Summary
Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.
Abstract
Los linfocitos T participan en la señalización rápida, polarizado, que ocurre dentro de minutos después de la activación del TCR. Esto induce la formación de la sinapsis inmunológica, una ensambladura del estereotipado de la célula que regula la activación de la célula de T y direccionalmente apunta las respuestas efectoras. Para estudiar con eficacia estos procesos, es necesario un enfoque imagen adaptado para capturar respuestas rápidas, polarizadas. Este protocolo describe un sistema, que se basa en un photoactivatable péptido mayor complejo de histocompatibilidad (pMHC) que es no estimulante hasta que se expone a la luz ultravioleta. Decaging objetivo de este reactivo durante experimentos de videomicroscopía permite exacto control espacio-temporal de la activación del TCR y vigilancia alta resolución de posteriores respuestas celulares por reflexión interna total (TIRF) proyección de imagen. Este enfoque también es compatible con estrategias de perturbación genética y farmacológica. Esto permite el montaje de vías moleculares bien definidas que vinculan la señalización del TCR a la formación de las estructuras citoesqueléticas polarizadas que subyacen en la sinapsis inmunológica.
Introduction
Los linfocitos T (células T) juegan un papel central en la inmunidad celular mediante el reconocimiento de péptidos antigénicos en el contexto de la superficie de la célula MHC. Reconocimiento del antígeno, que es mediada por el TCR, conduce a la diferenciación de células ingenuas T y promueve la entrega de respuestas citolíticas y comunicativas por poblaciones efectoras. Participación de TCR también induce cambios dramáticos en la arquitectura celular. Dentro de minutos, las células T gloms sobre el lado de la célula presentadora de antígeno (APC), formando una interfaz polarizada conocida como sinapsis inmunológica (es) de1,2. LA potencia respuestas de células T efectoras habilitando la direccional liberación de citoquinas o, en el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), proteínas líticas que destruyen el APC.
Participación de TCR por pMHC induce la fosforilación rápida de múltiples moléculas de adaptador aguas abajo, incluyendo a Linker para las activación de las células T (LAT), que en última instancia promueve fuerte remodelación del citoesqueleto sináptico2. Cortical actinia filamentosa (F-actina) unidades de la célula de T que se separa sobre la superficie de la APC y entonces se resuelve en una estructura anular, caracterizada por la acumulación de la F-actina en la periferia es y agotamiento del centro. Formación del anillo de F-actina se acopla firmemente a la reorientación del centro organizador de microtúbulos (MTOC, también llamado centrosoma en las células de T) a una posición justo debajo del centro de la interfaz. Ambos eventos ocurren dentro de minutos del reconocimiento del antígeno inicial y establecen el contexto arquitectónico en que eventos posteriores de activación y efectora se producen las respuestas.
Para estudiar es formación, varios laboratorios han desarrollado enfoques que la APC se sustituirá por una superficie de vidrio que contiene ligandos inmovilizados de TCR o apoya una bicapa lipídica que sí mismo contiene los ligandos3,4. Las células T forman contactos es-como en estas superficies que pueden ser reflejadas por el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o microscopía confocal, lo que permite estudios de alta resolución de activación temprana de la célula de T y es la formación.
Aunque estos enfoques han permitido la visualización excelente del totalmente montado, gran parte de la ligadura de TCR:pMHC siguiente señalización ocurre dentro de segundos, que complica los esfuerzos para determinar la secuencia de eventos después de la activación del TCR con precisión . Para evitar este problema, se ha desarrollado un enfoque de fotoactivación, que pMHC photoactivatable se utiliza para lograr un control spatiotemporal de TCR activación5,6,7. En este sistema, las células T se unen a las superficies de vidrio que contienen pMHC photoactivatable que es no estimulantes para el TCR hasta irradiados con luz ultravioleta (UV). La radiación UV de una región de micras de tamaño de la superficie debajo de la célula T quita la photocage crear una zona estimulante que puede ser reconocida por la célula de T. Posteriores eventos de señalización y remodelación citoesqueleto entonces son monitoreados utilizando reporteros fluorescentes genéticamente codificados. Dos versiones de photoactivatable de péptidos antigénicos, polilla citocromo c88-103 (MCC) y ovoalbúmina257-264 (OVA), que se presentan en el contexto de la clase II MHC-Ek y la clase I MHC H2-Kb, respectivamente, han sido desarrollados (figura 1). Esto permite el análisis de ambos CD4+ T las células específicas para MCC-Ek (expresando lo 5 C. C7, 2B4, o y TCR) y CD8+ T las células específicas para OVA-H2-Kb (expresan el TCR de OT1).
En la última década, el enfoque de fotoactivación y proyección de imagen de TCR se ha utilizado para establecer la cinética precisa de TCR primeros pasos de señalización y también para identificar las vías moleculares que regulan la remodelación citoesqueleto polarizados5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. por ejemplo, el ensayo era instrumental en la determinación de que el centrosoma reorientación hacia la APC está mediado por un gradiente localizado de lo lípidos segundo mensajero diacilglicerol centrada en el es. Se prevé que esta metodología seguirá siendo valioso para aplicaciones que exigen análisis proyección de imagen de alta resolución de la función de la célula de T.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparación de superficies de vidrio estimulante
- Cubre-objetos de capa bien ocho cámara con biotinilado poli-l-lisina (Bio-PLL) diluyen 1: 500 en agua destilada, desionizada (ddH2O). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Lavado con H2O.
- Secado por 2 h a TA.
- Bloque de Bio-PLL cubrió superficies con solución amortiguadora de bloqueo (HEPES-solución salina con tampón [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) por 30 min a TA.
- Disolver 5 mg de bromhidrato de poli-l-lisina en 1 mL de 10 mM NaPO4, pH 8.5.
- Añadir 125 μmol (0,55 mg) del NHS-biotina (de un stock de 100 mg/mL en DMSO) y compruebe el pH de la reacción. Si el pH está por debajo de 8.5, añadir 2 μL de 4 N NaOH para elevarla a entre pH 8.5 y 9.5.
- Vortex durante 30 minutos.
- Calmar la reacción con 50 μL de 100 mM glicina disuelta en 20 mM Tris de pH 8,0.
- Girar a plena potencia durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
Nota: Calidad de Bio-PLL es típicamente comparado con anteriores preparaciones por capa dos diluciones en serie del material sobre una placa de ELISA de 96 pocillos y cuantificar el contenido de biotina tras incubación con fosfatasa alcalina unida estreptavidina.
- Retire el amortiguador de bloqueo. No permita que los pozos se sequen. Añadir estreptavidina (100 μg/mL en solución amortiguadora de bloqueo). Incubar durante 1 h a 4 ° C.
- Lave en HBS. Llenar e invierta pozos de diapositiva de cámara 4 - 5 veces, quitando HBS de los pozos. No permita que los pozos se sequen.
- Añadir el biotinilado pMHC ligandos y moléculas de adhesión a la superficie.
Nota: MCC y los óvulos pueden ser photocaged mediante la adición de ortho-Nitrobencilo basado en grupos de protección (por ejemplo, nitrophenylethyl (NPE) o nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) para el grupo ε-amino de lisinas claves (K12 en MCC, K7 en OVA). Photocaged MCC y los óvulos pueden obtenerse de proveedores comerciales. Después de la reconstitución en buffer acuoso, ellos son replegados en bacteriano expresada-Ek y H2-Kb utilizando enfoques establecidos11,12. - Validación del péptido MCC o OVA photoactivatable
- Decage péptidos NVOC protegido por irradiación UV con una lámpara UV de mano (véase Tabla de materiales) por 20 min a TA.
- Pulso 1.0 x 105 vehículos blindados con 1 μm de péptido nonstimulatory (control negativo, por ejemplo, Hb), irradiados photoactivatable péptido péptido photoactivatable irradiado y péptido de agonista (control positivo, por ejemplo, MCC) durante 1 h a durante la noche a 37 ° C.
- Para estimular células T expresando el C. 5 C7/2B4/y TCR, uso CH12 o células B CH27. Para estimular las células de T de OT1, utilizar RMA-s o EL4 thymoma células.
- Mezclar el APCs pulsadas con igual número de células T en 96 pocillos redondos placas de fondo en un volumen final de 200 μl. incubar a 37 ° C durante 12-24 h.
- Recuperar el sobrenadante de cada pozo y analizar IL-2 por ELISA con detección colorimétrica de peroxidasa estreptavidina-rábano.
Nota: Se recomienda confirmación del estado de los péptidos por espectrometría de masas por electrospray antes refolding en complejos de MHC, jaulas.
- Realizar el plegado y la purificación de MHC con el fin de minimizar la exposición a la luz. Por ejemplo, envuelven reacciones de plegamiento de papel de aluminio y llevar a cabo cromatografía de gel filtración con la lámpara Ultravioleta de.
Nota: Se ha encontrado photoactivatable MCC-Ek y OVA - H2-Kb inducir la activación de células T independientes de UV en alta densidad, posiblemente debido a la incompleta jaulas funcional. Por lo tanto, la photoactivatable pMHC se diluye en un 10-30 x exceso de pMHC nonstimulatory (e.g. -Ek que contiene el péptido de64-76 de hemoglobina (Hb)) durante la etapa de inmovilización. Esto mejora la relación señal a ruido del experimento de imágenes posteriores. - Para Fotoactivar CD4+ T las células, colectivamente utilizan una mezcla de biotinilado Hb-Ek (3 μg/mL), biotinilado photoactivatable MCC-Ek (0,1 μg/mL) y el anticuerpo biotinilado contra la clase I MHC H2-Kk (0,5 μg / mL). los anticuerpos de anti-H2-Kk anima a 5 C. C7/2B4/y T las células, que expresan H2-Kk, extender sobre la superficie de vidrio sin sufrir activación.
- Para CD8+ T células, use una mezcla de biotinilado H2 Db teniendo el péptido KAVYDFATL (1 μg/mL), biotinilado photoactivatable OVA-H2-Kb (0,1 μg/mL) y el dominio extracelular de la molécula de adhesión ICAM-1 (2 μg/mL producido por insectos de la célula cultura13). El ICAM-1 favorece la formación contacto cercana enganchando la integrina LFA1 en la superficie de la célula de T.
- Aplicar todas las mezclas de proteínas en solución amortiguadora de bloqueo, seguido por incubación durante 1 h a temperatura ambiente o por lo menos 2 h a 4 ° C.
Nota: La densidad molecular en las superficies de este tipo que ~ 8000 por μm2 ha sido previamente6. Que pMHC photoactivatable representa ~1/30to de la proteína biotinilada en la superficie, su densidad será ~ 267 moléculas por μm2, antes de decaging. - Lavar como en el paso 1.6 y deje en HBS hasta que esté listo para usar.
- Añadir 200.000 CD4+ o CD8+ T expresan el TCR adecuado en cada pocillo de las células y permitir que las células se adhieran a 37 ° C durante 15 minutos. Una vez las células se han unido a la extensión en la superficie, están listos para la fotoactivación y proyección de imagen.
Nota: Transducción Retroviral de células efectoras T con fluorescente puntas de prueba de la proyección de imagen se describe en detalle cordón6,7. Señalización de calcio también se puede estudiar usando las células de T untransduced con el tinte sensible del calcio Fluo-46. El tinte radiométrica Fura-2 no se recomienda porque requiere excitación en el rango de UV, que también induce la decaging de la photoactivatable pMHC.
2. adquisición de la imagen
- Usar un microscopio TIRF invertido con un objetivo X UV 150 compatible para la adquisición de la imagen. UV irradiar regiones definidas por el usuario mediante un sistema de diafragma digital conectado a una lámpara de mercurio de 100 W (HBO). Luz de esta lámpara sobre la muestra utilizando un espejo de pase largo 400 nm UV directa.
- Utilizar software de análisis de imagen para la fotoactivación localizada y adquisición de Time-lapse. En la mayoría de los experimentos, controlar las puntas de prueba en los canales rojos y verdes con 488 nm y 561 láseres de excitación nm, respectivamente. Luz láser se dirige sobre la muestra utilizando un espejo dicroico de doble banda que transmite también en la gama ultravioleta (para decaging). Por favor vea la Tabla de materiales y la figura 6 para obtener información adicional sobre la configuración del microscopio.
- Después de montar el portaobjetos de la cámara que contiene las células de T, ajuste la configuración para obtener iluminación TIRF o epifluorescencia, según sea necesario. En modo live, seleccione el campo de las células que están expresando la sonda fluorescente de interés. Establecer regiones de microescala para la fotoactivación por debajo de las células individuales utilizando el software de control.
- Comenzar la adquisición de Time-lapse. Por lo general, se adquieren los puntos de 80 tiempo, con un intervalo de 5 s entre cada punto del tiempo. Esto deja tiempo más que suficiente para secuencial 488 nm y 563 exposiciones nm, en el caso de los experimentos de doble color.
- Después de 10 puntos de tiempo, Fotoactivar las regiones seleccionadas al abrir el diafragma digital del obturador de 1-1.5 s.
- Una vez finalizado el lapso de tiempo, seleccione un nuevo campo de las células y repetir el proceso.
3. Análisis de los datos
Nota: Fotoactivación localizada de ligandos inmovilizados crea una región estimuladora bien definida y estacionaria, que puede utilizarse para el análisis cuantitativo de la señalización de las respuestas y eventos remodelación citoesqueleto. Análisis de protocolos generalmente involucran cuantificación de la intensidad de fluorescencia dentro de la región irradiada o utilizando la región irradiada como un extremo posicional para medidas de distancia (ej. para evaluar la polarización del centrosoma a la irradiado a región). A continuación se describen ambos protocolos de análisis. Varios programas de análisis de imagen interactiva pueden utilizarse para hacer intensidad y medidas de la distancia, que pueden ser salida de procesamiento adicional y análisis.
-
Intensidad de fluorescencia
- Determinar la intensidad de fluorescencia (FI) de una región de fondo fuera de la célula (FIb). Esto se utilizará para la corrección de fondo.
- Dibuja una región cuadrada de tamaño micrométrico fuera de la célula y hacer una máscara. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en analizar | Estadísticas de la máscara. Seleccione Intensidad de fluorescencia media y los valores de exportación.
Nota: Ver detalles de procedimiento (p. ej. 3.1.1.1) software Slidebook (véase Tabla de materiales). Aplicación del presente Protocolo con otros paquetes de software (por ej., FIJI) será ligeramente diferente.
- Dibuja una región cuadrada de tamaño micrométrico fuera de la célula y hacer una máscara. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en analizar | Estadísticas de la máscara. Seleccione Intensidad de fluorescencia media y los valores de exportación.
- Determinar la FI dentro de la región de fotoactivado para cada punto del tiempo.
- Seleccione máscara para resaltar la región que se fotoactiva. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en analizar | Estadísticas de la máscara. Seleccione Intensidad de fluorescencia media y los valores de exportación.
- Restar el fondo FI de los valores medidos de FI dentro de la región. Entonces, normalizar las mediciones de FI corregidas dividiendo por la media, antecedentes corrección FI de los primeros 9 marcos antes de fotoactivación. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)).
Nota: El gráfico ΔF/F como una función del tiempo.
- Determinar la intensidad de fluorescencia (FI) de una región de fondo fuera de la célula (FIb). Esto se utilizará para la corrección de fondo.
-
Distancia
- Obtener x e y coordenadas del centro de la región de fotoactivado.
- Para determinar x e y coordenadas del centro de la región de Fotoactivado, seleccione máscara para resaltar la región que se fotoactiva. Una vez que se destaca la región de fotoactivación, seleccione analizar | Estadísticas de la máscara | Centro de zona y los valores de exportación.
- Determinar x e y las coordenadas de la punta de prueba fluorescente de interés para cada momento. Esto se logra normalmente a través de rastreo de partículas ya sea manual o automatizado.
- Para determinar x e y coordenadas de la punta de prueba fluorescente de interés, seleccione Manual de seguimiento de partículas y haga clic en la punta de prueba fluorescente de interés con el tiempo. Una vez que han sido rastreados todos los puntos de tiempo, seleccione analizar | Estadísticas de la máscara | Centro de zona y los valores de exportación.
- Calcular la distancia entre la proteína fluorescente de interés y el centro de la región de fotoactivado para cada punto del tiempo usando la ecuación: distancia = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), en que x2 y y2 son las coordenadas de la proteína fluorescente de interés y x1 y y1 son las coordenadas del centro de la región de fotoactivado.
- Gráfico de la distancia en función del tiempo.
- Obtener x e y coordenadas del centro de la región de fotoactivado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El enfoque de fotoactivación y proyección de imagen permite observación y fácil cuantificación de respuestas señalización rápidas, polarizadas. Para ilustrar sus capacidades, reproducidos aquí es un experimento examinando la correlación espacio-temporal entre la acumulación inducida por TCR DAG y reorientación del centrosoma. 5C. T C7 celular ráfagas fueron retrovirally transduced con dos reporteros fluorescentes: un biosensor de DAG que contienen los dominios C1 de tándem de la proteína quinasa C θ vinculados a GFP (GFP-C1) y RFP-tubulina para supervisar el centrosoma. Las células de T entonces fueron atadas a cubreobjetos cámaras que contienen photoactivatable MCC-Ek. C1-GFP era reflejada mediante microscopía TIRF y RFP-tubulina en el modo de epifluorescencia. Como se muestra en la figura 2, fotoactivación localizada de la superficie debajo de la célula T induce la acumulación de DAG en la zona irradiada. Esto es seguido en segundos por la reorientación del centrosoma en la misma región.
Acumulación de C1-GFP puede cuantificarse mediante el cálculo de la intensidad de fluorescencia normalizado, después de la corrección de fondo, en el centro de la región de fotoactivado con el tiempo (figura 3). Reorientación del centrosoma en respuesta a la fotoactivación puede cuantificarse mediante el cálculo de la distancia entre el centrosoma y el centro de la región de fotoactivado en función del tiempo (figura 4).
Este método puede utilizarse para examinar una amplia gama de respuestas señalización rápidas, polarizadas, esencialmente todo lo que pueden ser monitoreados utilizando una sonda fluorescente. Por ejemplo, TCR fotoactivación es utilizado para monitorear la formación señalización temprana de microcluster usando fluorescencia etiquetada Grb2 (Grb2-GFP) (figura 5). Similar a la acumulación de DAG y respuestas de reorientación del centrosoma, Grb2-GFP polarización se produce poco después de la fotoactivación (figura 5) y se puede cuantificar utilizando el enfoque de la intensidad de fluorescencia normalizado.
Figura 1: Sistema de fotoactivación mediante photocaged péptido MCC.
(A) Photocaged estrategia de péptido MCC. Un grupo NPE se une a los residuos de lisina del péptido de MCC. Resultados de la irradiación UV en el retiro de la NPE, restablecimiento de MCC en su forma nativa. (B) cuando NPE está limitado a MCC, la C. 5 C7 TCR no se puede enlazar a MCC. Resultados de eliminación de NPE en reconocimiento a la C. 5 C7 TCR para el péptido nativo de MCC. (C) la estrategia de photocaged ha sido adaptada para trabajar con células T CD8 +, en el cual péptido del OVA de photocaged se utiliza para activar el TCR de OT-1 a la irradiación UV.
Figura 2: Montaje Time-lapse de la reorientación de la acumulación y el centrosoma de DAG, después de la fotoactivación del TCR en 5C. Célula de T de C7.
5C. Celda C7 expresando un biosensor de DAG, con el tándem C1-dominios de PKC - fusionada a GFP (GFP-C1) y etiqueta RFP tubulina (RFP-bañera), un reportero fluorescente para el centrosoma. Los montajes ilustran la respuesta polarizada de 5C. Células de T de C7 con el tiempo. El óvalo amarillo y el texto indican el tiempo y la ubicación de fotoactivación. Con el tiempo, C1-GFP se acumula en la región de Fotoactivado, seguida por reorientación de centrosoma hacia la región de fotoactivado. Barra de escala: 10 μm.
Figura 3: Cuantificación de la acumulación de DAG en la región de fotoactivado
Acumulación de DAG, C1-GFP, en la región de fotoactivado (izquierda) puede cuantificarse mediante el cálculo de la intensidad de fluorescencia normalizado, después de la corrección de fondo, en la región de fotoactivado (círculo amarillo con sombreado azul) con el tiempo. Los datos se normalizan con respecto a los nueve fotogramas obtenidos antes de fotoactivación. Enriquecimiento de C1-GFP en la región de fotoactivado puede ser calculado por la división de la intensidad de fluorescencia media en la región irradiada por la intensidad de fluorescencia media de toda la célula, tras corrección de fondo. La ecuación: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), en que FI es la intensidad de fluorescencia media puede utilizarse para calcular la intensidad de fluorescencia normalizado. La intensidad de fluorescencia normalizado en la región de fotoactivado entonces puede graficar como una función del tiempo (derecha). Línea morada indica el tiempo de fotoactivación. Barra de escala: 10 μm.
Figura 4: Cuantificación de la reorientación del centrosoma.
Determinar las coordenadas del centrosoma (RFP-tina) con el tiempo mediante el seguimiento manualmente la ruta de centrosoma hacia la región fotoactivado (flecha blanca) en cada momento (izquierda). Determinar las coordenadas del centro de la región de fotoactivado (círculo amarillo). Se puede calcular la distancia entre el centrosoma y el centro de la región de fotoactivado en cada momento utilizando la ecuación para la distancia = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), en la que x2 e y 2 son el x y y coordenadas para el centro de la zona del centrosoma y x1 y y1 son x e y coordenadas del centro de la región de fotoactivado. La distancia del centrosoma del centro de la región de fotoactivado en cada momento punto entonces puede graficar como una función del tiempo (derecha). Línea morada indica el tiempo de fotoactivación. Barra de escala: 10 μm.
Figura 5: Formación de microcluster de Grb2-GFP.
(A) representante C. 5 Celda C7 expresando fluorescencia etiquetada Grb2 (Grb2-GFP). Los montajes ilustran la respuesta polarizada extra Grb2-GFP. El óvalo amarillo y el texto indican el tiempo y la ubicación de fotoactivación. Con el tiempo, Grb2-GFP se acumula en la región de fotoactivado. (B) cuantificación de la intensidad de la fluorescencia de GFP Grb2 en la región de fotoactivado con el tiempo. N = 15 células. C cuantificación de la intensidad de la fluorescencia de GFP Grb2 en una región de control fuera de la zona de fotoactivado. N = 15 células.
Figura 6: Configuración del microscopio para la fotoactivación y proyección de imagen de TIRF.
488 nm y 561 nm láseres se utilizan para TIRF y proyección de imagen de epifluorescencia de sondas de verdes y rojas, respectivamente. Se toma por fotoactivación luz UV de una lámpara de mercurio (Hg) conectada a un sistema de diafragma digital capaz de iluminar las regiones pequeñas, definidas por el usuario. Luz de la lámpara de Hg/diafragma se refleja en la muestra por un espejo longpass ubicado debajo el espejo dicroico que refleja la proyección de imagen láser. El espejo dicroico debe estar diseñado para pasar a UV luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En los últimos años, la luz ha surgido como una excelente herramienta para la activación spatiotemporally controlada de procesos celulares. Diversas metodologías se han desarrollado, cada uno con desventajas y ventajas asociadas. El sistema descrito aquí, que se basa en la decaging de ligandos inmovilizados, extracelulares, es ideal para el análisis de las respuestas de señalización rápidas, subcelulares, polarizados. Este enfoque se ha aplicado para examinar la formación es en las células T como se describió anteriormente. Además, ligandos enjaulados para otros receptores han sido diseñados, lo que nos permite aplicar la misma estrategia para evaluar señalización inhibitorio en las células de la muerte natural y translocación nuclear del factor de transcripción NF-κB en respuesta al peaje como receptor señalización de14,15.
En este protocolo, ligandos estimulantes son inmovilizadas para asegurar que permanecen como una fuente estacionaria, polarizada de estimulación durante el experimento de la proyección de imagen. Este enfoque es ideal para estudios de polarización celular. Sin embargo, cabe señalar que el enfoque de la fotoactivación TCR se adapta fácilmente para la activación de células T temporal controlada en bicapas lipídicas soportadas. Obviamente, uno no puede lograr la estimulación sostenida, polarizada en este contexto. Esto puede ser innecesario, sin embargo, dado los objetivos experimentales.
El sistema es también muy flexible con respecto a la fuente de luz UV para decaging. Actualmente, una lámpara de 100 W Hg se utiliza para iluminación centrada, un láser de nitrógeno pulsada (pulso ancho 4 ns, mJ de energía 120 de pulso), era usada anteriormente6. A veces, una mano lámpara UV (365 nm, 4 W) se ha posicionado sobre la muestra imágenes para regiones más amplias del ligando de photostimulatable de decage. Las características específicas del sistema decaging en cada caso dependerá de los requisitos técnicos del experimento en cuestión.
Al implementar este sistema, es importante confirmar que las respuestas observadas son específicas para el evento de fotoactivación y no el resultado de la activación del receptor espurios o fotodaño inducido por UV. Para descartar estos artefactos, se pueden realizar dos controles de especificidad. En primer lugar, se puede monitorizar intensidad de fluorescencia en células que no son directamente irradiadas durante experimentos de fotoactivación. Si la superficie está adecuadamente enjaulados, apreciable respuesta en estas células no debe ser observado (por ejemplo, figura 5). En segundo lugar, se pueden realizar experimentos en que T las células son irradiadas por UV en superficies carentes de ligandos photoactivatable. Este control es fundamental para la identificación de los efectos inducidos por UV que son independientes del ligando de photoactivatable (por ejemplo, ver referencia 6). Durante la optimización del sistema, también es muy útil tener a mano una respuesta imagen celular sólida (e.g., Grb2-GFP reclutamiento) que es rápida y localizada. Evaluación de correlaciones entre eventos de señalización y fotoactivación es mucho más sencillo si esos acontecimientos son spatiotemporally proximales a la estimulación del receptor.
Aunque el enfoque de fotoactivación ofrece exquisito control spatiotemporal sobre receptor de señalización, carece de la capacidad de adaptación de optogenetic transfectable sistemas16,17,18,19 ,20,21,22. Ciertas proteínas optogenetic son también photoreversible, proporcionando un control condicional que no con el enfoque de la fotoactivación que se describe aquí. En sistemas de optogenetic, sin embargo, restricción de la difusión de proteínas fotoactivado es un desafío técnico. Esto complica el análisis de señales polarizadas, particularmente en un contexto subcelular.
También cabe destacar que la entidad atractiva de este sistema de fotoactivación es una superficie de vidrio, que no puede recapitular todos los aspectos de una interacción de buena fe de la célula. Para evitar este problema y mantener el control espacio-temporal de la iniciación de la señal, los investigadores han utilizado un sistema trampa óptica para traer un APC entre en contacto con una célula T, lo que permite la aparición de cambios citoesqueléticos y maduración es que visualizar en tiempo real23. Aunque este sistema permite la iniciación precisa y visualización del citoesqueleto dinámica mediante una real APC, es relativamente bajo rendimiento y no es compatible con la iluminación de la TIRF, que afecta negativamente a la calidad de imagen.
En conclusión, el método descrito en el presente Protocolo proporciona control espacio-temporal de la inducida por TCR señalización dentro de la célula de T, en última instancia, lo que permite la elucidación de los cambios bioquímicos rápidamente tras la activación del TCR. Este sistema nos proporciona un medio para comprender mejor cómo los eventos de señalización siguiendo la activación del TCR promoción la polarización de la célula de T, es la formación y, en última instancia, la entrega de las respuestas efectoras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Huse para asesoramiento y asistencia. El apoyo de los Estados Unidos institutos nacionales de salud (R01-AI087644 a M.H.) y P30-CA008748 al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
