Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntese og massespektrometri analyse av Oligo-peptoids

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/56652
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, University of the Pacific

Summary

En protokoll som er beskrevet for manuell syntese av oligo-peptoids etterfulgt av sekvens analyse av massespektrometri.

Abstract

Peptoids er rekkefølgen-kontrollerte peptid-mimicking oligomers bestående av N-alkylated glysin enheter. Blant mange potensielle programmer, har peptoids vært tenkt på som en type av molekylære informasjonslagring. Massespektrometri analyse har vært vurdert metoden for valg for sekvensering peptoids. Peptoids kan syntetiseres via solid fase kjemi ved hjelp av en gjentatt totrinns reaksjon syklus. Her presenterer vi en metode å syntetisere manuelt oligo-peptoids og til å analysere en rekke peptoids med tandem massespektrometri (MS-/ MS) teknikker. Eksempel peptoid er en nonamer som består av vekslende N-(2-methyloxyethyl) glysin (Nme) og N-(2-phenylethyl) glysin (Npe), samt en N-(2-aminoethyl) glysin (Nae) på N-terminus. Rekkefølgen formelen for peptoid er Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, der Ac er gruppen acetyl. Syntese foregår i en kommersielt tilgjengelig solid-fase reaksjonen fartøyet. Skøytebane amid harpiks brukes som solid støtte til peptoid med en amid gruppe på C-terminus. Det resulterende peptoid produktet er utsatt for sekvensen analyse ved hjelp av en trippel-quadrupole masse spectrometer koplet til en electrospray ionization kilde. MS-/ MS målingen produserer et spekter av fragment ioner som følge av ladet peptoid. Fragment ioner sorteres basert på verdiene i sine masse-til-lade ratio (m/z). M/z-verdier fragment ioner sammenlignes mot nominell massene teoretisk spådd fragment ioner, i henhold til ordningen av peptoid fragmentering. Analysen genererer et fragmentering mønster av ladet peptoid. Fragmentering mønsteret er korrelert til monomer sekvensen av den nøytrale peptoid. I denne forbindelse, leser MS analyse ut sekvens av peptoids.

Introduction

Peptoids er en klasse av sekvens-kontrollerte polymerer med ryggraden strukturer mimicking strukturen av peptider. Peptoids kan bli syntetisert fra mangfoldig aminer, som gjør peptoids viser svært tunable egenskaper1,2. Peptoids har blitt brukt som molekylær modeller for Biofysiske forskning, ansett som terapeutiske agenter og utformet som ligander i proteiner3,4,5,6. Peptoids har blitt utviklet til en rekke biologisk aktive forbindelser, som anti-fouling og antistoff-mimetic, antimikrobielle midler og enzym-hemmere7,8,9. Med en svært organisert og tunable natur, har peptoids også blitt oppfattet som en type av molekylære informasjonen lagring10. Oppdagelsen av disse forskjellige programmer krever utviklingen av effektive analytiske metoder å karakterisere sekvensen og strukturen i peptoids. Tandem masse massespektrometri-baserte teknikker har vist lovende som metoden for valg for å analysere egenskapene sekvens av sekvens-kontrollerte polymerer, inkludert peptoids11,12,13, 14,15. Men systematiske studier samkjøre peptoid ion fragmentering mønstre som følge av masse massespektrometri studier og strukturinformasjon fra peptoids er svært begrenset.

Peptoids kan lett syntetiseres bruke en solid fase. Den godt utviklet metoden innebærer en gjentakelse av en to-trinns monomer tillegg syklus16,17. I hvert tillegg syklusen, en harpiks-bundet Amin er acetylated av en haloacetic syre (vanligvis bromoacetic acid, BMA), og dette etterfølges av en forskyvning reaksjon med en primær Amin. Selv om automatiserte syntese protokoller er rutinemessig brukt for peptoid syntese, kan peptoids syntetiseres manuelt med utmerket rentene i en standard kjemi laboratorium16,18,19, 20.

Våre lab har vedtatt metoden for manuell peptoid syntese og forenklet apparater i eksisterende metoder. Vi har tidligere studert fragmentering mønstre av en rekke peptoids med MS-/ MS teknikker21,22,23. Våre resultater viser at peptoids produsere karakteristiske fragmentations når de utsettes for kollisjon-indusert dissosiasjon (CID)21,23 eller electron-fangst dissosiasjon (ECD)22 eksperimenter. I denne artikkelen viser vi hvordan oligo-peptoids kan syntetiseres i et standard kjemi laboratorium, utføre CID eksperimenter med en trippel-quadrupole masse spectrometer og analysere spektraldata. Peptoid syntetisert og preget er en nonamer med N-terminal acetylation og C-terminalen amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Strukturen i peptoid er vist i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. syntese av Peptoid

Merk: Syntese begynner med aktivere harpiks ved hevelse harpiks og fjerne beskytte gruppen. Dette etterfølges av voksende peptoid kjeden på harpiks gjennom gjentatte monomer tillegg sykluser. Den første monomer koblet til harpiksen er C-terminalen rester. Peptoid er langstrakt C-terminalen til N-terminus. Når sekvensen ønsket peptoid er oppnådd, harpiks er kløyvde av og peptoid produktet er renset.

  1. Forberedelse av reagenser
    Merk: De flytende reagensene er målt bruk brønnene og solid reagensene er målt bruk en analytical balanse.
    1. Bland 6.2 mL N N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) og 43,8 mL N, N-vannistedenfor (DMF) å forberede en 0,8 M DIC/DMF løsning.
    2. Oppløse 5.56 g BMA i 50.0 mL DMF å forberede en 0,8 M BMA/DMF løsning.
    3. Bland 2 mL av piperidine (Pip) og 8 mL DMF å oppnå 20% Pip/DMF løsning.
    4. Oppløse 1,9 mL av Npe til 13,1 mL DMF å oppnå 1,0 M Npe/DMF.
    5. Oppløse 1.3 mL Nme i 13,7 mL DMF å oppnå 1,0 M Nme/DMF.
    6. Oppløse 0.32 mL Nae til 2 mL DMF å oppnå 1,0 M Nae/DMF.
      Forsiktig: De fleste av kjemikaliene som brukes i syntesen er farlig. Trifluoroacetic syre (TFA), DIC, Pip og BMA er farlig for huden, øyne og luftveier. DMF og diklormetan (DCM) er mistenkt kreftfremkallende. Alle reaksjoner skal utføres i avtrekksvifte og riktig personlig verneutstyr benyttes. Kontroller sikkerhetsdatabladet (MSDS) av alle kjemikaliene som brukes i syntese.
  2. Harpiks aktivisering
    1. Mål ut 84 mg Rink amid harpiks (kvae, 0.047 mmol, lasting 0.56 mmol/g) og legge den til i en 10 mL polypropylen solid-fase reaksjonen fartøyet. Stempelet inn fartøyet.
    2. Legge til 2 mL DMF reaksjonen fartøyet og lue fartøyet med en trykket cap. Plasserer fartøyet i en shaker og agitere fartøyet i romtemperatur i en vinkel på bevegelse av ca 12 grader og 385 svingninger/min for 30 min. avløp løsningen til en avfallsbeholderen ved å fjerne hetten og skyve stempelet på reaksjonen fartøyet.
    3. Legg 2 mL 20% Pip/DMF løsning til fartøyet og cap fartøyet. Rist den på shaker i 2 minutter og avløp løsningen avfallsbeholderen.
    4. Legg 2 mL 20% Pip/DMF løsning til fartøyet, cap fartøyet, og røre det ved romtemperatur for 12 min. fjerne hetten og avløp løsningen avfallsbeholderen.
    5. Vask harpiks ved å legge til 1 mL av DMF, capping fartøyet, og agitating fartøyet i 1 Fjern cap og avløp løsningen ved å skyve stempelet. Vask harpiks med DMF for 4 ganger.
  3. Monomer tillegg og N-terminal acetylation
    Merk: Hver monomer tillegg syklus innebærer to reaksjon skritt, bromoacetylation og forskyvning.
    1. Utføre den første monomer tillegg syklusen skjemaet Nme-harpiks.
    2. Utføre en bromoacetylation reaksjon. Bland 1 mL av 0,8 M BMA/DMF løsningen og 1 mL av 0,8 M DIC/DMF løsning i et beaker. Overføre blandingen til en reaksjon fartøyet som inneholder harpiks og lue fartøyet. Plassere båten på shaker og rist det ved romtemperatur for 20 min. fjerne hetten og avløp løsningen avfallsbeholderen.
    3. Vask harpiks ved å legge til 1 mL av DMF, capping fartøyet, agitating det for 1 min og drenering løsningen ved å skyve stempelet. Vask harpiks ved å legge til 1 mL av DCM, agitating fartøyet for 1 min og drenering løsningen. Vask harpiks med DCM igjen, og deretter vaske det med DMF to ganger.
    4. Utføre en forskyvning reaksjon. Legge 1 mL av 1,0 M Nme/DMF løsning, cap fartøyet, agitere fartøyet ved romtemperatur for 60 min. fjerne hetten og avløp løsningen ved å skyve stempelet.
    5. Vask harpiks ved å legge til 1 mL DMF, agitating fartøyet for 1 min og drenering løsningen ved å skyve stempelet. Vask harpiks ved å tegne i 1 mL DCM, agiterte for 1 min, og drenering løsningen. Vask DCM igjen, etterfulgt av vask med DMF to ganger.
    6. Gjenta monomer tillegg sykluser fra trinn 1.3.2 til 1.3.5 til Nae-(Npe-Nme)4-harpiks. Når Gjenta trinnet forskyvning reaksjon (1.3.4), kan du bruke en bestemt Amin løsning i henhold til peptoid-sekvensen.
      Merk: Peptoid kjeden er langstrakt C-terminalen til N-terminus med C-terminalen rester bundet til harpiks.
    7. Utføre N-terminal acetylation å danne Ac-Nae-(Npe-Nme)4-harpiks.
    8. Mix 92 µL av eddiksyre, 43.5 µL av N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) og 2 mL DMF i et beaker å gjøre ca 2 mL av acetylation cocktail.
    9. Legge til 2 mL acetylation cocktail fartøyet som inneholder harpiks, cap fartøyet og røre det ved romtemperatur for 60 min. fjerne hetten og avløp løsningen ved å skyve stempelet.
    10. Vask harpiks ved å legge til 1 mL av DMF, agitating fartøyet for 1 min og drenering løsningen ved å skyve stempelet. Vask harpiks ved å legge til 1 mL av DCM, agitating fartøyet for 1 min og drenering løsningen. Gjenta vaske harpiks med DCM igjen og vask med DMF to ganger mer.
    11. Vask harpiks ved å legge til 1 mL av DCM, agitating fartøyet for 1 min og drenering løsningen ved å skyve stempelet. Gjenta vask med DCM to ganger. Fjern lokket og la harpiks air-dry i reaksjonen fartøyet i 10 min.
  4. Cleavage og rensing
    1. Bland 3,8 mL TFA 100 µL av triisopropylsilane (TIPS) og 100 µL av HPLC-klasse H2O i et beaker å gjøre 4 mL cleavage cocktail.
    2. Legge 4 mL av nystekte cleavage cocktail for fartøyet som inneholder harpiks, cap fartøyet og røre det ved romtemperatur for 2T.
    3. Fjerne hetten og samle filtratet løsningen i en 50 mL polypropylen sentrifuge rør. Legge til 1 mL av TFA fartøyet cap det og agitere for 1 min. samle filtratet løsningen i samme sentrifuge rør.
    4. Fordampe TFA ved å blåse i en strøm av nitrogen gass forsiktig til ca 1 mL tyktflytende løsning er igjen.
    5. Legge 15 mL diethyl Ether til gjenværende løsningen cap sentrifuge røret og ruge det i 20 ° C fryser for 2t overnight. Den rå peptoid precipitates hvit solid.
    6. Pellets solid ved hjelp av en sentrifuge 4,427 x g for 10 min. fjerne hetten sentrifuge røret og Dekanter diethyl Eter i et beaker nøye uten mister solid.
      Forsiktig: Diethyl Eter er en brennbar organiske løsemidler. Bruk en diethyl Eter trygt sentrifuge.
    7. Vask solid ved å legge 10 mL iskalde diethyl Ether i sentrifugen rør som inneholder solide, capping røret og plassere den i en sentrifuge. Utføre sentrifugering 4,427 x g for 10 min. fjerne sentrifuge rør fra sentrifuge og Dekanter diethyl Eter i et beaker nøye uten mister solid.
    8. Tørr solid ved å forsiktig blåse i en strøm av nitrogen gass.
    9. Legge til 10 mL HPLC-klasse H2O å oppløse tørket solid. Løsningen passere et nylon sprøyte filter med porestørrelse på 0,45 µm og samle filtratet i en pre vektet 50 mL polypropylen sentrifuge rør.
    10. Shell fryse løsningen ved å plassere og roterende sentrifuge rør som inneholder den peptoid løsningen i 12-unse, dobbelt sammensatte utvidet polystyren kopp 1/3 fylt med flytende nitrogen. Lyophilize frosne løsningen over natten for å gi solid peptoid.
    11. Gjenta lyophilization én gang ved å løse opp solid peptoid i 10 mL HPLC-klasse H2O, shell frysing i flytende nitrogen, og lyophilizing over natten. Den resulterende peptoid er tilstrekkelig ren for sekvensen analyse av massespektrometri.

2. MS målinger og Sequence Analysis

Merk: MS-/ MS eksperimentet er utført i en trippel-quadrupole masse spectrometer koplet til en electrospray ionization (ESI) kilde. Datainnsamling kontrolleres ved hjelp av data oppkjøpet programvaren sammen med apparatet. Den generelle fremgangsmåten omfatter 1) utfører i sin helhet avsøke massespektrometri eksperimentet og opptak mass spekteret, 2) utfører CID MS/MS eksperimentere og opptak MS-/ MS spekteret, og 3) sammenligne MS-/ MS spektraldata med teoretisk fragmentering ordningen spådd basert på de strukturelle trekk ved peptoid.

  1. Utarbeidelse av prøven løsning
    1. Veie ut 1,0 til 2,0 mg solid peptoid i en 3-5 mL hetteglass. Legg 1 mL blandet løsemiddel acetonitrile og vann (ACN/T2O, 1:1, v/v) for å oppløse peptoid. Dette gir lager prøve løsningen med en konsentrasjon av ca 10-3 M.
    2. Overføre 20 µL av lager løsning til en 1,5 mL sentrifuge rør og legge 1 mL blandet løsemiddel ACN/T2O å gi en utvannet eksempel løsning av ca 10-5 M.
    3. Fjern mulig uløselig partikler i utvannet prøve løsningen ved å utføre sentrifugering 4,427 x g for 3 min. overføre rundt 700 µL av den øverste delen av løsningen i en annen 1,5 mL sentrifuge rør for å gjøre peptoid MS fungerende løsning med konsentrasjon av ca 10-5 M.
    4. Justere konsentrasjonen av MS fungerende løsning basert på observerte signal intensiteten i massespektrometri målinger.
    5. En alternativ måte å fjerne mulig uløselig partikler i utvannet prøve løsningen er å passere et 0,20 µm sprøyte filter prøve løsningen og samle filtratet i en 1,5 mL sentrifuge tube gjøre peptoid MS fungerende løsning av ca 10-5 M.
  2. Innspillingen masse spectra
    1. Kjør blandet løsemiddel ACN/T2O (1:1, v/v) gjennom electrospray ionization (ESI) kilde og sette opp instrument i et standard positivt ion, full skannemodus massespektrometri med en masse-til-lade forholdet (m/z) rekke 100-1500.
      Merk:
      Typisk rammebetingelsene:
      ESI nål spenning, 5 kV
      Kapillær spenning, 40 V
      Tørking gass (nitrogen gass) temperatur, 200 ° C.
    2. Legg ca 300 µL av peptoid MS fungerende løsning (ca 10-5 M) i en 500 µL eller en 1 mL sprøyte og koble sprøyten til ESI innløp bruker kapillært polyether Eter keton (kikk) rør. Plasser sprøyten til sprøytepumpen og angi flow rate på 10 µL/min å infundere prøve løsningen i ESI innløpet.
    3. Slå på nål ESI spenning å aktivere ESI prosessen, og deretter slå på detektoren. Angi visningen i profil og 100-1500 m/z området. Vis en masse spektrum profil vises i vinduet profil. Høyden på m/z 1,265 (vises som m/z av 1,264.6) tilsvarer peptoid ion eller protonerte peptoid.
    4. Registrere MS spekteret i 2 minutter. "Metoden vinduet" bruke 2 min som "kjøre tid." Åpne vinduet fylle inn et riktig navn og begynne å ta spekteret.
      Merk: Det resulterende masse spekteret er vist i Figur 3.
    5. Optimalisere intensiteten av toppen på m/z av 1,265. Angi m/z til 1150-1350 og justere kapillær spenningen mens topp intensiteten i mV vises i vinduet profil. For eksempel øke kapillær spenningen til 50 V eller høyere og vise endringen av topp intensiteten. Optimal peak intensiteten er rundt 150-200 mV.
      Merk: Justere kapillær spenningen kan betydelig endre overflod av visse ioner. Økt kapillær spenningen kan øke intensiteten av peptoid ion. Men kan en høy kapillær spenning også indusere av peptoid ion i ion kilden, og redusere observert intensiteten. Justere temperaturen på tørking gass kan forbedre intensiteten av toppen på m/z 1,265, men det er mindre effektiv enn justere kapillær spenningen. Hvis høyden på m/z 1,265 ikke når optimal intensitet, justere utvalget konsentrasjon (eller eksempel doble konsentrasjonen av MS fungerende løsning).
    6. Bytt apparatet til MS-/ MS modus. Angi forløper ion på m/z 1,265 og MS-/ MS masse rekkevidde på m/z av 100-1400. "Metoden vinduet" Bruk m/z 1,265 som "Q1 første masse" og "Q1 siste massen" er tomt. Bruke m/z 100 som "Q3 første masse" og m/z 1400 som "Q3 siste Mass"
      Merk: I MS-/ MS modus, den første quadrupole enhet (Q1) fungerer som en masse filter isolere peptoid ion som forløper ion, den andre quadrupole enheten (Q2) er en kollisjon celle og funksjonene for tredje quadrupole-enhet (Q3) som en masse analysator.
    7. Sett kollisjon energien på 40 eV og kollisjon gassen (argon, i dette tilfellet) Trykk på 1,5 mTorr.
    8. Vis en masse spektrum profilen som vises i vinduet profil. Høyden på m/z av 1,265 tilsvarer peptoid ion, og toppene med lavere m/z-verdier representerer fragmenter fra peptoid ion.
    9. Justere kollisjon energi til å optimalisere visningen av fragmentering spekteret. For eksempel øke kollisjon energien til 45 eV og vise endringen av spekteret profilen.
      Merk: vanligvis øke kollisjon energi vil forbedre overflod av fragment ioner og redusere overflod av peptoid ion. Øker kollisjon gasstrykket vil også forbedre overflod av fragment ioner.
      Forsiktig: Ikke Øk kollisjon gasstrykket utover 2 mTorr.
    10. Registrere MS-/ MS spekteret i 2 minutter. "Metoden vinduet" bruke 2 min som "kjøre tid." Åpne vinduet fylle inn et riktig navn og begynne å ta spekteret.
    11. Gjenta innspilling 1 - 2 ganger.
  3. Peptoid rekkefølge analyse
    Merk: Under forutsetning av CID, ville peptoid ion fragmentere på amid bånd langs peptoid ryggraden å produsere en rekke N-terminal fragmenter B-ioner og en rekke C-terminalen fragmenter Y-ioner
    1. Trekke ut den kjemiske strukturen til den acetylated peptoid ved å plassere N-terminus på venstre side og C-terminus på høyre side og tegne en stiplet linje i hver amid obligasjon generere en fragmentering ordningen som vist i figur 2a. Tegne et proton med en stiplet sirkel å angi kostnad transportøren. Fra venstre side av strukturen, plassere etikettene på de stiplede linjene til å angi N-terminal fragmenter som B1, B2, B8. Start fra retten, plassere etikettene på de stiplede linjene til å angi C-terminalen fragmenter som Y1, Y2, Y8.
      Merk: En kjemisk tegning programvare kan brukes til å tegne peptoid strukturen.
    2. Tenk fragmentering 4th amid bånd fra venstre, og tegn konstruksjoner av N-terminal fragmentet og C-terminalen fragmentet med riktig formelle kostnader, som vist i figur 2b. Plasser etiketten for B4 på N-terminal fragmentet, og sted Y5 etiketten på C-terminalen fragmentet. Beregne m/z verdien av B4 med oppsummere nominell massene elementer i strukturen til en verdi av 580, og plassere m/z 580 på N-terminal fragmentet. Beregne m/z verdien av Y5 og plasser m/z 685 på C-terminalen fragmentet.
    3. Beregne m/z-verdier for alle åtte B ioner og alle åtte Y ioner, og samle dem i en tabell, som vist i tabell 1.
      Merk: M/z-verdier av fragmenter kan beregnes ved hjelp av en kjemisk tegning programvare.
    4. Åpne innspilte MS-/ MS spekteret av peptoid bruke den gjennomgang programvaren sammen med apparatet. Angi merking preferansene for "Vis Ion Merkelapper" og etiketten terskelen til 3%. Dette genererer et MS-/ MS spekter med m/z-verdier som er merket på toppene.
    5. Eksportere MS/MS spektraldata som en tekstfil i CSV-format og rekonstruere spekteret med databehandlingen programvare. Plasser m/z-verdier på toppene. Resulterende MS-/ MS spekteret er vist i Figur 4.
      Merk: Noen masse spektrometre er utstyrt med databehandling programvare som kan generere MS-/ MS spekteret. I dette tilfellet er eksportere MS-/ MS spectral dataene ikke nødvendig.
    6. Tilordne m/z-verdier vises på MS-/ MS spekteret de vist i tabell 1 å identifisere den tilsvarende B - og Y-ioner. For eksempel toppen på m/z 580 identifiseres som B4-ion og m/z 685 identifiseres som Y5-ion. Merk toppene med tilsvarende B og Y symboler på spectrum, som vist i Figur 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strukturen i en 9-mer peptoid med N-terminal acetylation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, er vist i figur 1. Peptoid ble syntetisert manuelt i et fritted polypropylen reaksjon fartøyet via solid fase tilnærming. Skøytebane amid harpiks (0.047 mmol, 84 mg med lasting 0.56 mmol/g) brukes som solid støtte til peptoid med en amidated C-terminus. Peptoid kjeden er bygget av flere sykluser av monomer tillegg. Hvert monomer tillegg syklus innebærer to reaksjoner skritt, bromoacetylation og forskyvning. Bromoacetylation oppnås ved å legge til 0,8 M BMA løsning og 0,8 M DIC løsning og reaksjonen tar 20 min. Forskyvning er oppnådd ved å legge til 1,0 M Amin løsning acetylation produktet og reaksjonen tar 1 h. N-terminal acetylation ble utført ved å legge til en cocktail løsning som inneholder 92 µL av eddiksyre, 43.5 µL av DIPEA, og 2 mL DMF. Peptoid er kløyvde av fra harpiks ved å legge til en cocktail løsning som inneholder 3,8 mL TFA, 100 µL av TIPS og 100 µL av HPLC-klasse H2O, og reaksjonen tar 2 h. TFA er fjernet i panseret ved å blåse i en strøm av nitrogen gass til ca 1 mL tyktflytende løsningen er igjen. Peptoid produktet precipitates i diethyl Eter og er isolert av sentrifugering, og dette etterfølges av to gjentakelser av lyophilization. Den resulterende peptoid er tilstrekkelig ren for MS-/ MS analyse.

Anslått fragmenteringsoppsettet for peptoid er vist i figur 2a, hvor proton i stiplet sirkel angir "mobile proton" som vil indusere peptoid fragmentering under CID eksperimentet. Peptoid ion fragmenter på amid bånd langs peptoid ryggraden, som indikeres webområdene fragmentering av de stiplede linjene. N-terminal fragmenter kalles B-type ioner og C-terminalen fragmenter er merket som Y-type ioner. Hvis fragmentering skjer på alle tilgjengelige amid obligasjoner, totalt åtte N-terminal fragmenter, B1 til B8, og totalt åtte C-terminalen fragmenter, Y1 Y8, vil danne. Hver fragment har en tilsvarende m/z-verdien som beregnes ved å summere opp nominell massene av alle elementer i fragmentet. Som et eksempel, strukturer og tilsvarende m/z verdier (nominell massene) av B4-ion og Y5-ion er vist i figur 2b. Den kjemiske formelen for B4 ion er C31H42N5O6+og nominell massen beregnes av ligningen (31 x 12) + (42 x 1) + (5 x 14) + (6 x 16) = 580. Siden B4 er en enkeltvis ladet ion, m/z-verdien vil være 580/1 = 580. I figur 2bstrukturen av B4-ion er et forenklet skjema (se drøftingen for detaljer). Beregnet m/z-verdier (nominell massene) alle fragment ioner fra B1-B8 og Y1-Y8 er gitt i tabell 1.

Masse analysen omfatter to prosesser. Den første prosessen er å utføre fullstendig skanning massespektrometri analyse av peptoid prøven. Resultatet indikerer hvorvidt prøven behersker en målbar mengde peptoid og relative renheten av prøven. Fullstendig skanning mass spekteret av peptoid ion vises i Figur 3, der m/z-verdier avrundes til nærmeste hele tall. Høyden på m/z 1,265 tilsvarer protonerte peptoid, og en topp på m/z 1,287 samsvarer med natrium ion adduct av peptoid. De to toppene på m/z 633 og m/z 644 tilsvarer dobbelt protonerte og blandet protonerte-sodiated peptoids, henholdsvis. Disse resultatene tyder på at peptoid prøven er tilstrekkelig ren for å utføre MS-/ MS analyse.

Den andre prosessen i masse analysen er å utføre MS-/ MS forsøket på protonerte peptoid på m/z 1,265. Denne prosessen inneholder isolere forløper peptoid ion av første quadrupole enhet, fragmentering peptoid ion i CID og sortere de fragment ionene ifølge deres m/z-verdier av tredje quadrupole. Det resulterende spekteret er vist i Figur 4, der m/z-verdier avrundes til nærmeste hele tall. Høyden på m/z 1,265 tilsvarer protonerte peptoid. Andre toppene på lavere m/z-verdier tilsvarer fragment ioner fra peptoid ion. Fragment ioner tilordnes som B-ion eller Y-ion ved å sammenligne deres m/z-verdier med de anslåtte (vist i tabell 1) basert på peptoid fragmentering ordningen (vist i figur 2). Syv Y-ioner (Y2 Y8) og syv B-ioner (B1 til B7) er dannet med observerbare dyp. Merk at overflod av Y-ioner er mye høyere enn de fleste B-ioner.

Figure 1
Figur 1: kjemiske strukturen til peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Peptoid ble syntetisert manuelt via solid fase tilnærming. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Fragmentering skjemaet for protonerte peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Peptoid ion fragmenter på amid bånd langs peptoid ryggraden å produsere en rekke N-terminal fragmenter kalles B-ioner og en rekke C-terminalen fragmenter Y-ioner. a) spådd fragmentering plan for protonerte peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. De stiplede linjene angir webområdene fragmentering, symboler B1 til B8 angi N-terminal fragmenter, og symboler Y1 til Y8 angir C-terminalen fragmenter; b) prøve fragmentering med skjematisk strukturer. Strukturer Vis B4-ion og Y5-ion med tilsvarende m/z verdier, henholdsvis. M/z-verdiene beregnes ved å summere opp nominell massene elementer i strukturer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Full skanning mass spekteret av peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, der m/z-verdier avrundes til nærmeste hele tall. Toppen på m/z 1,265 tilsvarer peptoid ion, [P + H]+, og en topp på m/z 1,287 samsvarer med natrium ion adduct av peptoid, [P + Na]+. De to toppene på m/z 633 og m/z 644 samsvarer med dobbelt ladet peptoid, [P + 2 H]2 + og [P + H + Na]2 +, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: MS-/ MS spekteret av protonerte peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2 merket med tildelte fragmenter. Toppen på m/z 1,265 tilsvarer protonerte peptoid, [P + H]+, og toppene med lavere m/z-verdier tilsvarer fragment ioner. B - og Y-ioner tilordnes ved å sammenligne deres m/z-verdier med beregnet basert på fragmenteringsoppsettet av peptoid ion. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

B-ion m/z verdi (nominell massen) Y-ion m/z verdi (nominell massen)
B1 143 Y1 133
B2 304 Y2 294
B3 419 Y3 409
B4 580 Y4 570
B5 695 Y5 685
B6 856 Y6 846
B7 971 Y7 961
B-8 årene 1132 Y8 1122

Tabell 1: Teoretisk m/z-verdier beregnes basert på forventet fragmentering ordningen med protonerte peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme) 4 -NH 2 . B-ion og Y-ion angir de tilsvarende fragment ionene N-terminus og C-terminus, henholdsvis. Hver m/z verdi (nominell massen) beregnes ved å summere opp nominell massene elementer i at fragment ion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, har blitt syntetisert ved hjelp av protokollen presentert. Syntese apparatet innebærer en sprøyte-aktige polypropylen solid-fase reaksjon fartøyet og en mekanisk shaker. Reaksjon fartøyene er kommersielt tilgjengelig og rimelig. En mekanisk shaker er en vanlig apparater i kjemi laboratorier. Med bruk av en sprøyte-aktige reaksjon fartøyet, kan løsninger være trukket inn og skjøvet ut av fartøyet ved å manuelt flytte stempelet. Denne teknikken gjør monomer tillegg og harpiks cleavage reaksjoner å skje i én enkelt reaksjon fartøyet og eliminerer trinnet overfører harpiks-bundet mellomliggende produktet i et annet fartøy for spalting. Denne teknikken også eliminerer behovet for en vakuum utvinning enhet fjerne løsninger fra reaksjonen fartøyet. Vakuum utvinning er vanlig i manuell peptoid syntese som har blitt demonstrert av andre forskere19,20. Grundig vask harpiks mellom reaksjon trinn er avgjørende for å få en høy renhetsgrad produkt. Et potensielt problem er tilstopping av frit i reaksjonen fartøyet etter flere sykluser monomer tillegg. En løsning på dette problemet er å overføre harpiks til en ny reaksjon fartøyet og fortsette synteseprosessen. Denne syntese teknikken fungerer godt for peptoids til 10-12 rester. For lengre peptoids blir det vanskelig å fjerne løsninger fra reaksjonen fartøyet ved å skyve stempelet. I dette tilfellet kan en vakuum utvinning enhet benyttes for å fjerne løsninger fra reaksjonen fartøyet (stempelet bør erstattes av en stopper). I syntese protokollen, er råolje produktet renset ved å fremskynde peptoid i diethyl ether. Noen kortere og svært polar peptoids nødvendigvis ikke bunnfall i diethyl ether. I dette tilfellet kan peptoid være isolert av oppløsende råolje produktet i 10% eddiksyre og vask løsningen med diethyl ether flere ganger som etterfølges av lyophilization. Noen svært hydrofobe peptoids kan også ikke danne bunnfall i diethyl ether. I dette tilfellet fordampe diethyl Eter og bruk en tilbakeført fase HPLC for å rense peptoid produktet.

I denne studien peptoid ion genereres av ESI og MS-/ MS eksperimentet utføres i en trippel-quadrupole masse spectrometer. På grunn av ion isolasjon evnen av første quadrupole, er prøven direkte infused inn ESI kilde, som eliminerer behovet for flytende kromatografi (Langbane). Enkeltvis kan protonerte peptoids også enkelt genereres ved hjelp av matrix-assistert laser desorpsjon-ionisering (MALDI) teknikk. MS-/ MS eksperimenter kan utføres ved hjelp av andre typer masse spektrometre, som en ion-felle spectrometer. Selv om relative overflod av fragment ioner vises annerledes hvis MS-/ MS spectra registreres ved hjelp av ulike instrumenter, skal kvalitativ spectral funksjonene være lik. Generelt, er den relative overfloden av ulike fragment ioner svært følsom for parameterne instrument. Endre kollisjon energi og kollisjon gasstrykket kan endre den relative overfloden av fragment ioner betydelig. For eksempel øker kollisjon energi eller øke kollisjon gasstrykket vil fremme fragmentering, og resultatet av peptoid forløper ion reduseres og overflod av fragment ioner vil øke. Denne studien fokuserer på enkeltvis ladet peptoids. Lengden på peptoids studerte bruker denne protokollen er begrenset av m/z rekke masse spectrometer. For en masse spectrometer med masse rekkevidde opp til m/z 2000 være m/z-verdier av de ladet peptoids lavere enn den øvre grensen. Hvis peptoids har en molekylær masse høyere enn grensen på masse spectrometer, en dobbelt protonerte peptoid kan brukes som forløper ion. Et dobbelt ladet peptoid ville ha en m/z-verdi som er omtrent halvparten av enkeltvis ladet.

Peptoid presenteres i dette arbeidet inneholder en grunnleggende resten med en primær amin som gruppen siden-kjeden. Grunnleggende rester fungerer som en protonation området, som vil øke ionisering effektiviteten i ESI kilden av det masse spectrometer. Mindre polar (mer hydrofobe) peptoids har dårlig ionisering effektivitet i ESI kilden. I dette tilfellet kan en atmosfærisk trykk kjemiske ionisering (APIC) kilde benyttes for å ionisere peptoids. Under CID betingelser fragmentere peptoid ioner hovedsakelig på amid obligasjoner til å produsere en serie av N-terminal og en serie av C-terminalen. Hvis kostnad transportøren, proton, ligger på N-terminal fragmenter, skjemaet B-ioner. Ellers skjemaet Y-ioner. Figur 2 viser en struktur av B4-ion. Dette er en forenklet struktur, som bidrar til å beregne m/z-verdien. De faktiske B-ionene er sannsynligvis dannet i en syklisk struktur, som en fem medlemmer oxazolone ring23. Ikke alle spådd fragment ioner dannet i masse spectrometer og observert i mass spekteret. Effektiviteten av danne positivt ladet fragment ioner er i stor grad bestemt av gassfase-basicity (eller proton affinitet) av fragment. Svært grunnleggende fragmenter har en stor sjanse å danne positivt ladet ioner og til observeres i til masse spectra. Generelt, gir observere minst 70% av de anslåtte fragment ionene en rimelig høy tillit for å forutsi sekvensen av en peptoid. Utforme peptoids for sekvensen analyse av massespektrometri, er det viktig å plassere rester med polar side-kjede grupper, for eksempel alkoxy grupper, på ulike steder langs peptoid kjeden.

Mest enkeltvis ladet peptoids med N-terminal acetylation viser Y-ioner mye høyere overflod enn B-ioner21,23. Som vist i Figur 3, bortsett fra at av B1-ion, intensiteten av toppene tilsvarer B-ioner er mye lavere enn de Y-ionene. For peptoids med gratis N-terminal amino grupper, er høyere overflod av Y-ioner over B-ioner observert samt21. Favoriserer Y-ioner antyder at Ladningsbærere proton foretrekker å ligge på C-terminalen fragmenter, som skyldes høyere proton slektskap av C-terminalen fragmenter23. I tillegg til dannelsen av B - og Y-ioner, sekundær fragment ioner knyttet vanntap eller labil side-kjeden gruppe tap er ofte observert i protonerte peptoids. Disse sekundære fragment ioner ofte vises som en rekke følgesvenn topper ved toppene av de primære fragment ionene (spesielt Y-ioner), og kan identifiseres ved å trekke massen av labilt side-kjeden fra massen av den tilsvarende primært fragment ioner.

Denne protokollen demonstrerer hvordan du manuelt syntetisere en oligo-peptoid og analysere monomer sekvensen av en peptoid med en tandem massespektrometri metode. Denne syntese protokollen kan lett vedtatt i en kjemi undervisning laboratoriet for å trene nye forskere i peptoid syntese. Denne massespektrometri protokollen fungerer som et effektivt verktøy, ikke bare å bekrefte identiteten til peptoid, men også å karakterisere strukturfunksjonene av peptoid i forhold til den observerte fragmentering mønsteret. Framtidige applikasjoner kan innebære utvikle kart sammenheng linke peptoid strukturen og fragmentering mønster gjennom syntese og massespektrometri analyse av et bibliotek med ulike peptoids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Mr. Michael Connolly og Dr. Ronald Zuckermann (The molekylær støperi, Lawrence Berkeley National Laboratory) for teknikk støtte i peptoid syntese. Vi anerkjenner støtte fra National Science Foundation (CHE-1301505). Alle massespektrometri eksperimentene ble utført på kjemi masse massespektrometri anlegget ved Universitetet i Stillehavet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L Agilent Technologies Inc. The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.
Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software Varian Inc. The software is a part of the Varian 320L package
Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD Fisher Scientific International Inc. 14-400-126
Hermle Centrifuge, Model Z 206 A Hermle Labortechnik GmbH
Solid phase reaction vessel, 10 mL Torviq SF-1000
Pressure caps for reaction vessels Torviq PC-SF
Syringe filters, pore size 0.2 μm Fisher Scientific Inc. 03-391-3B
Syringe filters, pore size 0.45 μm Fisher Scientific Inc. 03-391-3A
Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL VWR International, LLC. 490001-626
Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL VWR International, LLC. 490001-620
ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 CambridgeSoft Corporation CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.
Styrofoam cup, 12 Oz Common Supermarket
Rink amide resin Chem-Impex International, Inc. 10619
Piperidine Chem-Impex International, Inc. 02351 Highly toxic
N, N’-diisopropylcarbodiimide Chem-Impex International, Inc. 00110 Highly toxic
Bromoacetic acid Chem-Impex International, Inc. 26843 Highly toxic
2-Phenylethylamine VWR International, LLC. EM8.07334.0250
2-Methyoxyethylamine Sigma-Aldrich Co. LLC. 241067
N-Boc-ethylenediamine VWR International, LLC. AAAL19947-06
Acetic anhydride Sigma-Aldrich Co. LLC. 252845
N, N-dimethylformamide VWR International, LLC. BDH1117-4LG Further distillation before use
N, N-diisopropylethylamine Chem-Impex International, Inc. 00141
Triisopropylsilane Chem-Impex International, Inc. 01966
Trifluoroacetic acid Chem-Impex International, Inc. 00289 Highly toxic
Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System Millipore Corporation ZMQP60001 For generating HPLC grade water
HPLC-grade Water Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System
Methanol Pharmco-Aaper 339USP/NF HPLC grade
Acetonitrile Fisher Scientific International, Inc. A998-4 HPLC grade
Diethyl ether VWR International, LLC. BDH1121-19L Further distillation before use
Dichloromethane VWR International, LLC. BDH1113-19L Further distillation before use
Nitrogen gas Fresno Oxygen/Barnes Supply NIT 50-C-F Ultra high purity, 99.9995%
Argon gas Fresno Oxygen/Barnes Supply ARG 50-C-F Ultra high purity, 99.9995%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
  2. Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
  3. Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  4. Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
  5. Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
  6. Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
  7. Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
  8. Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
  9. Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
  10. Lutz, J. -F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), Washington, DC. 628 (2013).
  11. Altuntas, E., Schubert, U. S. "Polymeromics": Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
  12. Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
  13. Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
  14. Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
  15. Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
  16. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
  17. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
  18. Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
  19. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
  20. Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
  21. Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
  22. Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
  23. Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).

Tags

Kjemi problemet 132 Peptoid N-alkylated glysin syntese massespektrometri sekvens analyse fragmentering mønster Y-ion B-ion
Syntese og massespektrometri analyse av Oligo-peptoids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, J., Mann, Y. S., Zhang, Y.,… More

Ren, J., Mann, Y. S., Zhang, Y., Browne, M. D. Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids. J. Vis. Exp. (132), e56652, doi:10.3791/56652 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter