Summary
Протокол описан для ручной синтеза oligo-peptoids следуют анализ последовательности по масс-спектрометрии.
Abstract
Peptoids являются контролируемой последовательности пептид подражая олигомеров, состоящей из N-алкилированные глицин единиц. Среди многих потенциальных приложений было подумал peptoids как тип хранения молекулярной информации. Масс-спектрометрия анализ рассматривался метод выбора для последовательности peptoids. Peptoids может быть синтезирован через твердой фазы химии, используя повторяющийся цикл реакции двухэтапный. Здесь мы представляем метод вручную синтезировать oligo-peptoids и анализировать последовательность peptoids, с использованием методов тандемные масс-спектрометрия (МС/МС). Образец peptoid является nonamer, состоящие из чередующихся N-(2-methyloxyethyl) глицин (Nme) и N-(2-phenylethyl) глицин (Npe), а также N-(2-аминоэтил) глицин (НАО) в N-terminus. Последовательность формула peptoid является Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, где Ac ацетильной группы. Синтез происходит в коммерчески доступных твердофазный реакции судна. Каток Амида смола используется в качестве твердой поддержки приносить peptoid с амидной группой в C-terminus. Полученный продукт peptoid подвергается последовательность анализа с помощью тройной квадрупольного масс-спектрометра в сочетании с источником ионизации электроспрей. МС/МС измерение производит спектр фрагмент ионов в результате диссоциации заряженных peptoid. Ионы фрагмент сортируются основаны на значениях коэффициента их масса заряд (m/z). Значения m/z ионов фрагмент сравниваются номинальной массы ионов теоретически предсказанных фрагмент, по схеме peptoid фрагментации. Анализ генерирует шаблон фрагментации взимается peptoid. Структуре фрагментации связан на мономера последовательность нейтральных peptoid. В этой связи МС анализа считывает последовательность информации peptoids.
Introduction
Peptoids — класс контролируемой последовательности полимеров с структур позвоночника, имитирует структуру пептиды. Peptoids могут быть синтезированы из различных аминов, который позволяет peptoids выставить высоко настраиваемых свойств1,2. Peptoids были использованы как молекулярные модели для биофизических исследований, считается терапевтических агентов и разработана как лигандов для белки3,4,5,6. Peptoids были разработаны в различных биологически активных соединений, например противообрастающих и антитела подражательный материалы, противомикробных препаратов и фермента ингибиторы7,8,9. С весьма упорядоченный и перестраиваемые природой peptoids также было подумал как тип молекулярной информации хранения10. Открытие этих различных приложений требует разработки эффективных аналитических методов охарактеризовать последовательность и структура peptoids. Тандем массы на основе спектрометрии методы показали обещание как метод выбора для анализа свойства последовательности контролируемой последовательности полимеров, включая, peptoids11,12,13 14,15. Однако систематические исследования сопоставление моделей фрагментации Ион peptoid, результатом массовых спектрометрии исследования и структурной информации peptoids весьма ограничены.
Peptoids могут быть легко синтезированы методом твердой фазы. Хорошо разработанный метод предполагает итерации двухэтапный мономера дополнением цикла16,17. В каждом цикле сложения смола прыгните Амин ацетилированные haloacetic кислоты (как правило, bromoacetic кислота, BMA), и это сопровождается перемещением реакции с Первичные амины. Хотя протоколы автоматизированного синтеза регулярно применялись для синтеза peptoid, peptoids может быть синтезирован вручную с отличные урожаи в стандартной химии лабораторные16,18,19, 20.
Наша лаборатория приняла метод ручной peptoid синтеза и упростить аппарат используемых в существующих методах. Ранее мы изучили фрагментации моделей серии peptoids с помощью МС/МС методы21,22,23. Наши результаты показывают, что peptoids производят характерные образовавшиеся, когда они подвергаются столкновения индуцированной диссоциации (CID)21,23 или захват электронов диссоциации (ECD)22 экспериментов. В этой статье мы демонстрируем, как oligo-peptoids может быть синтезирован в стандартной химическую лабораторию, как выполнять CID эксперименты с помощью тройной квадрупольного масс-спектрометра и как анализировать спектральные данные. Peptoid быть синтезированы и характеризуется является nonamer с N-терминальный ацетилирования и C-терминала amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Структура peptoid показано на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. синтез Peptoid
Примечание: Синтез начинается с активации смолы, отек смолы и удаление группы защиты. Это сопровождается растущей цепи peptoid на смолы через повторяющиеся мономера Добавление циклов. Первый мономера, в сочетании со смолой является остатков C-терминала. Peptoid удлиненное от C-terminus до N-го. После достижения желаемого peptoid последовательность, смола расщепляется покинуть и очищенный продукт peptoid.
