Summary
Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.
Abstract
Linfociti T impegnano nella segnalazione rapida, polarizzati, che si verificano pochi minuti dopo l'attivazione del TCR. Ciò induce la formazione di sinapsi immunologica, una giunzione cellulare stereotipato che regola l'attivazione delle cellule T e direzionalmente gli obiettivi le risposte effettrici. Per studiare questi processi in modo efficace, è necessario un approccio imaging che è su misura per catturare le risposte veloci, polarizzate. Questo protocollo descrive tale sistema, che si basa su un fuse peptide-major istocompatibilità (pMHC) che è non-stimolatore fino a quando è esposto a luce ultravioletta. Decaging mirati di questo reagente durante gli esperimenti di videomicroscopia consente controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione di TCR e monitoraggio ad alta risoluzione delle successive risposte cellulari di riflessione interna totale (TIRF) imaging. Questo approccio è anche compatibile con le strategie di perturbazione genetici e farmacologici. In questo modo per il montaggio delle vie molecolari ben definite che collegano TCR segnalazione alla formazione delle strutture citoscheletriche polarizzate che sottendono la sinapsi immunologica.
Introduction
Linfociti T (cellule T) gioca un ruolo centrale nell'immunità cellulare riconoscendo peptidi antigenici visualizzate nel contesto della superficie cellulare MHC. Riconoscimento dell'antigene, che è mediata dal TCR, spinge la differenziazione delle cellule T naive e promuove la consegna delle risposte citolitiche e comunicative di effettori. Impegno di TCR inoltre induce cambiamenti drammatici nell'architettura cellulare. In pochi minuti, le cellule T gloms sul lato della cella presentanti l'antigene (APC), formando un'interfaccia polarizzata, conosciuta come la sinapsi immunologica (IS)1,2. L'IS rafforza le risposte delle cellule T effettrici abilitando il direzionale rilascio di citochine o, nel caso dei linfociti T citotossici (CTL), proteine litiche che distruggono l'APC.
Impegno di TCR di pMHC induce la fosforilazione rapida di più molecole di adattatore a valle, compreso il Linker per le celle di attivazione di T (LAT), che in definitiva promuove robusto rimodellamento del citoscheletro sinaptica2. Corticale actina filamentosa (F-actina) unità delle cellule di T di diffusione sopra la superficie APC e poi si risolve in una struttura anulare caratterizzata da accumulo di F-actina alla periferia IS e svuotamento dal centro. Formazione di anello di F-actina è strettamente per il riorientamento del centro organizzatore dei microtubuli (MTOC, chiamato anche il centrosoma in cellule di T) ad una posizione appena sotto il centro dell'interfaccia. Entrambi gli eventi si verificano all'interno di minuti di riconoscimento iniziale dell'antigene e stabilire il contesto architettonico in cui gli eventi di attivazione successiva ed effettrici si ottiene una risposta.
Per studiare la formazione di IS, vari laboratori hanno sviluppato approcci in cui la APC è sostituito da una superficie di vetro che contiene immobilizzato TCR ligandi o supporta un bilayer del lipido che a sua volta contiene i ligandi3,4. T cellule formano IS-come contatti su queste superfici che possono essere imaged di microscopio a fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) o microscopia confocale, permettendo studi ad alta risoluzione di attivazione delle cellule T iniziale e la formazione di IS.
Sebbene questi approcci hanno permesso per visualizzazione eccellente del è completamente assemblato, gran parte della legatura TCR:pMHC seguente segnalazione si verifica in pochi secondi, che complica gli sforzi per determinare la sequenza degli eventi che seguono l'attivazione TCR con precisione . Per ovviare a questo problema, è stato sviluppato un approccio di fotoattivazione, in cui fuse pMHC viene utilizzato per realizzare il controllo spazio-temporale di TCR attivazione5,6,7. In questo sistema, le cellule T sono attaccate alle superfici di vetro contenente pMHC di fuse che è non-stimolatori per il TCR, fino a quando irradiato con luce ultravioletta (UV). Irradiazione UV di una regione di graduate micron della superficie sotto la cellula T rimuove il photocage creando una zona di stimolatorio che possa essere riconosciuta dalle cellule T. Eventi successivi di segnalazione e il rimodellamento del citoscheletro sono quindi monitorati utilizzando reporter fluorescenti geneticamente codificato. Due versioni di fuse di peptidi antigenici, lepidottero del citocromo c88-103 (MCC) e ovoalbumina257-264 (OVA), che vengono presentati nel contesto della classe II MHC-Ek e la classe I di MHC H2-Kb, rispettivamente, sono stati sviluppato (Figura 1). Questo permette l'analisi di entrambi CD4+ T cellule specifiche per MCC-I-Ek (esprimendo il 5 C. C7, 2B4, o AND TCR) e CD8+ T cellule specifiche per OVA-H2-Kb (che esprimono TCR OT1).
Nell'ultimo decennio, l'approccio di fotoattivazione e formazione immagine di TCR è stata utilizzata per stabilire la precisa cinetica di TCR primi passi di segnalazione e anche per identificare i meccanismi molecolari che regolano polarizzata in rimodellamento del citoscheletro5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ad esempio, il dosaggio è stato strumentale nel determinare tale centrosoma riorientamento verso l'APC è mediato da una sfumatura localizzata del lipido secondo messaggero diacilglicerolo centrato presso l'IS. Si prevede che questa metodologia continuerà ad essere prezioso per applicazioni che richiedono analisi di imaging ad alta risoluzione della funzione delle cellule T.
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Protocol
1. preparazione delle superfici di vetro stimolatore
- Coprioggetto cappotto otto pozzetti camerata con biotinilati poli-L-lisina (Bio-PLL) diluito 1: 500 in acqua distillata e deionizzata (ddH2O). Incubare per 30 min a temperatura ambiente (TA).
- Lavare con H2O.
- A secco per 2 h a RT.
- Blocco di Bio-PLL rivestito superfici con tampone bloccante (tamponata HEPES salino [10 mM HEPES a pH 7.4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) per 30 minuti a TA.
- Sciogliere 5 mg di poli-L-lisina hydrobromide in 1 mL di 10 mM NaPO4, pH 8.5.
- Aggiungere 125 μmol (0,55 mg) di NHS-biotina (da uno stock di 100 mg/mL in DMSO) e controllare il pH della reazione. Se il pH è inferiore a 8,5, aggiungere 2 μL di 4 N NaOH per elevarlo a tra pH 8.5 e 9.5.
- Vortexare per 30 min.
- Placare la reazione con 50 µ l di 100 mM glicina disciolta in 20 millimetri Tris pH 8.0.
- Gira alla massima potenza per 10 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
Nota: Qualità Bio-PLL è in genere rispetto al precedente preparazioni del rivestimento diluizioni seriali del materiale su una piastra a 96 pozzetti ELISA e quantificare il contenuto in biotina dopo incubazione con fosfatasi alcalina accoppiato streptavidina.
- Rimuovere il tampone di bloccaggio. Non lasciare asciugare pozzetti. Aggiungere streptavidina (100 µ g/mL in tampone bloccante). Incubare per 1 h a 4 ° C.
- Lavare HBS. Riempire e invertire pozzi diapositiva camera 4 - 5 volte, rimozione di HBS dai pozzi. Non lasciare asciugare pozzetti.
- Aggiungere il biotinilati pMHC ligandi e molecole di adesione alla superficie.
Nota: MCC e ovuli possono essere photocaged con l'aggiunta di ortho-nitrobenzyl basato su gruppi di protezione (ad es., nitrophenylethyl (NPE) o nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) per il gruppo ε-amminico di Lisine chiave (K12 in MCC, K7 in ovuli). Photocaged MCC e ovuli possono essere ottenuti da produttori commerciali. Dopo la ricostituzione in tampone acquoso, essi sono ripiegati in batterico espressa-Ek e H2-Kb utilizzando gli approcci stabiliti11,12. - Convalida del peptide MCC o ovuli fuse
- Decage peptidi NVOC protetto UV irradiando con una lampada UV portatile (Vedi Tabella materiali) per 20 minuti a TA.
- Torio impulso 1.0 x 105 APC con 1 µM del peptide nonstimulatory (controllo negativo, ad esempio Hb), fuse peptide, peptide irradiati fuse e peptide agonista (controllo positivo, per esempio, MCC) per 1 h a durante la notte a 37 ° C.
- Per stimolare le cellule T che esprimono il 5C. C7/2B4/AND TCR, utilizzare celle CH12 o CH27 B. Per stimolare le cellule T OT1, utilizzare EL4 thymoma cellule o RMA-s.
- Mescolare le APCs pulsato con un numero uguale di cellule T nel 96 pozzetti tondo piastre inferiori ad un volume finale di 200 µ l. Incubare a 37 ° C per 12-24 h.
- Recuperare i surnatanti da ciascun pozzetto e analizzare il-2 da ELISA con rilevazione colorimetrica di streptavidina-rafano perossidasi.
Nota: Conferma dello status ingabbiamento di tutti i peptidi mediante spettrometria di massa electrospray prima del ripiegamento in complessi MHC, è fortemente raccomandato.
- Eseguire la piegatura e la purificazione di MHC in modo da minimizzare l'esposizione alla luce. Ad esempio, avvolgere pieghevole reazioni nella carta stagnola e svolgere cromatografia di gel filtrazione con la lampada UV.
Nota: È stato trovato quel fuse MCC-I-Ek e OVA - H2-Kb indurre attivazione indipendente delle cellule di T UV ad alta densità, probabilmente a causa di ingabbiamento funzionale incompleta. Quindi, il pMHC di fuse è diluito in un eccesso di x di 10-30 di nonstimulatory pMHC (per esempio -Ek contenente il peptide di64-76 di emoglobina (Hb)) durante la fase di immobilizzazione. Questo migliora il rapporto segnale-rumore del successivo esperimento di formazione immagine. - A photoactivate CD4+ T cellule, collettivamente utilizzare una miscela di biotinylated Hb-I-Ek (3 µ g/mL), biotinylated fuse MCC-I-Ek (0.1 µ g/mL) e anticorpi biotinilati contro la classe I di MHC H2-Kk (0,5 µ g / mL). incoraggia l'anticorpo anti-H2-Kk 5 C. C7/2B4/AND T cellule, che esprimono H2-Kk, di diffondere sulla superficie di vetro senza in fase di attivazione.
- Per CD8+ T cellule, utilizzare una miscela di biotinylated H2-Db recanti il peptide KAVYDFATL (1 µ g/mL), fuse biotinilati OVA-H2-Kb (0,1 µ g/mL) e il dominio extracellulare della molecola di adesione ICAM-1 (2 µ g/mL prodotto da cellule di insetto cultura13). L'ICAM-1 incoraggia stretto contatto formazione coinvolgendo l'integrina LFA1 sulla superficie delle cellule T.
- Applicare tutte le miscele della proteina in tampone bloccante, seguita da incubazione per 1h a RT o almeno 2 ore a 4 ° C.
Nota: La densità molecolare su superfici di questo tipo per essere ~ 8000 a µm2 è stata determinata in precedenza6. Dato che fuse pMHC rappresenta ~1/30th della proteina biotinilato sulla superficie, la sua densità sarà ~ 267 molecole al µm2, prima del decaging. - Lavare come al punto 1.6 e lasciare in HBS fino all'uso.
- Aggiungere 200.000 CD4+ o CD8+ T cellule che esprimono TCR appropriato in ogni pozzetto e permettono alle cellule di aderire a 37 ° C per 15 min. Una volta che le cellule hanno attaccato al e distribuire sulla superficie, sono pronti per fotoattivazione e imaging.
Nota: Retroviral trasduzione di cellule T effettrici con imaging sonde fluorescenti è descritto in dettaglio altrove6,7. Segnalazione del calcio possono essere studiate anche utilizzando cellule di T untransduced caricate con il colorante sensibile del calcio Fluo-46. Il colorante raziometrici Fura-2 non è raccomandato perché richiede eccitazione nella gamma UV, che induce anche la decaging della pMHC di fuse.
2. acquisizione immagini
- Usare un microscopio rovesciato di TIRF provvisti di un UV compatibile 150 X obiettivo obiettivo per acquisizione di immagini. UV irradiare regioni definite dall'utente utilizzando un sistema a membrana digitale collegato ad una lampada a mercurio 100 W (HBO). Diretta UV luce da questa lampada sul campione utilizzando un mirror di passaggio lungo 400 nm.
- Utilizzare software di analisi di immagine per fotoattivazione localizzata e l'acquisizione di time-lapse. Nella maggior parte degli esperimenti, monitorare le sonde in entrambi i canali, verde e rossi, utilizzando 488 nm e laser di eccitazione 561 nm, rispettivamente. Luce laser è diretto sul campione utilizzando uno specchio dicroico dual-banda passante che trasmette anche nella gamma UV (per abilitare decaging). Per ulteriori informazioni sulla configurazione del microscopio, vedere la Tabella dei materiali e la Figura 6 .
- Dopo aver montato la diapositiva di camera che contiene le cellule di T, regolare le impostazioni per ottenere illuminazione TIRF o epifluorescenza, come necessario. In modalità live, selezionare un campo di cellule che esprimono il sonde fluorescenti di interesse. Stabilire regioni di micron-scala per fotoattivazione sotto singole celle utilizzando software di controllo.
- Iniziare l'acquisizione di time-lapse. In genere, 80 punti temporali vengono acquisiti, con un intervallo di 5 s tra ogni punto del tempo. Questo lascia più di abbastanza tempo per sequenziale 488 nm e 563 nm esposizioni, nel caso di esperimenti di doppio colore.
- Dopo 10 punti temporali, photoactivate le regioni selezionate aprendo il diaframma digitale dell'otturatore per 1-1,5 s.
- Dopo aver completato il lasso di tempo, selezionare un nuovo campo di cellule e ripetere il processo.
3. analisi dei dati
Nota: Localizzata fotoattivazione di ligandi immobilizzati crea una regione ben definita, stazionaria stimolatore che può essere utilizzata per l'analisi quantitativa di segnalazione eventi rimodellamento del citoscheletro e risposte. Analisi protocolli tipicamente coinvolgono o quantificare l'intensità di fluorescenza all'interno della regione irradiata o utilizzando la regione irradiata come endpoint posizionale per misurazioni della distanza (ad es. per la valutazione della polarizzazione del centrosoma per la irradiati regione). Entrambi i protocolli di analisi sono descritti di seguito. Vari programmi di analisi di immagine interattiva consente di rendere intensità e misurazioni della distanza, che possono poi essere uscita per ulteriore elaborazione e analisi.
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Intensità di fluorescenza
- Determinare l'intensità di fluorescenza (FI) di una regione di sfondo all'esterno della cella (FIb). Verrà utilizzato per la correzione di fondo.
- Disegnare un'area quadrata micron imprese fuori della cellula e fare una maschera. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori.
Nota: Dettagli procedurali (ad es. 3.1.1.1) fare riferimento al software Slidebook (Vedi Tabella materiali). Attuazione del presente protocollo utilizzando altri pacchetti software (ad es., FIJI) sarà leggermente diverso.
- Disegnare un'area quadrata micron imprese fuori della cellula e fare una maschera. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori.
- Determinare il FI all'interno della regione di fotoattivazione per ciascun punto di tempo.
- Selezionare maschera per evidenziare la regione che era fotoattivazione. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori.
- Sottrarre lo sfondo FI dai valori misurati FI all'interno della regione. Quindi, normalizzare le misure FI corrette dividendo per la media, sfondo corretto FI dei primi 9 fotogrammi prima di fotoattivazione. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)).
Nota: Il grafico ΔF/F in funzione del tempo.
- Determinare l'intensità di fluorescenza (FI) di una regione di sfondo all'esterno della cella (FIb). Verrà utilizzato per la correzione di fondo.
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Distanza
- Ottenere la x e y le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.
- Per determinare gli assi x e y le coordinate del centro della regione fotoattivazione, selezionare maschera per evidenziare la regione che era fotoattivazione. Una volta evidenziata la regione di fotoattivazione, selezionare Analyze | Mascherare le statistiche | Centro della zona ed esportare i valori.
- Determinare gli assi x e y coordinate per la sonda fluorescente di interesse per ogni punto di tempo. Questo è tipicamente realizzato attraverso manuali o automatizzate delle particelle di rilevamento.
- Per determinare gli assi x e y coordinate della sonda fluorescente di interesse, selezionare Manuale Particle Tracking e cliccare sulla sonda fluorescente di interesse nel corso del tempo. Una volta che sono stati monitorati tutti i punti di tempo, selezionare Analyze | Mascherare le statistiche | Centro della zona ed esportare i valori.
- Calcolare la distanza tra la proteina fluorescente di interesse e il centro della regione di fotoattivazione per ciascun punto di tempo usando l'equazione: distanza = √ ((x2x -1)2+ (y2y -1)2), in cui x2 e y2 sono le coordinate della proteina fluorescente di interesse e x1 e1 di y sono le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.
- Grafico della distanza in funzione del tempo.
- Ottenere la x e y le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.
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Representative Results
L'approccio di fotoattivazione e imaging consente per l'osservazione e facile quantificazione delle risposte di segnalazione rapide, polarizzate. Per illustrare le sue capacità, riprodotta qui è un esperimento esaminando la spatiotemporal correlazione tra accumulo di TCR-indotta DAG e centrosoma riorientamento. 5 C. Gli scoppi di cella C7 T retrovirally sono state trasdotte con due reporter fluorescenti: un biosensore DAG contenente i domini di C1 tandem da chinasi di proteina C-θ collegata a GFP (C1-GFP) e RFP-tubulina per monitorare il centrosoma. Le cellule di T sono stati poi collegate a chambered coprioggetto contenente fuse MCC-I-Ek. C1-GFP era imaged usando microscopia elettronica TIRF e RFP-tubulina in epifluorescenza modalità. Come illustrato nella Figura 2, fotoattivazione localizzata della superficie sotto la cellula T induce l'accumulo di DAG nella zona irradiata. Questa è seguita in pochi secondi mediante la ridefinizione del centrosoma alla stessa regione.
Accumulo di C1-GFP può essere quantificato calcolando l'intensità di fluorescenza normalizzata, dopo correzione del fondo, al centro della regione di fotoattivazione nel tempo (Figura 3). Riorientamento centrosoma in risposta a fotoattivazione può essere quantificato calcolando la distanza tra il centrosoma e il centro della regione di fotoattivazione come funzione del tempo (Figura 4).
Questo metodo può essere utilizzato per esaminare una vasta gamma di risposte di segnalazione rapide, polarizzate, essenzialmente tutto ciò che possono essere monitorati utilizzando una sonda fluorescente. Ad esempio, TCR fotoattivazione è utilizzato per monitorare la formazione precoce di microcluster segnalazione utilizzando Grb2 fluorescente contrassegnati (Grb2-GFP) (Figura 5). Simile all'accumulo di DAG e centrosoma riorientamento risposte, Grb2-GFP polarizzazione si verifica poco dopo la fotoattivazione (Figura 5) e può essere quantificata utilizzando l'approccio di intensità di fluorescenza normalizzata.
Figura 1: Sistema di fotoattivazione utilizzando photocaged peptide MCC.
(A) Photocaged strategia per peptide MCC. Un gruppo NPE è attaccato al residuo di lisina del peptide MCC. L'irradiazione UV provoca la rimozione di NPE, ripristino MCC alla sua forma originaria. (B) quando NPE è associato a MCC, il C. 5 C7 TCR Impossibile associare a MCC. Rimozione di NPE risultati come riconoscimento il 5 C. C7 TCR per il peptide nativo di MCC. (C) la strategia di photocaged è stata adattata per funzionare con cellule T CD8 +, in cui il peptide OVA photocaged viene utilizzata per attivare il TCR di OT-1 all'irradiazione UV.
Figura 2: Montaggio time-lapse di riorientamento di accumulo e centrosoma DAG seguendo la fotoattivazione di TCR in C. 5 Cellula di T C7.
5 C. Cella C7 esprimendo un biosensore DAG, contenente tandem C1-domini di PKC - fuso a GFP (C1-GFP) e Tag-RFP tubulina (RFP-Tub), un reporter fluorescente per il centrosoma. I montaggi illustrano la risposta polarizzata di 5C. Cellule di T di C7 nel corso del tempo. Testo e ovali gialli indicano il tempo e la posizione di fotoattivazione. Nel corso del tempo, C1-GFP si accumula alla regione di fotoattivazione, seguita da riorientamento centrosoma verso la regione di fotoattivazione. Barra della scala: 10 µm.
Figura 3: Quantificazione dell'accumulazione di DAG alla regione di fotoattivazione
Accumulo di DAG, C1-GFP, presso la regione di fotoattivazione (a sinistra) può essere quantificato calcolando l'intensità di fluorescenza normalizzata, dopo correzione del fondo, presso la regione di fotoattivazione (cerchio giallo con ombreggiatura blu) nel corso del tempo. I dati sono normalizzati rispetto i nove fotogrammi ottenuti appena prima di fotoattivazione. Arricchimento di C1-GFP presso la regione di fotoattivazione può essere calcolato dalla divisione dell'intensità media di fluorescenza nella regione irradiata dall'intensità media di fluorescenza dell'intera cella, sfondo correzione seguente. L'equazione: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), in cui FI è l'intensità media di fluorescenza, può essere utilizzato per calcolare l'intensità di fluorescenza normalizzata. L'intensità di fluorescenza normalizzata alla regione di fotoattivazione può quindi essere graphed come funzione del tempo (a destra). Linea viola indica il tempo di fotoattivazione. Barra della scala: 10 µm.
Figura 4: Quantificazione del riorientamento centrosoma.
Determinare le coordinate del centrosoma (RFP-Tub) nel tempo registrando manualmente il percorso del centrosoma verso la regione di fotoattivazione (freccia bianca) in ciascun punto di tempo (a sinistra). Determinare le coordinate del centro della regione di fotoattivazione (cerchio giallo). La distanza tra il centrosoma e il centro della regione di fotoattivazione può essere calcolata in ogni punto del tempo usando l'equazione per distanza = √ ((x2x -1)2+ (y2y -1)2), in cui x2 e y 2 la x e y coordinate per il centro della zona del centrosoma e X1e y1 sono x e y le coordinate del centro della regione di fotoattivazione. La distanza del centrosoma dal centro della regione di fotoattivazione in ogni momento punto può quindi essere graphed come funzione del tempo (a destra). Linea viola indica il tempo di fotoattivazione. Barra della scala: 10 µm.
Figura 5: Formazione di microcluster Grb2-GFP.
(A) rappresentante C. 5 Cella C7 esprimendo fluorescente etichettati Grb2 (Grb2-GFP). I montaggi illustrano la risposta polarizzata di straordinario Grb2-GFP. Testo e ovali gialli indicano il tempo e la posizione di fotoattivazione. Nel corso del tempo, Grb2-GFP si accumula alla regione di fotoattivazione. (B) quantificazione dell'intensità di fluorescenza di Grb2-GFP presso la regione di fotoattivazione nel corso del tempo. N = 15 celle. (C) quantificazione dell'intensità di fluorescenza di Grb2-GFP in una regione di controllo all'esterno della zona di fotoattivazione. N = 15 celle.
Figura 6: Configurazione di microscopio per fotoattivazione e imaging TIRF.
488 nm e 561 nm laser sono utilizzati per TIRF ed epifluorescenza imaging delle sonde verde e rosse, rispettivamente. Luce UV per fotoattivazione è preso da una lampada a mercurio (Hg) collegata ad un sistema digitale a membrana in grado di illuminare regioni piccole, definito dall'utente. Luce da lampada Hg/diaframma viene riflessa sul campione da uno specchio di longpass posizionato sotto lo specchio dicroico che riflette i laser imaging. Lo specchio dicroico deve essere progettato per passare luce UV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Negli ultimi anni, la luce è emerso come un ottimo strumento per l'attivazione spatiotemporally controllata dei processi cellulari. Sono state sviluppate varie metodologie, ciascuno con associati vantaggi e svantaggi. Il sistema descritto qui, che è basato su decaging di ligandi extracellulari, immobilizzati, è ideale per l'analisi delle risposte di segnalazione rapide, subcellulare, polarizzate. Questo approccio è stato applicato per esaminare è formazione in cellule di T, come descritto in precedenza. Inoltre, sono state progettate in gabbia ligandi per altri recettori, che ci permette di applicare la stessa strategia per valutare la segnalazione inibitoria in cellule naturali uccisione e lo spostamento nucleare del fattore di trascrizione NF-κB in risposta a pedaggio come recettore segnalazione di14,15.
In questo protocollo, stimolatori ligandi sono immobilizzati per garantire che rimangano come stazionaria, polarizzata fonte di stimolo per tutta la durata dell'esperimento imaging. Questo approccio è adatto per gli studi di polarizzazione cellulare. Dovrebbe essere notato tuttavia, che l'approccio di fotoattivazione TCR si adatta facilmente per attivazione temporaneamente controllata delle cellule di T su lipidici supportati. Ovviamente, uno non può raggiungere la stimolazione sostenuta, polarizzata in questo contesto. Tuttavia, questo può essere inutile, dato gli obiettivi sperimentali.
Il sistema è anche abbastanza flessibile per quanto riguarda la sorgente di luce UV per decaging. Attualmente, una lampada Hg W 100 viene utilizzato per l'illuminazione concentrata, tuttavia un laser pulsato azoto (ns 4 di larghezza di impulso, impulso energia 120 mJ), è stato utilizzato in precedenza6. A volte, un palmare lampada UV (365 nm, 4 W) è stato posizionato sopra il campione di imaging per decage più grandi regioni del ligando photostimulatable. Le caratteristiche specifiche del sistema decaging in ogni caso dipenderà i requisiti tecnici dell'esperimento in questione.
Quando si implementa questo sistema, è importante confermare che le risposte osservate sono specifiche per l'evento di fotoattivazione e non il risultato dell'attivazione del recettore spurie o photodamage indotto da UV. Per escludere questi artefatti, due controlli di specificità possono essere eseguiti. In primo luogo, è possibile monitorare l'intensità di fluorescenza in cellule che non sono direttamente irradiati durante gli esperimenti di fotoattivazione. Se la superficie è correttamente in gabbia, apprezzabili risposte in queste cellule non dovrebbero essere osservate (ad esempio, Figura 5). In secondo luogo, gli esperimenti in cui T cellule sono UV-irradiati su superfici manca fuse ligandi possono essere eseguiti. Questo controllo è fondamentale per identificare gli effetti indotti da UV indipendenti fuse ligando (ad esempio, vedere riferimento 6). Durante l'ottimizzazione del sistema, è anche estremamente utile avere a portata di mano una risposta imaging cellulare robusta (ad es., Grb2-GFP reclutamento) che sia veloce e localizzata. Valutare le correlazioni tra eventi di segnale e fotoattivazione è molto più semplice se tali eventi sono spatiotemporally prossimale alla stimolazione del recettore.
Anche se l'approccio di fotoattivazione offre squisito spatiotemporal controllo su segnalazione del ricevitore, manca l'adattabilità accordata dal transfectable optogenetica sistemi16,17,18,19 ,20,21,22. Alcune proteine optogenetica sono anche photoreversible, fornendo il controllo condizionale che non è disponibile con l'approccio di fotoattivazione descritto qui. Nei sistemi di optogenetica, tuttavia, limitare la diffusione delle proteine di fotoattivazione è tecnicamente impegnativo. Questo complica l'analisi della segnalazione polarizzata, particolarmente in un contesto subcellulare.
Si dovrebbe anche notare che l'entità coinvolgente di questo sistema di fotoattivazione è una superficie di vetro, che non è possibile riassumere tutti gli aspetti di un'interazione cellula-cellula buona fede. Per ovviare a questo problema mantenendo il controllo spazio-temporale dell'iniziazione di segnale, i ricercatori hanno usato un sistema ottico trappola per portare un APC a contatto con una cellula di T, che permette per l'insorgenza di riarrangiamenti citoscheletrici e maturazione è di essere visualizzate in tempo reale23. Anche se questo sistema permette l'iniziazione precisa e la visualizzazione delle dinamiche del citoscheletro utilizzando un APC effettivo, esso è relativamente bassa velocità effettiva e non è compatibile con illuminazione TIRF, che incide negativamente la qualità dell'immagine.
In conclusione, il metodo descritto in questo protocollo fornisce controllo spazio-temporale del TCR-indotta di segnalazione all'interno della cellula T, in ultima analisi, permettendo per la delucidazione dei cambiamenti biochimici veloce dopo l'attivazione del TCR. Questo sistema ci fornisce un mezzo per capire meglio come gli eventi di segnalazione dopo l'attivazione di TCR promuovono la polarizzazione delle cellule T, IS formazione e, in definitiva, la consegna delle risposte effettrici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del laboratorio Huse per consulenza e assistenza. Supportato da l'US National Institutes of Health (R01-AI087644 di M.H.) e P30-CA008748 al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
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