Summary
酸性腫瘍微小環境は、腫瘍の進行に重要な役割を果たしています。がん細胞のin vitro での酸性細胞外 pH の効果を評価するためには、単純な酸性文化体制を確立しました。
Abstract
腫瘍微小環境、低酸素や栄養飢餓などの条件は、癌の進行や悪性腫瘍で重要な役割を果たします。ただし、腫瘍の積極性とそのメカニズムの解明に酸性細胞外 pH の役割は検討されていない広く低酸素や栄養飢餓状態と比較しています。さらに、酸性細胞外腫瘍微小環境を模倣するように明確に定義された培養法は完全に報告されていません。
重炭酸塩や増加の乳酸培養液中で HCl 濃度酸性細胞外 pH による削減を維持するために単純な体外培養法をご紹介します。培地の pH は少なくとも 24 時間持続され、72 h PANC-1 および AsPC 1 膵臓癌細胞の文化を次によって徐々 に減少します。本研究では 3 つの異なる酸性メディア条件高い pH 応答性遺伝子MSMO1 INSIG1、 IDI1などと比較して低酸素や栄養飢餓.これらの遺伝子の発現は、酸性 pH のマーカーとして使用できます。これらの簡単なテクニックは、酸性腫瘍微小環境下で腫瘍の悪性度の基になるメカニズムを解明するために有益です。したがって、細胞の酸性 pH 文化体制によりがん細胞のみならず、その他酸性障害など糖尿病性ケトアシドーシスに関連して、腎の尿細管細胞など、細胞の細胞の酸性 pH 応答の発見乳酸アシドーシス、腎の尿細管性アシドーシス、呼吸性アシドーシス。
Introduction
腫瘍微小環境は、腫瘍の進行と癌細胞代謝1,2,3で重要な役割を果たしています。がん細胞が低酸素血症、栄養不足、酸性細胞外 pH (pHe) など条件にさらされること。ただし、腫瘍の進行の pHe の役割は明らかにされていないとして広く低酸素や栄養飢餓のように。腫瘍組織内 pHe を酸性、およそ pH 6.84,5に到達になることができます。酸性の pH はプロトン (H+) の好気性と嫌気性解糖系の排泄から発生し、増殖癌による乳酸細胞5,6.
最近の研究で明らかに酸性 pHe 誘起ヒストン脱アセチル化、脂肪酸酸化、酸性リソソーム酸性厳しい7,8,9,10への適応のための放出。しかし、どの細胞の酸性化を通じたメカニズム、がん行動と酸性 pH 腫瘍微小環境における規制当局が完全に決定されていないキーの id。さらに、いくつかのレポートの重炭酸塩、トリス、パイプ、および HEPES バッファーまたは乳酸と HCl、不明瞭な濃度を使用して様々 な酸性 pH メディアが中も包括的な調整後の安定性を示す報告は少ないいくつかの異なる酸性培地7,8,9,10の比較
主調整装置と細胞の酸性化のコンテキストでがん細胞の代謝変化を解明するには、酸性 pHe を維持するために単純な体外培養モデルを設立しを癌細胞11pHe の役割を検討しました。37 ° C 未満 5%、6.8 の pHe と酸性培を維持してこのメソッドを使用すると、CO2培養液の減少の重炭酸濃度を使用しています。pH 7.4 は、通常どおりに使用され、媒体を制御します。培地の pH は、少なくとも 24 時間持続され、72 h PANC-1 および AsPC 1 膵臓癌細胞の培養中に徐々 に減少します。削減するのではなく、乳酸を追加することによって乳酸性アシドーシスを模倣文化方法を確立した解糖系が乳酸7,8,9では、陽子だけでなく排泄を加速するため、重炭酸塩の濃度。さらに、中で HCl による酸性 pHe は酸性 pH 培養培地への細胞は重炭酸塩の集中力の低下の原因ではない可能性を除外することが出来ます。また、6.4 〜 7.4 異なる重炭酸塩濃度の pH で様々 なメディアを使用して、我々 は、細胞応答 pHe 影響の程度を評価できます。
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Protocol
1. 酸性の培地の準備
-
コントロール (pH 7.4) の作製と低 pH (ペーハー 6.8) 培
- 500 mL の水に L-グルタミンなし DMEM 粉末 4.75 g を溶解します。
- 耐圧ボトルで 0.33 M NaHCO3ソリューションを準備します。
注意: NaHCO3 CO2ガスを加熱すると熱分解を発するので圧力のタイトなボトルを使用することが重要です。 - オートクレーブ媒体およびソリューション。25 ° C に冷却するこれらのバッファーを許可します。
- 200 mM L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシンの 5 mL の 5 mL を加えると炭酸なし DMEM の 500 mL に牛胎児血清の 50 mL。
- コントロール (pH 7.4) 中 2.4 mL 炭酸なし DMEM の 100 mL あたり 0.33 M NaHCO3ソリューションを追加します。低 pH (ペーハー 6.8) 中炭酸なし DMEM の 100 mL あたり 0.33 M NaHCO3溶液 0.6 mL を追加します。
- 37 ° C で 24 時間後 5% 以下の培地の pH をチェック CO2。
注: NaHCO3溶液の量は、インキュベーターと空気圧の CO2の含有量によって異なることが培地の pH に応じて調整する必要があります。理想的には、初めて、DMEM に追加する NaHCO3ソリューションの適切な量を決定する重炭酸塩濃度と培地の pH を測定することをお勧めします。- CO2インキュベーターから培養皿を削除した直後に培養液を収集し、pH 計を用いて pH を測定します。必要に応じて水浴を使用して 37 ° C で中の温度を保ちます。測定培地の pH 3 回独立。
注: NaHCO3ソリューションは 4 ° C で保存する必要があります、各メディアが新たに作成される必要があります。本研究で使用できる市販の製品は、材料のテーブルに表示されます。
- CO2インキュベーターから培養皿を削除した直後に培養液を収集し、pH 計を用いて pH を測定します。必要に応じて水浴を使用して 37 ° C で中の温度を保ちます。測定培地の pH 3 回独立。
-
乳酸誘導または HCl による酸性培養培地の準備
- (1.1.5 の手順で準備) 制御媒体の 100 mL に乳酸溶液の 74 μ L または 1 M HCl の 125 μ L を追加します。
- 37 ° C で 24 時間後 5% 以下の培地の pH をチェック CO2。
注: 乳酸または塩酸溶液の量はまたインキュベーターと空気圧で CO2コンテンツによって異なることが培地の pH に応じて調整する必要があります。理想的には、シリアルの乳酸や媒体の目的の pH に調整するための適切な量を決定する塩酸濃度と培地の pH を測定することをお勧めします。
2. 収穫とセルを扱う
- 37 ° C 未満 5% CO2を実行する前に、少なくとも 1 週間の実験で細胞の育成を開始します。
注: この研究で使用される細胞は、材料表に表示されます。 - 70-90% の confluency に到達するときにセルを通過。コンフルエントになるため細胞を認めない。毎日培養中に 2-3 日毎に媒体を変更します。
- 5 mL の PBS を追加することによって、細胞を洗います。PBS を吸引し、1 mL のトリプシンなど脱着酵素を追加します。
- セル丸められますをデタッチする開始になるまでは、37 ° C で孵化させなさい。
- 剥離細胞に培養液 5 mL を追加し、酵素を非アクティブ化します。15 mL チューブ 300 x g 吸引上清に 3 分間遠心し、細胞懸濁液を転送、再培養培地で細胞を中断します。
- 検定とトリパン ブルーを使用して実行可能なセルを数えます。
- 種 5.0 × 105セル/10 mL の培地に 10 センチメートルの皿の井戸。37 ° C 未満 5% で 24 時間細胞をインキュベート CO2。
- 培養培地を吸引、5 ml の PBS、細胞を洗浄し、セクション 1 で作製した酸性培地の 10 mL を加えます。37 ° C 未満 5% で 24 時間細胞をインキュベート CO2。
3. RNA の隔離
- 培地を吸引し、5 ml の PBS セルを洗ってください。RNA 抽出試薬を追加してセルを破壊 (教材の一覧表を参照してください)。
- 料理を簡単にこすり、ピペットと RNA 抽出試薬を削除し、RNA 抽出試薬/細胞ライセートを 1.5 mL チューブを入金します。5 分間室温に置いたまま。
- 250 μ L のクロロホルムを加え、5 分間室温で約 15 米残すと ≥8、5 分 000 × g で遠心管を積極的に振る。
- ピペットを使用して水相を慎重に取り外します。水様段階のいくつかの後ろに残します。別 1.5 mL チューブに配置します。
- 水相に 550 μ L のイソプロパノールを加え、軽く混ぜます。室温で 5 分間遠心分離機 (≥20, 000 x g) 最大速度、4 ° C で 20 分を残してください。
- イソプロパノールを注ぐし、1 mL 75% エタノール DEPC 処理水を追加します。優しく混ぜます。5 分間 8,000 × g で遠心分離機します。
- ペレットが空気乾燥させエタノールをピペットします。
- RNA ペレットを約 15-25 μ (収量) に応じて DEPC 処理水を追加します。ミックス徹底的。
- 260 で外径を測定することによって隔離された RNA 濃度を測定分光光度計を用いた nm。
4. cDNA 合成
- PCR の反作用の管の次のコンポーネントを組み合わせて: 最大 5 μ g 総 RNA オリゴ dT 1 μ L (50 μ M) やランダム プライマー ミックス (60 μ M)、1 μ L 10 mM dNTP、ヌクレアーゼ フリー水 14 μ L の容量を。
- ミックスし、簡単に小さなベンチトップ遠心分離機を使用してコンポーネントを遠心分離機 (~ 5 s)。65 ° C で 5 分間サンプル RNA のプライマーを変化させなさい。簡単にスピン (~ 5 s) 遠心し、少なくとも 1 分間氷の上速やかにサンプルを置く小さな卓上型を使用します。
- 次のコンポーネントを追加: 4 μ L 5 x を逆転写バッファー、1 μ L 逆転写酵素 (200 U/μ L)、1 μ L RNase 阻害剤 (40 U/μ L)。
注: 市販キットの例は材料表のとおり - チューブをキャップ ミックス、および卓上型小型遠心分離機を使用してコンテンツを簡単に遠心分離機 (~ 5 s)。10 分間で 50-55 ° C 複合反応混合物を孵化させなさい。
- 10 分の 80 ° c の孵化によって反応を不活性化します。
5. リアルタイム PCR を用いた酸応答性遺伝子発現の測定
- 384 ウェル反応板の次のコンポーネントを組み合わせて: 1 μ L テンプレート cDNA、0.75 μ 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine、前方に 0.3 μ L 50 μ Mプライマー、0.3 μ L 50 μ M 逆プライマー、1 μ L の Taq のポリメラーゼ、Taq ポリメラーゼ バッファーの μ L の 20 mM dNTP、16.65 μ L 水の 2.5 x 2.5 μ L 10。
注:テーブルの材料に市販のキットの例を示します。プライマーの一覧を表 1に示します。96 ウェル リアクション プレートをこのステップで使用もできます。(例えば、Taqman プローブ) 他のプローブも使用できます。 - 実験およびリアルタイム PCR システムに次の PCR プログラムを設定: 2 分、1 サイクルは 50 ° C95 ° C、10 分、1 サイクル95 ° C 15 s の 60 ° C 1 分、40 サイクル95 ° C、15 s、1 サイクル60 ° C で 15 秒、1 サイクル95 ° C、15 s、1 サイクル。
- QPCR 測定器でプレートを配置します。プログラムを起動します。
注: IDI1 INSIG1、pH 応答性遺伝子MSMO1の発現タンパク質レベルで測定できます。
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Representative Results
適切な重炭酸濃度を決定するには、0 - 8 mM NaHCO3 (培養液に最終濃度) の範囲で DMEM を作製し、pH 6.4 7.4 (図 1) に至ると培地を準備することに成功しました。固形腫瘍4,5pH 6.8 を細胞外 pH に達することを示す以前のレポートによると 8 mm NaHCO3 (pH 7.4) 制御媒体と 2 mM NaHCO3 (Ph6.8) 媒体として酸性 pH DMEM をご用意しました。酸性の培地の pH は、24 時間持続され、約 6.6 72 時間培養中の pH PANC-1 と AsPC 1 細胞 (図 2) には漸減します。次に、乳酸や ph 6.8 制御媒体 (pH 7.4) を調整するために必要な塩酸の量を決定するコントロール中に乳酸や HCl の様々 な量を追加し、培地の pH を測定し、最終濃度でコントロール中の pH がわかった22.5 μ M 乳酸および 6.25 mM HCl の n 6.8 (図 3) の価値に達した。
MSMO1、 IDI1、 INSIG1などの酸性の pH 応答性遺伝子の発現に基づく ph 値の低い媒体を用いた細胞の酸性化の影響を簡単に評価できます。これらの遺伝子の発現を高め低酸素や栄養飢餓 (図 4) の下で彼らの表現と比較して低 pH 下で。さらに、これらの遺伝子の発現は、酸性の pH は減らされた重炭酸塩レベルによって引き起こされた媒体に固有ではなかったと彼らはまた酸性 pH が生じた乳酸および/または HCl (図 5) の添加による媒体で誘導されるだった。酸性の pH は減らされた重炭酸塩水準から派生または乳酸または HCl 添加により細胞が酸性化の特定の種類に固有であるかどうかのメディアに対する細胞応答の比較。細胞外の低 pH の下でIDI1、 MSMO1、 INSIG1などの酸性 pH 責任遺伝子の発現は、腫瘍細胞のみならず、正常な細胞に本手法を適用できるように正常細胞 (図 6) にも発生します。高 pH 条件下で pH 応答遺伝子の発現レベル PANC-1 と AsPC 1 細胞 (図 7)、ネガティブ コントロールとして使用することができますで亢進していたないです。
図 1。NaHCO3濃度と培地博士の相関水平軸 NaHCO3の濃度、縦軸 37 ° C での培地の pH を示しています未満 5 %co2.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。低 pH (ペーハー 6.8) 72 h 培養中の培地の培地の pH の変更。培地の pH は持続時間 24 h、72 h PANC-1 および AsPC 1 細胞の培養中に徐々 に減少します。105セル × 5.0 された培地 10 mL に 10 cm 皿にシード、24 時間培養、低 pH 培に変更します。データは、少なくとも 3 つの独立実験の平均 ± SEM として掲載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。乳酸または HCl 濃度と培地の pH と相関します。乳酸や塩酸の濃度制御媒体 (pH 7.4) がバッファリングされているこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。低博士への応答で酸性の pH 応答性遺伝子の転写のアップレギュレーションMSMO1、 IDI1、およびINSIG1の発現レベル高かった PANC-1 および AsPC 1 細胞低酸素症 (H) または栄養飢餓 (NS) 条件の下でより低い pH (ペーハー) のコンテキストで 24 時間データは、少なくとも 3 つの平均 ± SEM として表示後独立した実験。学生のt-指定された比較試験を行った。p < 0.005。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。乳酸アシドーシスと HCl を介したアシドーシスへの応答で酸性の pH 応答性遺伝子の転写のアップレギュレーション。Panc-1 細胞と AsPC 1 セルでIDI1、 MSMO1、およびINSIG1の Mrna の発現がコントロール (コン; pH 7.4)、pH が低く (pH; NaHCO3 の pH 6.8、削減量の下で量的なリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応分析によって決定されました。)、乳酸アシドーシス (乳酸; pH 6.8, 乳酸量) および HCl 媒介性アシドーシス (塩酸; 塩酸の pH 6.8, 増加量) については、24 時間データが少なくとも 3 つの独立実験の平均 ± SEM として表されます。学生のt-指定された比較試験を行った。p < 0.005。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。正常細胞の pH が低く酸性 pH 応答性遺伝子の転写のアップレギュレーション。線維芽 KMS-6、TIG で亢進していたMSMO1、 IDI1、およびINSIG1の発現レベルと MRC9 細胞と 24 時間データ後内皮血管内皮細胞は、少なくとも 3 つの独立実験の平均 ± SEM として表示されます。学生のt-指定された比較試験を行った。p < 0.005。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7。PH が低く (pH 6.8) の下での比較で高い pH (ペーハー 8.0 に 7.6) 条件下で酸性 pH 遺伝子の発現レベル。PANC - 1 高 pH (ペーハー 8.0 に 7.6) 条件の下でIDI1、 MSMO1、 INSIG1などの pH 応答遺伝子の発現レベルは変わりません、24 時間データ後 AsPC 1 細胞は、少なくとも 3 つの平均 ± SEM として表示独立した実験。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| プライマー | 前方のプライマー シーケンス | プライマー | 逆 pimer シーケンス | ||
| ACTB | 5'-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3' | ACTB | 5'-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3' | ||
| MSMO1 | 5'-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3' | MSMO1 | 5'-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3' | ||
| INSIG1 | 5'-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3' | INSIG1 | 5'-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3' | ||
| IDI1 | 5'-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3' | IDI1 | 5'-CAACATCCGGCATAACTGTG-3' | ||
表 1.定量的リアルタイム PCR 解析で使用されるプライマーの一覧。
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Discussion
ここでは、簡単な酸性 pH 文化システムとその評価プロセスについて説明しました。中程度の酸性化、すなわち、減らされた重炭酸濃度、乳酸添加と HCl 添加の 3 つの方法の組み合わせでは、pH 応答メカニズムを徹底的に調査し、他の腫瘍に対する細胞の反応を比較できました。低酸素や栄養飢餓などアイソレータケージ条件。
このメソッドのキーは、培養液中の重炭酸塩、乳酸、HCl の適切な濃度を決定することです。最初にこのメソッドを実行するときに重炭酸塩濃度と培地の pH を測定 NaHCO3培地での適切な量を決定することが重要です。37 ° C で 24 時間後の培地の pH を測定する必要があるこのプロセス中に下に 5% CO2CO2の中の温度と平衡状態として大きく影響培地の pH。重炭酸塩は簡単にフラットになると、重炭酸塩のオートクレーブは頻繁推奨します。細胞密度と細胞密度は、成長の癌細胞の数が多いは簡単にコントロールのサンプルでも培養液を酸性化の重要な要因です。さらに、レスポンスを酸性細胞外 pH セルの条件に依存し、衰退するかもしれない細胞は継代により小さい 10 の通路で細胞実験のための使用されたので。
本手法が 24 h の培地の pH の安定性を実証あり大幅に比べていくつかの酸性 pH メディア。このプロトコルでは、低 pH 条件では pH 6.4 6.9, pH 7.4 と 8.0 の間でシリアルの基本的な pH のメディアに加えて間シリアル酸性 pH が酸性細胞外に対する細胞の応答を調査する使用されたように 6.8 の培地の pH が使用されました。
私たちは主にがん細胞に焦点を当てたが、細胞間質細胞、免疫細胞、血管内皮細胞など、がん微小環境の内での他のタイプのこのメソッドを使用できます。我々 と他の報告、癌細胞の少なくともいくつかの pH の敏感なメカニズムが正常細胞7で共通。この胚性幹細胞と同様に、他の一次電池の解析法を適用することも可能ですし、誘導多能性幹細胞。この文化システムの 1 つの制限は、長期実験に酸性 pH 条件の維持が困難な可能性があります。
アシドーシスは、病気のさまざまな種類に関連付けられます。このメソッドは、糖尿病性ケトアシドーシス、腎尿細管性アシドーシス、呼吸性アシドーシスなど酸性障害を勉強もがん研究だけでなく、適用できます。
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Disclosures
著者綾乃近藤は協和発酵キリン株式会社の従業員
Acknowledgments
東京大学先端研、医学システム生物学、ゲノム科学部門と研究室のメンバーに感謝します我々 は特に感謝博士 h. 油谷、小玉徹博士、(LSBM、東大先端研、東京大学)、A 博士、博士・吉田先生・ k ・富塚
有用な議論とサポートの國里 (協和発酵キリン株式会社)。この作品は一部文部の若い科学者 (A) (26710005、ティー ・ オーエンタテインメント)、革新的な領域 (H 01567、ティー ・ オーエンタテインメントの 26116711 と 16) 科学研究費補助金・挑戦
文部科学省がん研究事業がん研究 (ティー ・ オーエンタテインメント)、小林財団、武田科学振興財団 (ティー ・ オーエンタテインメント) 日本の技術からの探索的研究 (16 K 14605、ティー ・ オーエンタテインメント) と(P 作成) 治療の進化とアメッド (ティー ・ オーエンタテインメント) 総合医療研究機構から革新的ながん対策の実践的研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
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