- Подготовка реагентов
Примечание: Жидких реагентов измеряются с помощью микропипеткой и твердых реагентов измеряются с помощью аналитического баланса.- Смешайте 6,2 мл n, N'-diisopropylcarbodiimide (ОПК) и 43,8 мл n, N-Диметилформамид (DMF) подготовить 0,8 М DIC/DMF решения.
- Растворите 5.56 g 50,0 мл ДМФ приготовить раствор 0.8 М BMA/DMF БМА.
- Смешайте 2 мл пиперидина (Pip) и 8 мл DMF для достижения решения Pip/DMF 20%.
- Распустить 1.9 мл Npe 13.1 мл DMF для достижения 1.0 M Npe/DMF.
- Распустить 1,3 мл Nme в 13,7 мл DMF для достижения 1.0 M Nme/DMF.
- Распустить 0,32 мл НАО в 2 мл DMF для достижения 1.0 M НАО/DMF.
Внимание: Большинство химических веществ, используемых в синтезе являются опасными. Trifluoroacetic кислоты (ТФК), ОПК, Pip и BMA опасны для кожи, глаз и дыхательных путей. DMF и Дихлорметан (DCM) являются канцерогенами. Все реакции должна быть выполнена в зонта и должны использоваться надлежащие средства личной защиты. Пожалуйста, проверьте лист данным по безопасности материала (MSDS) всех химических веществ, используемых в синтезе.
- Активация смолы
- Отмерьте 84 мг Ринк Амида смолы (смолы, 0,047 ммоль, загрузки 0.56 ммоль/г) и добавить его в 10 мл полипропиленовые твердофазный реакции судна. Вставьте поршень в судна.
- Добавить 2 мл ДМФ в реакционный сосуд и крышка судна с максимального давления. Место судна на шейкер и агитировать судна при комнатной температуре на угол движения около 12 градусов и 385 колебания/мин за 30 мин сливной решение в контейнер для отходов, сняв крышку и толкает поршень реакции судна.
- Добавить 2 мл 20% раствора Pip/DMF судна и крышка судна. Агитировать на шейкер для 2 мин и слейте раствор в контейнер для отходов.
- Добавить 2 мл 20% раствора Pip/DMF судна, крышка судна и агитировать его при комнатной температуре на 12 мин удалить колпачок и слейте раствор в контейнер для отходов.
- Вымойте смолы, добавив 1 мл ДМФ, укупорочные судна и агитировать судна за 1 мин снимите колпачок и слейте раствор, нажимая на поршень. Вымойте смолы с ДМФ 4 еще раз.
- Мономер сложения и N-терминальный ацетилирования
Примечание: Каждый мономер дополнением цикла включает в себя две реакции шаги, bromoacetylation и перемещения.- Осуществляют первого цикла дополнение мономерной форме Nme-смолы.
- Выполните bromoacetylation реакции. Смешайте 1 мл раствора 0.8 М BMA/DMF и 1 мл раствора 0.8 М DIC/DMF в стакан. Передача смеси реакционный сосуд, содержащий смолы и крышка судна. Место судна на шейкер и агитировать его при комнатной температуре 20 мин удалить колпачок и слейте раствор в контейнер для отходов.
- Вымойте смолы, добавив 1 мл ДМФ, укупорки судна, агитируя за 1 мин и слива раствора, нажимая на поршень. Вымойте смолы, добавив 1 мл DCM, агитируя судна за 1 мин и слив решение. Вымойте смолы с DCM еще раз и затем промойте его с ДМФ дважды.
- Выполните смещение реакции. Добавить 1 мл раствора 1,0 М Nme/DMF, крышка судна, агитировать судна при комнатной температуре на 60 мин удалить колпачок и слейте раствор, нажимая на поршень.
- Вымойте смолы, добавив 1 мл ДМФ, агитируя судна за 1 мин и слива раствора, нажимая на поршень. Вымойте смолы путем рисования в 1 мл DCM, агитирует за 1 мин и слив решение. Вымойте DCM еще раз, после стирки с ДМФ дважды.
- Повторите мономера Добавление циклов от шагов 1.3.2 для 1.3.5 сформировать Nae-(Npe-Nme)4-смолы. Когда повторив шаг перемещения реакции (1.3.4), используйте решение конкретных Амин peptoid последовательности.
Примечание: Peptoid цепь удлиненное от C-terminus до N-го с C-терминала остатков связывается со смолой. - Выполнения N-терминальный ацетилирования сформировать Ac-Nae-(Npe-Nme)4-смолы.
- Mix 92 мкл на ангидрид уксусной кислоты, 43,5 мкл N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) и 2 мл ДМФ в стакан сделать около 2 мл ацетилирования коктейль.
- Добавить 2 мл ацетилирования коктейль в сосуд, содержащий смолы, крышка судна и агитировать его при комнатной температуре за 60 мин снимите колпачок и слейте раствор, нажимая на поршень.
- Вымойте смолы, добавив 1 мл ДМФ, агитируя судна за 1 мин и слива раствора, нажимая на поршень. Вымойте смолы, добавив 1 мл DCM, агитируя судна за 1 мин и слив решение. Повторите, мытья смолы с DCM еще раз, а затем вымыть с ДМФ вдвое больше.
- Вымойте смолы, добавив 1 мл DCM, агитируя судна за 1 мин и слива раствора, нажимая на поршень. Повторите Стиральная с DCM дважды. Снимите крышку и дайте смоле просушите в реакционный сосуд за 10 мин.
- Расщепление и очистки
- Смешайте 3.8 мл TFA, 100 мкл triisopropylsilane (советы) и 100 мкл ВЭЖХ класса H2O в стакан, чтобы сделать 4 мл декольте коктейль.
- Добавить 4 мл свежеприготовленные декольте коктейль на судно, содержащие смолы, крышка судна и агитировать его при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Снимите крышку и сбора фильтрата раствора в 50 мл полипропиленовые пластиковых пробирок. Добавьте 1 mL TFA на судно, крышка его и агитировать за 1 мин сбор фильтрата раствора трубу же центрифуги.
- Испарится TFA, дует в потоке газа азота осторожно до тех пор, пока около 1 мл вязкий раствор оставляется.
- Добавьте оставшийся раствор 15 мл диэтиловым эфиром, крышка пластиковых пробирок и инкубировать в морозильной камере-20 ° C на 2 ч для ночевки. Сырой peptoid осаждает как белые твердые.
- Пелле твердого тела с помощью центрифуги на 4427 g x 10 мин удалить колпачок пластиковых пробирок и сцеживаться диэтиловый эфир в стакан тщательно без потери твердого тела.
Предупреждение: диэтиловый эфир является горючих органических растворителей. Пожалуйста, используйте центрифугу безопасные диэтиловый эфир. - Мыть твердые путем добавления 10 мл ледяной диэтиловый эфир в центрифуге трубки, содержащих твердые, укупорочные трубки и поместив его в центрифуге. Выполнение центрифугирования в 4427 x g 10 минут удалить центрифуги трубки из центрифуги и сцеживаться диэтиловый эфир в стакан тщательно без потери твердого тела.
- Насухо твердых осторожно дуть в потоке газа азота.
- Добавьте 10 мл ВЭЖХ класса H2O для растворения сухих твердых. Передайте решение через фильтр шприц нейлон с порами размером 0,45 мкм и сбора фильтрата в предварительно взвешенный 50 мл полипропиленовые центрифуги.
- Оболочки заморозить решение путем размещения и вращающейся центрифуге трубки, содержащий решение peptoid в 12-унция, двойной штабелироваться расширенного пенополистирола чашку 1/3 заполнены с жидким азотом. Lyophilize замороженные решение на ночь приносить твердых peptoid.
- Повторите лиофилизации еще один раз путем растворения твердых peptoid 10 мл ВЭЖХ класса H2O, shell замораживание в жидком азоте и лиофилизации ночлега. Полученный peptoid достаточно чистый для анализа последовательностей по масс-спектрометрии.
2. г-жа измерения и анализа последовательности
Примечание: МС/МС эксперимента осуществляется в тройной квадрупольного масс-спектрометра в сочетании с источником ионизации (ESI) электроспрей. Сбор данных управляется с помощью программного обеспечения сбора данных, вместе с документом. Общая процедура включает в себя 1) выполняет полное сканирование масс-спектрометрии эксперимент и запись массовых спектр, 2) выполнение CID МС/МС экспериментировать и записи МС/МС спектра и 3) сравнения спектральных данных МС/МС с теоретической Фрагментация схема предсказать на основе структурной особенностью peptoid.
- Подготовка примера решения
- Весят из твердых peptoid 1,0-2,0 мг в 3-5 мл флаконе стекла. Добавьте смешанные 1 мл растворителя, ацетонитриле и воды (АКС/H2O, 1:1, v/v) растворяют peptoid. Это дает биржевые образец решения с концентрацией около 10-3 М.
- Перевести 20 мкл Стоковый раствор в 1,5 мл пластиковых пробирок и добавьте 1 mL смешанного растворителя АКС/H2O приносить образец разбавленный раствор около 10-5 М.
- Удалить любые возможные нерастворимых частиц в разреженных образец решения, выполняя центрифугирования в 4427 g x 3 мин передачи около 700 мкл в верхней части решения в другой центрифуге 1,5 мл трубку сделать рабочий раствор с peptoid MS концентрация около 10-5 М.
- Отрегулируйте концентрация рабочего раствора МС, основанный на интенсивности наблюдаемых сигнала во время измерения масс-спектрометрии.
- Альтернативный способ для удаления любых возможных нерастворимых частиц в разреженных пример решения является пример решения через фильтр шприц 0,20 мкм и сбора фильтрата в 1,5 мл пластиковых пробирок сделать peptoid MS рабочего раствора около 10-5 М.
- Запись массы спектров
- Запустите смешанного растворителя АКС/H2O (1:1, v/v) через источник ионизации (ESI) электроспрей и настройка инструмента в стандартной положительных ионов, режим полного сканирования масс-спектрометрии с масса заряд (m/z) диапазон 100-1500.
Примечание:
Типичные рабочие параметры:
ESI иглы напряжения, 5 кв
Капиллярный напряжения, 40 V
Сушка газа (азот) температуры, 200 ° C. - Добавьте примерно 300 мкл рабочего раствора peptoid MS (около 10-5 М) в 500 мкл или 1 мл шприц и соедините шприц ESI входе с помощью капиллярного полиэфиром эфира кетон (PEEK) трубы. Поместите шприца шприцевый насос и задайте скорость потока в 10 мкл/мин настаиваться в примере решения в входе ESI.
- Включите ESI иглы напряжения для активации процесса еси и затем включите детектор. Установите дисплей в режим и m/z диапазон 100-1500. Просмотр профиля массовых спектр показан в окне профиля. Пик на m/z 1265 (отображается как m/z 1,264.6) соответствует peptoid Ион или протонированных peptoid.
- Запись MS спектра на 2 мин. В окне «метод» используйте 2 мин как «время выполнения». Открыть окно запись и введите имя нужного файла и начать записывать спектра.
Примечание: Результате массовых спектр показан на рисунке 3. - Оптимизируйте интенсивность пик на m/z 1265. Установите диапазон m/z до 1150-1350 и отрегулировать капиллярного напряжения во время просмотра пика интенсивности в МВ, показываемый в окне профиля. Например, увеличение капиллярного напряжения до 50 V или выше и просматривать изменения пиковой интенсивности. Оптимальное пика интенсивности составляет около 150-200 mV.
Примечание: Регулировка капиллярного напряжения могут существенно изменить обилие некоторых ионов. Увеличение капиллярного напряжения могут повысить интенсивность peptoid иона. Однако высоковольтных капилляров может также побудить диссоциации peptoid иона в источнике ионов и уменьшить интенсивность наблюдаемых. Регуляция температуры сушки газа может повысить интенсивность пик на m/z 1265, но это менее эффективно, чем регулировка капиллярного напряжения. Если пик на m/z 1265 не достигают оптимальной интенсивности, отрегулируйте концентрацию образца (или например, двойной концентрация рабочего раствора MS). - Переключите прибор в режим МС/МС. Ион прекурсоров на m/z 1265 и МС/МС массовые ассортимент на m/z 100-1400. В окне «метод», использовать m/z 1265 как «Первый массы Q1» и оставить «Последний массы Q1» пустым. Использовать m/z 100 как «Q3 Первая месса» и m/z 1400 как «Последний массы Q3»
Примечание: В режиме MS/MS, первый блок (Q1) функции квадрупольного как массового фильтр, чтобы изолировать peptoid Ион как прекурсор Ион, второй блок четырехполюсника (Q2) является ячейку столкновения и третий блок (Q3) функции квадрупольного масс-анализатор. - Набор энергии столкновения на 40 eV и столкновения газов (аргон, в данном случае) давление в 1,5 mTorr.
- Просмотр профиля массовых спектр отображаются в окне профиля. Пик на m/z 1265 соответствует Ион peptoid, и вершины с более низкими значениями m/z представляют собой фрагменты из peptoid иона.
- Отрегулируйте энергию столкновения для оптимизации отображения спектра фрагментации. Например увеличить энергию столкновения до 45 eV и просматривать изменения спектра профиля.
Примечание: В целом, увеличение энергии столкновения повысит обилие фрагмент ионов и уменьшить обилием ионная peptoid. Увеличение давления газа столкновения также укрепит обилие фрагмент ионов.
Предупреждение: Не увеличивают давление газа столкновения за 2 mTorr. - Запись МС/МС спектра на 2 мин. В окне «метод», используйте 2 мин как «время выполнения». Открыть окно запись и введите имя нужного файла и начать записывать спектра.
- Повторите запись 1 - 2 раза.
- Запустите смешанного растворителя АКС/H2O (1:1, v/v) через источник ионизации (ESI) электроспрей и настройка инструмента в стандартной положительных ионов, режим полного сканирования масс-спектрометрии с масса заряд (m/z) диапазон 100-1500.
- Анализ последовательности Peptoid
Примечание: При условии CID, Ион peptoid будет фрагмент на облигации Амида вдоль позвоночника peptoid производить серию N-терминальный фрагментов называется B-ионов и серия C-терминала фрагментов называется Y-ионов- Вытянуть химической структуры ацетилированный peptoid, поместив N-го на левой стороне и C-конечная на правой стороне и рисование пунктирной линии на каждом Амида Бонд сформировать схему фрагментации, как показано на рисунке 2А. Нарисуйте протона с пунктирной окружности для обозначения обязанности перевозчика. Начиная с левой стороны структуры, место этикетки на пунктирной линии для обозначения фрагментов N-стержня как B1, B2B8. Начиная с правой стороны, место этикетки на пунктирной линии для обозначения фрагментов C-терминала как Y1, Y2, Y8.
Примечание: Химические рисунок программное обеспечение могут быть использованы для рисования структуры peptoid. - Представьте себе фрагментации на 4й Амида Бонд с левой стороны и нарисуйте структуры N-концевого фрагмента и фрагмент C-терминала с надлежащего официального обвинения, как показано на рисунке 2b. Поместить ярлык B4 на N-концевого фрагмента и поместите метку Y5 на C-терминала фрагмент. Вычислить значение m/z B4 путем суммирования номинальной массы элементов в структуре давать значение 580 и место m/z 580 на N-концевого фрагмента. Вычислить значение Y5 m/z и место m/z 685 на C-терминала фрагмент.
- Рассчитать значения m/z для всех восьми B ионов и все восемь Y ионов и собрать их в таблицу, как показано в таблице 1.
Примечание: Значения m/z фрагментов можно рассчитать с помощью химического рисунок программное обеспечение. - Откройте записанные МС/МС спектр peptoid, с помощью программного обеспечения Обзор данных, вместе с документом. Установите маркировки настройки «Шоу Ион ярлыки» и Label порог до 3%. Это создает МС/МС спектра с m/z значения помечены на вершинах.
- Экспорт в MS/MS спектральных данных в виде текстового файла в CSV-формат и реконструировать спектра с помощью программного обеспечения для обработки данных. Поместите значения m/z на вершинах. Результате МС/МС спектра показан на рисунке 4.
Примечание: Некоторые масс-спектрометров оснащены обработки данных программного обеспечения способны для генерации МС/МС спектра. В этом случае экспорт MS/MS спектральных данных не является необходимым. - Назначьте m/z значения, показанные на МС/МС спектра показанным в таблице 1 для определения соответствующего B - и Y-ионов. Например, пик на m/z 580 идентифицируется как B4-иона и m/z 685 идентифицируется как Y5-Ион. Ярлык вершины с соответствующих символов B и Y на спектре, как показано на рисунке 4.
- Вытянуть химической структуры ацетилированный peptoid, поместив N-го на левой стороне и C-конечная на правой стороне и рисование пунктирной линии на каждом Амида Бонд сформировать схему фрагментации, как показано на рисунке 2А. Нарисуйте протона с пунктирной окружности для обозначения обязанности перевозчика. Начиная с левой стороны структуры, место этикетки на пунктирной линии для обозначения фрагментов N-стержня как B1, B2B8. Начиная с правой стороны, место этикетки на пунктирной линии для обозначения фрагментов C-терминала как Y1, Y2, Y8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Структура peptoid 9-mer с N-терминальный ацетилирования, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, показано на рисунке 1. Peptoid был синтезирован вручную в фриттированных полипропиленовые реакции судна через подход твердой фазы. Каток Амида смолы (0,047 ммоль, 84 мг с загрузкой 0,56 ммоль/г) используется в качестве твердой поддержки приносить peptoid с amidated C-terminus. Peptoid цепь построен несколько циклов мономера сложения. Каждый мономер дополнением цикла включает в себя две реакции шаги, bromoacetylation и перемещения. Bromoacetylation достигается путем добавления 0,8 М BMA раствора и раствора DIC 0,8 М и реакции занимает 20 минут. Перемещения достигается добавлением 1,0 М аминов решения к продукту ацетилирования и реакции ацетилирования принимает 1 h. N-терминальный осуществлялась путем добавления коктейль раствор, содержащий 92 мкл ангидрида уксусной кислоты, 43,5 мкл DIPEA и 2 мл ДМФ. Peptoid является расщепляется покинуть из смолы, добавив коктейль раствор, содержащий 3.8 мл TFA, 100 мкл советов и 100 мкл ВЭЖХ класса H2O, и реакция принимает 2 h. TFA удаляется в капюшоне, дует в потоке азота газа до около 1 мл вязкой оставил решение. Продукт peptoid осаждает в диэтиловом эфире и изолирован центрифугированием, и следуют две итерации лиофилизация. Полученный peptoid достаточно чистый для анализа МС/МС.
Предсказал фрагментации схема для peptoid показана в Рисунок 2a, где протона в пунктирной окружности указывает «мобильный Протон», которая побуждала бы фрагментации peptoid во время эксперимента CID. Peptoid Ион фрагментов на облигации Амида вдоль позвоночника peptoid, для которой сайты фрагментации обозначаются пунктирными линиями. N-терминальный фрагменты помечены как ионы типа B и C-терминала фрагменты помечены как Y-типа ионов. Если фрагментация происходит на всех доступных амидной форме облигаций, в общей сложности восемь N-терминальный фрагментов,1 B до B8, и составят в общей сложности восемь фрагментов C-терминал,1 Y Y8. Каждый фрагмент имеет соответствующее значение m/z, которая рассчитывается путем суммирования номинальной массы всех элементов во фрагменте. Как пример, структуры и соответствующие значения m/z (номинальной массы) B4-иона и Y5-Ион показано на рисунке 2b. Химическая формула для иона4 B C31H42N5O6+, и номинальная масса рассчитывается по формуле (31 x 12) + (42 x 1) + (5 x 14) + (6 x 16) = 580. Так как B4 поодиночке заряженный Ион, значение m/z будет 580/1 = 580. Рисунок 2b, структура B4-Ион является упрощенной форме (см. раздел "обсуждение" для подробной информации). Значения вычисляемых m/z (номинальной массы) всех ионов фрагмент B1-B8 и Y1-Й8 приведены в таблице 1.
Массового анализа включает в себя два процесса. Первый процесс является для выполнения полной проверки масс-спектрометрии анализа образца peptoid. Этот результат указывает, содержит ли образец измеримого количества peptoid и относительной чистоты образца. Полное сканирование массовых спектр Ион peptoid показано на рисунке 3, где m/z значения округляются до ближайшего целого числа. Пик на m/z 1265 соответствует протонированных peptoid, а пик на m/z 1 287 для ионов натрия аддукт из peptoid. Две вершины на m/z 633 и m/z 644 соответствуют вдвойне протонированных и смешанные протонированных sodiated peptoids, соответственно. Эти результаты показывают, что в peptoid образце достаточно чистым для проведения анализа МС/МС.
Второй процесс массового анализа является выполнение МС/МС эксперимент на протонированных peptoid на m/z 1265. Этот процесс включает в себя изоляции Ион peptoid прекурсоров группой первый четырехполюсника, фрагментации ионов peptoid в CID и сортировка фрагмент ионов согласно их значения m/z третьей группой квадрупольного. Результате спектра показан на рисунке 4, где m/z значения округляются до ближайшего целого числа. Пик на m/z 1265 соответствует протонированных peptoid. Вершины на более низкие значения m/z соответствуют ионов фрагмент из peptoid иона. Фрагмент ионов, назначаются в качестве B-Ион или Y-Ион путем сравнения их значений m/z с этих прогнозируемых (показано в таблице 1) на основе схемы фрагментации peptoid (показано на рис. 2). Семь Y-ионов (2 Y Y8) и семь B-ионов (B1 -B7) формируются с наблюдаемыми обилия. Обратите внимание, что обилие Y-ионов гораздо выше, чем у большинства B-ионов.
Рисунок 1: Химическая структура peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Peptoid был синтезирован вручную через подход твердой фазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схема фрагментации протонированных peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Peptoid Ион фрагментов на облигации Амида вдоль позвоночника peptoid производить серию N-терминальный фрагментов называется B-ионов и серии C-терминала фрагментов называется Y-ионов. ) предсказал фрагментации схема для протонированных peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Пунктирные линии показывают фрагментацию сайты, символы B1 -B8 указывают N-терминальный фрагменты и символы Y1 для Y8 указывают на C-терминала фрагментов; b) пример фрагментации с схема структуры. Структуры показывают B4-иона и Y5-иона с соответствующими m/z значения, соответственно. Значения m/z рассчитываются путем суммирования номинальной массы элементов в структурах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Полная проверка массовых спектр peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, где m/z значения округляются до ближайшего целого числа. Пик на m/z 1265 соответствует peptoid Ион, [P + H]+, а пик на m/z 1 287 для ионов натрия аддукт из peptoid, [P + Na]+. Две вершины на m/z 633 и m/z 644 соответствуют вдвойне заряженных peptoid, [P + 2 H]2 + и [P + H + Na]2 +, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: МС/МС спектр протонированных peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2 помечены с назначенным фрагментов. Пик на m/z 1265 соответствует протонированных peptoid, [P + H]+, и вершины с более низкими значениями m/z соответствуют фрагмент ионов. B-Y-ионов и назначаются путем сравнения их значений m/z с определяется на основе схемы фрагментации peptoid иона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| B-Ион | m/z значение (номинальная масса) | Y-Ион | m/z значение (номинальная масса) |
| B1 | 143 | Y-1 | 133 |
| B2 | 304 | Y2 | 294 |
| B3 | 419 | Y3 | 409 |
| B4 | 580 | Y4 | 570 |
| B5 | 695 | Y5 | 685 |
| B6 | 856 | Y6 | 846 |
| B7 | 971 | Y-7 | 961 |
| B8 | 1132 | Y-8 | 1122 |
Таблица 1: Теоретические m/z значения вычисляется на основе прогнозируемого фрагментации схема протонированных peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme) 4 -NH 2 . B-иона и Y-Ион указывают соответствующий фрагмент ионов N-го и C-конечная, соответственно. Каждое значение m/z (номинальная масса) рассчитывается путем суммирования номинальной массы элементов в этом фрагменте Ион.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, синтезирован с использованием представленные протокола. Синтез аппарат включает шприц как полипропиленовые твердофазный реакции судна и механический shaker. Реакционные сосуды, коммерчески доступных и недорогих. Механический shaker является общим аппарат в химических лабораториях. С использованием шприц как реакционный сосуд решения могут втянуты и выталкивается из корабля, вручную перемещая поршень. Эта техника позволяет мономер сложения и смолы реакции расщепления в один единый реакции судна и устраняет этап передачи смолы граница промежуточного продукта в другой сосуд для расщепления. Этот метод также устраняет необходимость для вакуум-экстракции устройства для удаления решений от реакции судна. Вакуум-экстракции обычно используется в синтезе ручной peptoid, который был продемонстрирован на других исследователей19,20. Тщательно мойте смола между шагами реакции является решающее значение для получения продуктов высокой степени чистоты. Одна потенциальная проблема является засорение фритта в реакционный сосуд после нескольких циклов мономера сложения. Решение этой проблемы заключается в передаче смолы в новый реакционный сосуд и продолжить процесс синтеза. Этот метод синтеза работает хорошо для peptoids 10-12 остатков. Для более peptoids она становится трудно удалить решения от реакции судна, нажимая на поршень. В этом случае вакуум-экстракции устройство может использоваться для удаления решений от реакции судна (Поршень заменить пробку). В протоколе синтеза сырой продукт очищается путем осаждения peptoid в диэтиловом эфире. Некоторые короче и весьма полярные peptoids не могут образовывать осадок в диэтиловом эфире. В этом случае peptoid могут быть изолированы путем растворения сырого продукта в 10% уксусной кислоты и моющего раствора с диэтиловым эфиром несколько раз, который сопровождается лиофилизация. Некоторые высокой гидрофобностью peptoids также не могут образовывать осадок в диэтиловом эфире. В этом случае испаряются диэтиловым эфиром и использовать обратной фазы ВЭЖХ, чтобы очистить продукт peptoid.
В этом исследовании Ион peptoid генерируется ESI и МС/МС эксперимента осуществляется в тройной квадрупольного масс-спектрометра. Благодаря возможности изоляции ионной группой первый четырехполюсника образец непосредственно вливаются в источнике ESI, который устраняет необходимость для жидкостной хроматографии (LC). Поодиночке протонированных peptoids можно также легко создавать с помощью матрицы с помощью лазерной десорбции ионизации (MALDI) техники. МС/МС может быть проведены эксперименты с использованием других видов масс-спектрометров также, как спектрометр ионов ловушки. Несмотря на относительное обилие фрагмент ионов может отличаться, если МС/МС спектры записываются с использованием различных инструментов, качественные спектральные характеристики должны быть схожими. В общем относительное обилие различных фрагментов ионов очень чувствительна к параметрам инструмента. Изменение энергии столкновения и давления газа столкновения может изменить относительное обилие ионов фрагмента значительно. Например увеличение энергии столкновения или увеличение давления газа столкновения будет способствовать фрагментации и в результате, обилие peptoid прекурсоров иона будет уменьшаться и обилие ионов фрагмент будет увеличиваться. Это исследование фокусируется на отдельно взимается peptoids. Длина peptoids, учился, используя этот протокол ограничивается m/z диапазон масс-спектрометр. Для масс-спектрометра с массового диапазоном до 2000 m/z m/z значения заряженных peptoids должно быть меньше, чем верхний предел. Если peptoids молекулярной массы, выше, чем предел масс-спектрометр, вдвойне протонированных peptoid может использоваться как прекурсор Ион. Вдвойне заряженных peptoid будет иметь значение m/z, которое составляет примерно половина поодиночке заряженных один.
Peptoid, представлена в этой работе содержит основные остатков с Первичные амины группе боковой цепи. Основные остатков служит протонирование сайт, который позволит повысить эффективность ионизации в источнике ESI масс-спектрометр. Меньше полярных (гидрофобных) peptoids имеют плохой ионизации КПД в источнике ESI. В этом случае источником атмосферного давления ионизация (ИУППА) могут быть использованы чтобы ионизировать peptoids. В условиях CID ионы peptoid главным образом фрагмент в амидной форме облигаций производить серию N-терминальный фрагментов и серии C-терминала фрагментов. Если заряд перевозчика, Протон, проживает на N-терминальный фрагменты, форма B-ионов. В противном случае форма Y-ионов. На рисунке 2 показана структура B4-Ион. Это упрощенная структура, которая позволяет рассчитать значение m/z. Скорее всего фактической B-ионы образуются в циклические структуры, например пятичленных oxazolone кольцо23. Не все предсказал фрагмент ионы образуются в масс-спектрометр и наблюдается в массовых спектр. Эффективность формирования позитивно взимается фрагмент ионов в значительной степени определяется основности газовой фазы (или протонного сродства) фрагмента. Очень основных фрагментов имеют высокий шанс сформировать положительно заряженных ионов и наблюдаться в массовых спектров. В общем наблюдения по крайней мере 70% прогнозируемого фрагмент ионов дает достаточно высокая достоверность прогнозирования последовательности peptoid. В разработке peptoids для анализа последовательностей по масс-спектрометрии, важно поместить остатки с полярных боковой цепи групп, например групп алкокси, на различных участках вдоль цепи peptoid.
Для наиболее поодиночке заряженных peptoids с N-терминальный ацетилирования Y-ионов показать гораздо выше изобилия, чем B-ионов21,23. Как показано на рисунке 3, за исключением B1-Ион, интенсивности пиков, соответствующий B-ионов гораздо ниже, чем Y-ионов. Для peptoids с бесплатным N-терминальный аминогруппами выше обилие Y-ионов на B-ионов наблюдается также21. Пользу Y-ионов свидетельствует о том, что заряд носитель Протон предпочитает находиться на C-терминала фрагменты, который из-за выше сродство Протон фрагменты C-терминал23. Помимо формирования B - и Y-ионов фрагмент вторичных ионов, связанные с потерей воды или потери лабильной боковой цепи группы часто наблюдаются в протонированных peptoids. Эти вторичные фрагмент ионы часто появляются как последовательность вершин компаньон рядом с вершины основной фрагмент ионов (особенно Y-ионы) и могут быть идентифицированы путем вычитания массы лабильной боковой цепи группы из массы соответствующей первичной фрагмент ионов.
Этот протокол показано, как вручную синтезировать oligo-peptoid и анализировать последовательность мономера peptoid методом масс-спектрометрии тандем. Этот синтез протокол может быть легко принят в химии, учебные лаборатории для подготовки новых исследователей в peptoid синтезе. Этот протокол масс-спектрометрии служит эффективным инструментом, не только для подтверждения личности peptoid, но и охарактеризовать структурные особенности peptoid по отношению к структуре наблюдаемых фрагментации. Будущих приложений может включать разработку корреляции карта ссылок peptoid структуре и структуре фрагментации путем обобщения и анализа масс-спектрометрии библиотеки различных peptoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить г-н Майкл Коннолли и д-р Рональд Гилад (молекулярных литейного, Лоуренса Беркли национальной лаборатории) для поддержки технику в peptoid синтезе. Мы признаем поддержку от национального научного фонда (ЧЕ-1301505). Все масс-спектрометрии эксперименты были проведены на объекте спектрометрии массы химии в Университете Тихого океана.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
References
- Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
- Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
- Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
- Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
- Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
- Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
- Lutz, J. -F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), Washington, DC. 628 (2013).
- Altuntas, E., Schubert, U. S. "Polymeromics": Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
- Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
- Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
- Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
- Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
- Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
- Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
- Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
- Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
- Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).
