Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntese og massespektrometri analyse af Oligo-peptoids

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/56652
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, University of the Pacific

Summary

En protokol, der er beskrevet for manuel syntese af oligo-peptoids efterfulgt af Sekvensanalyse ved massespektrometri.

Abstract

Peptoids er sekvens-kontrollerede peptid-efterligne oligomerer bestående af N-alkylerede glycin enheder. Blandt mange potentielle anvendelser, har peptoids været tænkt som en type af Molekylær information opbevaring. Massespektrometri analyse har været betragtet som den foretrukne metode til sekvensering peptoids. Peptoids kan syntetiseres via faste fase kemi ved hjælp af en gentaget to-trins reaktion cyklus. Her vil vi præsentere en metode til at manuelt syntetisere oligo-peptoids og analysere sekvensen af peptoids ved hjælp af tandem massespektrometri (MS/MS) teknikker. Prøve peptoid er en nonamer bestående af skiftevis N-(2-methyloxyethyl) glycine (Nme) og N-(2-phenylethyl) glycine (Npe), samt en N-(2-aminoethyl) glycine (næ) på N-terminus. Formlen sekvens af peptoid er Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, hvor Ac er acetyl-gruppen. Syntesen finder sted i et kommercielt tilgængelige fast-fase reaktion fartøj. Rink akrylamid harpiks bruges som solid støtte til at give peptoid med et AMID gruppe på C-terminus. Den resulterende peptoid produkt er udsat for Sekvensanalyse ved hjælp af en triple-Quadrupol massespektrometer koblet til en electrospray Ionisation kilde. MS/MS måling producerer et spektrum af fragmentioner som følge af dissociation af ladede peptoid. Fragmentioner sorteres baseret på værdier af deres masse til ladning forhold (m/z). M/z-værdier af fragmentioner sammenlignes mod de nominelle masserne af teoretisk forudsagte fragmentioner, ifølge ordningen af peptoid opsplitning. Analysen skaber en fragmentering mønster af de ladede peptoid. Fragmentering mønster er korreleret til monomere sekvens af de neutrale peptoid. I denne henseende læser MS analyse de sekvens oplysninger af peptoids.

Introduction

Peptoids er en klasse af sekvens-kontrollerede polymerer med rygrad strukturer efterligne struktur af peptider. Peptoids kan syntetiseres fra forskellige aminer, som gør det muligt for peptoids at udstille meget afstemmelige egenskaber1,2. Peptoids har været brugt som Molekylær modeller for biofysiske forskning, betragtes som terapeutiske agenter, og udformet som ligander for proteiner3,4,5,6. Peptoids har udviklet sig til en bred vifte af biologisk aktive forbindelser, såsom anti-tilgroning og antistof-mimetiske materialer, antimikrobielle stoffer og enzym-hæmmere7,8,9. Med et stærkt bestilte og afstemmelige karakter, har peptoids også været tænkt som en type af Molekylær information opbevaring10. Opdagelsen af disse forskellige programmer kræver udvikling af effektive analytiske metoder til at karakterisere sekvensen og strukturen i peptoids. Tandem massespektrometri-baseret teknikker har vist lovende som den foretrukne metode til at analysere egenskaberne sekvens for sekvens-kontrollerede polymerer, herunder peptoids11,12,13, 14,15. Men systematiske undersøgelser korrelerede peptoid ion opsplitning mønstre som følge af masse massespektrometri undersøgelser og de strukturelle oplysninger af peptoids er meget begrænset.

Peptoids kan syntetiseres let, ved hjælp af en fast fase metode. Den veludviklede metode indebærer en gentagelse af en to-trins monomer tilføjelse cyklus16,17. En harpiks-bundet Amin er acetyleret af en haloacetic syre (typisk bromacetat, BMA) i hver cyklus med tilsætning, og dette er efterfulgt af en forskydning reaktion med en primær Amin. Selv om automatiserede syntese protokoller har været rutinemæssigt anvendt i peptoid syntese, kan peptoids syntetiseres manuelt med fremragende udbytter i en standard kemi laboratorium16,18,19, 20.

Vores lab har vedtaget metoden til manuel peptoid syntese og forenklet de apparater, der anvendes i de eksisterende metoder. Vi har tidligere studeret opsplitning mønstre af en serie af peptoids ved hjælp af MS/MS teknikker21,22,23. Vores resultater viser, at peptoids producere karakteristiske opdelinger, når de er udsat for kollision-induceret dissociation (CID)21,23 eller elektron-indfangning dissociation (ECD)22 eksperimenter. I denne artikel vil vise vi hvordan oligo-peptoids kan syntetiseres i en standard kemi laboratorium, hvordan man udfører CID eksperimenter ved hjælp af en triple-Quadrupol massespektrometer og hvordan man kan analysere den spektrale data. Peptoid at være syntetiseret og karakteriseret er en nonamer med N-terminale acetylation og C-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Strukturen i peptoid er vist i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sammenfatning af Peptoid

Bemærk: Syntese begynder med aktivering harpiksen af hævelse af harpiks og fjerne gruppen beskyttelse. Dette er efterfulgt af voksende peptoid kæden på harpiks gennem gentagne monomer tilføjelse cyklusser. Den første monomer koblet til harpiks, der er den C-terminale rester. Peptoid er aflange fra C-terminus til N-terminus. Når den ønskede peptoid sekvens er opnået, harpiks, der er kløvet og peptoid produkt er renset.

  1. Forberedelse af reagenser
    Bemærk: De flydende reagenser måles ved hjælp af en mikropipette og solid reagenserne måles ved hjælp af en Analysevægt.
    1. Bland 6,2 mL N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) og 43.8 mL N, N-dimethylformamid (DMF) til at forberede en 0,8 M af DIC/DMF løsning.
    2. 5.56 g BMA i 50,0 mL DMF at forberede en 0,8 M BMA/DMF opløsning opløses.
    3. Bland 2 mL af Piperidin (Pip) og 8 mL DMF at opnå 20% Pip/DMF løsning.
    4. Opløse 1,9 mL af Npe i 13,1 mL DMF at opnå 1,0 M Npe/DMF.
    5. Opløse 1,3 mL af Nme i 13,7 mL DMF at opnå 1,0 M Nme/DMF.
    6. Opløse 0,32 mL næ til 2 mL DMF at opnå 1,0 M næ/DMF.
      Forsigtig: De fleste af kemikalier, der anvendes i syntesen er farlige. Trifluoreddikesyre (TFA), DIC, Pip og BMA er farlige for hud, øjne og luftveje. DMF og dichlormethan (DCM) er mistænkt kræftfremkaldende stoffer. Alle reaktioner bør udføres i et stinkskab og passende personlige værnemidler skal anvendes. Tjek venligst de materielle sikkerhedsdatabladet (MSDS) af alle kemikalier anvendt i syntese.
  2. Harpiks aktivering
    1. Afmåle 84 mg af Rink akrylamid harpiks (harpiks, 0.047 mmol, lastning 0,56 mmol/g) og føje den til en 10 mL polypropylen fast-fase reaktion fartøj. Sæt stemplet i fartøjet.
    2. Der tilsættes 2 mL DMF reaktion fartøj og cap fartøjet med et pres cap. Placere fartøjet på en shaker, og gnub fartøj ved stuetemperatur i en vinkel på ca 12 grader og 385 svingninger/min i 30 min. afløb løsningen bevægelighed til en spildbakken ved at fjerne fælles landbrugspolitik og skubbe stemplet af reaktion fartøj.
    3. Tilsættes 2 mL 20% Pip/DMF til fartøjet og cap fartøjet. Gnub det på shaker for 2 min, og afløb løsning til spildbakken.
    4. Tilsættes 2 mL 20% Pip/DMF til fartøjet, cap fartøjet, og gnub det ved stuetemperatur i 12 min. Fjern hætten og afløb løsning til spildbakken.
    5. Vaske harpiks ved tilsætning af 1 mL DMF, udjævningen fartøjet og agiterer fartøjet i 1 min. Fjern hætten og afløb løsningen ved at skubbe stemplet. Vask harpiks med DMF for 4 ekstra gange.
  3. Monomer tilsætning og N-terminal acetylation
    Bemærk: Hver monomer tilføjelse cyklus indebærer to reaktion trin, bromoacetylation og forskydning.
    1. Udføre den første monomer tilføjelse cyklus til form Nme-harpiks.
    2. Udføre en bromoacetylation reaktion. 1 mL af 0,8 M BMA/DMF løsning og 1 mL af 0,8 M DIC/DMF løsning i et bægerglas blandes. Overfør blandingen til en reaktion fartøj indeholdende harpiks og cap fartøjet. Placere fartøjet på shaker og agitere det ved stuetemperatur i 20 min. Fjern hætten og afløb løsning til spildbakken.
    3. Vask i resin ved tilsætning af 1 mL DMF, udjævningen fartøjet, agiterer det for 1 min og dræning løsningen ved at skubbe stemplet. Vask harpiks ved tilsætning af 1 mL af DCM, agiterer skibet for 1 min og dræning løsningen. Vaske harpiks med DCM endnu en gang, og derefter vaske det med DMF to gange.
    4. Udføre en forskydning reaktion. Der tilsættes 1 mL af 1.0 M Nme/DMF løsning, cap fartøjet, agitere fartøj ved stuetemperatur for 60 min. Fjern hætten og afløb løsningen ved at skubbe stemplet.
    5. Vask i resin ved tilsætning af 1 mL DMF, agiterer skibet for 1 min og dræning løsningen ved at skubbe stemplet. Vask harpiksen af tegning i 1 mL DCM, idet for 1 min, og dræning løsningen. Vask DCM endnu en gang, efterfulgt af vask med DMF to gange.
    6. Gentag monomer desuden cykler fra trin 1.3.2 til 1.3.5 at danne Nae-(Npe-Nme)4-harpiks. Når gentage trin af fordrivelse reaktion (1.3.4), bruge en specifik Amin løsning ifølge peptoid sekvens.
      Bemærk: Peptoid kæden er aflange fra C-terminus til N-terminus med C-terminale rester bundet til harpiks.
    7. Udføre N-terminale acetylation at danne Ac-Nae-(Npe-Nme)4-harpiks.
    8. Mix 92 µL af eddikesyreanhydrid, 43,5 µL af N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) og 2 mL DMF i et bægerglas gøre ca. 2 mL acetylation cocktail.
    9. Der tilsættes 2 mL af acetylation cocktail det fartøj, som indeholder harpiks, cap fartøjet og agitere det ved stuetemperatur for 60 min. Fjern hætten og afløb løsningen ved at skubbe stemplet.
    10. Vask i resin ved tilsætning af 1 mL DMF, agiterer skibet for 1 min og dræning løsningen ved at skubbe stemplet. Vask harpiks ved tilsætning af 1 mL af DCM, agiterer skibet for 1 min og dræning løsningen. Gentag vask harpiks med DCM én gang mere, så vask med DMF to gange mere.
    11. Vask i resin ved tilsætning af 1 mL af DCM, agiterer skibet for 1 min og dræning løsningen ved at skubbe stemplet. Gentag vask med DCM to gange. Fjern hætten og lad harpiksen lufttørre i reaktion fartøj i 10 min.
  4. Kavalergang og rensning
    1. Bland 3,8 mL TFA, 100 µL af triisopropylsilane (TIPS) og 100 µL HPLC-grade H2O i et bægerglas gøre 4 mL af kavalergang cocktail.
    2. Tilføje 4 mL af frisklavet kavalergang cocktail det fartøj, som indeholder harpiks, cap fartøjet og agitere det ved stuetemperatur i 2 timer.
    3. Fjern hætten og saml filtratet løsning i en polypropylen 50 mL-centrifugerør. Tilsættes 1 mL TFA til fartøjet, lægge loft over det, og gnub i 1 min. Saml filtratet løsning i den samme centrifugerør.
    4. Fordampe TFA ved at blæse i en strøm af nitrogen gas forsigtigt indtil ca. 1 mL tyktflydende løsning er tilbage.
    5. Tilsættes 15 mL dietylaeter til den resterende løsning, cap centrifugeglasset, og der inkuberes det i en-20 ° C fryser for 2 h til natten. Den rå peptoid udfældes som hvid solid.
    6. Pellet legemet ved hjælp af en centrifuge på 4,427 x g i 10 min. Fjern hætten af centrifugeglasset og dekanteres diethylether i et bægerglas omhyggeligt uden at miste fast.
      Forsigtig: diethylether er brandfarlige organiske opløsningsmiddel. Brug venligst en diethylether sikker centrifuge.
    7. Vask solid ved at tilføje 10 mL iskold dietylaeter i centrifugen tube, som indeholder solid, loft over røret, og placere den i centrifugen. Udføre centrifugering ved 4,427 x g i 10 min. Fjern centrifugen rør fra centrifugeres og dekanteres diethylether i et bægerglas omhyggeligt uden at miste fast.
    8. Tørre solid ved forsigtigt blæser i en strøm af nitrogen gas.
    9. Der tilsættes 10 mL af HPLC-grade H2O opløses de tørrede solid. Passerer løsningen gennem en nylon sprøjte filter med porestørrelse på 0,45 µm, og saml filtratet i et polypropylen pre vejede 50 mL-centrifugerør.
    10. Shell fryse løsningen ved at placere og rotere centrifuge rør der indeholder peptoid løsning i en 12-ounce, dobbelt-stacked ekspanderet polystyren cup 1/3 fyldt med flydende kvælstof. Lyophilize den frosne løsning natten over for at give solid peptoid.
    11. Gentag ingot endnu en gang ved at opløse den solide peptoid i 10 mL af HPLC-grade H2O, shell frysning i flydende kvælstof, og lyophilizing natten over. Den resulterende peptoid er tilstrækkelig ren for Sekvensanalyse ved massespektrometri.

2. MS målinger og Sekvensanalyse

Bemærk: MS/MS eksperiment udføres i en triple-Quadrupol massespektrometer koblet til en electrospray Ionisation (ESI) kilde. Dataindsamling er kontrolleret ved hjælp af data erhvervelse software ledsaget med instrumentet. Den generelle procedure omfatter 1) udfører fuld scanning massespektrometri eksperiment og optage den masse spektrum, 2) udfører CID MS/MS eksperimentere og optagelse MS/MS-spektrum, og 3) sammenligner MS/MS spektrale data med teoretiske fragmentering ordningen forudsagt baseret på den strukturelle træk ved peptoid.

  1. Forberedelse af prøveopløsning
    1. Der afvejes 1,0-2,0 mg solidt peptoid i en 3-5 mL hætteglas. Tilføj 1 mL blandet opløsningsmiddel acetonitril og vand (ACN/H2O, 1:1, v/v) til at opløse peptoid. Dette giver stock prøveopløsningen med en koncentration på omkring 10-3 M.
    2. Overføre 20 µL af stamopløsningen i en 1,5 mL-centrifugerør og tilsæt 1 mL blandet opløsningsmiddel af ACN/H2O til at give en fortyndet prøveopløsningen af ca. 10-5 M.
    3. Fjern eventuelle mulige uopløselige partikler i prøveopløsningen fortyndes ved at udføre centrifugering ved 4,427 x g til 3 min. Transfer omkring 700 µL af den øverste del af løsningen i en anden 1,5 mL centrifugeres tube gøre peptoid MS brugsopløsning med koncentration af ca. 10-5 M.
    4. Justere koncentrationen af MS brugsopløsning baseret på den observerede signal intensitet under massespektrometri målinger.
    5. En alternativ måde at fjerne enhver mulig uopløselige partikler i prøveopløsningen fortyndes er at passere en 0,20 µm sprøjte filter prøveopløsningen og saml filtratet i et 1,5 mL-centrifugerør at gøre peptoid MS brugsopløsning ca 10-5 M.
  2. Optagelse massespektre
    1. Køre Blandet oploesningsmiddel af ACN/H2O (1:1, v/v) gennem electrospray Ionisation (ESI) kilde og oprette instrument i en standard positiv ion, fuld scanning massespektrometri mode med en masse til ladning forhold (m/z) række 100-1500.
      Bemærk:
      Typiske driftsparametre:
      ESI nål spænding, 5 kV
      Kapillar spænding, 40 V
      Tørring (nitrogen gas) gastemperatur, 200 ° C.
    2. Tilføje ca 300 µL af peptoid MS brugsopløsning (ca. 10-5 M) i en 500 µL eller en 1 mL sprøjte og tilslutte sprøjten til de ESI indløb ved hjælp af kapillar polyestersegmenter ether keton (PEEK) slanger. Placere sprøjte på sprøjten pumpe og angive strømningshastigheden 10 µL/min. til at indgyde prøveopløsningen i ESI indløbet.
    3. Tænd ESI nål spændingen til at aktivere ESI processen, og tænd derefter detektoren. Indstille skærmen i profil tilstand og m/z række 100-1500. Se en masse spektrum profil vist i vinduet profil. Peak på m/z 1,265 (vises som m/z af 1,264.6) svarer til peptoid ion eller protonated peptoid.
    4. Optage MS-spektrum for 2 min. "Metode vinduet" bruge 2 min som "operationstiden." Åbn vinduet optagelse og udfylde et passende filnavn, og begynde at optage spektret.
      Bemærk: Den resulterende masse spektrum er vist i figur 3.
    5. Optimere intensiteten af peak på m/z af 1,265. Indstil rækken m/z til 1.150-1.350 og justere den kapillære spænding mens du ser peak intensitet i mV vist i vinduet profil. For eksempel, øge kapillær spændingen til 50 V eller højere og se ændringen af peak intensitet. Den optimale peak intensitet er omkring 150-200 mV.
      Bemærk: Justere kapillær spændingen kan væsentligt ændre overfloden af visse ioner. Øge den kapillære spændingen kan øge intensiteten af peptoid ion. Dog kan et kapillarrør højspænding også fremkalde dissociation af peptoid ion i ion kilde, og mindske de observerede intensitet. Justere temperatur tørring gas kan øge intensiteten af peak på m/z 1,265, men det er mindre effektivt end justere den kapillære spænding. Hvis peak på m/z 1,265 ikke nå den optimale intensitet, justere sample koncentration (eller eksempel, dobbelt koncentration af MS brugsopløsning).
    6. Skifte instrumentet til MS/MS-tilstand. Fastsættes m/z 1,265 forløber ion og MS/MS masse rækkevidde ved m/z af 100-1400. "Metode vinduet" bruge m/z 1,265 som "Q1 første Mass" og "Q1 sidste masse" er tomt. Brug m/z 100 som "Q3 første Mass" og m/z 1.400 som "Q3 sidste Massachusetts"
      Bemærk: I MS/MS-tilstand, de første Quadrupol enhed (Q1) funktioner som en massiv filter at isolere peptoid ion som forløber ion, den anden Quadrupol enhed (Q2) er en kollision celle, og de tredje Quadrupol enhed (Q3) funktioner som en masse analyzer.
    7. Sæt kollisionen energi på 40 eV og kollision gas (argon, i dette tilfælde) pres på 1,5 mTorr.
    8. Se en masse spektrum profil vises i vinduet profil. Peak på m/z af 1,265 svarer til peptoid ion, og toppe med lavere m/z værdier repræsenterer fragmenter fra peptoid ion.
    9. Justere kollisionen energi for at optimere visningen af fragmentering spektrum. For eksempel, øge kollisionen energi til 45 eV og se ændringen af spektrum profil.
      Bemærk: generelt stigende kollisionen energi vil forbedre overfloden af fragmentioner og reducere overfloden af peptoid ion. Stigende kollision gas pres vil også øge overfloden af fragmentioner.
      Forsigtig: Ikke øge kollision gastryk ud over 2 mTorr.
    10. Optage MS/MS-spektrum for 2 min. "Metode vinduet" bruge 2 min som "operationstiden." Åbn vinduet optagelse og udfylde et passende filnavn, og begynde at optage spektret.
    11. Gentag optagelse 1 - 2 gange.
  3. Peptoid Sekvensanalyse
    Bemærk: På betingelse af CID, peptoid ion vil fragmentere på akrylamid obligationer langs peptoid rygrad til at producere en serie af N-terminale fragmenter kaldes B-ioner, og en serie af C-terminale fragmenter kaldet Y-ioner
    1. Tegner ud den kemiske struktur af den acetyleret peptoid ved at placere N-terminus på venstre side og C-terminus på højre side, og trække en stiplet linje på hver akrylamid bond til at generere en opdeling ordning, som vist i figur 2a. Tegne en proton med en stiplet cirkel til at angive afgift luftfartsselskab. Starter fra den venstre side af strukturen, placere etiketter på de stiplede linjer angiver de N-terminale fragmenter som B1, B2, B8. Startende fra højre side, placere etiketter på de stiplede linjer angiver de C-terminale fragmenter som Y1, Y2, Y8.
      Bemærk: En kemisk tegning software kan udnyttes til at tegne peptoid struktur.
    2. Forestil dig opsplitning på de 4th akrylamid bond fra venstre side, og tegne strukturerne i den N-terminale fragmenter og C-terminale fragment med ordentlig formelle afgifter, som vist i figur 2b. Placer etiketten i B4 på den N-terminale fragmenter, og Placer etiketten Y5 på den C-terminale fragmenter. Beregne m/z værdien af B4 ved opsummering af de nominelle masser af elementer i strukturen til at give en værdi af 580, og placere m/z 580 på den N-terminale fragmenter. Beregne m/z værdien af Y5 og placere m/z 685 på C-terminal fragment.
    3. Beregne m/z-værdier for alle otte B ioner og alle otte Y ioner, og samle dem i en tabel, som vist i tabel 1.
      Bemærk: M/z-værdier af fragmenterne kan beregnes ved hjælp af en kemisk tegning software.
    4. Åbn den optagede MS/MS spektrum af peptoid ved hjælp af data review software ledsaget med instrumentet. Angivet indstillingerne mærkning "Vis Ion etiketter" og Label tærsklen til 3%. Dette skaber et MS/MS spektrum med m/z værdier mærket på toppene.
    5. Eksportere MS/MS spektrale data som en tekstfil i CSV-format og rekonstruere spektrum ved hjælp af edb-software. Placer m/z-værdier på toppene. Den resulterende MS/MS-spektrum er vist i figur 4.
      Bemærk: Nogle massespektrometre er udstyret med databehandling software i stand til at generere MS/MS-spektrum. I dette tilfælde er dataeksport MS/MS spektrale ikke nødvendigt.
    6. Tildele m/z værdierne vist på MS/MS-spektrum til dem vist i tabel 1 for at identificere de tilsvarende B - og Y-ioner. For eksempel, peak på m/z 580 er identificeret som B4-ion og m/z 685 er identificeret som Y5-ion. Label toppe med tilsvarende B og Y symboler på spektret, som vist i figur 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strukturen i en 9-mer peptoid med N-terminalen acetylation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, er vist i figur 1. Peptoid blev syntetiseret manuelt i en fritted polypropylen reaktion fartøj via faste fase tilgang. Rink akrylamid harpiks (0.047 mmol, 84 mg med indlæsning 0,56 mmol/g) bruges som solid støtte til at give peptoid med en amidated C-terminus. Peptoid kæden er bygget af flere cyklusser af monomere tilsætning. Hver monomer tilføjelse cyklus indebærer to reaktioner trin, bromoacetylation og forskydning. Bromoacetylation er opnået ved at tilføje 0,8 M BMA løsning og 0,8 M DIC løsning og reaktionen tager 20 min. Forskydningen er opnået ved at tilføje 1,0 M Amin løsning til acetylation produkt og reaktion tager 1 h. Nielsen-terminal acetylation blev udført ved at tilføje en cocktail løsning indeholdende 92 µL af eddikesyreanhydrid, 43,5 µL af DIPEA og 2 mL DMF. Peptoid er kløvet fra harpiks ved at tilføje en cocktail løsning indeholdende 3,8 mL TFA, 100 µL af TIPS og 100 µL HPLC-grade H2O og reaktion tager 2 h. TFA er fjernet i hætten af blæser i en strøm af nitrogen gas indtil ca. 1 mL tyktflydende løsning der er tilbage. Produktets peptoid udfældes i diethylether og er isoleret ved centrifugering, og dette er efterfulgt af to gentagelser af ingot. Den resulterende peptoid er tilstrækkelig ren for MS/MS analyse.

Den forudsagte fragmentering ordning for peptoid er vist i figur 2a, hvor proton i den stiplede cirkel viser "mobil proton", der ville fremkalde peptoid fragmentering under CID eksperimentet. Peptoid ion fragmenter på akrylamid obligationer langs peptoid rygrad, som fragmentering websteder er angivet ved de stiplede linjer. De N-terminale fragmenter er mærket som B-type ioner og C-terminale fragmenter er mærket som Y-type ioner. Hvis opsplitningen sker på alle tilgængelige akrylamid obligationer, ialt otte N-terminale fragmenter, B1 -B8, og ialt otte C-terminale fragmenter, Y1 Y8, ville danne. Hvert fragment har en tilsvarende m/z-værdi, som beregnes ved at lægge op de nominelle masserne af alle elementer i fragmentet. Som et eksempel, strukturer og de tilsvarende m/z-værdier (nominel masserne) B4-ion og Y5-ion er vist i figur 2b. Den kemiske formel for B4 ion er C31H42N5O6+, og den nominelle masse beregnes af ligningen (31 x 12) + (42 x 1) + (5 x 14) + (6 x 16) = 580. Da B4 er en enkeltvis ladede ion, m/z-værdien vil være 580/1 = 580. I figur 2b, strukturen i B4-ion er en forenklet form (Se diskussion sektionen for detaljer). Beregnede m/z-værdier (nominel masse) af alle fragmentioner fra B1-B8 og Y1-Y8 er givet i tabel 1.

En masse analyse omfatter to processer. Den første proces er at udføre en fuld scanning massespektrometri analyse af eksemplet peptoid. Dette resultat indikerer hvorvidt prøven indeholder en målelig mængde af peptoid og den relative renhed af prøven. Fuld scanning masse spektrum peptoid ion er vist i figur 3, hvor m/z-værdier er afrundet til nærmeste hele tal. Peak på m/z 1,265 svarer til protonated peptoid, og peak på m/z 1,287 svarer til natrium ion addukt af peptoid. De to toppe på m/z 633 og m/z 644 svarer til dobbelt protonated og blandet protonated-sodiated peptoids, henholdsvis. Disse resultater tyder på, at peptoid prøven er tilstrækkelig ren for at udføre MS/MS analyse.

Den anden proces i masse analyse er at udføre MS/MS eksperimentet på protonated peptoid på m/z 1,265. Denne proces omfatter isolere forløber peptoid ion af første Quadrupol enhed, fragmentering peptoid ion i CID, og sortering fragmentioner ifølge deres m/z værdier af den tredje Quadrupol enhed. Den resulterende spektrum er vist i figur 4, hvor m/z-værdier er afrundet til nærmeste hele tal. Peak på m/z 1,265 svarer til protonated peptoid. De andre bjergtoppe på lavere m/z-værdier svarer til fragmentioner fra peptoid ion. Fragmentioner tildeles som enten B-ion eller Y-ion ved at sammenligne deres m/z-værdier med de forudsagte (vist i tabel 1) baseret på ordningen peptoid fragmentering (vist i figur 2). Syv Y-ioner (Y2 Y8) og syv B-ioner (B1 B7) dannes med observerbare mængder. Bemærk at overfloden af Y-ioner er meget højere end i de fleste B-ioner.

Figure 1
Figur 1: kemiske struktur af peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Peptoid blev syntetiseret manuelt via den faste fase tilgang. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Opsplitning ordning for protonated peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Peptoid ion fragmenter på akrylamid obligationer langs peptoid rygrad til at producere en serie af N-terminale fragmenter kaldes B-ioner og en serie af C-terminale fragmenter kaldet Y-ioner. a) forudsagde fragmentering ordningen for protonated peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. De stiplede linjer angiver fragmentering steder, symboler B1 -B8 angiver de N-terminale fragmenter, og symboler Y1 Y8 angiver de C-terminale fragmenter; b) prøve opsplitning med skematisk strukturer. Strukturerne Vis B4-ion og Y5-ion med tilsvarende m/z værdier, henholdsvis. M/z-værdierne beregnes ved opsummering af de nominelle masser af elementer i strukturer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Fuld scanning masse spektrum af peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, hvor m/z-værdier er afrundet til nærmeste hele tal. Peak på m/z 1,265 svarer til peptoid ion, [P + H]+, og peak på m/z 1,287 svarer til natrium ion addukt i peptoid, [P + Na]+. De to toppe på m/z 633 og m/z 644 svarer til dobbelt ladede peptoid, [P + 2 H]2 + og [P + H + Na]2 +, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: MS/MS spektrum af protonated peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2 mærket med tildelte fragmenter. Peak på m/z 1,265 svarer til protonated peptoid, [P + H]+, og toppe med lavere m/z-værdier svarer til fragmentioner. B - og Y-ioner er tildelt ved at sammenligne deres m/z-værdier med de beregnede baseret på den opsplitning af peptoid ion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

B-ion m/z værdi (nominel masse) Y-ion m/z værdi (nominel masse)
B1 143 Y1 133
B2 304 Y2 294
B3 419 Y3 409
B4 580 Y4 570
B5 695 Y5 685
B6 856 Y6 846
B7 971 Y7 961
B8 1132 Y8 1122

Tabel 1: Teoretisk m/z-værdier beregnet på grundlag af ordningen forudsagte opsplitning af protonated peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme) 4 -NH 2 . B-ion og Y-ion angiver de tilsvarende fragmentioner N-terminus og C-terminus, henholdsvis. Hver m/z værdi (nominel masse) beregnes ved at lægge op de nominelle masserne af elementerne i dette fragment ion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, er blevet syntetiseret ved hjælp af protokollen præsenteret. Apparatet sammenfatning indebærer en sprøjte-lignende polypropylen fast-fase reaktion fartøj og et rysteapparat. Reaktion fartøjer er kommercielt tilgængelige og lave omkostninger. Omrøreren er en fælles apparater i kemi laboratorier. Med brugen af en sprøjte-lignende reaktion fartøj, kan løsninger trukket ind og skubbet ud af fartøjet ved at manuelt flytte stemplet. Denne teknik giver mulighed for monomeren tilsætning og harpiks kavalergang reaktioner at forekomme i én enkelt reaktion fartøj og eliminerer trin af overførsel af harpiks-bundet mellemprodukt i et andet fartøj til kavalergang. Denne teknik også eliminerer behovet for en vakuum ekstraktion enhed fjerne løsninger fra reaktion fartøj. Vakuum ekstraktion er almindeligt anvendt i manuel peptoid syntese, der er blevet påvist af andre forskere19,20. Grundigt vaske harpiks mellem reaktion trin er afgørende for at opnå en høj renhed produkt. Et potentielt problem er tilstopning af fritte i reaktion fartøj efter flere cyklusser af monomere tilsætning. En løsning på dette problem er at Ionbyttermaterialet overføres til en ny reaktion fartøj og at fortsætte processen, syntese. Denne syntese teknik fungerer godt for peptoids til 10-12 restkoncentrationer. For længere peptoids bliver det svært at fjerne løsninger fra reaktion fartøj ved at skubbe stemplet. I dette tilfælde kan en vakuum ekstraktion enhed udnyttes til at fjerne løsninger fra reaktion skibets (stemplet bør erstattes af en prop). I den sammenfattende protokol, er den rå vare renset af fældningen peptoid i diethylether. Nogle kortere og stærkt polære peptoids kan ikke danne bundfald i diethylether. I dette tilfælde, kan peptoid være isoleret ved at opløse den rå vare i 10% eddikesyre og vask løsning med diethylether flere gange, som er efterfulgt af ingot. Nogle meget hydrofobe peptoids kan også ikke danne bundfald i diethylether. I dette tilfælde fordampe dietylaeter og bruge en HPLC med omvendt fase til at rense peptoid produkt.

I denne undersøgelse, peptoid ion er genereret af ESI og MS/MS forsøget er udført i en triple-Quadrupol massespektrometer. På grund af ion isolation kapacitet af den første Quadrupol enhed infunderes prøven direkte ind i de ESI kilde, hvilket eliminerer behovet for væskekromatografi (LC). Enkeltvis kan protonated peptoids også let oprettes ved hjælp af matrix assisted laser desorption-ionisering (MALDI) teknik. MS/MS eksperimenter kan udføres ved hjælp af andre typer af massespektrometre samt, såsom en ion-fælde spektrometer. Selv om den relative forekomst af fragmentioner vises muligvis anderledes, hvis MS/MS-spektre registreres ved hjælp af forskellige instrumenter, bør de kvalitative spektrale beskrivere lignende. Den relative forekomst af forskellige fragmentioner er generelt meget følsomme over for parametrene instrument. Ændre kollisionen energi og kollision gastryk kan ændre den relative forekomst af fragmentioner betydeligt. For eksempel øge kollisionen energi eller stigende kollision gas pres vil fremme fragmentering, og som et resultat, overfloden af peptoid forløber ion vil falde og overflod af fragmentioner vil øge. Denne undersøgelse fokuserer på enkeltvis ladede peptoids. Længden af peptoids studerede ved hjælp af denne protokol er begrænset af rækken m/z af de massespektrometer. For et massespektrometer med masseinterval op til m/z 2.000 bør m/z-værdier af de ladede peptoids være lavere end den øvre grænse. Hvis peptoids har en højere end grænsen for massespektrometer, molekylmasse en dobbelt protonated peptoid kan bruges som forløber ion. En dobbelt ladede peptoid ville have en m/z-værdi, som er cirka halvdelen af de enkeltvis opladet.

Peptoid præsenteres i dette værk indeholder en grundlæggende rester med en primær Amin som gruppen side-kæden. Den grundlæggende rest fungerer som et protonation websted, som vil øge ionisering effektiviteten i ESI kilden til den massespektrometer. Mindre polære (flere hydrofobe) peptoids har dårlig ionisering effektivitet i ESI kilden. I dette tilfælde kan en atmosfærisk tryk kemisk ionisering (APCI) kilde udnyttes til at ionisere peptoids. Betingelser CID fragment peptoid ioner hovedsagelig på akrylamid obligationer til at producere en serie af N-terminale fragmenter og en serie af C-terminale fragmenter. Hvis afgift carrier, proton, bosat på de N-terminale fragmenter, formen B-ioner. Ellers, formen Y-ioner. Figur 2 viser en struktur af B4-ion. Dette er en forenklet struktur, som hjælper til at beregne m/z-værdi. De faktiske B-ioner er sandsynligvis dannet i en cyklisk struktur, som en fem-leddede oxazolone ring23. Ikke alle forudsagt fragmentioner er dannet i den massespektrometer og observeret i masse spektrum. Effektiviteten af danner positivt opkrævet fragmentioner bestemmes i vid udstrækning af fragmentet gas-fase baser (eller proton affinitet). Meget grundlæggende fragmenter har en høj chance for at danne positivt ladede ioner og skal overholdes i de massespektre. Generelt giver observere mindst 70% af de forventede fragmentioner en rimelig høj tillid til at forudsige sekvensen af en peptoid. I at designe peptoids til Sekvensanalyse ved massespektrometri, er det vigtigt at placere rester med polar sidekæde grupper, såsom alkoxy grupper, på forskellige steder langs peptoid kæde.

For mest enkeltvis ladede peptoids med N-terminalen acetylation viser Y-ioner meget højere overflod end B-ioner21,23. Som vist i figur 3, undtagen, B1-ion, intensiteten af toppene svarende til B-ioner er meget lavere end de af Y-ioner. For peptoids med gratis N-terminale amino grupper, er højere overflod af Y-ioner over B-ioner blevet observeret samt21. Favorisere Y-ioner tyder på, at charge-carrier proton foretrækker at opholde sig på de C-terminale fragmenter, som skyldes de højere proton affinitet af C-terminale fragmenter23. Ud over dannelsen af B - og Y-ioner, sekundære fragmentioner forbundet med vandtab eller labile sidekæde gruppe tab er ofte observeret i protonated peptoids. Disse sekundære fragmentioner ofte vises som en række følgesvend toppe ved siden af toppene af de primære fragmentioner (især Y-ioner), som kan identificeres ved at fratrække massen af gruppen labile side-kæden fra massen af den tilsvarende primære fragmentioner.

Denne protokol demonstrerer, hvordan du manuelt syntetisere en oligo-peptoid og analysere monomer sekvens af en peptoid ved hjælp af en tandem massespektrometri metode. Denne sammenfattende protokol kan let vedtages i en kemi undervisning laboratorium til at uddanne nye forskere i peptoid syntese. Denne massespektrometri-protokollen fungerer som et effektivt redskab, ikke blot at bekræfte identiteten af peptoid, men også til at karakterisere de strukturelle træk af peptoid i forhold til de observerede opsplitning mønstre. Fremtidige ansøgninger kan indebære udvikle en korrelation kort forbinder peptoid struktur og fragmentering mønster gennem syntese og massespektrometri analyse af et bibliotek af forskellige peptoids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Mr. Michael Connolly og Dr. Ronald Zuckermann (The molekylære støberi, Lawrence Berkeley National Laboratory) for teknik opbakning i peptoid syntese. Vi anerkender støtten fra National Science Foundation (CHE-1301505). Alle massespektrometri eksperimenter blev udført på kemi masse massespektrometri facilitet på universitetet i Stillehavet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L Agilent Technologies Inc. The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.
Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software Varian Inc. The software is a part of the Varian 320L package
Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD Fisher Scientific International Inc. 14-400-126
Hermle Centrifuge, Model Z 206 A Hermle Labortechnik GmbH
Solid phase reaction vessel, 10 mL Torviq SF-1000
Pressure caps for reaction vessels Torviq PC-SF
Syringe filters, pore size 0.2 μm Fisher Scientific Inc. 03-391-3B
Syringe filters, pore size 0.45 μm Fisher Scientific Inc. 03-391-3A
Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL VWR International, LLC. 490001-626
Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL VWR International, LLC. 490001-620
ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 CambridgeSoft Corporation CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.
Styrofoam cup, 12 Oz Common Supermarket
Rink amide resin Chem-Impex International, Inc. 10619
Piperidine Chem-Impex International, Inc. 02351 Highly toxic
N, N’-diisopropylcarbodiimide Chem-Impex International, Inc. 00110 Highly toxic
Bromoacetic acid Chem-Impex International, Inc. 26843 Highly toxic
2-Phenylethylamine VWR International, LLC. EM8.07334.0250
2-Methyoxyethylamine Sigma-Aldrich Co. LLC. 241067
N-Boc-ethylenediamine VWR International, LLC. AAAL19947-06
Acetic anhydride Sigma-Aldrich Co. LLC. 252845
N, N-dimethylformamide VWR International, LLC. BDH1117-4LG Further distillation before use
N, N-diisopropylethylamine Chem-Impex International, Inc. 00141
Triisopropylsilane Chem-Impex International, Inc. 01966
Trifluoroacetic acid Chem-Impex International, Inc. 00289 Highly toxic
Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System Millipore Corporation ZMQP60001 For generating HPLC grade water
HPLC-grade Water Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System
Methanol Pharmco-Aaper 339USP/NF HPLC grade
Acetonitrile Fisher Scientific International, Inc. A998-4 HPLC grade
Diethyl ether VWR International, LLC. BDH1121-19L Further distillation before use
Dichloromethane VWR International, LLC. BDH1113-19L Further distillation before use
Nitrogen gas Fresno Oxygen/Barnes Supply NIT 50-C-F Ultra high purity, 99.9995%
Argon gas Fresno Oxygen/Barnes Supply ARG 50-C-F Ultra high purity, 99.9995%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
  2. Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
  3. Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  4. Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
  5. Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
  6. Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
  7. Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
  8. Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
  9. Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
  10. Lutz, J. -F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), Washington, DC. 628 (2013).
  11. Altuntas, E., Schubert, U. S. "Polymeromics": Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
  12. Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
  13. Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
  14. Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
  15. Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
  16. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
  17. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
  18. Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
  19. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
  20. Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
  21. Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
  22. Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
  23. Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).

Tags

Kemi sag 132 Peptoid N-alkylerede glycin syntese massespektrometri Sekvensanalyse fragmentering mønster Y-ion B-ion
Syntese og massespektrometri analyse af Oligo-peptoids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, J., Mann, Y. S., Zhang, Y.,… More

Ren, J., Mann, Y. S., Zhang, Y., Browne, M. D. Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids. J. Vis. Exp. (132), e56652, doi:10.3791/56652 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter