Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist

Published: April 25, 2018 doi: 10.3791/56655
Automatic Translation
1,2, 1
1Immunology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Weill-Cornell Graduate School of Medical Sciences

Summary

Dit protocol beschrijft een imaging gebaseerde methode om te activeren met behulp van photoactivatable peptide-MHC, waardoor nauwkeurige Spatio controle van T cel activatie van T-lymfocyten.

Abstract

T-lymfocyten zich bezighouden met het snelle, gepolariseerde signalering, die zich voordoen binnen enkele minuten na activering van de TCR. Dit induceert de vorming van de immunologische SYNAPS, een stereotiepe cel-cel-knooppunt dat regelt van T cel activatie en gerichte doelen effector reacties. Deze processen effectief studeren, is een imaging aanpak die is aangepast voor het vastleggen van snelle, gepolariseerde antwoorden nodig. Dit protocol beschrijft een dergelijk systeem, dat gebaseerd is op een photoactivatable peptide-major histocompatibility complex (pMHC) dat is niet-stimulerend totdat het wordt blootgesteld aan ultraviolet licht. Gerichte decaging van dit reagens tijdens videomicroscopy experimenten kan nauwkeurige Spatio controle van TCR activering en hoge resolutie controle van latere cellulaire reacties door de totale interne reflectie (TIRF) imaging. Deze aanpak is ook compatibel met genetische en farmacologische perturbation strategieën. Dit zorgt voor de vergadering van welomschreven moleculaire trajecten die link TCR signalering tot de vorming van de gepolariseerde cytoskeletal structuren die ten grondslag liggen aan de immunologische synaps.

Introduction

T-lymfocyten (T-cellen) spelen een centrale rol in de cellulaire immuniteit door de erkenning van de antigene peptiden in het kader van het celoppervlak MHC weergegeven. Antigeen erkenning, dat is bemiddeld door de TCR, drijft de differentiatie van naïeve T cellen en bevordert de levering van de cytolytische en communicatieve antwoorden van effector populaties. TCR betrokkenheid induceert ook dramatische veranderingen in cellulaire architectuur. Binnen enkele minuten de T-cellen gloms op de kant van de antigeen-presenteren cel (APC), vormen een gepolariseerde interface genoemd de immunologische synapse (IS)1,2. Het IS potentiates T cel effector reacties doordat de directionele release van cytokines of, in het geval van cytotoxische T-lymfocyten (CTL's), lytische eiwitten die de APC vernietigen.

TCR betrokkenheid door pMHC induceert de snelle fosforylatie van meerdere stroomafwaartse adapter moleculen, met inbegrip van de Linker voor de activering van T-cellen (LAT), die uiteindelijk bevordert robuuste remodelleren van de synaptische cytoskelet2. Corticale filamenteuze actine (F-actine) T cel verspreiden over het oppervlak van de APC-stations, en vervolgens moet omzetten naar een ringvormige structuur gekenmerkt door ophoping van de F-actine onderaan de IS periferie en de uitputting van het centrum. F-actine ring vorming is het strak gekoppeld aan de heroriëntering van het organiserende centrum van microtubuli (MTOC, ook wel de centrosoom in T-cellen) naar een positie net onder het midden van de interface. Beide gebeurtenissen zich voordoen binnen enkele minuten van de eerste antigeen erkenning en stellen de architecturale context waarin de activering van de daaropvolgende gebeurtenissen en effector reacties optreden.

Studeren IS vorming, hebben verschillende labs benaderingen waarbij de APC is vervangen door een glazen oppervlak, dat geïmmobiliseerdet TCR liganden bevat of ondersteunt een lipide dubbelgelaagde dat zelf de liganden3,4 bevatontwikkeld. T-cellen vormen IS-achtige contacten op deze oppervlakken die image kunnen worden gemaakt door de totale interne reflectie fluorescentie Microscoop (TIRF) of confocale microscopie, waardoor hoge resolutie studies van vroege T-cel activatie en IS vorming.

Hoewel deze benaderingen hebben toegestaan voor uitstekende visualisatie van het volledig geassembleerde IS, plaatsvindt veel van de signalering volgende TCR:pMHC afbinding binnen seconden, complicerende inspanningen om te bepalen van de volgorde van de gebeurtenissen na de activering van de TCR nauwkeurig . Om dit probleem te omzeilen, een photoactivation aanpak ontwikkeld, waarin photoactivatable pMHC wordt gebruikt om spatio controle over TCR activering5,6,7. In dit systeem, zijn T-cellen gekoppeld aan glazen oppervlakken met photoactivatable pMHC thats niet-stimulerend voor de TCR totdat bestraald met ultraviolet (UV) licht. UV bestraling van een regio van de micron grootte van het oppervlak onder de T cel verwijdert het creëren van een stimulerend zone die kan worden herkend door de T-cel photocage. Daaropvolgende signalering gebeurtenissen en cytoskeletal remodeling worden vervolgens gecontroleerd met behulp van genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggevers. Twee versies van de photoactivatable van antigene peptides, nachtvlinder cytochroom c88-103 (MCC) en ovoalbumine257-264 (OVA), die worden gepresenteerd in het kader van de klasse II MHC-Ek en de klasse ik MHC H2-Kb, respectievelijk, zijn geweest ontwikkeld (Figuur 1). Dit maakt de analyse van beide CD4+ T cellen specifiek voor MCC-ik-Ek (uiting van de 5 C. C7, 2B4, of en TCRs) en CD8+ T cellen specifiek voor eicellen-H2-Kb (uiten de OT1 TCR).

In het afgelopen decennium, is de TCR photoactivation en imaging aanpak gebruikt om de precieze kinetiek van vroege TCR signalering stappen, en ook om te identificeren van de moleculaire pathways bestuur gepolariseerde cytoskeletal remodelleert5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. de bepaling was bijvoorbeeld instrumentaal bij het bepalen van die centrosoom heroriëntatie naar de APC wordt gemedieerd door een gelokaliseerde verloop van het lipide tweede boodschapper diacylglycerol gecentreerd op de IS. Verwacht wordt dat deze methode zal waardevol zijn voor toepassingen die hoge resolutie beeldvormende analyse van T-cel functie vereisen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van stimulerend glazen oppervlakken

  1. Jas acht-well chambered dekglaasje met biotinyleerd poly-L-lysine (Bio-PLL) verdund 1:500 in gedestilleerd, gedeïoniseerd water (ddH2van O). Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  2. Wassen met H2O.
  3. Droog voor 2 h op RT.
  4. Blok Bio-PLL gecoate oppervlakken met een blokkeerbuffer (HEPES-gebufferde zoutoplossing [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], met 2% BSA) voor 30 min op RT.
    1. Los 5 mg poly-L-lysine hydrobromide in 1 mL 10 mM NaPO4, pH 8,5.
    2. Voeg 125 μmol (0.55 mg) van de NHS-Biotine (uit een voorraad van 100 mg/mL in DMSO) en controleer de pH van de reactie. Als de pH lager dan 8,5 is, voeg 2 l 4 N NaOH te verhogen naar tussen pH 8,5 en 9.5.
    3. Vortex gedurende 30 minuten.
    4. De reactie met 50 μl van 100 mM glycine opgelost in 20 mM Tris pH 8,0 doven.
    5. Draaien op volle kracht gedurende 10 minuten en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis.
      Opmerking: Bio-PLL kwaliteit wordt meestal vergeleken met eerdere voorbereidingen door coating seriële tweevoudige verdunningen van het materiaal op een 96-Wells-ELISA-plaat en kwantificeren van biotine inhoud na incubatie met alkalische fosfatase combinatie daar.
  5. Buffer met blokkerend verwijderen. Laat geen putten te drogen. Voeg daar (100 µg/mL in blokkeerbuffer). Incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  6. Wassen in de HBS. Vul in en omkeren kamer dia wells 4 - 5 keer, het verwijderen van HBS uit de putten. Laat geen putten te drogen.
  7. Voeg de biotinyleerd pMHC liganden en celadhesie-moleculen naar de oppervlakte.
    Opmerking: MCC en eicellen kunnen worden photocaged door toevoeging van ortho-nitrobenzyl gebaseerd bescherming groepen (bijvoorbeeld nitrophenylethyl (NFE) of nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) aan de ε-amino groep van belangrijke lysines (K12 in MCC, K7 in eicellen). Photocaged MCC en eicellen kunnen worden verkregen van commerciële leveranciers. Na reconstitutie in waterige buffer, zijn ze refolded in bacterially uitgedrukt-E-k en H2-Kb met behulp van vastgestelde benaderingen11,12.
  8. Validatie van de MCC of eicellen peptide photoactivatable
    1. Decage NVOC-beschermd peptiden door UV bestralen met een handbediende UV-lamp (Zie Tabel of Materials) voor 20 min op RT.
    2. Pulse 1.0 x 105 APCs met 1 µM van nonstimulatory peptide (negatieve controle, bijvoorbeeld Hb), bestraalde photoactivatable peptide, peptide van bestraalde photoactivatable, en agonist peptide (positieve controle, bijvoorbeeld, MCC) voor 1 h overnachting bij 37 ° C.
    3. Ter stimulering van T cellen uiten de 5C. C7/2B4/en TCR, CH12 of CH27 B cellen gebruiken. Om te stimuleren OT1 T-cellen, door RMA-s of EL4 thymoom cellen te gebruiken.
    4. Meng de gepulste APCs met een gelijk aantal T-cellen in 96-Wells ronde bodem platen op een eindvolume van 200 µL. Incubeer bij 37 ° C gedurende 12-24 uur.
    5. Herstellen van het supernatant van elk putje en IL-2 door ELISA met streptavidine-horseradish peroxidase colorimetrische detectie te analyseren.
      Opmerking: Bevestiging van de caging status van alle peptiden door electrospray massaspectrometrie voorafgaand aan uiteinde naar MHC complexen, wordt sterk aanbevolen.
  9. Het uitvoeren van de vouwen en zuivering van MHC om te minimaliseren van de blootstelling aan licht. Bijvoorbeeld, wikkel vouwen reacties in aluminiumfolie en gel filtratie chromatografie verrichten met de UV-lamp uit.
    Opmerking: Het is gevonden dat photoactivatable MCC-ik-Ek en eicellen - H2-Kb induceren UV onafhankelijke T-cel activatie bij hoge dichtheid, mogelijk als gevolg van onvolledige functionele kooien. Vandaar, de photoactivatable pMHC wordt verdund in een 10-30 x overmaat van nonstimulatory pMHC (b.v. -Ek met de peptide64-76 hemoglobine (Hb)) tijdens de stap van immobilisatie. Dit verbetert de signaal / ruisverhouding van de latere imaging experiment.
  10. Te photoactivate CD4+ T cellen, collectief gebruik een mengsel van biotinyleerd Hb-ik-Ek (3 µg/mL), biotinyleerd photoactivatable MCC-ik-Ek (0,1 µg/mL) en biotinyleerd antilichaam tegen de klasse ik MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). het antilichaam van de anti-H2-Kk moedigt 5 C. C7/2B4/en T-cellen, die express H2-Kk, te verspreiden op het glazen oppervlak zonder activering ondergaan.
  11. Voor CD8+ T cellen, gebruik een mengsel van H2-Db rekening houdend met de peptide KAVYDFATL biotinyleerd (1 µg/mL), biotinyleerd photoactivatable eicellen-H2-Kb (0,1 µg/mL), en het extracellulaire domein van de adhesie molecuul ICAM-1 (2 µg Mo/mL geproduceerd door insecten cel cultuur13). De ICAM-1 moedigt nauwe contact vorming door de integrine LFA1 op het celoppervlak van de T.
  12. Toepassing van alle eiwitten mengsels in de blokkeerbuffer, gevolgd door incubatie gedurende 1 h op RT of ten minste 2 uur bij 4 ° C.
    Opmerking: Het moleculaire dichtheid op oppervlakken van dit soort worden ~ 8000 per µm2 geweest vooraf bepaalde6. Gezien het feit dat photoactivatable pMHC ~1/30 vertegenwoordigt zullenth van het biotinyleerd-eiwit op het oppervlak, de dichtheid ~ 267 moleculen per µm2, vóór decaging.
  13. Wassen zoals in stap 1.6 en verlaten in HBS tot klaar voor gebruik.
  14. Toevoegen van 200.000 CD4+ of CD8+ T cellen uiten de juiste TCR in elk putje en toestaan cellen te houden bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Zodra de cellen hebt aangesloten op en verspreid op het oppervlak, ze zijn klaar voor photoactivation en beeldbewerking.
    Opmerking: Retrovirale transductie van effector T cellen met fluorescerende imaging sondes in detail buitenaf6,7wordt beschreven. Calcium signalering kan ook worden bestudeerd met behulp van untransduced T-cellen geladen met de calcium-gevoelige kleurstof Fluo-4-6. De kleurstof ratiometric Fura-2 wordt afgeraden omdat het vereist excitatie in de UV-reeks, die ook induceert decaging van de photoactivatable pMHC.

2. de Beeldacquisitie

  1. Gebruik een omgekeerde TIRF Microscoop uitgerust met een objectief van UV compatibel 150 X voor Beeldacquisitie. UV bestralen gebruiker gedefinieerde regio's met een digitale membraan systeem gekoppeld aan een 100 W kwik lamp (HBO). Directe UV-licht van deze lamp op het monster met behulp van een 400 nm lange pass spiegel.
  2. Gebruik de software van de analyse van de afbeelding voor gelokaliseerde photoactivation en time-lapse overname. In de meeste experimenten, controleren sondes in de groene en rode kanalen met behulp van 488 nm en 561 nm excitatie lasers, respectievelijk. Laserlicht is gericht op het monster met behulp van een dual-Bandfilter dichroïde spiegel die ook in het UV-bereik doorgeeft (om decaging). Zie de Tabel van materialen en Figuur 6 voor aanvullende informatie over de configuratie van de Microscoop.
  3. Na het mounten van de dia van de kamer met de T-cellen, instellingen aanpassen zodat verkrijgen van TIRF of epifluorescence verlichting, als dit nodig is. In de live-modus, selecteert u een veld van cellen die zijn uiting van de fluorescerende probe(s) van belang. Micron-schaal gebieden voor photoactivation onder de individuele cellen met behulp van softwarecontrole vast.
  4. Time-lapse overname beginnen. Doorgaans 80 timepoints worden overgenomen, met een interval van 5 s tussen elk punt van de tijd. Dit laat meer dan genoeg tijd voor sequentiële 488 nm en 563 nm posities, in het geval van dubbele kleur experimenten.
  5. Na 10 timepoints, photoactivate de geselecteerde regio's door het openen van het digitale middenrif sluitertijd voor 1-1.5 s.
  6. Nadat de time-lapse voltooid is, selecteert u een nieuw veld van cellen en herhaal het proces.

3. de gegevensanalyse

Opmerking: Vertaalde photoactivation van geïmmobiliseerdet liganden maakt een welomschreven, stationaire stimulerend gebied dat kan worden gebruikt voor de kwantitatieve analyse van de reacties en cytoskeletal remodelleert evenementen signalering. Analyse protocollen zijn gewoonlijk kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie in het bestraalde gebied of met behulp van de bestraalde regio als een positionele eindpunt voor afstandsmetingen (bv. voor de beoordeling van de polarisatie van het centrosoom aan de bestraalde regio). Beide protocollen van de analyse worden hieronder beschreven. Diverse interactieve afbeelding analyse programma's kunnen worden gebruikt om intensiteit en afstandsmeting, die vervolgens uitgevoerd voor extra verwerking en analyse worden kunnen te maken.

  1. Intensiteit van de fluorescentie
    1. Het bepalen van de intensiteit van de fluorescentie (FI) van een gebied op de achtergrond buiten de cel (FIb). Dit zal worden gebruikt voor achtergrondcorrectie.
      1. Teken een micron middelgrote vierkante regio buiten de cel en maak een masker. Om te bepalen van de intensiteit van de fluorescentie, klik op de Analyze | Maskeren van statistieken. Selecteer Bedoel fluorescentie intensiteit en de waarden worden geëxporteerd.
        Opmerking: Procedurele details (bijvoorbeeld 3.1.1.1) verwijzen naar Slidebook software (Zie Tabel van materialen). Uitvoering van dit protocol, met behulp van andere softwarepakketten (bv., FIJI) zal er iets anders uitzien.
    2. Bepaal de FI binnen de photoactivated regio voor elk punt van de tijd.
      1. Selecteer masker wil de regio die photoactivated was. Om te bepalen van de intensiteit van de fluorescentie, klik op de Analyze | Maskeren van statistieken. Selecteer Bedoel fluorescentie intensiteit en de waarden worden geëxporteerd.
    3. Aftrekken van de achtergrond FI van de meetwaarden van de FI binnen de regio. Vervolgens het normaliseren van de gecorrigeerde FI metingen door te delen door het gemiddelde, achtergrond verbeterd FI van de eerste 9 frames voor photoactivation. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FI-b)).
      Opmerking: Grafiek ΔF/F als functie van de tijd.
  2. Afstand
    1. Verkrijgen van de x- en y-coördinaten van het middelpunt van de photoactivated-regio.
      1. Om de x en y coördinaten van het middelpunt van de regio photoactivated, selecteer masker wil de regio die photoactivated was. Zodra de regio van photoactivation wordt gemarkeerd, selecteert u analyseren | Maskeren van statistieken | Centrum voor gebied en de waarden worden geëxporteerd.
    2. Bepalen van de x- en y-coördinaten voor de fluorescente sonde van belang voor elk punt van de tijd. Dit wordt meestal bereikt door handmatige of geautomatiseerde deeltje bijhouden.
      1. Om te bepalen van de x- en y-coördinaten van de fluorescente sonde van belang, selecteer Handleiding Particle volgen en klik op de fluorescente sonde van belang na verloop van tijd. Zodra alle tijdstippen zijn bijgehouden, selecteer analyseren | Maskeren van statistieken | Centrum voor gebied en de waarden worden geëxporteerd.
    3. Berekenen van de afstand tussen de fluorescente proteïne van belang en het centrum van de photoactivated-regio voor elk punt van de tijd met behulp van de vergelijking: afstand = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), waarin x2 en y zijn2 de coördinaten van de fluorescente proteïne van belang en x1 en y1 zijn de coördinaten van het middelpunt van de photoactivated-regio.
    4. Grafiek de afstand als een functie van de tijd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De photoactivation en imaging aanpak zorgt voor observatie en facile kwantificering van snelle, gepolariseerde signalering antwoorden. Ter illustratie van de mogelijkheden, gereproduceerd hier is een experiment dat onderzoekt de spatio correlatie tussen TCR-geïnduceerde DAG accumulatie en centrosoom heroriëntatie. 5C. Waren retrovirally getransduceerde C7 T cel ontploffing met twee fluorescerende verslaggevers: een DAG biosensor met de tandem C1 domeinen van proteïne kinase C-θ gekoppeld aan GFP (C1-GFP) en RFP-tubuline te controleren van het centrosoom. De T-cellen werden vervolgens gekoppeld aan chambered dekglaasje met photoactivatable MCC-ik-Ek. C1-GFP werd beeld met behulp van TIRF microscopie en RFP-tubuline in epifluorescence modus. Zoals blijkt uit Figuur 2, induceert gelokaliseerde photoactivation van het oppervlak onder de T cel de accumulatie van de DAG in het bestraalde gebied. Dit wordt gevolgd binnen enkele seconden door de heroriëntering van het centrosoom tot een zelfde regio.

C1-GFP accumulatie kan worden gekwantificeerd door de berekening van de intensiteit van de genormaliseerde fluorescentie, na achtergrondcorrectie, in het midden van de photoactivated-regio na verloop van tijd (Figuur 3). Centrosoom heroriëntatie in reactie op photoactivation kan worden gekwantificeerd door het berekenen van de afstand tussen de centrosoom en het centrum van de photoactivated-regio als functie van de tijd (Figuur 4).

Deze methode kan worden gebruikt om te onderzoeken van een breed scala aan snelle, gepolariseerde signalering antwoorden, in feite om het even wat die kan worden gecontroleerd met behulp van een fluorescente sonde. Bijvoorbeeld, TCR photoactivation wordt gebruikt voor het controleren van de vroege signalering microcluster formatie met behulp van fluorescently geëtiketteerde Grb2 (Grb2-GFP) (Figuur 5). Gelijkaardig aan de DAG accumulatie en centrosoom heroriëntatie reacties, Grb2-GFP polarisatie optreedt kort na photoactivation (Figuur 5), en kan worden gekwantificeerd aan de hand van de benadering van de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit.

Figure 1
Figuur 1: Photoactivation systeem met behulp van photocaged MCC peptide.
(A) Photocaged strategie voor MCC peptide. Een groep van NPE is gekoppeld aan het lysine residu van de MCC-peptide. UV bestraling resulteert in de verwijdering van NPE, MCC herstellen naar zijn oorspronkelijke vorm. (B) bij het NFE is gebonden aan de MCC, de 5 C. C7 TCR binden niet aan MCC. Verwijdering van NPE resultaten ter erkenning van de 5 C. C7 TCR aan de inheemse MCC-peptide. (C) de photocaged strategie is aangepast om te werken met CD8 + T cellen, waarin photocaged eicellen peptide wordt gebruikt voor het activeren van de OT-1 TCR op UV-bestraling.

Figure 2
Figuur 2: Time-lapse montage DAG accumulatie en centrosoom heroriëntering na photoactivation van TCR in 5C. C7 T cel.
5C. C7 cel een DAG biosensor, met tandem C1-domeinen van PKC-gesmolten GFP (C1-GFP) en Tag-RFP tubuline (RFP-Tub), een fluorescerende verslaggever voor de centrosoom uitdrukken. De montages illustreren de gepolariseerde reactie van 5C. C7 T-cellen na verloop van tijd. De gele ovaal en de tekst geven de tijd en de locatie van photoactivation. Na verloop van tijd hoopt C1-GFP zich aan de photoactivated-regio, gevolgd door centrosoom heroriëntatie ten aanzien van de photoactivated-regio. Schaal bar: 10 µm.

Figure 3
Figuur 3: Kwantificering van de ophoping van de DAG onderaan de photoactivated-regio
De ophoping van de DAG, C1-GFP, onderaan de photoactivated regio (links) kan worden gekwantificeerd door de berekening van de intensiteit van de genormaliseerde fluorescentie, na achtergrondcorrectie, in de photoactivated regio (gele cirkel met blauwe arcering) na verloop van tijd. Gegevens worden genormaliseerd ten opzichte van de negen frames verkregen net voor photoactivation. C1-GFP verrijking op de photoactivated-regio kan worden berekend door de deling van de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie in het bestraalde gebied door de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde van de gehele cel, na achtergrondcorrectie. De vergelijking: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FI-b)), in welke FI is de gemiddelde fluorescentie-intensiteit, kan worden gebruikt voor de berekening van de intensiteit van de genormaliseerde fluorescentie. De intensiteit van de genormaliseerde fluorescentie bij de photoactivated-regio kan vervolgens worden opgenomen in een grafiek als een functie van de tijd (rechts). Paarse lijn geeft het de tijd van photoactivation. Schaal bar: 10 µm.

Figure 4
Figuur 4: Kwantificeren centrosoom heroriëntering.
Het bepalen van de coördinaten van het centrosoom (RFP-Tub) na verloop van tijd door het handmatig bijhouden van het centrosoom pad naar de photoactivated regio (witte pijl) op elk punt van de tijd (links). De coördinaten van het middelpunt van de regio photoactivated (gele cirkel) bepalen. De afstand tussen de centrosoom en het centrum van de photoactivated-regio kan worden berekend op elk punt van de tijd met behulp van de vergelijking voor afstand = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), waarin x2 en y 2 zijn de x en y-coördinaten van het middelpunt van de ruimte van het centrosoom en x1 en y1 zijn de x en y coördinaten van het middelpunt van de photoactivated-regio. De afstand van het centrosoom vanuit het midden van de photoactivated-regio op elk tijdstip punt kan vervolgens worden opgenomen in een grafiek als een functie van de tijd (rechts). Paarse lijn geeft het de tijd van photoactivation. Schaal bar: 10 µm.

Figure 5
Figuur 5: Grb2-GFP microcluster formatie.
(A) vertegenwoordiger 5C. C7 cel fluorescently uitdrukken met de naam Grb2 (Grb2-GFP). De montages illustreren de gepolariseerde reactie van Grb2-GFP overuren. De gele ovaal en de tekst geven de tijd en de locatie van photoactivation. Na verloop van tijd Grb2-GFP hoopt zich aan de photoactivated-regio. (B) kwantificering van Grb2-GFP intensiteit van de fluorescentie op de regio van de photoactivated na verloop van tijd. N = 15 cellen. (C) kwantificering van Grb2-GFP-intensiteit van de fluorescentie in een besturingselement regio buiten de zone van de photoactivated. N = 15 cellen.

Figure 6
Figuur 6: De configuratie van de Microscoop voor photoactivation en TIRF imaging.
488 nm en 561 nm lasers worden gebruikt voor TIRF en epifluorescence beeldvorming van groene en rode sondes, respectievelijk. UV-licht voor photoactivation is ontleend aan een kwik (Hg) lamp aangesloten op een digitale membraan systeem dat kan verhelderend kleine, door de gebruiker gedefinieerde regio's. Licht van het Hg lamp/middenrif wordt weerspiegeld op het monster door een spiegel van de longpass Geplaatst onder de dichroïde spiegel waarin de imaging lasers. De dichroïde spiegel moet worden bedoeld voor het doorsturen van UV licht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In de afgelopen jaren heeft licht ontpopt als een uitstekend hulpmiddel voor spatiotemporally gecontroleerde activering van cellulaire processen. Verschillende methoden zijn ontwikkeld, elk met de bijbehorende voordelen en nadelen. Het systeem hier beschreven, die is gebaseerd op de decaging van geïmmobiliseerdet, extracellulaire ligand, is bij uitstek geschikt voor de analyse van snelle, subcellular, gepolariseerde signalering reacties. Deze aanpak is vereffend te onderzoeken IS vorming in T cellen zoals hierboven beschreven. Bovendien hebben gekooide liganden voor andere receptoren ontworpen, zodat we kunnen het toepassen van dezelfde strategie te beoordelen remmende signalering in natuurlijke doden cellen en nucleaire translocatie van de transcriptiefactor NF-recombination in reactie op tol zoals receptor signalering van14,15.

In dit protocol zijn stimulerend liganden geïmmobiliseerd om ervoor te zorgen dat ze als een stationaire, gepolariseerde bron van stimulatie voor de duur van de beeldvorming experiment blijven. Deze aanpak is geschikt voor studies van cel polarisatie. Opgemerkt moet worden echter dat de TCR photoactivation aanpak gemakkelijk aan te passen voor stoffelijk gecontroleerde T-cel activatie op ondersteunde lipide bilayers is. Uiteraard kan een aanhoudende, gepolariseerde stimulatie in dit verband niet bereiken. Dit kan onnodige, echter krijgen de experimentele doelstellingen.

Het systeem is ook heel flexibel ten aanzien van de UV-lichtbron voor decaging. Op dit moment wordt een 100 W Hg-lamp gebruikt voor gerichte verlichting, maar een gepulseerde stikstof laser (puls breedte 4 ns, pulse energie 120 mJ) was eerder gebruikte6. Soms, een handbediende UV-lamp (365 nm, 4 W) over de beeldvorming monster heeft zijn geplaatst om te decage grotere regio's van photostimulatable ligand. De specifieke kenmerken van het decaging systeem hangt in elk geval de technische voorschriften van het experiment in kwestie.

Bij de uitvoering van dit systeem, is het belangrijk om te bevestigen dat de waargenomen reacties specifiek voor de photoactivation gebeurtenis, en niet het resultaat van valse receptor activering of UV-geïnduceerde photodamage zijn. Om uit te sluiten deze artefacten, kunnen twee specificiteit controles worden uitgevoerd. Eerst, de intensiteit van de fluorescentie in cellen die niet rechtstreeks worden bestraald tijdens photoactivation experimenten kan worden gecontroleerd. Indien de oppervlakte goed gekooide, merkbare moeten antwoorden in deze cellen niet worden geobserveerd (bijvoorbeeld figuur 5C). Ten tweede, experimenten in welke T cellen zijn UV-bestraling op oppervlakken ontbreekt photoactivatable liganden kunnen worden uitgevoerd. Deze controle is van cruciaal belang voor het identificeren van UV-geïnduceerde effecten die onafhankelijk van photoactivatable ligand zijn (zie bijvoorbeeld referentie 6). Tijdens systeemoptimalisering is het ook zeer nuttig om een robuuste cellulaire imaging antwoord (bijvoorbeeld Grb2-GFP werving) dat is zowel snel en gelokaliseerde bij de hand hebt. Beoordeling van correlaties tussen signalering gebeurtenissen en photoactivation is veel eenvoudiger als deze gebeurtenissen spatiotemporally proximale aan receptor stimulatie zijn.

Hoewel de photoactivation aanpak voortreffelijke Spatio controle over receptor signalering biedt, ontbreekt het het aanpassingsvermogen die worden geboden door de transfectable optogenetic systemen16,17,18,19 ,20,21,22. Bepaalde optogenetic eiwitten zijn ook photoreversible, verstrekken van voorwaardelijke besturingselement dat is niet beschikbaar met de hier beschreven aanpak van de photoactivation. In optogenetic systemen is het beperken van de verspreiding van photoactivated eiwitten echter technisch uitdagende. Dit bemoeilijkt de analyse van de gepolariseerde signalering, met name in een subcellular kader.

Men moet ook opmerken dat de boeiende entiteit van dit photoactivation systeem is een glazen oppervlak, dat alle aspecten van een bonafide cel-cel interactie kan niet recapituleren. Om te omzeilen van dit probleem met behoud van Spatio controle van signaal inleiding, hebben onderzoekers een optische val-systeem gebruikt om een APC in contact met een T-cel, waardoor het begin van cytoskeletal herschikkingen en IS rijping worden gevisualiseerd in real-time23. Hoewel dit systeem maakt het mogelijk nauwkeurig initiatie en visualisatie van cytoskeletal dynamics met behulp van een werkelijke APC, het is relatief lage doorvoersnelheid en is niet compatibel met TIRF verlichting, die een negatieve invloed op de beeldkwaliteit.

Ter afronding: de methode beschreven in dit protocol voorziet Spatio controle van TCR-geïnduceerde signalering binnen de T cel, waardoor uiteindelijk de opheldering van de snel biochemische veranderingen na TCR activering. Dit systeem biedt ons een middel om beter te begrijpen hoe de signalering gebeurtenissen na activering van de TCR bevorderen T cel polarisatie, IS vorming, en uiteindelijk de levering van effector reacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken de leden van de lab Huse voor advies en hulp. Ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R01-AI087644 naar M.H.) en P30-CA008748 aan Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermofischer Scientific 155361
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P2636 Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin Thermofischer Scientific 20217 Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin Thermofischer Scientific 434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500 Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-EK  For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-EK  Anaspec Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibody BD Biosciences 553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb Anaspec Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db  Anaspec Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1  For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lamp UVP UVGL-25 Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system. Olympus Additional information about the imaging system can be found in Figure 6
Mosaic digital diaphragm Andor
Slidebook software Intelligent Imaging Innovations

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
  2. Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
  3. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  4. Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
  5. Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
  6. Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
  7. Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
  8. Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
  9. Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
  10. Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
  11. Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
  12. Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
  13. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
  14. Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
  15. Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
  16. Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
  17. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
  18. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
  19. Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
  20. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
  21. Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
  22. Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
  23. Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).

Tags

Immunologie en infecties probleem 134 T lymfocyten T-cel Receptor (TCR) signaaltransductie cel polariteit centrosoom fotochemie Major Histocompatibility Complex (Pmhc) centrosoom totale interne reflectie microscopie (TIRF) immunologie cel Biologie
Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez, E., Huse, M. Spatial and… More

Sanchez, E., Huse, M. Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist. J. Vis. Exp. (134), e56655, doi:10.3791/56655 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter