Summary
Denne protokol beskriver en imaging-baseret metode hen til aktivere T lymfocytter ved hjælp af photoactivatable peptid-MHC, muliggør præcis spatiotemporelle kontrol af T-celle aktivering.
Abstract
T-lymfocytter engagere sig i hurtige, polariseret signalering, indtræffer inden for minutter efter TCR aktivering. Dette inducerer dannelsen af de immunologiske synapse, en stereotype celle-celle junction, der regulerer T-celle aktivering og veje mål effektor svar. For at studere disse processer effektivt, er en billeddannelse tilgang, der er skræddersyet til at indfange hurtig, polariseret svar nødvendigt. Denne protokol beskriver et sådant system, som er baseret på et photoactivatable peptid-major histocompatibility complex (pMHC) der er ikke-stimulerende, indtil den udsættes for ultraviolet lys. Målrettet decaging af dette reagens under videomicroscopy eksperimenter giver præcise spatiotemporelle kontrol af TCR aktivering og høj opløsning overvågning af efterfølgende cellulære svar af total interne reflection (JOHANNAS) imaging. Denne tilgang er også kompatibel med genetiske og farmakologiske undertrykkelse af netbårne strategier. Dette giver mulighed for samling af veldefinerede molekylære veje, der forbinder TCR signalering til dannelsen af de polariserede cytoskeletal strukturer, der ligger bag den immunologiske synapse.
Introduction
T-lymfocytter (T-celler) spiller en central rolle i cellulær immunitet ved at anerkende antigene peptider vises i forbindelse med celleoverfladen MHC. Antigen anerkendelse, hvilket er medieret af TCR, drev differentiering af naive T celler og fremmer levering af cytolytisk og kommunikative svar af effektor populationer. TCR engagement også inducerer dramatiske ændringer i cellulære arkitektur. Inden for minutter gloms T-celler på den side af antigen-præsentere celler (APC), danner en polariseret grænseflade, kendt som immunologiske synapse (IS)1,2. ER potentiates T-celle effektor svar ved at aktivere retningsbestemt frigivelse af cytokiner eller, i tilfælde af cytotoksiske T-lymfocytter (CTL), lytisk proteiner, der ødelægger APC.
TCR engagement af pMHC inducerer den hurtige fosforylering af flere downstream adapter molekyler, herunder Linker til aktivering af T-celler (LAT), som i sidste ende fremmer robust remodellering af synaptic cytoskeleton2. Kortikale trådformede actin (F-actin) drev T celle sprede over APC overflade, og derefter løser ind i en ringformet struktur kendetegnet ved F-actin ophobning på IS periferien og udtynding fra center. F-actin ring dannelse er tæt koblet til omlægning af mikrotubulus organisering center (MTOC, også kaldet centrosome i T-celler) til en position lige under midten af grænsefladen. Begge begivenheder ske inden for få minutter af første antigen anerkendelse og etablere den arkitektoniske sammenhæng i hvilke efterfølgende aktivering begivenheder og effektor svar opstår.
For at studere er dannelsen, har forskellige labs udviklet metoder hvor APC er erstattet af en glasoverflade, der enten indeholder immobiliseret TCR ligander eller understøtter en lipid tolagede at selv indeholder ligander3,4. T-celler danner IS-lignende kontakter på disse overflader, der kan være afbildet af total interne reflection fluorescens mikroskop (JOHANNAS) eller Konfokal mikroskopi, gør det muligt for høj opløsning studier af tidlige T-celle aktivering og er dannelse.
Selv om disse tilgange har tilladt for fremragende visualisering af den færdigsamlede er, opstår meget af den signaling følgende TCR:pMHC ligatur inden for sekunder, komplicerer bestræbelserne på at bestemme rækkefølgen af begivenhederne efter TCR aktivering præcist . For at omgå dette problem, er blevet udviklet en photoactivation tilgang, hvor photoactivatable pMHC anvendes til at opnå spatiotemporelle kontrol af TCR aktivering5,6,7. I dette system, er T-celler knyttet til glasoverflader indeholdende photoactivatable pMHC, der er ikke-stimulerende til TCR indtil bestråles med ultraviolet (UV) lys. UV-bestråling af en micron mellemstore region af overfladen under T-celle fjerner photocage at skabe et stimulerende zone, der kan genkendes af T-celle. Efterfølgende signalering begivenheder og cytoskeletal remodellering er derefter overvåges ved hjælp af genetisk kodet fluorescerende journalister. To photoactivatable versioner af antigene peptider, møl cytokrom c88-103 (MCC) og ægalbumin257-264 (æg), som er fremlagt i forbindelse med klasse II MHC-Ek og klassen jeg MHC H2-Kb, henholdsvis, har været udviklet (figur 1). Dette muliggør analysen af begge CD4+ T-celler specifikke for MCC-I-Ek (udtrykker 5 C. C7, 2B4, eller og TCRs) og CD8+ T-celler specifikke for æg-H2-Kb (udtrykker OT1 TCR).
TCR photoactivation og imaging tilgang i det sidste årti, er blevet udnyttet til at fastsætte den præcise kinetik af tidlige TCR signalering trin og også til at identificere de molekylære veje for polariseret cytoskeletal remodeling5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. For eksempel analysen var medvirkende til bestemmelse af denne centrosome nyorientering mod APC er medieret af en lokaliseret gradient af lipid second messenger diacylglycerol centreret på IS. Det forventes, at denne metode fortsat vil være værdifuld for programmer, der kræver høj opløsning imaging analyse af T cellefunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af stimulerende glasoverflader
- Frakke otte-brønds chambered daekglas med biotinylated poly-L-lysin (Bio-PLL) fortyndet til 1: 500 i destilleret, deioniseret vand (ddH2O). Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur (RT).
- Vask med H2O.
- Tør i 2 timer ved RT.
- Blok Bio-PLL belagt overflader med blokerende buffer (HEPES-bufferet saltvand [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], med 2% BSA) for 30 min. ved RT.
- Opløses 5 mg af poly-L-lysin hydrobromid i 1 mL af 10 mM NaPO4, pH 8,5.
- Tilsæt 125 μmol (0,55 mg) af NHS-biotin (fra en 100 mg/mL bestand i DMSO) og kontrollere pH i reaktionen. Hvis pH er nedenfor 8,5, tilsættes 2 μl af 4 N NaOH til at hæve det til mellem pH 8,5 og 9,5.
- Vortex i 30 min.
- Dæmpning reaktion med 50 μL af 100 mM glycin opløst i 20 mM Tris pH 8,0.
- Spin på fuld kraft i 10 min og overføre supernatanten til en ny tube.
Bemærk: Bio-PLL kvalitet er typisk sammenlignet med tidligere præparater af belægning serie to-Folds fortyndinger af materiale på en 96-vel ELISA tallerken og kvantificere biotin indhold efter inkubation med alkalisk fosfatase kombineret streptavidin.
- Fjern blokerende buffer. Lad ikke brøndene tørre. Tilføje streptavidin (100 µg/mL i blokerende buffer). Inkuber i 1 time ved 4 ° C.
- Vaske i HBS. Fylde og invertere kammer dias wells 4 - 5 gange, fjerne HBS fra brøndene. Lad ikke brøndene tørre.
- Tilføj biotinylated pMHC ligander og adhæsionsmolekyler på overfladen.
Bemærk: MCC og æg kan være photocaged ved at tilføje ortho-nitrobenzyl baseret beskyttelse grupper (f.eks. nitrophenylethyl (NPE) eller nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) til ε-amino gruppen af centrale lysines (K12 i MCC, K7 i æg). Photocaged MCC og æg kan fås fra kommercielle leverandører. Efter rekonstituering i vandig buffer, er de refolded i bacterially udtrykt-Ek og H2-Kb ved hjælp af etablerede fremgangsmåder11,12. - Validering af photoactivatable MCC eller æg peptid
- Decage NVOC-beskyttet peptider af UV bestråling med en håndholdt UV-lampe (Se Tabel af materialer) i 20 min. på RT.
- Puls 1,0 x 105 PMV'er med 1 µM af nonstimulatory peptid (negativ kontrol, fx Hb), ubestrålet photoactivatable peptid, bestrålede photoactivatable peptid, og agonist peptid (positiv kontrol, fxMCC) i 1 time til natten over ved 37 ° C.
- At stimulere T celler udtrykker 5C. 2B4-C7-og TCR, bruge CH12 eller CH27 B celler. For at stimulere OT1 T-celler, bruge RMA-s eller EL4 tymom celler.
- Bland de pulserende PMV'er med et tilsvarende antal T-celler i 96-brønd runde nederst plader på en endelige mængden af 200 µL. der inkuberes ved 37 ° C i 12-24 timer.
- Genskab analysere fra hver brønd og analysere IL-2 ved ELISA med streptavidin-peberrod peroxidase kolorimetrisk detektion.
Bemærk: Bekræftelse af alle peptider ved electrospray massespektrometri før hvorved man genfolder i MHC komplekser, anbringelse i bur status anbefales kraftigt.
- Udføre foldning og rensning af MHC for at minimere eksponering for lys. For eksempel, wrap folde reaktioner i aluminiumsfolie og udføre gel filtrering kromatografi med UV-lampe ud.
Bemærk: Det er blevet fundet at photoactivatable MCC-I-Ek og æg - H2-Kb fremkalde UV uafhængige T-celle aktivering med høj tæthed, muligvis på grund af ufuldstændig funktionel bure. Derfor er photoactivatable pMHC fortyndet i en 10-30 x overskud af nonstimulatory pMHC (f.eks. -Ek der indeholder hæmoglobin64-76 peptid (Hb)) under trinnet immobilisering. Dette øger signalet støjforhold af den efterfølgende imaging eksperiment. - Til photoactivate CD4+ T celler, kollektivt bruger en blanding af biotinylated Hb-jeg-Ek (3 µg/mL), biotinylated photoactivatable MCC-I-Ek (0,1 µg/mL) og biotinylated antistof mod klassen jeg MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). anti-H2-Kk antistof tilskynder 5 C. C7/2B4/og T celler, der giver udtryk for H2-Kk, at spredes på glasoverfladen uden at undergå aktivering.
- For CD8+ T celler, bruge en blanding af biotinylated H2-Db bærer peptid KAVYDFATL (1 µg/mL), biotinylated photoactivatable æg-H2-Kb (0,1 µg/mL), og det ekstracellulære domæne vedhæftning molekyle ICAM-1 (2 µg/mL produceret af insekt celle kultur13). ICAM-1 tilskynder tæt kontakt dannelsen af engagerende integrin LFA1 på T-celle overflade.
- Gælde alle protein blandinger i blokerende buffer, efterfulgt af inkubation i 1 h i RT eller mindst 2 h ved 4 ° C.
Bemærk: Den molekylære tæthed på overflader af denne art at være ~ 8000 per µm2 har været tidligere beregnede6. Photoactivatable pMHC repræsenterer ~1/30 vilth biotinylated protein på overfladen, dens massefylde være ~ 267 molekyler per µm2, før decaging. - Vask som i trin 1,6 og forlade i HBS indtil klar til brug.
- Tilføje 200.000 CD4+ eller CD8+ T celler udtrykker den passende TCR i hver brønd og tillade celler til at overholde ved 37 ° C i 15 min. Når celler har tilknyttet og spredes på overfladen, er de klar til photoactivation og billedbehandling.
Bemærk: Retroviral transduktion af effektor T celler med fluorescerende imaging sonder er beskrevet i detaljer elswhere6,7. Calcium signalering kan også studeres ved hjælp af untransduced T celler fyldt med calcium følsomme farvestof Fluo-46. Ratiometric farvestoffet Fura-2 anbefales ikke, fordi det kræver excitation i UV-området, som også inducerer decaging af photoactivatable pMHC.
2. billede erhvervelse
- Bruge en inverteret JOHANNAS mikroskop udstyret med en UV kompatibel 150 X mål linse til billede erhvervelse. UV bestråle bruger-definerede områder ved hjælp af en digital membran system knyttet til en 100 W kviksølv lampe (HBO). Direkte UV-lys fra denne lampe på prøven ved hjælp af en 400 nm lang pass spejl.
- Brug billede analyse software for lokaliserede photoactivation og time-lapse erhvervelse. I de fleste eksperimenter, overvåge sonder i både grøn og rød kanaler ved hjælp af 488 nm og 561 nm excitation lasere, henholdsvis. Laserlys er rettet ind på prøven ved hjælp af en dual-bandpass dichroic spejl, der også sender i rækken UV (at decaging). Se venligst Tabellen af materialer og figur 6 for yderligere oplysninger om konfiguration af mikroskop.
- Efter montering af diasset afdeling T celler, justere indstillingerne for at få JOHANNAS eller epifluorescensmikroskop belysning, som nødvendigt. I live-mode, skal du vælge et område af celler, der udtrykker den fluorescerende sonderne af interesse. Etablere micron-skala regioner for photoactivation under enkelte celler ved hjælp af software kontrol.
- Begynde time-lapse erhvervelse. Typisk, 80 timepoints er opnået, med et interval på 5 s mellem hvert tidspunkt. Dette giver mere end nok tid til sekventielle 488 nm og 563 nm engagementer, for dobbelt farve eksperimenter.
- Efter 10 timepoints, photoactivate de udvalgte regioner ved at åbne digital mellemgulvet lukkertid til 1-1,5 s.
- Når tiden er fuldført, skal du vælge et nyt felt af celler og gentage processen.
3. dataanalyse
Bemærk: Lokaliseret photoactivation af immobiliserede ligander skaber en veldefineret, stationære stimulerende-regionen, der kan bruges til kvantitativ analyse af signalering svar og cytoskeletal remodeling begivenheder. Analyse protokoller typisk involverer enten kvantificere fluorescens intensitet inden for det bestrålede område eller ved hjælp af det bestrålede område som en positionel slutpunkt for distance målinger (fx. til vurdering af polarisering af centrosome til den bestrålede område). Begge analyser protokoller er beskrevet nedenfor. Forskellige interaktive billede analyse programmer kan bruges til at lave intensitet og afstandsmålinger, som derefter kan output for yderligere behandling og analyse.
-
Fluorescens intensitet
- Bestemme fluorescens intensitet (FI) af en baggrund region uden for cellen (FIb). Dette vil blive brugt for baggrundskorrektion.
- Tegne en micron mellemstore firkantede region uden for cellen og laver en maske. Bestem fluorescens-intensiteten ved klik på analyser | Maskere statistik. Vælg Betyde fluorescens intensitet og eksportere værdierne.
Bemærk: Proceduremæssige detaljer (fx 3.1.1.1) henviser til Slidebook software (Se Tabel af materialer). Gennemførelsen af denne protokol, ved hjælp af andre software-pakker (fx., FIJI) vil være lidt anderledes.
- Tegne en micron mellemstore firkantede region uden for cellen og laver en maske. Bestem fluorescens-intensiteten ved klik på analyser | Maskere statistik. Vælg Betyde fluorescens intensitet og eksportere værdierne.
- Bestemme FI inden for regionen photoactivated for hvert tidspunkt.
- Vælg maske til at fremhæve det område, der var photoactivated. Bestem fluorescens-intensiteten ved klik på analyser | Maskere statistik. Vælg Betyde fluorescens intensitet og eksportere værdierne.
- Subtrahere baggrund FI fra de målte FI værdier inden for regionen. Derefter, normalisere de korrigerede FI målinger ved at dividere med gennemsnitlige, baggrundskorrigeret FI for de første 9 rammer før photoactivation. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)).
NOTE: Grafen ΔF/F som funktion af tiden.
- Bestemme fluorescens intensitet (FI) af en baggrund region uden for cellen (FIb). Dette vil blive brugt for baggrundskorrektion.
-
Afstand
- Få x og y koordinater for centrum af photoactivated regionen.
- At bestemme x og y koordinater for centrum af regionen photoactivated Vælg maske til at fremhæve det område, der var photoactivated. Når region af photoactivation er fremhævet, skal du vælge analyser | Maskere statistikker | Centrum af området og eksportere værdierne.
- Bestemme x og y koordinater for fluorescerende sonden af interesse for hvert tidspunkt. Dette opnås typisk via enten manuel eller automatiske partikel sporing.
- At bestemme x og y koordinater af fluorescerende sonden af interesse, skal du vælge Manuel partikel Tracking og klik på fluorescerende sonden af interesse over tid. Når alle tidspunkter er blevet sporet, skal du vælge analyser | Maskere statistikker | Centrum af området og eksportere værdierne.
- Beregne afstanden mellem de fluorescerende proteiner af interesse og midten af regionen photoactivated for hvert tidspunkt ved hjælp af ligningen: afstanden = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), hvor x2 og y er2 den fluorescerende proteiner af interesse og x1 og y1 koordinaterne koordinaterne for midten af photoactivated regionen.
- Graf afstand som funktion af tiden.
- Få x og y koordinater for centrum af photoactivated regionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Photoactivation og imaging tilgang giver mulighed for observation og letkøbt kvantificering af hurtige, polariseret signaling svar. Til at illustrere sine kapaciteter, gengivet her er et eksperiment, der undersøger den spatiotemporelle korrelation mellem TCR-induceret DAG ophobning og centrosome reorientering. 5C. C7 T celle eksplosionerne var Retroviralt transduced med to fluorescerende reportere: en DAG biosensor indeholdende tandem C1 domæner fra protein kinase C-θ knyttet til normal god landbrugspraksis (C1-normal god landbrugspraksis) og RFP-tubulin til at overvåge centrosome. T-celler blev derefter tilknyttet chambered daekglas indeholdende photoactivatable MCC-I-Ek. C1-normal god landbrugspraksis var afbildet med JOHANNAS mikroskopi og RFP-tubulin i epifluorescensmikroskop tilstand. Som vist i figur 2, inducerer lokaliserede photoactivation af overfladen under T-celle ophobning af DAG i det bestrålede område. Dette efterfølges i sekunder ved omlaegningen af centrosome til samme region.
C1 NGL ophobning kan kvantificeres ved beregningen af normaliserede fluorescens-intensiteten efter baggrundskorrektion midt i regionen photoactivated over tid (figur 3). Centrosome omlægning som svar på photoactivation kan kvantificeres ved beregningen af afstanden mellem centrosome og midt i regionen photoactivated som funktion af tiden (figur 4).
Denne metode kan bruges til at undersøge en bred vifte af hurtige, polariseret signaling svar, hovedsagelig noget, der kan overvåges ved hjælp af en fluorescerende sonde. For eksempel, TCR photoactivation er udnyttet til at overvåge tidlige signalering microcluster dannelse ved hjælp af fluorescently mærket Grb2 (Grb2-NGL) (figur 5). Lig DAG ophobning og centrosome nyorientering svar, Grb2-NGL polarisering sker kort tid efter photoactivation (figur 5), og kan kvantificeres ved hjælp af normaliserede fluorescens intensitet tilgang.
Figur 1: Photoactivation system ved hjælp af photocaged MCC peptid.
(A) Photocaged strategi for MCC peptid. En NPE gruppe er knyttet til lysin rester af MCC peptid. UV-bestråling resulterer i fjernelse af NPE, genoprette MCC til sin oprindelige form. (B) når NPE er bundet til MCC, 5 C. C7 TCR kan ikke binde sig til MCC. Fjernelse af NPE resulterer i erkendelse af 5 C. C7 TCR til de indfødte MCC peptid. (C) photocaged strategien er blevet tilpasset for at arbejde med CD8 + T celler, hvor photocaged æg peptid bruges til at aktivere OT-1 TCR ved UV-bestråling.
Figur 2: Time-lapse montage af DAG ophobning og centrosome nyorientering efter photoactivation af TCR i 5C. C7 T celle.
5C. C7 celle udtrykker en DAG biosensor, der indeholder tandem C1-domæner af PKC-smeltet til normal god landbrugspraksis (C1-normal god landbrugspraksis) og Tag-RFP Tubulin (RFP-badekar), en fluorescerende reporter for centrosome. Montager illustrere den polariserede svar af 5C. C7 T celler over tid. Gule ovale og tekst angiver det tidspunkt og sted for photoactivation. Over tid ophobes C1 NGL i regionen photoactivated, efterfulgt af centrosome nyorientering mod photoactivated området. Skalalinjen: 10 µm.
Figur 3: Kvantificering af DAG ophobning på regionen photoactivated
DAG, C1-normal god landbrugspraksis, ophobning i regionen photoactivated (til venstre) kan kvantificeres ved beregningen af normaliserede fluorescens-intensiteten efter baggrundskorrektion, på regionen photoactivated (gul cirkel med blå skygge) over tid. Dataene er normaliseret i forhold til de ni rammer opnået lige før photoactivation. C1 NGL berigelse på regionen photoactivated kan beregnes ved division af den gennemsnitlige fluorescens intensitet i det bestrålede område af gennemsnitlig fluorescens-intensiteten af hele cellen, efter baggrundskorrektion. Ligning: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), kan bruges til at beregne normaliseret fluorescens-intensiteten i hvilke FI er gennemsnitlig fluorescens-intensiteten. Normaliserede fluorescens-intensiteten på regionen photoactivated kan derefter grafen som funktion af tiden (til højre). Lilla linje angiver tidspunktet for photoactivation. Skalalinjen: 10 µm.
Figur 4: Kvantificering af centrosome nyorientering.
Bestem koordinaterne for centrosome (RFP-badekar) over tid ved manuelt spore stien centrosome mod photoactivated-regionen (hvid pil) ved hvert tidspunkt (venstre). Bestemme koordinaterne for midten af regionen photoactivated (gul cirkel). Afstanden mellem centrosome og midt i regionen photoactivated kan beregnes for hvert tidspunkt ved hjælp af ligningen for afstand = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), hvor x2 og y 2 x og y koordinater for midt i området af centrosome, og x1 og y1 er x og y koordinater for centrum af photoactivated regionen. Afstand af centrosome fra midten af regionen photoactivated på hver gang punkt kan derefter være grafen som funktion af tiden (til højre). Lilla linje angiver tidspunktet for photoactivation. Skalalinjen: 10 µm.
Figur 5: Grb2-NGL microcluster dannelse.
(A) repræsentant 5C. C7 celle udtrykker fluorescently mærket Grb2 (Grb2-NGL). Montager illustrere den polariserede svar Grb2-NGL overarbejde. Gule ovale og tekst angiver det tidspunkt og sted for photoactivation. Over tid ophobes Grb2-NGL på photoactivated området. B kvantificering af Grb2-NGL fluorescens intensitet på regionen photoactivated over tid. N = 15 celler. C kvantificering af Grb2-NGL fluorescens intensitet i en kontrol region uden for photoactivated zonen. N = 15 celler.
Figur 6: Mikroskop konfiguration for photoactivation og JOHANNAS billeddannelse.
488 nm og 561 nm lasere anvendes til JOHANNAS og epifluorescensmikroskop billeddannelse af grønne og røde sonder, henholdsvis. UV-lys for photoactivation er taget fra en kviksølv (Hg) lampe knyttet til en digital membran system i stand til at lysende lille, bruger-definerede regioner. Lys fra Hg lampe/membran afspejles på prøven ved et longpass spejl placeret under den dichroic spejl, der afspejler de billeddiagnostiske lasere. Den dichroic spejl skal være konstrueret til at passere UV lys. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de seneste år opstået lys som et udmærket redskab for spatiotemporally kontrolleret aktivering af cellulære processer. Forskellige metoder er blevet udviklet, hver med tilhørende fordele og ulemper. Systemet beskrives her, som er baseret på decaging af immobiliserede, ekstracellulære ligander, er velegnet til analyse af hurtige, subcellulært, polariseret signaling svar. Denne tilgang er blevet anvendt til at undersøge er dannelse i T celler som beskrevet ovenfor. Derudover har bur ligander til andre receptorer været manipuleret, så vi kan anvende den samme strategi for at vurdere hæmmende signalering i naturlige dræber celler og nukleare translokation af transkriptionsfaktor NF-κB i svar til toll som receptor signalering14,15.
I denne protokol, er stimulerende ligander immobiliseret for at sikre, at de forbliver som en stationær, polariseret kilde til stimulation for varigheden af den billeddiagnostiske eksperiment. Denne metode er velegnet til studier af celle polarisering. Det skal dog bemærkes, at TCR photoactivation tilgang er let tilpasses til tidsligt kontrolleret T-celle aktivering på understøttede lipid dobbeltlag. Naturligvis kan man opnå vedvarende, polariseret stimulation i denne sammenhæng. Dette kan være unødvendig, men givet de eksperimentelle mål.
Systemet er også ganske fleksible med hensyn til UV-lyskilden til decaging. I øjeblikket, bruges en 100 W Hg-lampe til målrettet belysning, men en pulserende kvælstof laser (pulse bredde 4 ns, puls energy 120 mJ), var tidligere anvendte6. Til tider, en håndholdt UV-lampe (365 nm, 4 W) har været placeret over imaging prøven for at decage større regioner af photostimulatable ligand. De specifikke funktioner i det decaging system afhænger i hvert enkelt tilfælde af de tekniske krav i det pågældende eksperiment.
Når du implementerer dette system, er det vigtigt at bekræfte, at de observerede responser er specifikke for photoactivation begivenheden, og ikke resultatet af spurious receptor aktivering eller UV-induceret solskader. For at udelukke disse artefakter, kan to specificitet kontrol udføres. Først, fluorescens intensitet i celler, der ikke er direkte bestrålet under photoactivation eksperimenter kan overvåges. Hvis overfladen er korrekt bur, mærkbare observeres reaktioner i disse celler ikke (f.eks. figur 5 c). Andet, kan der udføres eksperimenter i hvilke T celler er UV-bestråling på overflader mangler photoactivatable ligander. Denne kontrol er vigtig for identificering af UV-induceret virkninger, der er uafhængige af photoactivatable ligand (for eksempel Se reference 6). Under systemoptimering er det også meget nyttigt at have ved hånden en robust cellulære imaging-svar (f.eks. Grb2-NGL rekruttering), der er både hurtig og lokaliserede. Vurdering af sammenhænge mellem signalering begivenheder og photoactivation er langt mere ligetil, hvis disse begivenheder er spatiotemporally proksimalt for receptor stimulation.
Selv om photoactivation tilgangen tilbyder udsøgte spatiotemporelle kontrol over receptor signalering, mangler det tilpasningsevne ydes af transfectable optogenetic systemer16,17,18,19 ,20,21,22. Visse optogenetic proteiner er også photoreversible, at give betinget kontrol, der ikke er tilgængelig med den photoactivation fremgangsmåde beskrevet her. I optogenetic systemer, men er begrænse udbredelsen af photoactivated proteiner teknisk udfordrende. Dette komplicerer analysen af polariseret signalering, især i forbindelse med subcellulært.
Man bør også bemærke, at den engagerende enhed for dette photoactivation system er en glasoverflade, som ikke kan sammenfatte alle aspekter af en bona fide celle-celle interaktion. For at omgå dette problem samtidig opretholde spatiotemporelle kontrol af signal indledning, har efterforskere brugt en optisk fælde system til at bringe en APC i kontakt med en T-celle, giver mulighed for udbrud af cytoskeletal rearrangementer og IS modning skal visualiseret i realtid23. Selv om dette system muliggør præcis indledning og visualisering af cytoskeletal dynamics ved hjælp af en faktiske APC, det er forholdsvis lav dataoverførselshastighed og er ikke kompatibel med JOHANNAS belysning, der negativt påvirker billedkvaliteten.
Afslutningsvis, giver i denne protokol beskrevne metode spatiotemporelle kontrol af TCR-induceret signalering inden for T-celle, i sidste ende giver mulighed for belysning af de hurtigt biokemiske ændringer efter TCR aktivering. Dette system giver os et middel til bedre at forstå hvordan signaling begivenhederne efter TCR aktivering fremme T-celle polarisering, er dannelse og i sidste ende levering af effektor svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke medlemmerne af Huse lab for rådgivning og bistand. Støttet af U.S. National Institutes sundhed (R01-AI087644 til M.H.) og P30-CA008748 til Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
