Summary
산 성 종양 microenvironment 종양 진행에 중요 한 역할을 담당합니다. 암 세포 생체 외에서 에 산 성 세포 외 산도의 효과 평가 하기 위해 간단한 산 성 문화 시스템을 설립 했습니다.
Abstract
종양 microenvironment 영양 기아, 저 산소 증 등의 암 진행 및 암에 중요 한 역할을 한다. 그러나, 종양의 적극성 및 그것의 기본 메커니즘에 산 성 세포 외 산도의 역할은 하지 광범위 하 게 연구 되었습니다 hypoxic 또는 영양소 고갈 조건에 비해. 또한, 산 성 세포 외 종양 microenvironment을 모방 하는 잘 정의 된 문화 방법 하지 완전히 보고 되었습니다.
여기는 간단한 생체 외에서 문화 메서드 중 탄산염 및 젖 산 증가 또는 문화 매체에서 HCl 농도 감소 산 성 세포 외 산도 사용 하 여 유지 하기 위해 선물이. 중간 pH는 적어도 24 시간 동안 되었고 72 h PANC-1과 AsPC 1 췌장암 세포의 문화에 따라 점차적으로 감소. 이 연구에서는 3 가지 산 성 미디어 조건 매우 upregulated pH 반응 유전자 MSMO1, INSIG1, 및 IDI1 와 같은 산소 또는 영양 기아. 에 비해 이 유전자의 upregulation 산 성 pH의 표식으로 사용할 수 있습니다. 이 간단한 기술은 microenvironment 산 성 종양에서 종양 악성의 기본 메커니즘을 명료 하 게 도움이 됩니다. 따라서, 우리의 세포 외 산 성 pH 문화 시스템 셀룰러 산 성 pH 응답 암 세포 뿐만 아니라 1 차 셀, 신장 관 세포는 다른 산 성 장애, 당뇨병 ketoacidosis, 관계 등에서 발견을 통해 유산 증, 신장 관 산 성 증, 그리고 호흡 증.
Introduction
종양 microenvironment 종양 진행과 암 세포 물질 대사1,2,3에 중요 한 역할을 재생합니다. 암 세포는 저 산소 증, 영양 부족, 세포 외 산 성 pH (페) 등 조건에 자주 노출 됩니다. 그러나, 종양 진행에 pHe의 역할은 하지 명확히으로 광범위 하 게 산소 또는 양분 기아에서. 종양 조직에 페 산 성, 약 산도 6.84,5에 도달 될 수 있다. 산 성 pH에서 양성자 (H+)의 호 기성 및 혐 기성 glycolytic 배설 발생 하 고 확산 암에 의해 젖 산 세포5,6.
최근 연구 결과 밝혀 그 산 성 페 유도 히스톤 deacetylation, 지방산 산화 및 심한 산 성 환경7,8,,910에 적응에 대 한 산 성 리소좀의 exocytosis. 그러나, 어떤 세포 외 산성화를 통해 장치 암 동작 및 산 성 pH 종양 microenvironment 레 귤 레이 터 완전히 결정 되지 않은 키의 id 영향을 줍니다. 또한, 몇 가지 보고서 중 탄산염, 트리 스, 파이프와 HEPES 버퍼 또는 젖 산 및 HCl, 불분명 한 농도 사용 하 여 다양 한 산 성 pH 미디어 설명 하지만 중간도 포괄적인의 조정 안정성을 설명 하기 위해 몇 가지 보고서 여러 독특한 산 성 문화 미디어7,8,,910 의 비교
키 레 귤 레이 터 및 extracellular 산성화의 맥락에서 암 세포의 대사 변화를 명료 하 우리 산 성 페를 유지 하기 위해 간단한 생체 외에서 문화 모델을 설립 하 고 암 세포11페의 역할을 조사 했다. 우리 37 ° C에서 5%에서 6.8의 pHe와 산 성 문화 매체를 유지 하는이 메서드를 사용 하 여 CO2, 문화 매체에서 감소 중 탄산염 농도 사용 하 여. pH 7.4 정상적으로 사용 하 고 매체를 제어. 중간 pH는 적어도 24 시간 동안 되었고 PANC-1과 AsPC 1 췌장암 세포의 문화 중 72 h에 의해 점차적으로 감소. 향상 된 분해 가속 양성자 뿐만 아니라 젖 산7,,89의 배설, 때문에 우리 또한 감소 하는 것 보다 젖 산을 추가 하 여 유도 하는 젖 산 증을 흉내 낸 문화 메서드를 설립 합니다 중 탄산염 농도입니다. 또한, 매체에서 HCl을 이용한 산 성 페 산 성 pH 배양 세포 응답 하지 않은 중 탄산염의 감소 된 농도 때문 가능성을 제외 수 있습니다. 또한, 다양 한 미디어를 사용 하 여 다른 중 탄산염 농도와 7.4을 6.4의 ph, 우리 세포 응답에 페 효과의 정도 평가할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1입니다. 산 성 문화 매체의 준비
-
제어 (pH 7.4)의 준비 및 낮은 pH (pH 6.8) 문화 매체
- 4.75 g을 물 500 mL에 L-글루타민 없이 DMEM 분말의 분해.
- 압력 꽉 병에서 0.33 M NaHCO3 솔루션을 준비 합니다.
주의: 그것은 이후 NaHCO3 CO2 가스가 열 하 고 열 분해 방출 압력 꽉 병을 사용 하는 것이 중요. - 압력솥 매체 고 솔루션입니다. 이러한 버퍼를 25 ° c에 냉각을 허용합니다
- 200 mM L-글루타민, 페니실린 스의 5 mL의 5 mL을 추가 및 태아의 소 혈 청 중 탄산염 없이 DMEM의 500 mL 50 mL.
- 제어 (pH 7.4) 매체에 대 한 중 탄산염 없이 DMEM의 100 mL 당 0.33 M NaHCO3 솔루션의 2.4 mL를 추가 합니다. 낮은 pH (pH 6.8) 매체에 대 한 중 탄산염 없이 DMEM의 100 mL 당 0.33 M NaHCO3 솔루션의 0.6 mL를 추가 합니다.
- 5% 미만 37 ° C에 외피의 24 h 후 중간 pH를 확인 CO2.
참고: NaHCO3 솔루션의 금액 인큐베이터와 공기 압력의 CO2 내용에 따라 다를 수 있습니다 중간 pH에 따라 조정 될 필요가 있다. 이상적으로, 처음으로 그것은 DMEM 추가 하려면 NaHCO3 솔루션의 적절 한 금액을 결정 하기 위해 다양 한 중 탄산염 농도와 중간 pH를 측정 하는 더 나은.- CO2 배양 기에서 문화 접시를 제거한 후 바로 문화 매체를 수집 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 측정. 필요한 경우 물 목욕을 사용 하 여 37 ° C에 중간 온도 유지. 측정 하지 중간 산도 세 번 독립적으로.
참고: NaHCO3 솔루션 4 ° C에서 저장 되어야 하 고 각 미디어를 신선 하 게 준비 한다. 이 연구에 사용 될 수 있는 상용 제품 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.
- CO2 배양 기에서 문화 접시를 제거한 후 바로 문화 매체를 수집 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 측정. 필요한 경우 물 목욕을 사용 하 여 37 ° C에 중간 온도 유지. 측정 하지 중간 산도 세 번 독립적으로.
-
젖 산 유도 또는 HCl을 이용한 산 성 문화 매체 준비
- 제어 매체 (단계 1.1.5에서에서 준비) 100 mL를 74 µ L 젖 산 솔루션의 또는 1 M HCl의 125 µ L를 추가 합니다.
- 5% 미만 37 ° C에 외피의 24 h 후 중간 pH를 확인 CO2.
참고: 젖 산 또는 HCl 솔루션의 금액 또한 필요가 CO2 콘텐츠 인큐베이터와 공기 압력에 따라 다를 수 있습니다 중간 pH에 따라 조정할 수 있다. 이상적으로, 그것은 직렬 젖 또는 매체의 원하는 pH를 조정 하기 위해 적절 한 크기를 결정 HCl 농도 중간 pH를 측정 하기 위해 좋습니다.
2. 수확 및 세포 치료
- 37 ° C 미만 5% CO2 를 수행 하기 전에 적어도 1 주 실험에서 세포 배양을 시작 합니다.
참고:이 연구에 사용 된 셀 라인 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. - 70-90 %confluency 도달할 때 세포를 통과. Confluent 될 셀을 허용 하지 않습니다. 매체 매일 재배 중 2-3 일 마다 변경 합니다.
- 5 mL PBS를 추가 하 여 셀을 씻어. PBS를 발음 하 고 파견 효소 1 mL 트립 신 등을 추가 합니다.
- 셀은 분리를 시작 때까지 37 ° C에서 품 어.
- 분리 된 세포 배양의 5 mL을 추가 하 고 효소 비활성화. 15 mL 튜브와 300 x g. Aspirate는 상쾌한에 3 분 동안 원심 분리기에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 다시 문화 매체와 셀을 일시 중단.
- Hemocytometer 고 Trypan 파랑을 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
- 씨 5.0 x 105 셀/잘 매체의 10 mL에 10 cm 접시의. 37 ° C에서 5%에서 24 h에 대 한 셀을 품 어 CO2.
- 문화 매체를 발음, 5 mL PBS 가진 세포를 세척 하 고 제 1에서 준비 산 성 문화 매체의 10 mL를 추가. 37 ° C에서 5%에서 24 h에 대 한 셀을 품 어 CO2.
3. RNA 격리
- 문화 매체를 발음 하 고 5 mL PBS로 세포를 씻어. RNA 추출 시 약을 추가 하 여 셀을 방해 ( 테이블의 자료를 참조).
- 짧게 접시를 긁어, 다음 한 피 펫으로 RNA 추출 시 약을 제거 하 고 1.5 mL 튜브에 lysate RNA 추출 시 약/셀 입금. 5 분 동안 실 온에 둡니다.
- 250 µ L 클로 프롬을 추가 하 고 5 분 동안 실 온에서 약 15 미 허가 및 ≥8, 5 분 동안 000 x g에서 원심 분리기 튜브를 적극적으로 악수.
- 수성 단계는 피 펫을 사용 하 여 조심 스럽게 제거. 수성 단계 중 일부를 남겨두고. 또 다른 1.5 mL 튜브에 배치 합니다.
- 수성 단계에 550 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 4 ° c.에 20 분 동안 5 분 원심 분리기 (≥20, 000 x g) 최대 속도에 대 한 실 온에 두고
- 소 프로 파 놀을 부 어와 DEPC에 1 mL 75% 에탄올 처리 물 추가. 부드럽게 혼합. 5 분 동안 8000 x g에서 원심.
- 에탄올과 펠 릿 건조 하자 플라스틱.
- 약 15-25 µ L (에 따라 수율) DEPC의 RNA 펠 릿에 물 치료를 추가 합니다. 철저 하 게 혼합.
- 260에 OD를 측정 하 여 절연된 RNA의 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
4입니다. cDNA 합성
- PCR 반응 관에는 다음 구성 요소를 결합: 최대 5 µ g 총 RNA, 1 µ L 올리고 dT (50 µ M) 또는 무작위 뇌관 믹스 (60 µ M), 1 µ L 10 mM dNTP와 14 µ L의 총 볼륨 nuclease 무료 물.
- 짧게 원심 작은 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 구성 요소와 혼합 (5 ~ s). 65 ° c.에 5 분에 대 한 샘플 RNA/뇌관 변성 짧게 스핀 (5 ~ s) 원심 작은 벤치탑 사용 하 고 적어도 1 분 동안 얼음에 신속 하 게 샘플을 넣어.
- 다음 구성 요소 추가: 역방향 전송 버퍼 x 4 µ L 5, 1 µ L 역전사 (200 U / µ L), 1 µ L RNase 억제제 (40 U / µ L).
참고: 상용 키트의 예제 자료의 테이블에 에서 표시 됩니다. - 캡 튜브, 혼합, 그리고 다음 간단히 작은 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 내용을 원심 (5 ~ s). 10 분 동안 50-55 ° C에서 결합된 반응 혼합물을 품 어.
- 10 분 동안 80 ° C에서 배양 하 여 반응을 비활성화.
5. 실시간 PCR를 사용 하 여 산 성 반응 유전자 발현의 측정
- 384 잘 반응 판에 다음 구성 요소를 결합: 1 µ L 템플릿 cDNA, 0.75 µ L 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0.3 µ L 50 µ M 앞으로 뇌관, 0.3 µ L 50 µ M 반전 뇌관, 1 µ L Taq 중 합 효소, Taq 중 합 효소 버퍼, 2.5 µ L 20 mM dNTP, 16.65 µ L 물 2.5 µ L 10.
참고: 상용 키트의 예는 테이블의 자료에 표시 됩니다. 뇌관의 목록 표 1에 표시 됩니다. 96-잘 반응 접시는 또한이 단계에서 사용할 수 있습니다. 다른 조사 (예를 들어, Taqman 프로브)도 사용할 수 있습니다. - 실험 및 실시간 PCR 시스템에 다음 PCR 프로그램 설정: 2 분, 1 개 주기; 50 ° C 95 ° C 10 분, 1 개 주기; 95 ° C 15 s와 1 분, 40 사이클; 60 ° C 95 ° C 15에 대 한 s, 1 개 주기; 15 60 ° C s, 1 개 주기; 95 ° C 15에 대 한 s, 1 주기.
- 정량 Pcr 장비에서 접시를 놓습니다. 프로그램을 시작 합니다.
참고: 전화 응답 유전자 MSMO1의 Upregulation, INSIG1및 IDI1 는 단백질 수준에 의해 측정할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
적절 한 중 탄산염 농도 결정 하려면 우리 0-8 m m NaHCO3 (문화 매체에서 최종 농도)의 범위에서 DMEM을 준비 하 고 ph 6.4-7.4 (그림 1)에서 이르는 문화 미디어를 준비 하는 데 성공 했다. 우리는 extracellular pH pH 6.8 단단한 종양4,5에 도달 하면 주장 이전 보고서에 따르면 8 m m NaHCO3 (pH 7.4) 제어 매체, 그리고 산 성 ph 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) 매체로 DMEM을 준비. 산 성 매체의 pH 24 시간 동안 되었고 점차 약 pH 6.6 문화 중 72 h PANC-1 및 AsPC-1 셀 (그림 2)로 감소. 다음, 젖 산 또는 HCl 제어 매체 (pH 7.4) pH 6.8 조정 하는 데 필요한 크기를 결정, 우리 제어 매체에 다양 한 양의 젖 또는 HCl를 추가 매체의 pH 측정 그리고 발견을 최종 농도와 제어 매체의 pH 22.5 µ M 젖 산 및 6.25 m HCl의 n 6.8 (그림 3)의 값에 도달 했습니다.
낮은 ph는 매체를 사용 하 여 세포 외 산성화의 영향은 MSMO1, IDI1, INSIG1등 산 성 pH 반응 유전자의 upregulation에 따라 쉽게 평가 수 있습니다. 이 유전자의 표현 산소 또는 영양 기아 (그림 4)에서 그들의 표정에 비해 낮은 pH에서 높은 증가 되었다. 또한,이 유전자의 upregulation는 산 성 pH 감소 중 탄산염 수준에 의해 발생 했다 매체에 그리고 그들은 또한 산 성 pH 젖 산 HCl (그림 5)의 추가 의해 발생 했다 매체에 의해 upregulated 했다. 미디어는 산 성 pH 감소 중 탄산염 수준에서 파생 된다 또는 젖 산 이나 HCl 산성화의 특정 종류에 세포질 응답 인지 확인 수 세포 응답의 비교. 그래서 우리의 방법은 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 적용할 수 있는 extracellular 낮은 pH에서 IDI1, MSMO1, INSIG1 등 산 성 pH 책임 유전자의 Upregulation 또한 정상 세포 (그림 6)에서 발생 합니다. 높은 pH 조건 pH 책임 유전자의 식 수준 PANC-1과 AsPC-1 셀 (그림 7), 부정적인 제어로 사용 될 수 있는 upregulated 아니었다.
그림 1입니다. NaHCO3 농도 중간 박사 사이 상호 관계 수평 축 NaHCO3 의 농도 고 수직 축 37 ° C에서 중간 pH 미만 5 %CO2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 72 h-문화 중 낮은 pH (pH 6.8) 문화 매체의 중간 pH의 변화. 중간 산도 24 시간 동안 되었고 점차 PANC-1 및 AsPC-1 셀의 문화 중 72 h에 대 한 감소. 105 셀 x 5.0 매체의 10 mL에 10 cm 접시에 시드, 24 h에 대 한 인 큐베이 팅 되었고 낮은 pH 문화 매체를 변경. 데이터는 적어도 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 젖 또는 HCl 농도 매체의 pH 사이 상호 관계. 제어 매체 (pH 7.4) 젖 산 또는 HCl.의 다양 한 농도와 버퍼링은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 낮은 박사에 대 한 응답에서 산 성 pH 반응 유전자의 transcriptional upregulation MSMO1, IDI1및 INSIG1 의 식 수준이 높았다 PANC-1와 hypoxia (H) 또는 영양 기아 (NS) 조건 보다 낮은 산도 (pH)의 맥락에서 AsPC-1 셀 24 h. 데이터는 적어도 3의 평균 ± SEM으로 제시 후 독립적인 실험입니다. 학생의 t-표시 된 비교에 대 한 테스트가 수행 되었습니다. p < 0.005. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 유산 증 및 HCl 중재 증 산 성 pH 반응 유전자의 transcriptional upregulation. PANC-1 셀과 AsPC-1 셀에 IDI1, MSMO1및 INSIG1 mRNAs의 표현은 제어 (콘, pH 7.4), 낮은 pH (pH; NaHCO3의 pH 6.8, 감소 양을 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 분석에 의해 결정 되었다 ), 유산 증 (젖 산, 젖 산의 pH 6.8, 증가 금액), 및 24 h. HCl 중재 증 (HCl, HCl의 pH 6.8, 증가 금액) 조건 데이터 적어도 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 선물 된다. 학생의 t-표시 된 비교에 대 한 테스트가 수행 되었습니다. p < 0.005. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 정상 세포에서 낮은 pH에 반응에서 산 성 pH 반응 유전자의 transcriptional upregulation. MSMO1, IDI1및 INSIG1 의 식 수준 upregulated TIG, KMS 6 fibroblastic 그리고 MRC9 세포와 내 피 HUVEC 셀 24 h. 데이터 후 최소한 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 제공 됩니다. 학생의 t-표시 된 비교에 대 한 테스트가 수행 되었습니다. p < 0.005. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7입니다. 식 수준에 비해 낮은 pH (pH 6.8)에서 높은 pH (pH 7.6 8.0) 조건 하에서 산 성 pH 책임 유전자. PH-책임 유전자 IDI1, MSMO1, INSIG1 등의 식 수준 PANC-1에서 높은 pH (pH 7.6 8.0) 조건 하에서 그대로 고 AsPC-1 셀 24 h. 데이터 후 적어도 3의 평균 ± SEM으로 표시 됩니다. 독립적인 실험입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 뇌관 | 앞으로 뇌관 순서 | 뇌관 | Pimer 순서 반전 | ||
| ACTB | 5'-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3' | ACTB | 5'-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3' | ||
| MSMO1 | 5'-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3' | MSMO1 | 5'-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3' | ||
| INSIG1 | 5'-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3' | INSIG1 | ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3-5' ' | ||
| IDI1 | 5'-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3' | IDI1 | 5'-CAACATCCGGCATAACTGTG-3' | ||
표 1. 실시간 정량 PCR 분석에 사용 하는 뇌관의 목록.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기, 우리는 간단한 산 성 pH 문화 시스템 및 그것의 평가 과정을 설명. 중간 산성화, 즉, 감소 된 중 탄산염 농도, 젖 산 추가, 및 HCl 또한의 세 가지 방법의 조합을 사용 pH-응답 메커니즘을 철저 하 게 조사 하 고 다른 종양 세포 응답을 비교 하 산소 또는 양분 기아 같은 microenvironmental 조건.
이 방법의 키 문화 매체에서 중 탄산염, 젖 산, 그리고 HCl의 적절 한 농도 결정 하는. 처음으로이 방법을 수행할 때 다양 한 중 탄산염 농도와 중간 pH 측정 NaHCO3 매체에서의 적절 한 크기를 결정 중요 하다. 이 과정 동안, 그것은 37 ° C에 외피의 24 h 후 중간 pH를 측정 하는 데 필요한 아래 5% CO2, CO2 의 중간 온도 평형 상태로 크게 영향을 미칠 중간 pH. 중 탄산염의 압력가 마로 소독은 자주 권장, 중 탄산염 쉽게 플랫 하 게 된다. 셀 밀도 셀 confluency 성장 암 세포의 큰 번호 쉽게 컨트롤 샘플에도 문화 매체 시 어 지 다 때문에 중요 한 요소가 됩니다. 또한, 세포 외 산 성 pH에 대 한 응답 셀의 상태에 따라 고 그래서 셀 10 구절을 실험에 사용 된 셀은 passaged으로 사라질 수 있습니다.
우리의 방법은 크게 24 h에 대 한 중간 pH의 안정성을 증명 하 고 몇몇 산 성 pH 미디어 비교. 이 프로토콜에서 중간 pH 6.8의 낮은 pH 조건, 하지만 pH 6.4 고 6.9, pH 7.4와 8.0 사이 직렬 기본적인 pH 미디어 뿐만 아니라 사이 직렬 산 성 pH 세포 외 산성화에 대 한 세포질 응답을 조사 하는 데 사용 했다 사용 되었다.
우리는 주로 암 세포에 집중 하지만 다른 유형의 stromal 세포, 혈관 내 피 세포, 면역 세포 등 종양 microenvironment 내의 셀에 대 한이 메서드를 사용할 수 있습니다. 우리와 다른 암 세포에 적어도 일부 pH 민감한 메커니즘은 정상 세포7에 일반적인 보고. 또한 배아 줄기 세포 뿐 아니라 다른 1 차 셀의 분석에 대 한이 메서드를 적용 하 고 유도 만능 줄기 세포. 이 문화 시스템의 한계가 장기 실험의 산 성 pH 조건을 유지의 어려움이 있을 수 있습니다.
증 질환의 다양 한 종류와 연결 됩니다. 이 메서드는 뿐만 아니라 당뇨병 ketoacidosis, 신장 관 산 성 증과 호흡 증 등 산 성 장애 공부에서 암 연구에서 뿐만 아니라 적용 될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 아야 노 콘도 쿄와 Hakko 기린 (주)의 직원
Acknowledgments
우리 시스템 생물학 및 의학, RCAST, 도쿄의 대학에 대 한 게놈 과학의 부 및 연구실의 회원을 감사합니다. 우리는 특히 박사 H. 油, 박사 토니 고다마, (LSBM, RCAST, 도쿄의 대학), 감사 박사 K. 富, 박사 토니 요시다, 및 박사 대답
유용한 토론 및 지원에 대 한 Kunisato (쿄와 Hakko 기린 (주)). 이 작품 일부에 의해 지원 되었다 특정에 대 한 젊은 과학자 (A) (26710005, 방법), 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (26116711 16 H 01567, 방법), 그리고 도전에 대 한 특정
교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 일본, 다케다 과학 재단 (러브), 암 연구 (러브), 고바야시 재단 및 암 연구에 대 한 프로젝트의 예비 연구 (16 K 14605, 방법) 및 치료 진화 (P-만들기) 그리고 의료 연구 및 개발, 아메드 (러브) 일본 기관에서 혁신적인 암 제어에 대 한 실질적인 연구.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
- Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
- Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
- McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
- Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752 (2015).
- Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).
- Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).
