokollet beskrivs häri, utställda djur termisk hypoalgesia och mekanisk allodyni på D7 efter RTX injektionen. Att upprätta denna små fiber neuropati modell, tre doser av RTX: 200, 50 och 10 µg/kg administrerades av i.p. rutten. RTX dosen (50 µg/kg) ansågs kritiska och Förstudien visade att höga doser RTX (200 µg/kg) orsakade hög mus dödlighet (figur 3).
Figur 2. Systematiken i musmodell av resiniferatoxin (RTX)-inducerad små fiber neuropati. Systemet visar protokollet av etablerade RTX-inducerad små fiber neuropati. För systematisk bedömning, beteende utvärdering och neuropatologisk undersökning ingår det värmeplatta och von Frey tester och dubbel-märkt immunfärgning studier, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Dos-effekt av resiniferatoxin (RTX) på djur dödlighet och beteendemässiga dysfunktion. (A) olika doser av RTX administrerades av intraperitoneal (IP) injektion. Dödlighet av dos-effekt var dosberoende; till exempel en hög dos av RTX (200 µg/kg) orsakade 100% dödlighet. (B, C) Termiska latenser och mekaniska trösklar utvärderades med värmeplatta (B) och von Frey glödtråden tester (C), respektive. En 50 µg/kg dos av RTX inducerad termisk hypoalgesia och mekanisk allodyni jämfört med fordonet och gruppen 10 µg/kg-administreras. Öppna torget, fordonet. öppna cirkeln, 50 µg/kg; öppna diamond, 10 µg/kg. Streckad linje i (B), cutoff tidpunkt av värmeplatta test. p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Patologiskt, fanns det IENF degeneration och markerade ATF3 induktion. Dubbel-märkning studier visade att skadade nervceller var specifikt peripherin(+) liten diameter nervceller. I kontrast, den låg dos av RTX (10 µg/kg) inte upprätta små fiber neuropati, inklusive inga förändringar i IENF innervation (figur 4) och ingen neuronal skada (ATF3 induktion) (figur 5). Detta protokoll anser därför dosen på 50 µg/kg kritiska till att fastställa musmodell av små fiber neuropati.
Sammanfattningsvis påverkas systematiskt RTX administration med en 50 µg/kg dos särskilt små nervfibrer. Till exempel, ledde det till neuronala soma skada och perifera IENF degeneration, som är förknippade med sensoriska störningar.
Figur 4. Degeneration av intraepidermal nervfibrer (IENFs) i resiniferatoxin (RTX) neuropati. (A-C) Vävnadssnitt från footpad huden möss var immunostained med anti protein genprodukten 9,5 (PGP 9,5) antiserum i fordonet (A), 50 µg/kg-(B), och 10 µg/kg-administreras (C) grupper. PGP 9.5(+) IENFs uppstå från subepidermal nerv plexus med en typisk åderbråck utseende. PGP 9,5 (+) IENFs reduceras markant 50 µg/kg, men inte i gruppen 10 µg/kg. (D) IENFs var quantitated enligt immunhistokemisk resultaten av A-C. Öppna torget, fordonet. öppna cirkeln, 50 µg/kg; öppna diamond, 10 µg/kg. p < 0,001 jämfört med vehikelgruppen. Skala bar, 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5. Specificitet för liten diameter neuron skada i resiniferatoxin (RTX) neuropati. (A-C) Dubbel-märkning Immunofluorescerande färgning utfördes med anti aktiverande transkription faktorn-3 (ATF3; A-C, i grönt) och peripherin (A-C, i rött) i fordonet (A), 50 µg/kg-(B), och 10 µg/kg-administreras (C) grupper. (D) diagrammet visar densitet ändringarna av ATF3(+) nervceller. ATF3(+) nervceller höjdes 50 µg/kg, men inte i fordonet och 10 µg/kg grupper. Öppna torget, fordonet. öppna cirkeln, 50 µg/kg; öppna diamond, 10 µg/kg. p < 0,001 jämfört med vehikelgruppen. Skala bar, 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiv behandling av små fiber neuropati i kliniken krävs för att främja funktionell återhämtning och livskvalitet för patienter. För närvarande finns det brist på en terapeutisk guide inriktning sensorisk störning är associerad med små fiber neuropati på grund av omfattande förståelse av de molekylära mekanismerna bakom liten diameter neuronal skada. Tidigare modeller av neuropati påverkas brukar både stor - och liten diameter sensoriska nerver; exempelvis modeller av kemoterapi-inducerad neuropati12,32,33 och mekaniska-inducerad neuropati34,35. Således, muskelsvaghet och stor diameter sensoriska nervskador bidrag kan inte helt uteslutas för beteendemässiga testning av dessa neuropati modeller. Protokolls beskriver en ny modell för små fiber neuropati hos möss, som bara påverkar liten diameter sensoriska nerver genom att ge patologiska och funktionella bevis för IENFs degeneration.
RTX är ett ultrapotent agonist för TRPV1 och en capsaicin-analog, som kan orsaka förlust av peptiderga DRG nervceller i kultur36 och i vivo system18,19. Tidigare studier på RTX och capsaicin har främst fokuserat på morfologiska eller funktionella förlusten av DRG neuronala cell organ, som avslöjade TRPV1 roll i den termiska överföring svar37,38,39. Dessutom visat en tidigare studie systematisk högdos RTX behandling (200 µg/kg) hos råttor inducerade mekanisk allodyni och termiska hypoalgesia, möjligen på grund av patologi av stor diameter nervfibrer28. Dosen 200 µg/kg, men är en dödlig dos hos möss och detta nuvarande protokoll utvecklat en ren liten fiber neuropati modell av RTX-dosen (50 µg/kg). Denna dos av RTX (50 µg/kg) är kritisk till att fastställa en ren liten fiber neuropati modell, som är överlägsen den tidigare rapporterade28, eftersom det besparar stora fibrer18. Det vill säga påverkar det bara små nervfibrer; nämligen skadades endast liten diameter nervceller, vilket bekräftas genom induktion av ATF3 uppreglering6,40 på liten diameter DRG nervceller och IENFs degeneration6,18,19 ,41, associerade med sensoriska störningar. Dessa patologiska manifestationer härma utförligt de kliniska symptomen vid små fiber neuropati. Dessutom denna nuvarande modell inducerad den typiska neuropatologi och neuropatisk smärta profil av små fiber neuropati och effekter varade för 8 veckor efter RTX behandling6,18,19. Varaktigheten för neuropatologi och neuropatisk smärta var likvärdiga och kunde återföras genom att främja syntesen av nervtillväxtfaktor (NGF)18,40,41. Kollektivt, detta protokoll både etablerade en ren liten fiber neuropati modell och belyst NGF möjliga terapeutiska potential.
Kliniskt, är den gyllene standarden för att utreda neuropatier som påverkar liten diameter nociceptiva nerver8,9 biopsying lem hud för att utvärdera huden innervation. Vår nuvarande rapport tillämpat denna teknik till footpad huden på försöksdjur att utvärdera huden innervationen av en liten fiber neuropati modell, som kunde härma patologin vid IENFs i kliniken, och även undersökt de morfologiska profilerna av DRG sektioner med skada markören, ATF3, att avslöja patologiska status av neuronala somata. Särskilt de rumsliga fördelningorna av IENFs inom epidermis förgrening mycket och beräkningskriterierna är den viktigaste faktorn som leder till statistiska skillnader mellan grupper. Till exempel räknas vår nuvarande protokollet varje IENF med förgrenade pekar endast i dermis och IENFs med förgrenade punkter i överhuden som en enda IENF14,18,19. Detta kriterium kan ha orsakat en lägre täthet av IENFs i våra undersökningar än i de andra grupperna. Vi förberett och bearbetas hud och DRG delar av försöksdjur i en systematisk och bulk-utvärdering mode med vår nuvarande modifierade protokoll. Dessa systematiska undersökningar av IENF degeneration och neuronal skada kunde således undvika beteendetester bias av funktionella och patologiska förhållanden av liten diameter nervceller i små fiber neuropati.
Funktionell utvärdering av liten diameter nerver med beteendemässiga kopplats testning, särskilt med ofarliga von Frey hår glödtråden ansökan, traditionellt till patienternas hud för att diagnostisera mekaniska känslighet underliggande små fiber neuropati. Observationen av mekanisk allodyni i försöksdjur är utmanande på grund av foten grundstötning på den metallnät, som anses vara exogena mekanisk stimulering, och djuren är mycket aktiv under tester. Det nuvarande protokollet optimerad en specifik storlek mesh tråd golv (5 mm × 5 mm) i en halvtransparent plast bur för miljömässig anpassning av försöksdjur för de beteendemässiga testerna. Denna storlek av mesh golvet kunde minska exogen stimulering av fot jordning och undvika fot släppa.
Detta RTX musmodell av neuropati kan tillämpas på olika typer av små fiber neuropati, såsom diabetes, som är associerad med IENF degeneration1,42. Denna modell är dock fortfarande begränsad. Djurmodell av spinal nerv ligering43 med egenskaperna hos små fiber neuropati, kallad radiculopathy i kliniken, påverka exempelvis stora fibrerna i den spinal rootlet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från ministeriet för vetenskap och teknik (106-2320-B-037-024), Kaohsiung Medical University (KMU-M106028, KMU-S105034) och målet för topp universiteten beviljande (TP105PR15), Kaohsiung Medical University, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
- Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
- Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
- Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
- Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
- Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
- Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
- Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
- Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
- Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
- Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
- Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
- Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
- Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
- Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
- Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
- Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
- Neubert, J. K., et al. Peripherally induced resiniferatoxin analgesia. Pain. 104 (1-2), 219-228 (2003).
- Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
- Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
- Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Jr Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), table of contents 1253-1258 (2002).
- Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
- Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
- Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
- Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
- Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
- Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
- Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
- Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
- Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
- Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
- Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
- Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
