Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.
Abstract
לימפוציטים מסוג T לעסוק מהירה, מקוטב איתות, המתרחשים בתוך דקות לאחר הפעלת TCR. זה גורם להיווצרות הסינפסה חיסוניות, צומת הסטראוטיפי תא-תא זה מווסת את תא T הפעלה ויעדים directionally אפקטור תגובות. ללמוד ביעילות של תהליכים אלה, נחוצה גישה הדמיה המותאם לתפיסת תגובות מהר, מקוטב. פרוטוקול זה מתאר מערכת כזו, אשר מבוססת על photoactivatable פפטיד-מייג'ר histocompatibility מורכבים (pMHC) זה שאינו מופחתים עד חשוף לאור אולטרה סגול. Decaging יישוב של ריאגנט הזה במהלך הניסויים videomicroscopy מאפשר שליטה ייתכן מדויקת של הפעלת TCR וניטור ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר עוקבות מאת גמורה (TIRF) הדמיה. גישה זו מתאימה גם אסטרטגיות ההפרעות גנטיות ולא תרופתי. דבר זה מאפשר ההרכבה של מסלולים מולקולריים מוגדרים היטב לקשר TCR איתות היווצרות המבנים cytoskeletal מקוטב העומדים בבסיס הסינפסה אימונולוגי.
Introduction
T לימפוציטים (T תאים) לשחק תפקיד מרכזי חסינות תאית על ידי זיהוי פפטידים antigenic מוצג בהקשר של תא השטח MHC. זיהוי אנטיגן, אשר מתווך על ידי TCR, מניע את הבידול של תמים T תאים ומעודדת המסירה של התגובות cytolytic וקומוניקטיבי אפקטור אוכלוסיות. TCR האירוסין גורם גם שינויים דרמטיים אדריכלות הסלולר. בתוך דקות, תאי T אני מטפל לצד של התא אנטיגן (APC), ויצרו ממשק מקוטב המכונה סינפסה אימונולוגי (IS)1,2. IS potentiates תא T אפקטור תגובות על-ידי הפעלת שחרור כיוונית של ציטוקינים או, במקרה של לימפוציטים T ציטוטוקסיות (Ctl), חלבונים lytic להרוס את APC.
TCR האירוסין מאת pMHC גורם זירחון מהירה של מולקולות מתאם הזרם מרובות, כולל מקשר עבור התאים ההפעלה של T (LAT), אשר בסופו של דבר מקדם שיפוץ חזקים של שלד התא סינפטית2. אקטין filamentous בקליפת המוח (F-אקטין) כוננים תא T מתפשטת על פני השטח APC, ואז פותר לתוך מבנה טבעתי מאופיין על ידי F-אקטין הצטברות IS הפריפריה, דלדול מהמרכז. F-אקטין טבעת היווצרות בחוזקה רתומה ולהתפכחות של מרכז הארגון microtubule (MTOC, הנקרא גם centrosome של תאי T) למיקום מתחת למרכז של ממשק שני האירועים מתרחשים בתוך דקות של זיהוי אנטיגן הראשונית ולהקים ההקשר אדריכלי אירועי הפעלה עוקבות, אפקטור מתרחשות תגובות.
ללמוד הוא היווצרות, מעבדות שונות פיתחו גישות אשר APC מוחלף על ידי משטח זכוכית מכיל ליגנדים TCR קיבוע או תומך ליפידית עצמו מכיל3,ליגנדים4. תאי T טופס הוא כמו הקשר על משטחים אלה יכולים לדימות גמורה פלורסצנטיות מיקרוסקופ (TIRF) או מיקרוסקופיה קונפוקלית, הפעלת מחקרים ברזולוציה גבוהה של הפעלת תא T מוקדמת ויצירת IS.
למרות גישות אלה אפשרו להמחשת מעולה של IS שהרכבתם, הרבה איתות מצדו TCR:pMHC הבאים מתרחש תוך שניות, מקשים על המאמצים כדי לקבוע את רצף האירועים בעקבות הפעלת TCR במדויק . כדי לעקוף בעיה זו, בגישה photoactivation פותחה, שבו photoactivatable pMHC משמש כדי להשיג שליטה ייתכן TCR הפעלה5,6,7. במערכת זו, תאי T מחוברים משטחי זכוכית המכיל pMHC photoactivatable זה ללא-מופחתים TCR עד מוקרן באור אולטרה סגול (UV). הקרנת UV על אזור מיקרון בגודל של המשטח מתחת לתא T מסיר את photocage יצירת אזור מופחתים יכולים להיות מזוהים על-ידי תא T. והאירועים איתות ובניה cytoskeletal ואז מנוטרים באמצעות מקודדים גנטית כתבים פלורסנט. שתי גרסאות photoactivatable של פפטידים antigenic, עש ציטוכרום c88-103 (MCC) ו אובלבומין257-264 (פשוט), אשר מוצגות בהקשר של המחלקה II MHC-Ek , הכיתה אני MHC H2-Kb, בהתאמה, היה פיתח (איור 1). פעולה זו מאפשרת הניתוח של שני CD4+ T תאים ספציפיים עבור MCC-אני-Ek (לבטא את ג 5 C7, 2B4, או AND TCRs) ו CD8+ T תאים ספציפיים עבור ביצית-H2-Kb (לבטא את OT1 TCR).
בעשור האחרון, הגישה photoactivation ודימות TCR יש כבר מנוצל כדי לבסס את קינטיקה מדויק של TCR מוקדם איתות צעדים וגם כדי לזהות מסלולים מולקולריים המסדירים מקוטב cytoskeletal שיפוצים5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. לדוגמה, וזמינותו היה תפקיד חשוב בקביעת centrosome הזה ולהתפכחות לכיוון APC מתווך על ידי מעבר הדרגתי המותאמות לשפות אחרות של השומנים השני messenger diacylglycerol מרוכז בכל IS. הוא צפוי כי מתודולוגיה זו ימשיכו להיות יקר עבור יישומים הדורשים ניתוח דימות ברזולוציה גבוהה של תפקוד תא T.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של משטחי זכוכית מופחתים
- המעיל. ובכן שמונה תאיים coverglass עם biotinylated פולי-L-ליזין (ביו-PLL) מדולל שבערך במים מזוקקים, יונים (ddH2O). תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- לשטוף עם H2O.
- היא יבשה 2 h-RT.
- בלוק ביו-PLL מצופה משטחים עם מאגר חסימה (באגירה HEPES תמיסת מלח [10 מ מ HEPES pH 7.4, 150 מ מ NaCl], עם 2% BSA) במשך 30 דקות ב- RT.
- להמיס 5 מ"ג פולי-L-ליזין מנות ב- 1 מ ל 10 מ מ נאפו4, pH 8.5.
- להוסיף μmol 125 (0.55 מ ג) של NHS-ביוטין (מתוך מלאי 100 מ"ג/מ"ל ב דימתיל סולפוקסיד) ולבדוק את רמת החומציות של התגובה. אם ה-pH מתחת 8.5, להוסיף 2 μL של 4 N NaOH לגדל אותו בין pH 8.5 ו- 9.5.
- מערבולת למשך 30 דקות.
- להרוות את תגובת עם 50 μL 100 מ מ גליצין מומס 20 מ מ טריס pH 8.0.
- ספין בעוצמה מלאה למשך 10 דקות, להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש.
הערה: ביו-PLL איכות הוא בדרך כלל לעומת ההכנות הקודם על ידי ציפוי טורי דילולים כפולה של החומר על צלחת אליסה 96-ובכן וכימות ביוטין תוכן לאחר דגירה עם phosphatase אלקליין בשילוב streptavidin.
- להסיר את חסימת מאגר. אל תאפשר בארות להתייבש. להוסיף streptavidin (100 µg/mL במאגר חסימה). תקופת דגירה של h 1-4 מעלות צלזיוס.
- לרחוץ ב- HBS. מילוי, היפוך קאמרית שקופית בארות 4 - 5 פעמים, הסרת HBS מן הבארות. אל תאפשר בארות להתייבש.
- הוסף biotinylated pMHC ליגנדים של אדהזיה מולקולות על פני השטח.
הערה: MCC וביצית יכולה להיות photocaged על-ידי הוספת אורתופדיה-nitrobenzyl המבוסס על קבוצות מגן (למשל, nitrophenylethyl (NPE) או nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) על קבוצת אמינו חדוה lysines מפתח (K12 ב- MCC, K7 בתוך ביצית). ניתן להשיג Photocaged MCC וביצית של ספקים מסחריים. לאחר שיחזור במאגר מימית, הם הם refolded לתוך ביטוי bacterially-Ek ו- H2-Kb באמצעות גישות הוקמה11,12. - אימות של פפטיד MCC או ביצית photoactivatable
- Decage פפטידים NVOC המוגנים על-ידי UV בין עם מנורת UV כף יד (ראה טבלה של חומרים) במשך 20 דקות ב- RT.
- הדופק 1.0 x 105 נגמ שים עם 1 מיקרומטר של פפטיד nonstimulatory (שליטה שלילי, למשל Hb), unirradiated photoactivatable פפטיד, photoactivatable לקרינה פפטיד, ופפטיד אגוניסט (בקרה חיובית, למשל, MCC) עבור h 1 כדי לילה ב 37 º C.
- כדי לעורר תאי T לבטא את ג 5 C7/2B4/AND TCR, להשתמש CH12 או CH27 B תאים. לעורר תאים OT1 T, השתמש RMA-s או EL4 thymoma תאים.
- מערבבים את נגמ שים פעמו עם מספר שווה של תאי T ב 96-ובכן סביב לוחות בווליום הסופי של 200 µL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות.
- לשחזר את supernatants מכל קידוח ולנתח il-2 מאת אליסה עם streptavidin-חזרת peroxidase זיהוי ערכי צבע מוחלטים.
הערה: אישור על מצב caging של פפטידים כל באמצעות ספקטרומטר מסה ספקטרומטריית electrospray לפני refolding לתוך מתחמי MHC, מומלץ מאוד.
- לבצע קיפול וטיהור של MHC כדי למזער חשיפה לאור. למשל, גלישת קיפול תגובות בנייר אלומיניום, לבצע בדיקות סינון ג'ל עם מנורת UV מחוץ.
הערה: זה כבר מצא את photoactivatable MCC-אני-Ek , ביצית - H2-Kb זירוז UV הפעלה עצמאית תא T-צפיפות גבוהה, ייתכן שעקב שכולאת פונקציונלי לא שלם. לפיכך, pMHC photoactivatable הוא מדולל מעודף x 10-30 nonstimulatory pMHC (למשל -Ek שמכיל פפטיד64-76 (Hb) של המוגלובין) במהלך השלב הנייח. זה מגביר את האות לרעש יחס של הניסוי הדמיה עוקבות. - כדי photoactivate CD4+ T תאים, באופן קולקטיבי משתמשים בתערובת של biotinylated על בסיס חצי פנסיון-אני-Ek (3 µg/mL), biotinylated photoactivatable MCC-אני-Ek (0.1 µg/mL) ו- biotinylated נוגדנים נגד המעמד אני MHC H2-Kk (0.5 µg / mL)-נוגדן anti-H2-Kk מעודד ג 5 C7/2B4/AND T תאים, אשר אקספרס H2-Kk, למרוח על גבי משטח זכוכית שבלי לעבור הפעלה.
- עבור CD8+ T תאים, משתמשים בתערובת של biotinylated H2-Db הנושאת את פפטיד KAVYDFATL (1 µg/mL), biotinylated photoactivatable ביצית-H2-Kb (0.1 µg/mL), לבין קבוצת המחשבים חוץ-תאי של המולקולה אדהזיה ICAM-1 (2 µg/mL הופק על ידי חרקים תא תרבות13.) ה-ICAM-1 מעודד היווצרות קשר קרוב ומרבה את אינטגרין LFA1 על פני תא T.
- החלת כל חלבון תערובות במאגר חסימה, ואחריו הדגירה 1 h RT או לפחות 2 h-4 מעלות צלזיוס.
הערה: צפיפות מולקולרית על משטחים מסוג זה להיות ~ 8000 לכל מיקרומטר2 כבר נקבע בעבר6. בהתחשב בכך photoactivatable pMHC מייצג ~1/30th של החלבון biotinylated על פני השטח, כשהצפיפות שלה יהיה ~ 267 מולקולות לכל מיקרומטר2, לפני decaging. - לשטוף כמו שלב 1.6 ולהשאיר ב- HBS עד מוכן לשימוש.
- להוסיף 200,000 CD4+ או CD8+ T תאים המבטאים את TCR המתאים לבאר כל ולאפשר תאים לדבוק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ברגע תאים יש המצורפת, התפשט על פני השטח, הם מוכנים בשבילכם photoactivation והדמיה.
הערה: התמרה חושית Retroviral אפקטור T תאים עם פלורסנט הדמיה הגששים מתואר בפרט elswhere6,7. סידן איתות שניתן גם ללמוד באמצעות תאי T untransduced טעון עם סידן רגיש לצבוע Fluo-46. לצבוע רציומטרי Fura-2 לא מומלץ כי זה דורש עירור בטווח UV, אשר גם גורם decaging של pMHC photoactivatable.
2. ייבוא תמונות
- השתמש במיקרוסקופ TIRF הפוכה לבוש עם עדשה המטרה UV תואם 150 X עבור רכישת התמונה. UV להאיר אזורים על-ידי המשתמש באמצעות מערכת דיגיטלית הסרעפת מחוברת מנורת כספית W 100 (HBO). ישיר UV אור המנורה הזו על המדגם באמצעות מראה מסירה ארוכה 400 nm.
- השתמש התמונה ניתוח תוכנה עבור photoactivation מקומי ורכישת זמן לשגות. בניסויים רוב, לפקח על הגששים בערוצים שני ירוק ואדום באמצעות 488 ננומטר, 561 nm עירור לייזרים, בהתאמה. אור לייזר מכוונת על המדגם באמצעות מראה כפולה-bandpass ודיקרואיק זוהר ששולחות גם בטווח UV (כדי לאפשר decaging). אנא עיין טבלה של חומרים איור 6 לקבלת מידע נוסף על תצורת מיקרוסקופ.
- לאחר טעינת השקופית תא המכיל תאי T, להתאים את ההגדרות כדי להשיג תאורה TIRF או epifluorescence, לפי הצורך. במצב live, בחר שדה של תאים הם המבטאים את probe(s) פלואורסצנט עניין. להקים בקנה מידה מיקרון אזורים עבור photoactivation מתחת תאים בודדים באמצעות תוכנת שליטה.
- מתחילים רכישת זמן לשגות. בדרך כלל, 80 timepoints נרכשים, עם מרווח של 5 s בין כל נקודת זמן. זה משאיר יותר ממספיק זמן רציפים 488 ננומטר, 563 חשיפות ננומטר, במקרה של ניסויים צבע כפול.
- לאחר 10 timepoints, photoactivate האזורים שנבחרו על-ידי פתיחת הסרעפת דיגיטלי תריס עבור s 1-1.5.
- בתום זמן לשגות, בחר שדה חדש של תאים וחזור על התהליך.
3. ניתוח נתונים
הערה: photoactivation המותאמות לשפות אחרות של ליגנדים קיבוע יוצר אזור מופחתים מוגדרים היטב, נייח יכול לשמש לניתוח כמותי של איתות תגובות ואירועים שיפוץ cytoskeletal. ניתוח פרוטוקולים בדרך כלל כרוכים או לכימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך אזור לקרינה או באמצעות האזור לקרינה כמו נקודת קצה של מיקום מרחק מעבדתיים (למשל. להערכת קיטוב של centrosome אזור לקרינה). ניתוח פרוטוקולים שיפורטו להלן. תוכניות שונות של ניתוח תמונה אינטראקטיבית יכול לשמש כדי להפוך את העוצמה של מדידות מרחק, אשר לאחר מכן ניתן ליצור תבנית פלט עבור עיבוד נוסף וניתוח.
-
עוצמת קרינה פלואורסצנטית
- קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FI) של אזור רקע מחוץ לתא (FIb). זה ישמש עבור רקע תיקון.
- לצייר אזור מרובע בגודל מיקרון מחוץ לתא ולעשות מסכה. כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, לחץ על נתח | מסיכה הסטטיסטיקה. בחר כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית ולייצא את הערכים.
הערה: פרטי פרוצדורלי (למשל 3.1.1.1) מתייחסים לתוכנה Slidebook (ראה טבלה של חומרים). יישום של פרוטוקול זה באמצעות חבילות תוכנה אחרות (למשל., פיג'י) יהיה שונה במקצת.
- לצייר אזור מרובע בגודל מיקרון מחוץ לתא ולעשות מסכה. כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, לחץ על נתח | מסיכה הסטטיסטיקה. בחר כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית ולייצא את הערכים.
- לקבוע את האלחוטי בתוך אזור photoactivated עבור כל נקודת זמן.
- בחרו מסיכה כדי לסמן את אזור זה היה photoactivated. כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, לחץ על נתח | מסיכה הסטטיסטיקה. בחר כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית ולייצא את הערכים.
- הפחת על רקע פי מתוך הערכים FI שנמדד באזור. לאחר מכן, לנרמל את המידות FI המתוקן על-ידי חלוקת מאת הממוצע, רקע מתוקנת האלחוטי של המסגרות 9 קודם לפני photoactivation. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)).
הערה: גרף ΔF/F כפונקציה של הזמן.
- קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FI) של אזור רקע מחוץ לתא (FIb). זה ישמש עבור רקע תיקון.
-
מרחק
- להשיג x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated.
- כדי לקבוע את x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated, בחרו מסיכה כדי לסמן את אזור זה היה photoactivated. ברגע האזור של photoactivation מודגשת, בחר נתח | מסיכה סטטיסטיקה | מרכז של אזור ולייצא את הערכים.
- לקבוע x ו- y קואורדינטות עבור המכשיר פלואורסצנט עניין עבור כל נקודת זמן. זו מושגת בדרך כלל באמצעות חלקיקים ידני או אוטומטי מעקב.
- כדי לקבוע את x ו- y הקואורדינטות של המכשיר פלואורסצנט עניין, בחר ידני חלקיקים מעקב ולחץ על החללית פלואורסצנט עניין לאורך זמן. לאחר כל נקודות זמן כבר מסומנים, לבחור נתח | מסיכה סטטיסטיקה | מרכז של אזור ולייצא את הערכים.
- לחשב את המרחק בין החלבון הניאון עניין למרכז של האזור photoactivated עבור כל נקודת זמן באמצעות המשוואה: מרחק = כהן ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), שבו x2 ו- y הם2 הקואורדינטות של החלבון הניאון של ריבית ו- x1 ו- y1 הן הקואורדינטות של מרכז האזור photoactivated.
- גרף המרחק כפונקציה של הזמן.
- להשיג x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגישה photoactivation ודימות מאפשר התבוננות נתיישב כימות של תגובות איתות מהירה, מקוטב. כדי להדגים את היכולות שלה, לשכפל הנה ניסוי בחינת המתאם ייתכן בין צבירה דאג TCR-induced ולהתפכחות centrosome. ג 5 תקיעות התא C7 T היו transduced retrovirally עם שני הכתבים פלורסנט: ביוסנסור דאג המכיל קבוצות המחשבים C1 טנדם מכל חלבון קינאז C-θ באמצעות מקושר GFP (C1-GFP) ו- RFP-טובולין כדי לנטר את centrosome. תאי T צורפו אז אל תאיים coverglass המכיל photoactivatable MCC-אני-Ek. C1-GFP צולמה באמצעות מיקרוסקופ TIRF ו- RFP-טובולין במצב epifluorescence. כפי שמוצג באיור2, photoactivation המותאמות לשפות אחרות של המשטח מתחת לתא T גורם להצטברות של דאג באזור לקרינה. זה מלווה בתוך שניות ולהתפכחות של centrosome באזור.
C1-GFP הצטברות ניתן לכמת על-ידי חישוב עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל, לאחר תיקון רקע, במרכזו של אזור photoactivated לאורך זמן (איור 3). ניתן לכמת centrosome ולהתפכחות בתגובה photoactivation על-ידי חישוב המרחק בין centrosome את המרכז של האזור photoactivated כפונקציה של הזמן (איור 4).
בשיטה זו ניתן לבחון מגוון רחב של תגובות איתות מהירה, מקוטב, בעצם כל דבר ניתן לנטר באמצעות בדיקה פלורסנט. לדוגמה, TCR photoactivation הוא מנוצל כדי לפקח בתחילת הגיבוש microcluster איתות באמצעות Grb2 שכותרתו fluorescently (Grb2-GFP) (איור 5). בדומה להצטברות דאג ותגובות ולהתפכחות centrosome, קיטוב Grb2-GFP מתרחשת זמן קצר לאחר photoactivation (איור 5), ניתן לכמת באמצעות גישה עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל.
איור 1: המערכת Photoactivation באמצעות photocaged MCC פפטיד.
(א) Photocaged אסטרטגיה פפטיד MCC. קבוצת NPE מחובר ליזין. השאריות פפטיד MCC. הקרנת UV גורמת להסרת NPE, שחזור MCC לצורתו המקורית. (B) כאשר NPE מאוגד MCC, ג 5 C7 TCR אין אפשרות לאגד אל MCC. הסרת NPE תוצאות מתוך הכרה ג 5 TCR C7 ל פפטיד MCC מקורית. (ג) האסטרטגיה photocaged הותאם לעבודה עם תאי CD8 + T, שבו פפטיד ביצית photocaged משמש כדי להפעיל את TCR OT-1 על הקרנת UV.
איור 2: מונטאז בצילום מואץ של הצטברות דאג ולהתפכחות centrosome בעקבות photoactivation של TCR ב 5 ג תא C7 T.
ג 5 תא C7 לבטא ביוסנסור דאג, המכיל טנדם C1-תחומים של PKC - התמזגו GFP (C1-GFP), תג-RFP טובולין (RFP-ג'קוזי), כתב centrosome פלורסנט. Montages להמחיש את התגובה מקוטב של 5 ג תאי C7 T לאורך זמן. האליפסה צהוב והטקסט מציינים את הזמן והמיקום של photoactivation. לאורך זמן, C1-GFP מצטבר על האזור photoactivated, ואחריו centrosome ולהתפכחות לכיוון האזור photoactivated. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.
איור 3: כימות של הצטברות דאג על האזור photoactivated
ניתן לכמת דאג, C1-GFP, הצטברות על האזור photoactivated (משמאל) על-ידי חישוב עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל, לאחר תיקון רקע, על האזור photoactivated (עיגול צהוב עם צללית כחולה) לאורך זמן. הנתונים הם מנורמל ביחס המסגרות תשעה שהושגו לפני photoactivation. C1-GFP העשרה על האזור photoactivated יכול להיות מחושב על ידי חלוקת עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע באזור לקרינה מעוצמת פלורסצנטיות אומר כל התא, בעקבות תיקון רקע. המשוואה: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), על פי אילו היא עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע, ניתן להשתמש כדי לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל. אז יכול להיות בגרף עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמלת על האזור photoactivated כפונקציה של הזמן (מימין). הקו הסגול מציין את הזמן של photoactivation. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.
איור 4: כימות ולהתפכחות centrosome.
לקבוע את הקואורדינטות של centrosome (RFP-ג'קוזי) לאורך זמן על ידי שתבצע מעקב ידני אחר הנתיב centrosome לכיוון האזור photoactivated (חץ לבן) בכל נקודה בזמן (משמאל). לקבוע את נקודות הציון של המרכז של אזור photoactivated (עיגול צהוב). ניתן לחשב את המרחק בין centrosome את המרכז של האזור photoactivated בכל נקודה בזמן באמצעות המשוואה עבור מרחק = כהן ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), שבו x2 ו- y 2 נמצאים ה-x, y נקודות ציון במרכז האזור של centrosome, ולא x1 ו- y1 x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated. המרחק של centrosome מן המרכז של האזור photoactivated בכל מועד נקודת יכול אז להיות בגרף כפונקציה של הזמן (מימין). הקו הסגול מציין את הזמן של photoactivation. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.
איור 5: Grb2-GFP-צורה microcluster.
(א) נציג 5 ג תא C7 לבטא fluorescently שכותרתו Grb2 (Grb2-GFP). Montages ממחישים את התגובה מקוטב Grb2-GFP נוספות. האליפסה צהוב והטקסט מציינים את הזמן והמיקום של photoactivation. לאורך זמן, מצטבר Grb2-GFP-האזור photoactivated. (ב) כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית Grb2-GFP-האזור photoactivated לאורך זמן. N = 15 תאים. (ג) כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית Grb2-GFP באזור הבקרה מחוץ לאזור photoactivated. N = 15 תאים.
איור 6: מיקרוסקופ תצורה עבור photoactivation ו- TIRF הדמיה.
488 ננומטר, 561 ננומטר לייזר משמשים TIRF epifluorescence הדמיה של הגששים ירוק ואדום, בהתאמה. אולטרא סגול עבור photoactivation נלקח מנורת כספית (Hg) המחובר למערכת דיגיטלית הסרעפת מסוגל זרחני אזורים קטנים, על-ידי המשתמש. אור המנורה/הסרעפת Hg משתקף על המדגם על ידי מראה longpass ממוקם מתחת במראה ודיקרואיק זוהר שמשקף את הלייזרים הדמיה. להיות מעוצב במראה ודיקרואיק זוהר לעבור UV אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשנים האחרונות התפתחה אור כלי מצוין עבור הפעלה מבוקרת spatiotemporally של תהליכים תאיים. מתודולוגיות שונות פותחו, כל אחד עם המשויך יתרונות וחסרונות. המערכת המתוארת כאן, אשר מבוססת על decaging של ליגנדים קיבוע, חוץ-תאית, מתאימה באופן אידיאלי עבור הניתוח של תגובות איתות מהירה, subcellular, מקוטב. גישה זו הוחל לבחון הוא היווצרות בתאי T כפי שתואר לעיל. בנוסף, ליגנדים בכלוב על רצפטורים אחרים יש מהונדס, ומאפשרת לנו ליישם את האסטרטגיה אותה כדי להעריך מעכבות איתות תאי הרג טבעיים, רוברטסונית הגרעין של הגורם שעתוק NF-κB בתגובה על אגרה כמו קולטן איתות14,15.
ב פרוטוקול זה, ליגנדים מופחתים הם הנשיכה כדי להבטיח שהם יישארו כמקור נייח, מקוטב של גירוי משך זמן הניסוי הדמיה. גישה זו היא מתאימה על מחקרים של התא קיטוב. יודגש עם זאת, כי הגישה photoactivation TCR הוא מותאם בקלות הפעלה מבוקרת חנותם תא T על השומנים הנתמכים bilayers. ללא ספק, אחד לא יכול להשיג גירוי מתמשך, מקוטב בהקשר זה. עם זאת, ייתכן שהדבר נחוץ, ובהתחשב ביעדים ניסיוני.
המערכת הוא גם גמיש למדי לגבי מקור אור UV עבור decaging. כיום, מנורה W Hg 100 משמש עבור תאורה ממוקדת, אולם לייזר פעמו חנקן (ns רוחב 4 דופק, דופק אנרגיה 120 mJ), היה בשימוש בעבר6. לעתים, מנורת UV כף יד (365 nm, 4 W) היה ממוקם מעל המדגם דימות על מנת decage אזורים גדולים של ליגנד photostimulatable. התכונות הספציפיות של מערכת decaging בכל מקרה תלוי הדרישות הטכניות של הניסוי המדובר.
בעת יישום מערכת זו, חשוב לוודא כי התגובות שנצפו הן ספציפיות עבור האירוע photoactivation, ולא התוצאה של הפעלת קולטן כדין או נזקי UV-induced. כדי לשלול לכלוכים אלה, ניתן לבצע שני פקדים ירידה לפרטים. ראשית, ניתן לנטר עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתאים הם לא ישירות מוקרן במהלך הניסויים photoactivation. אם השטח כראוי בכלוב, ניכר תגובות בתאים אלה לא להתייחס (לדוגמה, איור 5C). שנית, ניתן לבצע ניסויים ב- T אילו תאים UV-מזויפותאו מסומנות על משטחים חסר ליגנדים photoactivatable. שליטה זו היא חיונית לזיהוי UV-induced תופעות שאינן תלויות ליגנד photoactivatable (ראה לדוגמה, הפניה 6). במהלך מערכת אופטימיזציה, זה גם מועיל מאוד שיהיה בהישג יד איתנה הסלולר הדמיה תגובה (למשל, Grb2-GFP הגיוס) הוא גם מהיר וגם לשפות אחרות. הערכת מתאמים בין אירועים איתות, photoactivation היא הרבה יותר פשוטה אם האירועים הללו הם spatiotemporally הפרוקסימלית אל קולטן לגירוי.
למרות הגישה photoactivation מציעה שליטה ייתכן משובח על קולטן איתות, היא חסרה את הסתגלות המוענקת על ידי transfectable optogenetic מערכות16,17,18,19 ,20,21,22. חלבונים מסוימים optogenetic גם הם photoreversible, מספקת מותנה שליטה שאינה זמינה עם הגישה photoactivation המתוארים כאן. במערכות optogenetic, עם זאת, הגבלת פעפוע של חלבונים photoactivated הוא טכנית מאתגר. זה מסבך את הניתוח של איתות מקוטב, במיוחד בהקשר subcellular.
צריך גם לציין כי הישות מרתקים של המערכת photoactivation הזאת היא משטח זכוכית, אשר לא מסכם את הדברים בכל ההיבטים של אינטראקציה תאים תאים בתום-לב. כדי לעקוף בעיה זו תוך שמירה על בקרת ייתכן אות החניכה, החוקרים השתמשו מערכת אופטית מלכודת להביא משוריין במגע עם תא T, המאפשר התחלתה של cytoskeletal rearrangements ו- IS ההבשלה להיות דמיינו בזמן אמת23. למרות מערכת זו מאפשר החניכה מדויק, ויזואליזציה של cytoskeletal dynamics באמצעות משוריין בפועל, זה תפוקה נמוכה יחסית והוא לא תואם עם תאורה TIRF, המשפיע לרעה על איכות התמונה.
לסיכום, השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה מספק שליטה ייתכן TCR-induced איתות בתוך התא T, בסופו של דבר המאפשר הבהרה של שינויים ביוכימיים מהר בעקבות הפעלת TCR. מערכת זו מספקת לנו אמצעים כדי להבין טוב יותר איך האירועים איתות בעקבות הפעלת TCR לקדם קיטוב תא T, הוא היווצרות, ובסופו של דבר מסירת אפקטור תגובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים חברי המעבדה Huse עבור ייעוץ וסיוע. נתמך על ידי ארצות הברית המכונים הלאומיים לבריאות (R01-AI087644 ל מ. ה) ו- P30-CA008748 אל מרכז הסרטן סלואן-קטרינג הזיכרון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
