Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntes och masspektrometri analys av Oligo-peptoids

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/56652
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, University of the Pacific

Summary

Ett protokoll som beskrivs för manuell syntesen av oligo-peptoids följt av sekvensanalys av masspektrometri.

Abstract

Peptoids är kontrollerad sekvens peptid-härma oligomerer bestående av N-alkylerade glycin enheter. Bland många potentiella tillämpningar, har peptoids varit tänkt som en typ av molekylär informationslagring. Masspektrometri analys har ansetts metoden för val av sekvensering peptoids. Peptoids kan syntetiseras via fasta fasen kemi använder en upprepande two-step reaktion cykel. Här presenterar vi en metod att syntetisera manuellt oligo-peptoids och analysera sekvensen av den peptoids med tandem masspektrometri (MS/MS) tekniker. Den prov-peptoid är en nonamer bestående av omväxlande N-(2-methyloxyethyl) glycin (Nme) och N-(2-phenylethyl) glycin (Npe), samt en N-(2-aminoethyl) glycin (Nae) vid N-terminalen. Sekvens formeln för peptoid är Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, där Ac är gruppen acetyl. Syntesen sker i ett kommersiellt tillgängliga fasta fasen reaktionskärl. Rink amide kådan används som fasta stöd för att ge peptoid med en amid-gruppen vid C-terminus. Peptoid produkten utsätts för sekvensanalys använder en triple-quadrupole masspektrometer kopplad till en elektrospray jonisering källa. MS/MS mätningen producerar ett spektrum av fragmentet joner följd dissociationen av laddade peptoid. Fragmentet jonerna sorteras baserat på värdena i sin massa-till-storma baserat (m/z). De m/z-värdena av fragmentet joner jämförs nominella massorna av teoretiskt förväntade fragment joner, enligt systematiken i peptoid fragmentering. Analysen genererar en fragmentering mönster av den laddade peptoid. Den fragmentering mönstret är korrelerad till monomer sekvensen av den neutrala peptoid. I detta avseende läser MS analys ut informationen om sekvensen av peptoids.

Introduction

Peptoids är en klass av sekvens-kontrollerade polymerer med ryggraden strukturer som efterliknar strukturen i peptider. Peptoids kan syntetiseras från olika aminer, som gör peptoids att uppvisa mycket avstämbara boenden1,2. Peptoids har använts som molekylära modeller för biofysiska forskning, anses vara terapeutiska medel, och utformade som ligander för proteiner3,4,5,6. Peptoids har utvecklats till en mängd biologiskt aktiva föreningar, såsom antifouling och antikropp-mimetiska material, antimikrobiella medel och enzym-hämmare7,8,9. Med en mycket ordnad och avstämbara natur, har peptoids också varit tänkt som en typ av molekylär information lagring10. Upptäckten av dessa applikationsmöjligheter efterlyser utveckling av effektiva analysmetoder att karakterisera sekvensen och strukturera av peptoids. Tandem mass spectrometry-baserade tekniker har visat lovande resultat som metoden för val av analysera egenskaperna sekvens för sekvens-kontrollerade polymerer, inklusive peptoids11,12,13, 14,15. Dock systematiska studier korrelerar peptoid ion fragmentering mönster följd mass spectrometry studier och strukturell information av peptoids är mycket begränsade.

Peptoids kan syntetiseras lätt med en fast fas metod. Väl utvecklade metoden innebär en iteration av en två-stegs monomer tillägg cykel16,17. I varje tillägg cykel, en hartsa-begränsar Amin är acetylerade av en haloacetic syra (vanligtvis bromacetat, BMA) och detta följs av en förskjutning reaktion med en primär Amin. Även om automatiserad syntes protokoll har tillämpats rutinmässigt för peptoid syntes, kan peptoids syntetiseras manuellt med utmärkt avkastning i en standard kemi laboratoriet16,18,19, 20.

Vårt labb har antagit metoden för manuell peptoid syntes och förenklat den apparat som används i de befintliga metoderna. Vi har tidigare studerat fragmentering mönster i en serie av peptoids med MS/MS tekniker21,22,23. Våra resultat visar att peptoids producerar karakteristiska splittringarna när de utsätts för kollision-inducerad dissociation (CID)21,23 eller electron capture dissociation (ECD)22 experiment. I den här artikeln visar vi hur oligo-peptoids kan syntetiseras i en standard kemilaboratorium, hur du utför de CID experiment med en trippel-quadrupole masspektrometer och hur att analysera spektrala data. Peptoid syntetiseras och kännetecknas är en nonamer med N-terminala acetylering och C-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Peptoid struktur visas i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sammanfattning av Peptoid

Obs: Syntesen börjar med aktivering kådan av svullnad kådan och ta bort den skyddande gruppen. Detta följs av växande peptoid kedjan på kådan genom upprepande monomer tillägg cykler. Den första monomeren kopplat till harts är C-terminal återstoden. Peptoid är avlånga från C-terminus till N-terminalen. När önskad peptoid sekvensen uppnås, kådan är klyvs bort och peptoid produkten renas.

  1. Beredning av reagens
    Obs: De flytande reagenserna mäts med hjälp av en mikropipett och solid reagenserna mäts med hjälp av en Analysvåg.
    1. Blanda 6,2 mL N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) och 43,8 mL N, N-dimetylformamid (DMF) att förbereda en 0,8 M DIC/DMF lösning.
    2. Lös 5.56 g BMA till 50,0 mL DMF att förbereda en 0,8 M BMA/DMF-lösning.
    3. Blanda 2 mL av Piperidin (Pip) och 8 mL DMF att uppnå 20% Pip/DMF lösning.
    4. Lös upp 1,9 mL Npe till 13,1 mL DMF att uppnå 1.0 M Npe/DMF.
    5. Lös upp 1,3 mL Nme till 13,7 mL DMF att uppnå 1.0 M Nme/DMF.
    6. Upplösa 0.32 mL Nae i 2 mL DMF att uppnå 1.0 M Nae/DMF.
      Varning: De flesta av de kemikalier som används i syntesen är farliga. Trifluorättiksyra (TFA), DIC, Pip och BMA är farliga för hud, ögon och andningsorgan. DMF och diklormetan (DCM) är misstänkt cancerframkallande. Alla reaktioner bör utföras i dragskåp och lämplig personlig skyddsutrustning ska användas. Vänligen kontrollera material säkerhetsdatablad (MSDS) av alla kemikalier som används i syntesen.
  2. Harts aktivering
    1. Mäta ut 84 mg Rink amide harts (kåda, 0,047 mmol, lastning 0.56 mmol/g) och lägga till ett 10 mL polypropylen fasta fasen reaktionskärl. Sätt kolven i fartyget.
    2. Tillsätt 2 mL DMF till reaktionskärlet och keps fartyget med badmössa trycket. Placera kärlet på en shaker och skaka fartyget vid rumstemperatur i en vinkel på rörlighet för cirka 12 grader och 385 svängningar/min för 30 min. avlopp lösningen till en avfallsbehållare genom avlägsnande av locket och trycka kolven i reaktionskärlet.
    3. Tillsätt 2 mL av 20% Pip/DMF lösning till kärlet och locket fartyget. Agitera det på skakapparaten i 2 min, och rinna lösningen till avfallsbehållaren.
    4. Tillsätt 2 mL av 20% Pip/DMF lösning till fartyget, cap fartyget, och agiterar det i rumstemperatur i 12 min. ta bort locket och dränera lösningen till avfallsbehållaren.
    5. Tvätta kådan genom att tillsätta 1 mL DMF, tak fartyget, och agitera fartyget för 1 min. ta av locket och dränera lösningen genom att trycka på kolven. Tvätta kådan med DMF för 4 ytterligare gånger.
  3. Monomer tillägg och N-terminala acetylering
    Obs: Varje monomer tillägg cykel innebär två reaktionen kliver, bromoacetylation och förskjutning.
    1. Genomföra den första monomer tillägg cykeln att bilda Nme-harts.
    2. Utför en bromoacetylation reaktion. Blanda 1 mL 0,8 M BMA/DMF lösning och 1 mL av 0,8 M DIC/DMF lösning i en bägare. Överför blandningen till ett reaktionskärl innehållande harts och locket fartyget. Placera kärlet på shaker och agiterar det i rumstemperatur i 20 min. ta bort locket och dränera lösningen till avfallsbehållaren.
    3. Tvätta kådan genom tillsats av 1 mL DMF, tak fartyget, agitera det för 1 min och dränering lösningen genom att trycka på kolven. Tvätta kådan genom tillsats av 1 mL DCM, agitera fartyget för 1 min och dränering lösningen. Tvätta kådan med DCM en gång till, och sedan tvätta den med DMF två gånger.
    4. Utföra en förskjutning reaktion. Tillsätt 1 mL 1,0 M Nme/DMF, cap fartyget, agitera fartyget i rumstemperatur i 60 min. ta bort locket och dränera lösningen genom att trycka på kolven.
    5. Tvätta kådan genom att tillsätta 1 mL DMF, agitera fartyget för 1 min och dränering lösningen genom att trycka på kolven. Tvätta kådan genom att rita i 1 mL DCM, agitera för 1 min, och dränering lösningen. Tvätta DCM en gång, följt av tvättning med DMF två gånger.
    6. Upprepa monomer tillägg cykler från trappan 1.3.2 till 1.3.5 att bilda Nae-(Npe-Nme)4-harts. När upprepa steget av deplacement reaktion (1.3.4), använda en specifik amine lösning enligt sekvensen peptoid.
      Obs: Peptoid kedjan är avlånga från C-terminus till N-terminalen med C-terminal återstoden bunden till hartsen.
    7. Utföra N-terminala acetylering för att bilda Ac-Nae-(Npe-Nme)4-harts.
    8. Blanda 92 µL av ättiksyraanhydrid, 43,5 µL av N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) och 2 mL DMF i en bägare att göra ca 2 mL acetylering cocktail.
    9. Tillsätt 2 mL av acetylering cocktail till fartyget som innehåller harts, cap fartyget och agiterar det vid rumstemperatur för 60 min. ta av locket och dränera lösningen genom att trycka på kolven.
    10. Tvätta kådan genom tillsats av 1 mL DMF, agitera fartyget för 1 min och dränering lösningen genom att trycka på kolven. Tvätta kådan genom tillsats av 1 mL DCM, agitera fartyget för 1 min och dränering lösningen. Upprepa tvättningen kådan med DCM, tvätta sedan med DMF dubbelt mer.
    11. Tvätta kådan genom tillsats av 1 mL DCM, agitera fartyget för 1 min och dränering lösningen genom att trycka på kolven. Upprepa tvättning med DCM två gånger. Ta av locket och låt kådan lufttorka i reaktionskärlet i 10 min.
  4. Klyvning och rening
    1. Blanda 3,8 mL TFA, 100 µL av triisopropylsilane (TIPS) och 100 µL av HPLC-grad H2O i en bägare att göra 4 mL klyvning cocktail.
    2. Lägga till 4 mL nygjorda klyvning cocktail till fartyget som innehåller harts, cap fartyget och agiterar det i rumstemperatur i 2 h.
    3. Ta bort locket och samla filtratet lösningen i en 50 mL polypropylen centrifugrör. Tillsätt 1 mL TFA till fartyget, råga och agitera för 1 min. samla filtratet lösningen i det samma centrifugröret.
    4. Avdunsta TFA genom att blåsa i en ström av kvävgas försiktigt tills ca 1 mL viskös lösning är kvar.
    5. Tillsätt 15 mL dietyleter till återstående lösningen, cap centrifugröret och inkubera det i-20 ° C frys för 2 h till över natten. Den rå peptoid fällningar som vit solid.
    6. Pellet fast med hjälp av en centrifug vid 4,427 x g i 10 min. ta bort locket på centrifugröret och Dekantera dietyleter till en bägare noggrant utan att förlora fast.
      Varning: dietyleter är brännbara organiska lösningsmedel. Använd en dietyleter säker centrifug.
    7. Tvätta fast genom att tillsätta 10 mL iskallt dietyleter in i centrifugen röret som innehåller fast, tak röret, och placera den i centrifugen. Utföra centrifugering vid 4,427 x g i 10 min. ta bort centrifugen röret från centrifugen och Dekantera dietyleter till en bägare noggrant utan att förlora fast.
    8. Torka fast genom att försiktigt blåsa i en ström av kvävgas.
    9. Tillsätt 10 mL av HPLC-grad H2O att upplösa den torkade fast. Låt lösningen rinna genom ett nylon spruta filter med porstorlek 0,45 µm, och samla upp filtratet i en polypropylen förvägda 50 mL centrifugrör.
    10. Shell frysa lösningen genom att placera och rotera den Centrifugera röret som innehåller den peptoid lösningen i en 12-ounce, dubbel-staplade expanderad polystyren cup 1/3 fylld med flytande kväve. Lyophilize frysta lösningen över natten för att ge fasta peptoid.
    11. Upprepa frystorka den en mer tid av upplösning den fasta peptoid i 10 mL av HPLC-grad H2O, shell frysning med flytande kväve, och frystorkning övernattning. Den resulterande peptoid är tillräckligt ren för sekvensanalys av masspektrometri.

2. MS mätningar och analyser

Obs: MS/MS experimentet utförs i en trippel-quadrupole masspektrometer kopplad till en elektrospray jonisering (ESI) källa. Insamling av data styrs med hjälp av data förvärv programvaran tillsammans med instrumentet. Det allmänna förfarandet omfattar 1) utför fullständig skanning masspektrometri experimentet och inspelning på masspektrum, 2) utför den CID MS/MS experimentera inspelning MS/MS spektrumet och 3) jämföra MS/MS spektrala data med teoretisk fragmentering system förutspådde baserat på den strukturella inslaget i peptoid.

  1. Beredning av provlösningen
    1. Väg upp 1,0-2,0 mg fast peptoid i en 3-5 mL injektionsflaska av glas. Tillsätt 1 mL blandat lösningsmedel acetonitril och vatten (ACN/H2O, 1:1, v/v) för att upplösa peptoid. Detta ger lager provlösningen med en koncentration av cirka 10-3 M.
    2. Överför 20 µL av stamlösning i ett 1,5 mL centrifugrör och tillsätt 1 mL blandat lösningsmedel av ACN/H2O ge en utspädda provlösning av ca 10-5 M.
    3. Ta bort några möjliga olösliga partiklar i utspädda provlösningens genom att utföra centrifugering vid 4,427 x g för 3 min. överför ca 700 µL av den övre delen av lösningen till en annan 1,5 mL Centrifugera röret för att göra peptoid MS fungerande lösning med koncentration av cirka 10-5 M.
    4. Justera koncentrationen av MS arbetslösning baserat på observerade signal intensiteten under masspektrometri mätningar.
    5. Ett alternativt sätt att ta bort eventuella möjliga olösliga partiklar i utspädda provlösningens är att passera ett 0,20 µm spruta filter provlösningen och samla upp filtratet i ett 1,5 mL centrifugrör att göra peptoid MS fungerande lösning av ca 10-5 M.
  2. Inspelning masspektra
    1. Kör blandade lösningsmedlet av ACN/H2O (1:1, v/v) genom elektrospray jonisering (ESI) källa och Ställ upp instrumentet i en standard positiv Jon, fullständig genomsökning masspektrometri-läge med en massa-till-storma baserat (m/z) rad 100-1500.
      Obs:
      Typiska parametrar:
      ESI nål spänning, 5 kV
      Kapillär spänning, 40 V
      Torkning gastemperatur (kvävgas), 200 ° C.
    2. Tillsätt ungefär 300 µL peptoid MS arbetslösning (cirka 10-5 M) i en 500 µL eller en 1 mL spruta och Anslut sprutan till ESI inloppet med kapillär polyeter eter keton (PEEK) slangar. Placera sprutan på sprutpumpen och ställa in flödet på 10 µL/min att ingjuta provlösningen i inloppet till ESI.
    3. Slå på ESI nål spänningen till aktivera ESI-processen, och slå sedan på detektorn. Ställa in displayen i profilläge och m/z utbudet av 100-1.500. Visa en masspektrum profil visas i fönstret profil. Toppen vid m/z 1 265 (visas som m/z av 1,264.6) motsvarar den peptoid ion eller protonerade peptoid.
    4. Spela in MS spektrumet i 2 min. I metoden fönstret' ', använda 2 min som ”bearbetningstiden”. Öppna fönstret inspelning och fyll i en korrekt filnamn och börja spela in spektrumet.
      Obs: Den resulterande masspektrum visas i figur 3.
    5. Optimera intensiteten i toppen vid m/z av 1 265. Inställt 1.150-1,350 m/z spänna och justera kapillär spänningen medan du visar topp intensiteten i mV visas i fönstret profil. Exempelvis öka kapillär spänningen till 50 V eller högre och visa den på topp intensiteten. Optimal maximal intensitet är runt 150-200 mV.
      Obs: Justera kapillär spänningen kan avsevärt ändra överflödet av vissa joner. Ökad kapillär spänningen kan öka intensiteten av peptoid ion. Dock kan en hög kapillär spänning också framkalla dissociation av peptoid ion i ion källan, och minska observerade intensiteten. Justera temperaturen för torkning av gas kan öka intensiteten av toppen vid m/z 1 265, men det är mindre effektivt än justera kapillär spänningen. Om toppen vid m/z 1 265 inte når den optimala intensiteten, justera prov koncentration (eller exempelvis dubbla koncentrationen av arbetslösning MS).
    6. Slå på instrumentet till MS/MS-läge. Föregångaren jonen vid m/z 1 265 som MS/MS massa utbud på m/z av 100-1,400. I metoden fönstret',' använda m/z 1 265 som ”Q1 första massan” och lämna ”Q1 förra massan” tomt. Använda m/z 100 som ”Q3 första Mass” och m/z 1400 som den ”Q3 senaste mässan”.
      Obs: I MS/MS-läge, den första quadrupole enhet (Q1) fungerar som en massa filter att isolera peptoid ion som föregångaren jonen, andra quadrupole enheten (Q2) är en kollision cell och tredje quadrupole enhet (Q3) fungerar som en massa analyzer.
    7. Uppsättning kollision energin på 40 eV och kollision gas (argon, i detta fall) Tryck på 1,5 mTorr.
    8. Visa en masspektrum profil visas i fönstret profil. Toppen vid m/z av 1 265 motsvarar peptoid ion, och topparna med lägre m/z-värden representerar fragment från peptoid ion.
    9. Justera kollision energi för att optimera visningen av fragmentering spektrumet. Exempelvis öka kollision energin till 45 eV och Visa ändringen av spektrum profilen.
      Obs: I allmänhet ökar kollision energi kommer att öka överflöd av fragmentet jonerna och minska överflödet av peptoid ion. Ökande kollision gastrycket förbättrar också överflödet av fragmentet jonerna.
      Försiktighet: Öka inte kollision gastrycket bortom 2 mTorr.
    10. Spela in MS/MS spektrumet i 2 min. I metoden fönstret',' Använd 2 min som ”bearbetningstiden”. Öppna fönstret inspelning och fyll i en korrekt filnamn och börja spela in spektrumet.
    11. Upprepa inspelningen 1 - 2 gånger.
  3. Peptoid sekvensanalys
    Obs: På CID villkor, peptoid ion skulle fragmentera på amide obligationerna längs peptoid ryggraden att producera en serie av N-terminala fragmenten kallas B-joner, och en serie C-terminal fragment kallas Y-joner
    1. Dra ut den acetylerade peptoid kemiska struktur genom att placera N-terminalen på vänster sida och C-terminus på höger sida och rita en streckad linje på varje amide bond att generera en fragmentering system som visas i figur 2a. Rita en proton med en streckad cirkel att indikera laddningsbärare. Start från vänster sida av strukturen, placera etiketter på de streckade linjerna anger N-terminala fragmenten som B1, B2, B8. Start från höger sida, placera etiketter på de streckade linjerna att indikera C-terminala fragmenten som Y1, Y2, Y8.
      Obs: En kemisk ritning programvara kan användas för att rita peptoid struktur.
    2. Föreställ dig fragmentering av de 4th amide bond från vänster sida och rita strukturer den N-terminala fragmenten och C-terminal fragmentet med ordentlig formella anklagelser, som visas i figur 2b. Placera etiketten för B4 på den N-terminala fragmenten och placera etiketten Y5 på C-terminalen fragmentet. Beräkna m/z värdet av B4 genom att summera de nominella massorna element i strukturen till ett värde av 580 och placera m/z 580 på den N-terminala fragmenten. Beräkna m/z värdet Y5 och placera m/z 685 på C-terminalen fragmentet.
    3. Beräkna de m/z-värdena för alla åtta B-joner och alla åtta Y joner och montera dem i en tabell, som visas i tabell 1.
      Obs: M/z värdena fragment kan beräknas med hjälp av en kemikalie som ritprogram.
    4. Öppna den inspelade MS/MS spectrumen av de peptoid som med hjälp av data från gästerna programvara tillsammans med instrumentet. Inställd märkning preferenser att ”Visa Ion-etiketter och etikett tröskelvärdet på 3%. Detta genererar ett MS/MS spektrum med m/z-värden märkt på topparna.
    5. Exportera till MS/MS spektrala data som en textfil i CSV-format och rekonstruera det spektrum som med databehandling programvara. Placera m/z-värden på topparna. Det resulterande MS/MS-spektrumet visas i figur 4.
      Obs: Vissa masspektrometrar är utrustade med databehandling programvara kapabel för att generera MS/MS spektrumet. I så fall är exportera MS/MS spektrala data inte nödvändigt.
    6. Tilldela de m/z-värden som visas på MS/MS spektrumet till de som visas i tabell 1 att identifiera motsvarande B - och Y-jonerna. Till exempel toppen vid m/z 580 identifieras som den B4-ion och m/z 685 identifieras som Y5-ion. Etikett topparna med motsvarande Y och B symboler på spektrumet, som visas i figur 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strukturen på en 9-mer peptoid med N-terminala acetylering, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, visas i figur 1. Peptoid synthesized manuellt i en fritted polypropylen reaktionskärl via fasta fasen strategi. Rink amide harts (0,047 mmol, 84 mg med lastning 0.56 mmol/g) används som det fasta stödet för att ge peptoid med en amidated C-terminus. Peptoid kedjan är byggd av flera cykler av monomer tillägg. Varje monomer tillägg cykel innebär två reaktioner steg, bromoacetylation och förskjutning. Bromoacetylation uppnås genom att lägga till 0,8 M BMA lösning och 0,8 M DIC lösning och reaktionen tar 20 min. Förskjutningen uppnås genom att lägga till 1,0 M amine lösning acetylering produkten och den reaktion tar 1 h. N-terminala acetylering genomfördes genom att lägga till en cocktail lösning innehållande 92 µL av ättiksyraanhydrid, 43,5 µL av DIPEA, och 2 mL DMF. Peptoid är klyvs bort från harts genom att lägga till en cocktail lösning innehållande 3,8 mL TFA, 100 µL av TIPS och 100 µL av HPLC-grad H2O och tar reaktion 2 h. TFA tas bort i huven genom att blåsa i en ström av kvävgas tills ca 1 mL trögflytande lösningen är kvar. Peptoid produkten fällningar i dietyleter och isoleras genom centrifugering, och detta följs av två iterationer av frystorka den. Den resulterande peptoid är tillräckligt ren för MS/MS-analys.

Den förutspådda fragmentering ordningen för peptoid visas i figur 2a, där protonen i streckad cirkel anger ”mobila protonen” som skulle framkalla peptoid fragmentering under CID experimentet. Peptoid ion fragment på amide obligationerna längs peptoid ryggraden, för vilka de fragmentering platserna indikeras av de streckade linjerna. N-terminala fragmenten är märkta som B-typen joner och C-terminala fragmenten är märkta som Y-typen joner. Om fragmenteringen inträffar på alla tillgängliga amide obligationer, sammanlagt åtta N-terminala fragmenten, B1 B8, och sammanlagt åtta C-terminal fragment, Y1 Y8, skulle bilda. Varje fragment har ett motsvarande m/z-värde som beräknas genom att summera de nominella massorna av alla element i fragmentet. Som ett exempel, strukturerna och de motsvarande m/z-värdena (nominell massorna) av B4-ion och Y5-ion visas i figur 2b. Den kemiska formeln för B4 jonen är C31H42N5O6+, och den nominella massan beräknas genom ekvation (31 x 12) + (42 x 1) + (5 x 14) + (6 x 16) = 580. Eftersom B4 är en ensamma laddad Jon, m/z värdet skulle vara 580/1 = 580. I figur 2b, strukturen av B4-ion är en förenklad form (se diskussionsavsnittet för detaljer). De beräknade m/z-värdena (nominell massorna) av alla fragment joner från B1-B8 och Y1-Y8 ges i tabell 1.

Massa analysen omfattar två processer. Den första processen är att utföra en fullständig genomsökning masspektrometri analys av peptoid provet. Detta resultat anger om provet innehåller en mätbar mängd peptoid och den relativa renheten av provet. Fullständig genomsökning massa spectrumen av peptoid ion visas i figur 3, där de m/z-värdena är avrundade till närmaste heltal. Toppen vid m/z 1 265 motsvarar den protonerade peptoid och toppen vid m/z 1 287 motsvarar den natrium-Jon addukt av peptoid. De två topparna på m/z 633 och m/z 644 motsvarar dubbelt protonerade blandade protonerade-sodiated peptoids, respektive. Dessa resultat tyder på att peptoid provet är tillräckligt ren för att utföra MS/MS-analys.

Den andra processen i massa analys är att utföra MS/MS experimentet på den protonerade peptoid på m/z 1 265. Denna process inkluderar isolera föregångare peptoid jonen av första quadrupole enheten, Fragmentera peptoid jonen i CID och sortering fragment jonerna enligt deras m/z värden av tredje quadrupole enheten. Det resulterande spektrumet visas i figur 4, där de m/z-värdena är avrundade till närmaste heltal. Toppen vid m/z 1 265 motsvarar den protonerade peptoid. De andra topparna på lägre m/z-värden motsvarar de fragment jonerna från peptoid ion. Fragmentet jonerna tilldelas antingen B-jonen eller Y-jonen genom att jämföra deras m/z-värden med de förutspådda (visas i tabell 1) baserat på det peptoid fragmentering system (visas i figur 2). Sju Y-joner (Y2 Y8) och sju B-joner (B1 B7) bildas med observerbara sammansättning. Observera att överflödet av Y-jonerna är mycket högre än för de flesta B-joner.

Figure 1
Figur 1: kemiska strukturen hos peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Peptoid synthesized manuellt via fasta fasen strategi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Fragmentering system för den protonerade peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Peptoid ion fragment på amide obligationerna längs peptoid ryggraden att producera en serie av N-terminala fragmenten kallas B-joner och en serie C-terminal fragment kallas Y-joner. (a) förutspådde fragmentering system för den protonerade peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. De streckade linjerna visar fragmentering webbplatser, symboler B1 B8 anger N-terminala fragmenten och symbolerna Y1 Y8 anger C-terminala fragmenten; (b) prov fragmentering med Schematisk strukturer. Strukturerna som visar den B4-ion och Y5-ion med motsvarande m/z värden, respektive. M/z värdena beräknas genom att summera de nominella samlas av beståndsdelarna i strukturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Fullständig genomsökning masspektrum av peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, där de m/z-värdena är avrundade till närmaste heltal. Toppen vid m/z 1 265 motsvarar peptoid ion, [P + H]+, och toppen vid m/z 1 287 motsvarar natrium ion addukt av peptoid, [P + Na]+. De två topparna på m/z 633 och m/z 644 motsvarar dubbelt laddade peptoid, [P + 2 H]2 + och [P + H + Na]2 +, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: MS/MS spektrum av den protonerade peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2 märkt med tilldelade fragment. Toppen vid m/z 1 265 motsvarar den protonerade peptoid, [P + H]+, och topparna med lägre m/z-värden motsvarar de fragment jonerna. B - och Y-jonerna tilldelas genom att jämföra deras m/z-värden med de beräknade baserat på systemet fragmentering av de peptoid Jon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

B-Jon m/z värdet (nominell vikt) Y-Jon m/z värdet (nominell vikt)
B1 143 Y1 133
B2 304 Y2 294
B3 419 Y3 409
B4 580 Y4 570
B5 695 Y5 685
B6 856 Y6 846
B7 971 Y7 961
B8 1132 Y8 1122

Tabell 1: Teoretiska m/z-värden beräknas baserat på den förutspådda fragmentering systematiken i den protonerade peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme) 4 -NH 2 . B-jonen och Y-jonen anger motsvarande fragment jonerna av N-terminalen och C-terminus, respektive. Varje m/z-värdet (nominell vikt) beräknas genom att summera de nominella samlas av beståndsdelarna i att fragmentet Jon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, har syntetiserats använda protokollet presenteras. Syntes apparaten innebär en spruta-liknande polypropylen fasta fasen reaktionskärlet och en mekanisk skakapparat. Reaktionskärl är kommersiellt tillgängliga och låg kostnad. En mekanisk skakapparat är en gemensam apparatur i kemi laboratorier. Med användning av en spruta-liknande reaktionskärlet, kan lösningar dras in och sköt ur fartyget genom att manuellt flytta kolven. Denna teknik tillåter monomeren tillägg och harts klyvning reaktioner förekomma i en enda reaktion fartyget och eliminerar steget att överföra hartsa-begränsar mellanprodukten till ett annat fartyg för klyvning. Denna teknik eliminerar också behovet av en vakuum extraktion enhet ta bort lösningar från reaktionskärlet. Vakuum extraktion används ofta i manuell peptoid syntes som har visats av andra forskare19,20. Tvätta noga kådan mellan reaktionen kliver är avgörande för att få en hög renhet produkt. Ett potentiellt problem är igensättning av fritta i reaktionskärlet efter flera cykler av monomer tillägg. En lösning på detta problem är att överföra kådan i en ny reaktionskärlet och fortsätta syntesprocessen. Denna syntes teknik fungerar bra för peptoids till 10-12 resthalter. För längre peptoids blir det svårt att ta bort lösningar från reaktionskärlet med kolven. I det här fallet kan en vakuum extraktion enhet utnyttjas för att ta bort lösningar från reaktionskärlet (kolven bör ersättas med en propp). I protokollet syntes renas rå produkten genom utfällning av peptoid i dietyleter. Vissa kortare och mycket polära peptoids kan inte bilda fällning i dietyleter. I det här fallet kan peptoid isoleras genom upplösning den rå produkten i 10% ättiksyra och tvätta lösningen med dietyleter flera gånger, som följs av frystorka den. Vissa starkt hydrofoba peptoids kan också inte bilda fällning i dietyleter. I det här fallet avdunsta dietyletern och använda en HPLC med omvänd fas för att rena peptoid produkten.

I denna studie peptoid ion genereras av ESI och MS/MS experimentet utförs i en trippel-quadrupole masspektrometer. På grund av den ion isolering anlagen av första quadrupole enheten, är provet direkt infunderas i ESI-källan, som eliminerar behovet av vätskekromatografi (LC). Ensamma kan protonerade peptoids också enkelt genereras med hjälp av matris-assisted laser desorption-jonisering (MALDI) teknik. MS/MS experimenten kan utföras med andra typer av masspektrometrar samt, såsom en ion-fällan spektrometer. Även om det relativa överflödet av fragmentet joner kan tyckas olika om MS/MS spektra registreras med hjälp av olika instrument, bör de kvalitativa spektrala funktionerna liknande. I allmänhet, är det relativa överflödet av olika fragment joner mycket känslig för parametrarna instrument. Ändra den kollision energin och kollision gastrycket kan förändra det relativa överflödet av fragmentet joner betydligt. Exempelvis öka kollision energi eller öka kollision gastrycket kommer att främja fragmentering, och som ett resultat, överflödet av peptoid föregångare jonen kommer att minska och överflödet av fragmentet jonerna kommer att öka. Denna studie fokuserar på ensamma laddade peptoids. Längden på den peptoids som studerat användning av detta protokoll begränsas av m/z spänna av masspektrometer. För en masspektrometer med massa räckvidd upp till m/z 2,000, bör den laddade peptoids m/z värden vara lägre än den övre gränsen. Om peptoids har en molekylvikt högre än gränsen för masspektrometer, ett dubbelt protonerade peptoid kan användas som föregångaren jonen. Ett dubbelt laddade peptoid skulle ha en m/z-värde som är ungefär hälften av den ensamma laddade.

De peptoid som presenteras i detta arbete innehåller en grundläggande rester med en primär Amin som gruppen sidokedjan. Det grundläggande rest fungerar som en protonation webbplats, som skulle effektivisera jonisering i ESI-källan till masspektrometer. Mindre polar (mer hydrofoba) peptoids har dålig jonisering effektivitet i ESI-källan. I det här fallet kan en atmosfärisk tryck kemisk jonisering (APCI) Källa utnyttjas för att jonisera peptoids. På CID villkor fragmenterar peptoid jonerna främst på amide obligationerna att producera en serie av N-terminala fragmenten och en serie C-terminal fragment. Om laddningsbärare, protonen, finns på N-terminala fragmenten, formuläret B-joner. Annars formuläret Y-joner. Figur 2 visar en struktur av B4-ion. Detta är en förenklad struktur, vilket hjälper till att beräkna m/z värdet. De faktiska B-jonerna bildas sannolikt i en cyklisk struktur, såsom en fem-membered oxazolone ring23. Inte alla förutspådde fragment joner bildas i masspektrometer och observerade i masspektrum. Effektiviteten i bildar positivt laddat fragment joner bestäms till stor del av den gas-fas valens (eller proton affinitet) av fragment. Mycket grundläggande fragment har en hög chans att bilda positivt laddade joner och observeras i masspektrum. I allmänhet ger observation minst 70% av de förutspådda fragment jonerna en någorlunda högt förtroende för att förutsäga sekvensen av en peptoid. I utformar peptoids för sekvensanalys av masspektrometri, är det viktigt att placera rester med polar sidokedjan grupper, såsom alkoxigrupper grupper, på olika platser längs peptoid kedjan.

För mest ensamma laddat peptoids med N-terminala acetylering visar Y-jonerna mycket högre överflöd än B-joner21,23. Som visas i figur 3, utom i B1-ion, intensiteten hos de toppar som motsvarar B-jonerna är mycket lägre än de av Y-joner. För peptoids med gratis N-terminala amino grupper, har högre överflöd av Y-joner över B-joner observerats samt21. Den gynnar av Y-joner antyder att laddningsbärare protonen föredrar att bosätta sig på C-terminalen fragment, vilket beror på högre proton affinitet av C-terminal fragment23. Förutom bildandet av B - och Y-joner, sekundära fragment joner är associerad med vattenförlust eller labila sidokedjan gruppen förlust är ofta observeras i protonerade peptoids. Dessa sekundära fragment joner ofta visas som en serie av följeslagare toppar bredvid topparna av de primära fragment jonerna (särskilt Y-joner), som kan identifieras genom att subtrahera massan av labila sidokedjan gruppen från massan av den motsvarande primärt fragmentet joner.

Detta protokoll visar hur du manuellt syntetisera en oligo-peptoid och analysera monomer sekvensen av en peptoid med en tandem mass spectrometry metod. Detta syntes protokoll kan lätt antas till en kemi undervisningen laboratorium för att utbilda nya forskare i peptoid syntes. Detta masspektrometri-protokoll fungerar som ett effektivt verktyg, inte bara att bekräfta identiteten hos peptoid, men också att karakterisera strukturella drag hos peptoid i förhållande till de observerade fragmentering mönsterna. Framtida tillämpningar kan inbegripa utveckling av kartan korrelation länka peptoid struktur och fragmentering mönster genom syntes och masspektrometri analys av ett bibliotek med olika peptoids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Mr Michael Connolly och Dr Ronald Zuckermann (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) för teknik som stöd i peptoid syntes. Vi erkänner stöd från National Science Foundation (CHE-1301505). Alla masspektrometri experiment genomfördes i kemi Mass Spectrometry anläggningen vid universitetet i Stilla havet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L Agilent Technologies Inc. The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.
Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software Varian Inc. The software is a part of the Varian 320L package
Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD Fisher Scientific International Inc. 14-400-126
Hermle Centrifuge, Model Z 206 A Hermle Labortechnik GmbH
Solid phase reaction vessel, 10 mL Torviq SF-1000
Pressure caps for reaction vessels Torviq PC-SF
Syringe filters, pore size 0.2 μm Fisher Scientific Inc. 03-391-3B
Syringe filters, pore size 0.45 μm Fisher Scientific Inc. 03-391-3A
Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL VWR International, LLC. 490001-626
Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL VWR International, LLC. 490001-620
ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 CambridgeSoft Corporation CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.
Styrofoam cup, 12 Oz Common Supermarket
Rink amide resin Chem-Impex International, Inc. 10619
Piperidine Chem-Impex International, Inc. 02351 Highly toxic
N, N’-diisopropylcarbodiimide Chem-Impex International, Inc. 00110 Highly toxic
Bromoacetic acid Chem-Impex International, Inc. 26843 Highly toxic
2-Phenylethylamine VWR International, LLC. EM8.07334.0250
2-Methyoxyethylamine Sigma-Aldrich Co. LLC. 241067
N-Boc-ethylenediamine VWR International, LLC. AAAL19947-06
Acetic anhydride Sigma-Aldrich Co. LLC. 252845
N, N-dimethylformamide VWR International, LLC. BDH1117-4LG Further distillation before use
N, N-diisopropylethylamine Chem-Impex International, Inc. 00141
Triisopropylsilane Chem-Impex International, Inc. 01966
Trifluoroacetic acid Chem-Impex International, Inc. 00289 Highly toxic
Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System Millipore Corporation ZMQP60001 For generating HPLC grade water
HPLC-grade Water Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System
Methanol Pharmco-Aaper 339USP/NF HPLC grade
Acetonitrile Fisher Scientific International, Inc. A998-4 HPLC grade
Diethyl ether VWR International, LLC. BDH1121-19L Further distillation before use
Dichloromethane VWR International, LLC. BDH1113-19L Further distillation before use
Nitrogen gas Fresno Oxygen/Barnes Supply NIT 50-C-F Ultra high purity, 99.9995%
Argon gas Fresno Oxygen/Barnes Supply ARG 50-C-F Ultra high purity, 99.9995%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
  2. Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
  3. Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  4. Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
  5. Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
  6. Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
  7. Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
  8. Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
  9. Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
  10. Lutz, J. -F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), Washington, DC. 628 (2013).
  11. Altuntas, E., Schubert, U. S. "Polymeromics": Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
  12. Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
  13. Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
  14. Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
  15. Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
  16. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
  17. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
  18. Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
  19. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
  20. Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
  21. Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
  22. Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
  23. Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).

Tags

Kemi fråga 132 Peptoid N-alkylerade glycin syntes masspektrometri sekvensanalys fragmentering mönster Y-Jon B-Jon
Syntes och masspektrometri analys av Oligo-peptoids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, J., Mann, Y. S., Zhang, Y.,… More

Ren, J., Mann, Y. S., Zhang, Y., Browne, M. D. Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids. J. Vis. Exp. (132), e56652, doi:10.3791/56652 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter