Summary
O microambiente do tumor ácido tem um papel crítico na progressão do tumor. Para avaliar os efeitos do pH extracelular ácido sobre câncer células in vitro, estabelecemos sistemas simples cultura ácidas.
Abstract
Condições do microambiente do tumor, como hipóxia ou inanição nutriente, desempenham um papel crítico na progressão do câncer e malignidade. No entanto, o papel do pH extracelular ácido na agressividade do tumor e seu mecanismo subjacente não foi extensivamente estudado em comparação com as condições de inanição hipóxica ou nutrientes. Além disso, um método de cultura bem definidos para imitar o microambiente do tumor extracelular ácidas não totalmente relatou.
Aqui nós apresentamos um método de cultura simples em vitro para manter o pH extracelular ácido usando reduzido bicarbonato e lactato aumentado ou concentrações de HCl em meio de cultura. O pH médio foi mantido pelo menos 24 h e gradualmente diminuiu de 72 h após a cultura de células de câncer pancreático PANC-1 e 1-AsPC. Três condições distintas mídia ácida neste estudo altamente upregulated pH-responsivo genes tais como MSMO1, INSIG1e IDI1 em comparação com hipoxia ou inanição nutriente. O upregulation destes genes pode ser usado como um marcador de pH ácido. Estas técnicas simples são benéficas para elucidar os mecanismos subjacentes de malignidade do tumor sob o microambiente do tumor ácidas. Portanto, nosso sistema de cultura de pH ácido extracelular permite a descoberta de respostas celulares pH ácido não só nas células cancerosas, mas também em células primárias, tais como células tubulares renais, em relação as outros ácidos distúrbios incluindo, cetoacidose diabética, acidose láctica, acidose tubular renal e acidose respiratória.
Introduction
O microambiente do tumor tem um papel crítico na progressão do tumor e câncer célula metabolismo1,2,3. As células cancerosas são frequentemente expostas a condições tais como hipóxia, privação de nutrientes e ácido pH extracelular (pHe). No entanto, o papel de pHe em progressão do tumor não foi clarificado tão extensivamente como fome de hipóxia ou nutriente. O pHe no tecido do tumor pode se tornar ácida, atingindo aproximadamente pH 6,84,5. O pH ácido surge da excreção glicolítico aeróbia e anaeróbica de prótons (H+) e lactato pela proliferação do câncer células5,6.
Estudos recentes revelaram que ácida induzida pela pHe histona deacetilação, oxidação do ácido graxo e exocitose de lisossomos ácidos para adaptação ao ambiente ácido grave7,8,9,10. No entanto, os mecanismos através do qual acidificação do extracelular afeta o comportamento do câncer e a identidade da chave reguladores no microambiente do tumor de pH ácido não foram totalmente determinados. Além disso, vários relatos descritos vários meios de pH ácido, usando pouco claras concentrações de bicarbonato, tampão Tris, tubulações e HEPES ou lactato e HCl, mas há poucos relatórios para demonstrar a estabilidade do ajustado média nem abrangente comparação de vários meios distintos de cultura ácida7,8,9,10
Para elucidar os reguladores chaves e alterações metabólicas em células cancerosas no contexto da acidificação do extracelular, que estabeleceu um modelo de cultura simples em vitro para manter um pHe ácida e examinou o papel de pHe em células de câncer11. Usando esse método, mantivemos um meio de cultura ácido com um pHe de 6,8 a 37 ° C abaixo dos 5% CO2, com as concentrações de bicarbonato reduzida do meio de cultura. pH 7,4 utilizou-se como normal e controle médio. O pH médio foi mantido pelo menos 24 h e gradualmente diminuiu 72 h durante a cultura de células de câncer pancreático PANC-1 e 1-AsPC. Porque reforçada glicólise acelera a excreção de prótons, não só mas também lactato7,8,9, estabelecemos também um método de cultura imitando acidose induzida por lactato por adição de lactato, em vez de reduzir o concentração de bicarbonato. Além disso, induzida por HCl Ácido pHe no meio nos permite excluir a possibilidade de respostas celulares ao meio de cultura de pH ácido não são devido a uma concentração reduzida de bicarbonato. Além disso, usando vários meios de comunicação com um pH de 6,4 a 7,4 com concentração diferente de bicarbonato, podemos avaliar a extensão dos efeitos de pHe em respostas celulares.
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Protocol
1. preparação do meio de cultura de ácido
-
Preparação do controle (pH 7,4) e o meio de cultura de baixo pH (pH 6,8)
- Dissolva 4,75 g de pó DMEM sem L-glutamina em 500 mL de água.
- Prepare a solução de 0,33 M NaHCO3 em uma garrafa de pressão-apertado.
Atenção: É importante que utilize uma garrafa de pressão apertado NaHCO3 emite CO2 gás quando aquecido e decomposto termicamente. - Autoclave a médio e a solução. Permitir que esses buffers esfriar a 25 ° C.
- Adicionar 5 mL de 200 mM L-glutamina, 5 mL de penicilina-estreptomicina e 50 mL de soro bovino fetal a 500 mL de DMEM sem bicarbonato.
- Por meio de controle (pH 7,4), adicione 2,4 mL de solução de 0,33 M NaHCO3 por 100 mL de DMEM sem bicarbonato. Por meio do baixo-pH (pH 6,8), adicione 0,6 mL da solução de 0,33 M NaHCO3 por 100 mL de DMEM sem bicarbonato.
- Verificar o pH médio após 24h de incubação a 37 ° C, menos de 5% de CO2.
Nota: A quantidade de solução de NaHCO3 precisa ser ajustada dependendo do pH médio, que pode diferir dependendo do teor de CO2 da incubadora e a pressão de ar. Idealmente, pela primeira vez, é melhor medir o pH médio com diferentes concentrações de bicarbonato, para determinar a quantidade adequada de solução de NaHCO3 para adicionar DMEM.- Recolher o meio de cultura imediatamente após a remoção da placa de cultura a incubadora de CO2 e medir o pH com um medidor de pH. Manter a temperatura média a 37 ° C, utilizando um banho de água se necessário. Medir o pH médio três vezes independentemente.
Nota: NaHCO3 solução deve ser armazenada a 4 ° C e deve ser preparadas de cada mídia. Produtos comercialmente disponíveis que podem ser usados neste estudo são listados na Tabela de materiais.
- Recolher o meio de cultura imediatamente após a remoção da placa de cultura a incubadora de CO2 e medir o pH com um medidor de pH. Manter a temperatura média a 37 ° C, utilizando um banho de água se necessário. Medir o pH médio três vezes independentemente.
-
Preparando o lactato-induzido ou induzido por HCl Ácido meio de cultura
- Adicione 74 µ l de solução de lactato ou 125 µ l de 1 M de HCl a 100 mL de meio de controle (preparado na etapa 1.1.5).
- Verificar o pH médio após 24h de incubação a 37 ° C, menos de 5% de CO2.
Nota: A quantidade de lactato ou solução de HCl também precisa ser ajustado de acordo com o pH médio, que pode diferir dependendo do teor de CO2 na incubadora e pressão de ar. Idealmente, é melhor medir o pH médio com lactato serial ou concentrações de HCl para determinar a quantidade adequada de ajuste para o pH desejado do meio.
2. a colheita e o tratamento de células
- Começa a cultivar células a 37 ° C, menos de 5% de CO2 pelo menos 1 semana antes de realizar experimentos.
Nota: A linha de celular utilizada neste estudo é listada na Tabela de materiais. - Células de passagem quando eles alcançam a confluência de 70-90%. Não permita que as células se tornar confluentes. Altere o meio de cada 2-3 dias durante o cultivo diariamente.
- Lave as células pela adição de 5 mL de PBS. Aspirar a PBS e adicionar enzima desmontar como 1ml tripsina.
- Incube a 37 ° C até que as células são arredondadas e começarem a separar.
- Adicionar 5 mL de meio de cultura para as células desanexadas e desactivar a enzima. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL e centrifugar por 3 min em 300 x g. Aspire o sobrenadante e ressuspender as células com meio de cultura.
- Conte as células viáveis usando um hemocytometer e azul Trypan.
- Semente 5.0 x 105 células/poço de um prato de 10 cm em 10 mL de meio. Incube as celulas por 24 h a 37 ° C abaixo de 5% de CO2.
- Aspire o meio de cultura, lavam-se as células com 5 mL de PBS e adicionar 10 mL de meio de cultura ácido preparado na secção 1. Incube as celulas por 24 h a 37 ° C abaixo de 5% de CO2.
3. isolamento de RNA
- Aspire o meio de cultura e lavam-se células com 5 mL de PBS. Romper as células, adicionando o reagente de extração de RNA (ver Tabelas de materiais).
- Raspe o prato brevemente, em seguida remover o reagente de extração de RNA com uma pipeta e depositar o RNA extração reagente/lisado celular em um tubo de 1,5 mL. Deixe em temperatura ambiente por 5 min.
- Adicionar 250 clorofórmio µ l e agite o tubo vigorosamente durante cerca de 15 s. deixar em temperatura ambiente por 5 min e centrifugar em ≥ 8, 000 x g durante 5 min.
- Remova cuidadosamente a fase aquosa com uma pipeta. Deixe para trás alguns da fase aquosa. Coloque em outro tubo de 1,5 mL.
- Adicionar a fase aquosa 550 µ l isopropanol e misture delicadamente. Deixe em temperatura ambiente por 5 min. centrifugar a máxima velocidade (≥ 20 000 x g) por 20 min a 4 ° C.
- Despeje o isopropanol e adicionar 1 mL de etanol a 75% em DEPC água tratada. Misture suavemente. Centrifugar a 8.000 x g durante 5 min.
- Pipetar o etanol e deixe que secar ao ar livre as pelotas.
- