Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Saf küçük Fiber nöropati bir fare modeli ile geçici reseptör potansiyel Vanilloid tip 1 Ultrapotent Agonist kurulması

Published: February 13, 2018 doi: 10.3791/56651

Summary

Bu çalışmada deneysel bir model saf küçük fiber nöropati ile resiniferatoxin (RTX) kurar. RTX benzersiz bir doz (50 µg/kg) hasta özellikleri taklit eden bir küçük fiber nöropati modeli geliştirmek için en uygun ve nöropatik ağrı altında yatan nosiseptif moleküler önemini araştırmak yardımcı olabilir.

Abstract

Diabetes mellitus (DM) veya bu kemoterapötik ajanların Nörotoksik etkileri yaşıyor olan hastalarda duyu bozuklukları dejenerasyon ve küçük çaplı duyusal nöronların, küçük fiber nöropati anılacaktır yaralanma nedeniyle gelişebilir. Her iki büyük - ve küçük çaplı duyusal lifler etkiler ve böylece bir nevropatoloji düzgün yaralı küçük çaplı duyusal lifler etkilerini değerlendirmek için çok karmaşık oluşturmak küçük fiber nöropati mevcut hayvan modelleri. Bu nedenle, yeterli bu sorunları incelemek için saf küçük fiber nöropati deneysel bir model geliştirmek gereklidir. Özellikle resiniferatoxin (RTX), geçici reseptör potansiyel vanilloid tip 1 (TRPV1), tek bir doz ile ultrapotent bir agonist ile küçük çaplı duyu sinirleri etkileyen küçük fiber nöropati bir deneme modeli bu protokolünü açıklar mayi enjeksiyon, RTX nöropati anılacaktır. Patolojik bulgular ve küçük fiber nöropati, intraepidermal Sinir lifi (IENF) dejenerasyonu, özellikle yaralanma dahil olan hastalarda klinik özelliklerini taklit davranış anormallikleri gösterdi bu RTX nöropati küçük çaplı neurons ve indüksiyon termal hypoalgesia ve mekanik allodynia. Bu iletişim kuralı RTX üç doz test (200, 50 ve 10 µg/kg, sırasıyla) ve sonucuna RTX kritik bir doz (50 µg/kg) tipik küçük fiber nöropati tezahürlerini gelişimi için gerekli ve değiştirilmiş immunostaining yordamına hazırlanan IENF dejenerasyon ve nöronal soma yaralanma araştırmak. Hızlı, sistematik ve ekonomik değiştirilmiş işlemdir. Nöropatik ağrı davranış değerlendirilmesi küçük çaplı duyusal sinir fonksiyonu ortaya çıkarmak için önemlidir. Deneysel Rodents mekanik eşikleri değerlendirilmesi özellikle zordur ve bu iletişim kuralı için bu tür bir değerlendirme Rodents uygundur özelleştirilmiş bir metal kafes açıklar. Özetle, moleküler önemi ve nöropatik ağrı terapötik ajanlar gelişimi için temel müdahale değerlendirmek için yeni ve kolayca kurulan deneysel bir model RTX nöropati var.

Introduction

IENFs dejenerasyon tarafından belirgindir, nöropatik ağrı içeren küçük fiber nöropati koşulları, DM gibi ve kemoterapötik ajanlar1,2Nörotoksik etkileri sonucunda çeşitli türleri yaygındır, 3,4,5. IENFs dorsal kök gangliyon (DRG) bulunan küçük çaplı nöronların periferik terminalleri ve paralel IENF dejenerasyon6durumlarında etkilenir. Örneğin, nöronal somata değişmiş ters yönde genetik transkripsiyon transkripsiyon faktörü-3 (ATF3)6,7etkinleştirme upregulation tarafından kanıtlanmıştır. Ayrıca, IENFs innervasyon cilt biyopsisi ile değerlendirilmesi küçük fiber nöropati5,8,9tanısı için yararlıdır. Geleneksel olarak, Cilt biyopsisi üzerinde IENFs profilleri protein gen ürünü immunohistokimyasal serilerinden 9,5 (PGP 9.5)1,10,11bağlıydı. Birlikte ele alındığında, DRG ve IENFs patolojik profilleri fonksiyonel durumu temel küçük fiber nöropati yansıtmak ve fonksiyonel sonuçları nöropati küçük çaplı nöronlar üzerinde bu tür bir göstergesi olabilir.

Daha önce çeşitli deneysel modeller IENF dejenerasyon sıkıştırma veya transeksiyon14,15 tarafından neden kemoterapi kaynaklı nöropati12,13 ve sinir yaralanma durumlarda sorunu ele sahip , 16. etkilenen bu modeller de geniş çaplı sinirler; Bu nedenle oldu, gözlenen küçük fiber nöropati; etkilenen büyük çaplı sinirler katkısını dışlamak mümkün değil Örneğin, thermosensation bozukluk zararlı çekilme tarafından incelenmesi fonksiyonel motor sinir lifleri17,18,19üzerinde bağlıdır. Böylece, bir saf küçük fiber nöropati model kurma ve sistematik olarak nöronal somata ve küçük çaplı nöronlar içinde onların çevre Kutanöz sinir lifleri patolojik durumunu araştıran gerekli ve zorunludur.

RTX kapsaisin Analog ve hangi nosiseptif işleme20,21,22aracılık eder geçici reseptör potansiyel vanilloid reseptör 1 (TRPV1), için güçlü bir agonist var. Son zamanlarda, periferik RTX tedavi nöropatik ağrı23,24,25 rahatlamış ve intraganglionic enjeksiyonu RTX DRG nöronlar22geri alınamaz kaybına bağlı. Periferik RTX yönetim geçici duyarsızlaştırma veya IENFs dejenerasyonu sonuçlanan doz bağımlı20,26,27, etkisidir. Çoğu intriguingly konularda, sistematik yüksek doz RTX tedavi nöropatik ağrı28için küçük fiber nöropati belirtisi yol açtı. Bu bulgular tedavi modu ve RTX doz belirgin patolojik etkileri ve nöronal yanıt-e doğru üretmek öneririz; Çevre Yönetim ağrı iletim yerel etkileri29 tarafından engelledi ve nöropatik davranış6geliştirilen nöronal somata etkiledi. Toplu olarak, bu bulgular RTX multipotency etkisi ve sistematik olarak periferik IENFs ve merkezi nöronal somata gibi periferik sinirleri etkileyebilir RTX belirli bir doz olup gündeme gösterir. Eğer öyleyse, RTX özellikle küçük çaplı nöronlar etkiler ve küçük fiber nöropati klinikte taklit potansiyel bir ajan olabilir. Örneğin, DM klinikte metabolik bozukluk ve küçük fiber nöropati temel özelliklerinin çoğu periferik sinirlerin nevropatoloji dahil olmak üzere karmaşık bir konudur. Küçük fiber DM ilişkili nöropati mekanizmaları periferik sinirleri etkileyen ana Ajan olmayabilir metabolik bozukluk katkısını dışlamak değil. Bu nedenle, küçük fiber DM ilişkili nöropati sistematik metabolik bozukluk etkileri dışlamak saf hayvan modeli gerektirir. Bu iletişim kuralı RTX IENF dejenerasyon ve küçük çaplı nöron yaralanma, değiştirilmiş immunostaining analiz tarafından gösterildiği gibi bir tipik küçük fiber nöropati modeli geliştirmek için çalışma doz açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Laboratuvar hayvanları30için etik kurallar doğrultusunda açıklanan yordamları vardır ve protokol hayvan Komitesi Kaohsiung Tıp Üniversitesi tarafından Kaohsiung, Tayvan kabul gördü.

