Summary
Il microambiente tumorale acide gioca ruoli critici nella progressione del tumore. Per valutare gli effetti del pH extracellulare acido sul cancro cellule in vitro, abbiamo istituito sistemi di semplice cultura acida.
Abstract
Condizioni del microambiente tumorale, quali ipossia o nutriente inedia, giocano un ruolo critico nella progressione del cancro e malignità. Tuttavia, il ruolo di pH acido extracellulare in aggressività del tumore e del suo meccanismo sottostante non è stato ampiamente studiato rispetto alle condizioni ipossiche o nutriente inedia. Inoltre, un metodo di cultura ben definita per imitare il microambiente tumorale extracellulare acido completamente non è stato segnalato.
Qui presentiamo un metodo di coltura semplice in vitro per mantenere acida pH extracellulare utilizzando ridotto bicarbonato e aumento del lattato o HCl concentrazioni nel terreno di coltura. Il pH medio era sostenuto per almeno 24 h e gradualmente diminuito da 72 h dopo coltura di cellule di cancro del pancreas PANC-1 e AsPC-1. Tre condizioni distinte media acide in questo studio altamente sovraregolati geni pH-sensible a reagire come MSMO1, INSIG1e IDI1 rispetto ad ipossia o nutriente inedia. Il upregulation di questi geni può essere utilizzato come un indicatore di pH acido. Queste semplici tecniche sono benefiche per delucidare i meccanismi di fondo di malignità del tumore sotto microambiente tumorale acide. Di conseguenza, il nostro sistema di cultura acida pH extracellulare consente l'individuazione di risposte cellulari pH acido non solo nelle cellule tumorali, ma anche nelle cellule primarie, come le cellule tubolari renali, nei confronti di altri acidi disordini compreso, chetoacidosi diabetica, acidosi lattica, acidosi tubulare renale e acidosi respiratoria.
Introduction
Il microambiente tumorale svolge un ruolo critico nella progressione del tumore e cancro cellula metabolismo1,2,3. Le cellule tumorali sono spesso esposti a condizioni quali ipossia, privazione nutriente e acida pH extracellulare (pHe). Tuttavia, il ruolo di pHe in progressione del tumore non è stato chiarito come ampiamente come ipossia o nutriente inedia. Il pHe nel tessuto del tumore può diventare acido, raggiungendo circa pH 6,84,5. Il pH acido nasce dall'aerobica ed anaerobica glicolitica escrezione di protoni (H+) e lattato di proliferazione del cancro cellule5,6.
Studi recenti hanno rivelato che acida indotta da pHe istone deacetilazione, ossidazione degli acidi grassi ed esocitosi dei lisosomi acidi per adattamento al severo ambiente acido7,8,9,10. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali l'acidificazione extracellulare influenza cancro comportamento e l'identità della chiave regolatori nel microambiente tumorale pH acido completamente non sono stati determinati. Inoltre, parecchi rapporti descritti vari media di pH acido, utilizzando poco chiare concentrazioni di bicarbonato, Tris, tubi e HEPES buffer o lattato e HCl, ma ci sono pochi rapporti per dimostrare la stabilità del rettificata media né completa confronto di diversi distinti acide cultura media7,8,9,10
Per delucidare i regolatori chiave ed i cambiamenti metabolici in cellule tumorali nel contesto dell'acidificazione extracellulare, abbiamo stabilito un modello semplice in vitro della coltura per mantenere un pHe acide ed ha esaminato il ruolo di pHe in cancro cellule11. Utilizzando questo metodo, abbiamo mantenuto un terreno di coltura acida con un pHe di 6.8 a 37 ° C inferiore al 5% CO2, usando le concentrazioni ridotte di bicarbonato nel terreno di coltura. pH 7.4 è stato utilizzato come normale e medio di controllo. Il pH medio era sostenuto per almeno 24 h e gradualmente diminuito di 72 h durante la coltura di cellule di cancro del pancreas PANC-1 e AsPC-1. Perché avanzata glicolisi accelera l'escrezione di non solo protoni, ma anche del lattato7,8,9, abbiamo anche stabilito un metodo di coltura che imita acidosi indotta da lattato di aggiunta del lattato, invece di ridurre il concentrazione di bicarbonato. Inoltre, indotta da HCl acido pHe nel medio permette di escludere la possibilità che risposte cellulari a pH acido di coltura non sono dovuti a una ridotta concentrazione di bicarbonato. Inoltre, utilizzando vari mezzi di comunicazione con un pH di 6.4 a 7.4 con concentrazione di bicarbonato differenti, possiamo valutare l'entità degli effetti di pHe su risposte cellulari.
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Protocol
1. preparazione del terreno di coltura acida
-
Preparazione del controllo (pH 7,4) e terreno di coltura di basso pH (pH 6,8)
- Sciogliere 4,75 g di polvere DMEM senza L-Glutammina in 500 mL di acqua.
- Preparare 0,33 M NaHCO3 soluzione in una bottiglia a tenuta di pressione.
Attenzione: È importante utilizzare una bottiglia di tenuta pressione poiché NaHCO3 emette CO2 gas quando riscaldato e decomposizione termica. - Autoclave il mezzo e soluzione. Consentire i buffer raffreddare a 25 ° C.
- Aggiungere 5 mL di 200 mM L-Glutammina, 5 mL di penicillina-streptomicina e 50 mL di siero fetale bovino a 500 mL di DMEM senza bicarbonato.
- Per mezzo di controllo (pH 7.4), aggiungere 2,4 mL di soluzione di 0,33 M NaHCO3 per 100 mL di DMEM senza bicarbonato. Per mezzo di basso pH (pH 6,8), aggiungere 0,6 mL di soluzione di 0,33 M NaHCO3 per 100 mL di DMEM senza bicarbonato.
- Controllare il pH medio dopo 24 h di incubazione a 37 ° C inferiore al 5% di CO2.
Nota: La quantità di soluzione di NaHCO3 deve essere regolato a seconda del pH medio, che possa differire a seconda del contenuto di CO2 del incubatrice e pressione dell'aria. Idealmente, per la prima volta, è meglio misurare il pH medio con varie concentrazioni di bicarbonato per determinare la quantità appropriata di NaHCO3 soluzione per aggiungere a DMEM.- Raccogliere il terreno di coltura immediatamente dopo aver tolto la piastra di coltura dell'incubatrice di CO2 e misurare il pH utilizzando un pH-metro. Mantenere la temperatura media a 37 ° C con un bagno d'acqua se necessario. Misurare il pH medio tre volte in modo indipendente.
Nota: NaHCO3 soluzione deve essere conservata a 4 ° C e ogni mass media deve essere preparata. Prodotti disponibili in commercio che possono essere utilizzati in questo studio sono elencati in Tabella materiali.
- Raccogliere il terreno di coltura immediatamente dopo aver tolto la piastra di coltura dell'incubatrice di CO2 e misurare il pH utilizzando un pH-metro. Mantenere la temperatura media a 37 ° C con un bagno d'acqua se necessario. Misurare il pH medio tre volte in modo indipendente.
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Preparazione terreno di coltura acida indotta da lattato o indotta da HCl
- Aggiungere 100 mL di terreno di controllo (preparata al punto 1.1.5) 74 µ l di soluzione del lattato o 125 µ l di 1 M HCl.
- Controllare il pH medio dopo 24 h di incubazione a 37 ° C inferiore al 5% di CO2.
Nota: La quantità di lattato o soluzione di HCl deve anche essere regolata secondo il pH medio, che possa differire a seconda del contenuto di CO2 nel incubatrice e pressione dell'aria. Idealmente, è meglio misurare il pH medio con seriale lattato o concentrazioni di HCl per determinare la quantità appropriata per la regolazione del pH desiderato del mezzo.
2. raccolta e trattamento di cellule
- Iniziare a coltivare le cellule a 37 ° C, inferiore al 5% di CO2 almeno 1 settimana prima di eseguire esperimenti.
Nota: Le linee cellulari utilizzate in questo studio sono elencate in Tabella materiali. - Cellule di passaggio quando raggiungono confluency di 70-90%. Non permettono alle cellule di diventare confluenti. Modificare il mezzo ogni 2-3 giorni durante la coltivazione quotidiana.
- Lavare le cellule aggiungendo 5 mL di PBS. Aspirare il PBS e aggiungere enzima distaccante quali 1 mL di tripsina.
- Incubare a 37 ° C fino a quando le cellule vengono arrotondate e iniziano a staccare.
- Aggiungere 5 mL di terreno di coltura le cellule indipendenti e disattivare degli enzimi. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare per 3 min a 300 x g. aspirare il supernatante e risospendere le cellule con terreno di coltura.
- Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e blu di Trypan.
- Seme 5,0 x 105 cellule/pozzetto di un piatto di 10 cm in 10 mL di terreno. Incubare le cellule per 24 h a 37 ° C inferiore al 5% di CO2.
- Aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule con 5 mL di PBS e aggiungere 10 mL di terreno di coltura acido preparato nella sezione 1. Incubare le cellule per 24 h a 37 ° C inferiore al 5% di CO2.
3. RNA isolamento
- Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con 5 mL di PBS. Frantumare le cellule con l'aggiunta del reagente di estrazione di RNA (Vedi Tabelle materiali).
- Raschiare il piatto brevemente, quindi rimuovere il reagente di estrazione di RNA con una pipetta e depositare il RNA estrazione reagente/lysate delle cellule in una provetta da 1,5 mL. Lasciare a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere 250 cloroformio µ l e agitare la provetta per lasciare circa 15 s. a temperatura ambiente per 5 min e centrifugare a ≥ 8, 000 x g per 5 min.
- Rimuovere con cautela la fase acquosa utilizzando una pipetta. Lasciare dietro alcuni della fase acquosa. Posto in un'altra provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere 550 µ l isopropanolo alla fase acquosa e mescolare delicatamente. Lasciare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare a massima velocità (≥ 20, 000 x g) per 20 min a 4 ° C.
- Versare fuori l'isopropanolo e aggiungere 1 mL di etanolo al 75% in DEPC acqua trattata. Mescolare delicatamente. Centrifugare a 8.000 x g per 5 min.
- Pipettare fuori l'etanolo e lasciare che asciugare all'aria il pellet.
- Aggiungere che circa 15-25 µ l (a seconda del rendimento) di DEPC acqua trattata per la pallina del RNA. Mescolare accuratamente.
- Misurare la concentrazione di RNA isolato misurando l'assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro.
4. sintesi del cDNA
- Combinare i seguenti componenti in un tubo di reazione di PCR: fino a 5 µ g RNA totale, 1 µ l Oligo dT (50 µM) o Primer Mix (60 µM), 1 µ l 10 mM dNTP e acqua priva di nucleasi per un volume totale di 14 µ l.
- Mescolare e centrifugare brevemente i componenti utilizzando una centrifuga da banco piccolo (~ 5 s). Denaturare il campione primer di RNA per 5 min a 65 ° C. Girare brevemente (~ 5 s) utilizzando un piccolo benchtop centrifugare e mettere il campione immediatamente in ghiaccio per almeno 1 min.
- Aggiungere i seguenti componenti: 4 µ l 5 x buffer della trascrizione inversa, 1 µ l della trascrittasi inversa (200 U / µ l), 1 µ l della RNAsi inibitore (40 U / µ l).
Nota: Esempi di kit commercialmente disponibili sono mostrati in Tabella materiali - Richiudere la provetta, mescolare e poi Centrifugare brevemente il contenuto utilizzando una centrifuga da banco piccolo (~ 5 s). Incubare la miscela di reazione combinata a 50-55 ° C per 10 min.
- Inattivare la reazione incubando a 80 ° C per 10 min.
5. misurazione dell'espressione genica acido-sensibli a reagire mediante PCR in tempo reale
- Combinare i seguenti componenti in una piastra 384 pozzetti di reazione: 1 µ l modello cDNA, 0,75 µ l 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µM 50 µ l in avanti Primer, 0,3 µ l 50 µM reverse primer, 1 µ l Taq polimerasi, 2,5 µ l 10 x buffer della polimerasi di Taq, 2,5 µ l 20 mM dNTP, 16.65 µ l acqua.
Nota: Esempio di kit commercialmente disponibili vengono visualizzati nella Tabella materiali. Nella tabella 1viene visualizzato un elenco degli iniettori. Una piastra a 96 pozzetti di reazione può essere utilizzata anche in questo passaggio. Altre sonde (ad es., sonda Taqman) possono anche essere utilizzate. - Impostare l'esperimento e il seguente programma PCR su un sistema di PCR in tempo reale: 50 ° C per 2 min, 1 ciclo; 95 ° C per 10 min, 1 ciclo; 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 1 min, 40 cicli; 95 ° C per 15 s, 1 ciclo; 60 ° C per 15 s, 1 ciclo; 95 ° C per 15 s, 1 ciclo.
- Posizionare la piastra nello strumento qPCR. Avviare il programma.
Nota: Upregulation dei geni reattivo pH MSMO1, INSIG1e IDI1 può essere misurata dai livelli della proteina.
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Representative Results
Per determinare la concentrazione di bicarbonato appropriato, abbiamo preparato DMEM al gamma di 0 - 8 mM NaHCO3 (concentrazione finale nel terreno di coltura) e riuscì a preparare terreni di coltura con pH che vanno da 6.4-7,4 (Figura 1). Abbiamo preparato DMEM con 8mm NaHCO3 (pH 7.4) come un mezzo di controllo e 2 mM NaHCO3 (pH 6,8) come un mezzo con pH acido secondo un precedente rapporto, affermando che il pH extracellulare raggiunge pH 6,8 per tumori solidi4,5. Il pH del terreno siliceo è stato sostenuto per 24 h e diminuito gradualmente a circa pH 6.6 per 72 h durante la cultura di PANC-1 e cellule AsPC-1 (Figura 2). Successivamente, per determinare la quantità di lattato o HCl necessarie per adeguare il mezzo di controllo (pH 7.4) pH 6.8, abbiamo aggiunto varie quantità di lattato o HCl al mezzo di controllo e misurato il pH del mezzo e trovato che il pH del mezzo di controllo con una concentrazione finale n di 22,5 µM lattato e 6,25 mM HCl ha raggiunto un valore di 6.8 (Figura 3).
L'effetto dell'acidificazione extracellulare usando un mezzo con basso pH può essere facilmente valutata basato sul upregulation dei geni acidi pH-sensible a reagire come MSMO1, IDI1e INSIG1. Espressione di questi geni altamente è stata aumentata sotto pH basso rispetto alla loro espressione nell'ambito di ipossia o di fame dei nutrienti (Figura 4). Inoltre, il upregulation di questi geni non era specifico per un mezzo in cui il pH acido è stato causato da livelli di bicarbonato ridotta, e anche loro erano sovraregolati da un mezzo in cui pH acido è stato causato dall'aggiunta di lattato e/o HCl (Figura 5). Confronto delle risposte cellulari ai media in cui il pH acido è derivato da livelli di bicarbonato ridotta o l'aggiunta di lattato o HCl consente di determinare se le risposte cellulari sono specifiche per determinati tipi di acidificazione. Upregulation dei geni responsabili di pH acido come IDI1, MSMO1e INSIG1 sotto basso pH extracellulare si verifica anche in cellule normali (Figura 6), così il nostro metodo può essere applicato non solo le cellule del tumore, ma anche le cellule normali. In condizioni di pH elevato, il livello di espressione di geni responsabili di pH non era upregulated in PANC-1 e cellule AsPC-1 (Figura 7), che possono essere utilizzate come controllo negativo.
Figura 1. Correlazione tra concentrazione di NaHCO3 e medio pH. Asse orizzontale Mostra la concentrazione di NaHCO3 e l'asse verticale Mostra il pH medio a 37 ° C inferiore 5% CO2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Cambiamento di pH medio basso pH (pH 6,8) del terreno di coltura durante 72 h-cultura. PH medio era sostenuta per 24 h e gradualmente diminuito per 72 h durante la coltura delle cellule PANC-1 e AsPC-1. 5,0 x 105 celle erano seminato per un piatto di 10 cm in 10 mL di terreno, incubate per 24 h e cambiato in terreno di coltura a basso pH. I dati sono presentati come la media ± SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Correlazione tra lattato o HCl concentrazioni e pH del terreno. Il mezzo di controllo (pH 7.4) è stato tamponato con diverse concentrazioni di lattato o HCl. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Upregulation trascrizionale dei geni acide pH-sensible a reagire in risposta a basso pH. Livello di espressione di MSMO1, IDI1e INSIG1 era più alta in PANC-1 e cellule AsPC-1 nel contesto del basso pH (pH) rispetto a condizioni di inedia nutriente (NS) o ipossia (H) dopo 24 h. i dati sono presentati come la media ± SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. Di Student t-test sono stati eseguiti per i confronti indicati. p < 0,005. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Upregulation trascrizionale dei geni acide pH-sensible a reagire in risposta all'acidosi lattica e HCl-mediata acidosi. Espressione dei mRNAs IDI1, MSMO1e INSIG1 in cellule PANC-1 e cellule AsPC-1 è stata determinata dall'analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale sotto controllo (Con; pH 7.4), basso pH (pH; pH 6.8, ridotta quantità di NaHCO3 ), acidosi lattica (lattato; pH 6.8, aumentata quantità di lattato) e condizioni di acidosi HCl-mediata (HCl; pH 6.8, aumentata quantità di HCl) per 24 h. i dati sono presentati come la media ± SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. Di Student t-test sono stati eseguiti per i confronti indicati. p < 0,005. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. Upregulation trascrizionale dei geni acide pH-sensible a reagire in risposta a basso pH nelle cellule normali. Livello di espressione di MSMO1, IDI1e INSIG1 era sovraregolati fibroblastico KMS-6, TIG, e le cellule MRC9 e cellule endoteliali HUVEC dopo 24 h. i dati sono presentate come la media ± SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. Di Student t-test sono stati eseguiti per i confronti indicati. p < 0,005. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Livello di espressione dei geni acide pH-responsabile in condizione di alto pH (pH 7,6 a 8.0) in confronto ai sensi basso pH (pH 6,8). Il livello di espressione dei geni pH-responsabile come IDI1, MSMO1e INSIG1 rimane invariato in condizioni di pH elevato (pH 7,6 a 8.0) in PANC-1 e cellule AsPC-1 dopo 24 h. i dati sono presentate come la media ± SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Primer | Trasmettere la sequenza più superelegante | Primer | Sequenza inversa pimer | ||
| ACTB | 5'-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3' | ACTB | 5'-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3' | ||
| MSMO1 | 5'-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3' | MSMO1 | 5'-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3' | ||
| INSIG1 | 5'-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3' | INSIG1 | 5'-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3 ' | ||
| IDI1 | 5'-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3' | IDI1 | 5'-CAACATCCGGCATAACTGTG-3' | ||
Tabella 1. Elenco dei primer usati nell'analisi quantitativa di PCR in tempo reale.
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Discussion
Qui, abbiamo descritto un sistema di coltura semplice pH acido e il suo processo di valutazione. La combinazione dei tre metodi di acidificazione medio, vale a dire, concentrazione ridotta di bicarbonato, aggiunta di lattato e aggiunta di HCl, ci ha permesso di indagare a fondo il meccanismo di pH-risposta e di confrontare la risposta cellulare ad altro tumore condizioni microambientali come ipossia o nutriente inedia.
La chiave di questo metodo consiste nel determinare le concentrazioni adeguate di bicarbonato, lattato e HCl nel terreno di coltura. Misurazione del pH medio con varie concentrazioni di bicarbonato durante l'esecuzione di questo metodo per la prima volta è importante per determinare la quantità appropriata di NaHCO3 nel mezzo. Durante questo processo, è necessario misurare il pH medio dopo 24 h di incubazione a 37 ° C inferiore al 5% di CO2, come media temperatura ed equilibrio lo stato di CO2 influenzare notevolmente il pH medio. Sterilizzazione in autoclave di bicarbonato è spesso consigliato, come bicarbonato facilmente diventa piatto. Densità delle cellule e confluency di cella sono fattori cruciali perché un numero elevato di cellule tumorali crescente facilmente acidificazione il terreno di coltura anche nei campioni di controllo. Inoltre, le risposte del pH acido extracellulare dipendono dallo stato delle cellule e possono sbiadire come le celle sono attraversate, quindi cellule con meno di 10 passaggi sono state usate per gli esperimenti.
Il nostro metodo ha significativamente hanno dimostrato la stabilità del pH medio per 24 h e confrontato diversi mezzi di pH acido. In questo protocollo, pH medio di 6.8 è stato utilizzato come una condizione di basso pH, ma seriale pH acido tra pH 6.4 e 6.9, oltre ai supporti di pH di base seriale tra pH 7.4 e 8.0, sono stati usati per studiare la risposta cellulare contro l'acidificazione extracellulare.
Ci siamo concentrati principalmente sulle cellule tumorali, ma questo metodo può essere utilizzato per altri tipi di cellule all'interno del microambiente tumorale, compreso le cellule stromali, cellule immunitarie e le cellule endoteliali vascolari. Noi ed altri ha riferito che almeno alcuni meccanismi sensibili del pH nelle cellule tumorali sono comuni in cellule normali7. È anche possibile applicare questo metodo per l'analisi di altre cellule primarie così come cellule staminali embrionali e cellule staminali pluripotenti indotte. Una limitazione di questo sistema di cultura potrebbe essere la difficoltà di mantenere la condizione di pH acido in esperimenti a lungo termine.
L'acidosi è associato con vari tipi di malattie. Questo metodo può essere applicabile non solo nella ricerca sul cancro ma anche nello studio acide disturbi come la chetoacidosi diabetica, acidosi tubulare renale e acidosi respiratoria.
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Disclosures
L'autore Ayano Kondo è un dipendente della Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri della divisione di scienza del genoma e laboratorio per sistemi di biologia e medicina, RCAST, The University of Tokyo. Ringraziamo in particolare Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, l'Università di Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida e Dr. A.
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) per utili discussioni e supporto. Quest'opera è stata in parte sostenuta da sovvenzione per scienziato (A) (26710005, T.O.), del giovane sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (26116711 e 16 H 01567, T.O.) e sovvenzione per sfidare
Ricerca esplorativa (16K 14605, T.O.) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone, la Fondazione di scienza di Takeda (T.O.), la Fondazione di Kobayashi della ricerca sul cancro (T.O.) e il progetto per la ricerca sul cancro e Evoluzione terapeutica (P-creare) e la ricerca pratica per la gestione innovativa cancro dal Giappone Agenzia per la ricerca medica e sviluppo, AMED (T.O.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
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