1. RTX nöropati kurulması

Uyarı: RTX Nörotoksik ve tehlikeli. Temas, göz, müköz membranlar ve üst solunum yolu için tahriş edici olarak görür. İnhalasyon önlemek ve laboratuvar gözlük ve kat RTX hazırlık sırasında giymek. Bol suyla cilde temas durumunda veya işleme sonra durulayın.

  1. RTX tozu 1 mg 200 µL eşit hacmi Tween 80 ve mutlak etanol (her çözücü için 100 µL) karışımı ekleyin.
  2. Aliquot RTX çözüm (12 µL/flakon) ve -20 ° C'de 3 aya kadar. Bu RTX hisse senedi oluşturmaktadır; süre sonu itibariyle kalan RTX çözüm atın.
  3. Son hacmi 600 µL için normal salin ile RTX stok sulandırmak. RTX çözüm son konsantrasyonu %0.01 1 µg RTX 10 µL araç çözümde eşit olmalıdır.
  4. 8-hafta-yaşlı yetişkin erkek ICR fareler (35-40 g) deneysel hayvan olarak kullanın ve tek doz RTX çözüm yönetmek (doz: 200, 50 ve 10 µg/kg, sırasıyla) intraperitoneally (IP) ile mikroenjeksiyon şırınga fareler için. Fareler tarafından derin anestezi için %5 isoflurane ile inhaler anestezi. Fareler ekstremitelerde para çekme eylemi RTX enjeksiyon sırasında gösterdi, fareler daha uzun inhalasyon anestezi almalıdır.
    Örnek: fare 40 g ağırlığında, sonra o 50 µg/kg doz temsil eden RTX çözümün 20 µL alırsınız.
  5. Farelerin bir grup bir denetim araç (% 10 Tween 80 ve % 10 mutlak etanol tuzlu çözüm), eşit bir hacmi ver.
  6. Sonra RTX enjeksiyon, fareler üzerinde bir 12-saat ışık/12-h karanlık bir plastik kafes için döngüsü ve yiyecek sağlamak ve ad libitumsu verir.

2. nöropatik davranış değerlendirilmesi

Not: kurtarma izin vermek için rahat bir ortam (Adım 1.6) hayvanlarda enjeksiyon sonra korumak. 7. gün sonrası RTX enjeksiyon (D7), her hayvan davranış testleri verimliliği teşvik ve saatine göre azaltmak için aynı gün sıcak sac ve von Frey saç filaman sınamaları gerçekleştirir. Hayvan iklimlendirme en iyi duruma getirme ve davranışsal test sırasında çevresel etkileri azaltmak için istikrarlı nem oranı (% 40) ve sıcaklık (27 ° C) de tutulur sessiz bir oda için hayvan getirmek. Hayvanlar sınav dönemlerinde rahatsız etmeyin; davranış testleri haftalık zamanlanır.

  1. Sıcak plaka testi ile termal gecikme süreleri ölçümü
    1. Hayvan yavaşça bir metal Isıtma levhası (27 cm × 29 cm) ile şeffaf pleksiglas kafes yerleştirin (Uzunluk × Genişlik × Yükseklik: 22 cm × 22 cm × 25 cm; Şekil 1A). Metal sıcak plaka sıcaklık 52 ° C'ye ayarlayın
    2. Bir kez hayvanın hindpaws sıcak plaka dokunma ve hayvanın hindpaws yanıt gözlemlemek hayvanın sıcak plaka üzerinde termal gecikme süresi ile sıcak plaka adım üzerinde yerleşik zaman ölçümünü başlatmak. Hayvan sallayarak gösteriyorsa, hindpaws yalama veya sıcak plaka üzerinde atlama kaldırmak ve hayvan sıcak plaka üzerinde kaldı süresini kaydetmek. Bu süre bireysel bir hayvan termal gecikme tanımlar. Termal gecikme süresi en yakın 0,1 için kayıt s.
    3. Her test oturumu için 30 dk aralıklarla son sıcak plaka test sonra yanıt normalleştirme için üç denemeler yapın. Hayvan sıcak plaka üzerinde hiçbir yanıtı gösteriyorsa, 25 sonra kesin potansiyel doku hasarı önlemek için s.
  2. Mekanik eşik von Frey saç filaman ile ölçüm test
    1. Özelleştirilmiş metal kafes üzerinde hayvan koymak (Kafes boyutu: 5 mm × 5 mm) bir yarı saydam silindir pleksiglas kafes ile (çapı: 13 cm; yükseklik: 12 cm) (şekil 1B) iklimlendirme için en az 2 h için.
    2. Von Frey saç filamentler farklı kalibre alçalarak yöntemi31' le hindpaw plantar bölgesine uygulayın. İlk başvuru süresi 5-8 s filaman uygulanması için von Frey saç filamentler bir dizi orta kuvvetlerinden başlatın.
    3. Filaman uygulamaları hayvan normalleştirme en iyi duruma getirmek için 2 dk aralığını kullanın. Hayvanın Son Yanıt üzerinde temel uygulamalı filaman kuvvet değiştirin.
      Not: 0.064, 0.085, 0.145, 0,32, 0.39, 1.1 ve 1,7 g kuvvet uygulama von Frey saç filamentler bir dizi oluşur. Örneğin, hindpaw para çekme 0,32 g ilk bir kuvvet ile oluştuysa, 0,145 g uygulanır. Pençe çekilme yokluğunda, 0,39 g kuvvet sonra uygulanır. O zaman değişen kuvvetlerin dört ek filamentler bağlı önceki yanıt olarak uygulanır ve mekanik eşik bir yayımlanan formül31göre hesaplanır.
    4. Her test oturumu için ikili hindpaws içerir. Üç denemeler her hindpaw için gerçekleştirin. Bu altı mekanik eşikleri ortalama kaba mekanik eşiğinde her hayvan (mg) hızlı.

Figure 1
Şekil 1. Özel yapım pleksiglas kafes ve metal mesh nöropatik ağrı resiniferatoxin (RTX), fare modeli değerlendirilmesi için-küçük fiber nöropati indüklenen. (A, B) Bu grafikler ölçmek için kullanılan ekipman(a)bir şeffaf pleksiglas kafes ile metal bir sıcak plaka (27 cm × 29 cm) tarafından termal gecikme süreleri göster (Uzunluk × Genişlik × Yükseklik: 22 cm × 22 cm × 25 cm) ve (B) tarafından özelleştirilmiş bir meta mekanik eşik değer biçmek l kafes (Kafes boyutu: 5 mm × 5 mm) bir yarı saydam silindir pleksiglas kafes ile (çapı: 13 cm; yükseklik: 12 cm) ile küçük fiber RTX kaynaklı nöropati farelerde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. cilt biyopsisi hazırlık ve IENFs innervasyon değerlendirilmesi

  1. Sınama davranışını sonra % 5 isoflurane hayvanlarla anestezi ve 0.1 M fosfat tampon (PB) (pH 7,4) ile İntrakardiyak perfüzyon hayvanlara % 4 paraformaldehyde (4 P) 0.1 M PB ardından kurban.
  2. İki hindpaws ilk ayaklıkları perfüzyon sonra kesin ve onları sonrası başka bir 6 h. 0.1 M PB uzun süreli depolama için 4 ° C'de footpad doku aktarmak için 4 P bağlayacaktın.
  3. Cryoprotect ayakları PB gecede % 30 sukroz ve yüzey şekilde plantar 30 µm kalınlığında dilimler için dikey kesim ile. Footpad bölümler ardışık olarak etiketleyin ve sonra antifriz-20 ° C'de depolayın
    Not: Antifriz kompozisyon gibidir: distile su, etilen gliserol, gliserol ve 2 x PB 3:3:3:1 oranında.
  4. Yeterli örnekleme sağlamak için footpad üçüncü her bölümünü seçin.
    1. Seçilen footpad bölümleri kaplamalı cam slaytlar üzerine koymak ve onları kuruması.
    2. Plastik coverplate slayt ve süreci ile standart immunostaining yordamları kapsar.
      1. Metanol için 30 dk içinde % 1 H2O2 footpad bölümlerle gidermek ve % 0,1 ile % 0.5 yağsız kuru süt Triton X-100 0.5 M Tris arabelleği (Tris) için 1 h blok.
      2. Pan aksonal marker, PGP 9.5 (büyüdü tavşan; 1:1, 000), karşı antisera bölümlerle footpad gecede 4 ° C'de kuluçkaya
      3. Footpad bölümleri ile bir biotinylated keçi Anti-tavşan IgG ikincil antikor, oda sıcaklığında (RT) 1 h için kuluçkaya ve RT, avidin-biotin kompleks için 45 dk ile kuluçkaya.
      4. Reaksiyon ürünü % 0.05 ile görselleştirmek için 45 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) çözüm s. Sonra footpad bölümleri distile su ile yıkayın ve onları montaj için kuruması.
        Not: Birincil ve ikincil antisera %0,5 0.5 M Tris yağsız kuru süt ile seyreltilmiş.

4. DRG bölümüne hazırlık ve yaralı küçük çaplı nöronlar değerlendirilmesi

  1. Th 4 ve 5inci teşrih bel DRG ve sonrası düzeltme başka bir 2 h için.
  2. PB % 30 Sükroz Cryoprotect DRG kurcalayarak bir gecede ve bir 8-µm kalınlık için sırayla kesip, mikroskop slaytlar ve etiket yerleştirin. DRG bölümleri-80 ° C dondurucuda saklayın.
  3. Immunostain DRG bölümleri yeterli örnekleme sağlamak için 80 µm aralıklarla.
    1. Bu footpad bölümlerin çift etiketleme immünfloresan yordamlar dışında DRG immunostaining yordamları gerçekleştirin. Alternatif olarak, ATF3 dahil (büyüdü tavşan; 1: 100), bir yaralanma marker ve peripherin (büyüdü fare; 1:800), birincil antisera küçük çaplı nöronal işaretleyicisinde.
    2. DRG bölümleri gecede 4 ° C'de birincil antisera karışımı ile kuluçkaya
  4. Her iki Teksas kırmızı veya floresein isothiocyanate (FITC) bölümlerle DRG kuluçkaya-Birleşik ikincil antisera (1: 200), 1 h için uygun birincil antisera RT, karşılık gelen ve miktar için monte edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu iletişim kuralı özellikle küçük çaplı nöronlar, IENF dejenerasyon, duyusal bozukluklar (Şekil 2) ile ilgili de dahil olmak üzere etkiler RTX nöropati bir roman fare modeli açıklar. Burada açıklanan iletişim kuralı hayvanlar termal hypoalgesia ve D7 yazı RTX enjeksiyon, mekanik allodynia sergilendi. Bu küçük fiber nöropati model RTX üç doz kurmak için: 200, 50 ve 10 µg/kg ı.p. rota tarafından idare. Belgili tanımlık RTX doz (50 µg/kg) kritik kabul edildi ve ön çalışma gösterdi bu yüksek doz RTX (200 µg/kg) neden olduğu yüksek fare lethality (şekil 3).

Figure 2
Şekil 2. Resiniferatoxin (RTX) fare modeli şeması-küçük fiber nöropati indüklenen. Düzeni RTX kaynaklı kurulan küçük fiber nöropati Protokolü gösterir. Sistematik değerlendirme, davranış değer biçmek ve neuropathological muayene için o sıcak sac ve von Frey testleri ve Çift etiketli immunostaining çalışmaları, sırasıyla dahil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Doz-resiniferatoxin (RTX) hayvan ölümcül ve davranış bozukluğu etkisi. (A)farklı dozlarda RTX mayi (IP) enjeksiyonu ile idare. Doz etkisi ölümcül doz bağımlı; Örneğin, bir yüksek doz RTX (200 µg/kg) neden % 100 ölümcül. (B, C) Termal gecikmeleri ve mekanik eşikleri ile belgili tanımlık sıcak plaka (B) ve von Frey filaman testleri (C), anılan sıraya göre değerlendirildi. RTX 50 µg/kg doz indüklenen termal hypoalgesia ve araç ve 10 µg/kg-yönetilen grubu ile karşılaştırıldığında mekanik allodynia. Açık kare, araç; Daire, 50 µg/kg açın; elmas, 10 µg/kg açın. Kesikli çizgi olarak (B), kesme süresi noktası sıcak plaka testi. p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Patolojik olarak, IENF dejenerasyon oldu ve ATF3 indüksiyon işaretlenmiş. Çift etiketleme çalışmaları yaralı nöronlar özel olarak peripherin(+) küçük çaplı nöronlar olduğunu gösterdi. Kontrast, RTX düşük doz (10 µg/kg) değil kurmak küçük fiber nöropati, hiçbir değişiklik IENF innervasyon (şekil 4) ve hiçbir nöronal yaralanma (ATF3 indüksiyon) dahil olmak üzere (şekil 5). Buna göre bu protokol 50 µg/kg doz küçük fiber nöropati fare modeli kuran kritik dikkate alır.

Özetle, sistematik RTX yönetim 50 µg/kg doz ile özellikle küçük sinir lifleri etkilenen. Örneğin, nöronal soma yaralanma ve periferik IENF dejenerasyon, duyu bozuklukları ile ilişkili olan yol açtı.

Figure 4
Şekil 4. İntraepidermal sinir lifleri (IENFs) resiniferatoxin (RTX) nöropati dejenerasyonu. (A-C) Footpad deri doku bölümlerini fareler vardı immunostained Anti-protein gen ürünü 9.5 (PGP 9.5) ile antisera (A) araç içinde 50 µg/kg-(B) ve 10 µg/kg-yönetilen (C) gruplar. PGP 9.5(+) IENFs subepidermal sinir pleksus ile tipik bir varis görünümü ortaya. PGP 9.5 (+) IENFs belirgin 50 µg/kg ama 10 µg/kg grup azaltılır. (D) IENFs A-Cimmunohistokimyasal sonuçlarına göre quantitated. Açık kare, araç; Daire, 50 µg/kg açın; elmas, 10 µg/kg açın. p < 0,001 araç grubuna göre. Ölçek bar, 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. Resiniferatoxin (RTX) nöropati küçük çaplı nöron yaralanma özgüllüğü. (A-C) Çift etiketleme immünfloresan boyama Anti-aktive transkripsiyon ile gerçekleştirilen faktör-3 (ATF3; A-C, yeşil) ve peripherin (A-C, kırmızı) araç(a)50 µg/kg-(B) ve 10 µg/kg-yönetilen (C) gruplar. (D) diyagram ATF3(+) nöronların yoğunluk değişiklikleri gösterir. ATF3(+) nöronlar 50 µg/kg, ancak değil araç ve 10 µg/kg grupları artan. Açık kare, araç; Daire, 50 µg/kg açın; elmas, 10 µg/kg açın. p < 0,001 araç grubuna göre. Ölçek bar, 25 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Küçük fiber nöropati klinikte etkili tedavisi hastaların yaşam kalitesi ve fonksiyonel iyileşme teşvik için gereklidir. Şu anda, küçük çaplı nöronal yaralanma temel moleküler mekanizmaları kapsamlı anlayış eksikliği küçük fiber nöropati ile ilgili duyusal bozukluk hedefleme terapötik bir rehber eksikliği vardır. Nöropati önceki modellere genellikle her iki büyük - ve küçük çaplı duyusal sinir etkilenen; Örneğin, kemoterapi kaynaklı nöropati12,32,33 ve mekanik kaynaklı nöropati34,35modelleri. Böylece, motor güçsüzlük ve geniş çaplı duyusal sinir hasarı katkısını tamamen davranış bu nöropati modelleri test dışarıda değil. Mevcut Protokolü sadece etkileyen küçük çaplı duyusal sinirler IENFs dejenerasyon patolojik ve fonksiyonel kanıtı sağlayarak küçük fiber nöropati farelerde, yeni bir modeli açıklar.

RTX TRPV1 ve peptidergic kaybı DRG nöronlar kültür36 ve in vivo sistemleri18',19neden olabilir bir kapsaisin analog ultrapotent bir agonist var. RTX ve kapsaisin önceki çalışmalar çoğunlukla DRG nöronal hücre gövdeleri, TRPV1 rolü ısı iletim yanıt37,38,39' ortaya morfolojik veya işlev kaybı üzerine yoğunlaşmıştır. Ayrıca, önceki bir çalışma içinde rats, indüklenen mekanik allodynia ve büyük olasılıkla büyük çaplı sinir lifleri28patoloji nedeniyle termal hypoalgesia sistematik yüksek doz RTX tedavi (200 µg/kg) gösterdi. 200 µg/kg, doz ancak, farelerde öldürücü bir doz ve geçerli bu iletişim kuralı bir saf küçük fiber nöropati model RTX doz (50 µg/kg) azaltarak gelişmiş. Bu doz RTX (50 µg/kg) büyük lifleri18yedek olarak o daha önce raporlanmış28için üstün olan bir saf küçük fiber nöropati modeli kurmak için önemlidir. Diğer bir deyişle, yalnızca küçük sinir lifleri etkiler; Sadece küçük çaplı nöronlar, küçük çaplı DRG nöronlar ve IENFs dejenerasyon6,18,19 ATF3 upregulation6,40 indüksiyon teyit gibi yaralandı ,41duyu bozuklukları ile ilişkili,. Bu patolojik bulgular kapsamlı bir şekilde küçük fiber nöropati klinik belirtileri taklit. Ayrıca, bu geçerli model tipik nevropatoloji indüklenen ve RTX tedavi6,18,198 hafta sonrası için nöropatik ağrı profili küçük fiber nöropati ve etkileri süren. Nevropatoloji ve nöropatik ağrı sürelerini eşdeğer ve sinir büyüme faktörü (NGF)18,40,41sentezini teşvik ederek ters. Toplu olarak, bu iletişim kuralı hem saf küçük fiber nöropati manken kurulan ve NGF olası tedavi potansiyelini vurgulanır.

Klinik olarak, altın neuropathies küçük çaplı nosiseptif sinirler8,9 etkileyen soruşturma omuriliğine bacak cilt cilt innervasyon değerlendirmek için standarttır. Bizim geçerli rapor bu teknik IENFs klinikte patoloji taklit etmek ve aynı zamanda DRG morfolojik profilleri araştırıldı bir küçük fiber nöropati modelinin cilt innervasyon değerlendirmek için deneysel hayvan footpad cilde uygulanır. yaralanma marker, ATF3 nöronal somata patolojik durumunu ortaya çıkarmak için bölümler. Özellikle IENFs kayma dağıtımları epidermiste son derece dallanma ve sayım ölçütünü gruplar arasında istatistiksel fark önde gelen en büyük etken vardır. Örneğin, bizim şu anki protokolü her IENF dallanma puanı sadece dermis ve epidermiste dallanma noktaları ile IENFs bir tek IENF14,18,19sayılır. Bu ölçüt IENFs daha düşük bir yoğunluğu bizim araştırmalarda, diğer grupların bu neden olabilir. Hazırlanan ve cilt ve sistematik ve toplu-değerlendirme bir şekilde deneysel hayvan DRG bölümleri bizim şu anki değiştirilmiş protokolü ile işlenebilir. Buna göre bu sistematik araştırmalar IENF dejenerasyon ve nöronal yaralanma stereological önyargı küçük çaplı nöronların küçük fiber nöropati içinde işlevsel ve patolojik durumlardan önlemek olabilir.

Küçük çaplı sinirler davranış ile fonksiyonel değerlendirilmesi test, özellikle innoxious von Frey saç filaman uygulaması ile geleneksel olarak mekanik hassasiyeti alttaki küçük fiber diagnostiği için hastaların deri uygulandı nöropati. Deneysel hayvanlarda mekanik allodynia gözlenmesi eksojen mekanik stimülasyon olarak kabul edilir, metal mesh topraklama ayak nedeniyle zordur ve hayvan testleri sırasında son derece etkindir. Geçerli protokol bir belirli boy Kafes Tel zemin (5 mm × 5 mm) bir yarı saydam plastik kafes deneysel hayvan davranış testleri için çevre adaptasyonu için optimize edilmiştir. Bu boyutu kafes tabanının ayak topraklama eksojen uyarılması azaltmak ve ayak bırakarak kaçının.

Nöropati bu RTX fare modeli küçük fiber nöropati, IENF dejenerasyon1,42ile ilişkili diyabet gibi farklı türde uygulanabilir. Ancak, bu model sınırlı kalır. Örneğin, küçük fiber nöropati, klinikte, radikülopati denir özellikleri ile spinal sinir ligasyonu43 modeli hayvan da omurilik rootlet büyük lifler etkileyebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgments

Bu eser Bakanlığı bilim ve Teknoloji (106-2320-B-037-024), Kaohsiung Tıp Üniversitesi (KMU-M106028, KMU-S105034) ve amaç üst üniversiteler hibe (TP105PR15), Kaohsiung Tıp Üniversitesi, Tayvan için gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical reagent
Resiniferatoxin Sigma R8756
Tween 80 Sigma P1754
3,3’-diaminobenzidine Sigma D8001
avidin-biotin complex Vector PK-6100
Name Company Catalog Number Comments
Primary Antisera
Peripherin Chemicon MAB-1527
ATF3 Santa Cruz SC-188
PGP9.5 UltraClone RA95101
Name Company Catalog Number Comments
Secondary Antisera
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector BA-1000
Texas Red-conjugated goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-075-146
Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-095-152
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Hot plate IITC Model 39
von Frey filament Somedic Sales AB 10-600-0001
Name Company Catalog Number Comments
Material
Shandon coverplate Thermo scientific 72110017
Slide rack Thermo scientific 73310017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
  2. Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
  3. Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
  4. Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
  5. Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
  6. Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
  7. Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
  8. Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
  9. Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
  10. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
  11. Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
  12. Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
  13. Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
  14. Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
  15. Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
  16. Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
  17. Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
  18. Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
  19. Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
  20. Neubert, J. K., et al. Peripherally induced resiniferatoxin analgesia. Pain. 104 (1-2), 219-228 (2003).
  21. Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
  22. Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
  23. Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
  24. Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
  25. Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Jr Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), table of contents 1253-1258 (2002).
  26. Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
  27. Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
  28. Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
  29. Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
  30. Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
  31. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  32. Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
  33. Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
  34. Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
  35. Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
  36. Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
  37. Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
  38. Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
  39. Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
  40. Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
  41. Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
  42. Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
  43. Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).

Tags

Neuroscience sayı 132 Resiniferatoxin (RTX) von Frey saç filament sıcak plaka testi mekanik allodynia termal hypoalgesia transkripsiyon etkinleştirme geçici reseptör potansiyel vanilloid tip 1 (TRPV1) küçük fiber nöropati sinir hasarı faktör-3 (ATF3)
Saf küçük Fiber nöropati bir fare modeli ile geçici reseptör potansiyel Vanilloid tip 1 Ultrapotent Agonist kurulması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y. C., Lu, S. C., Hsieh, Y. L.More

Lee, Y. C., Lu, S. C., Hsieh, Y. L. Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1. J. Vis. Exp. (132), e56651, doi:10.3791/56651 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter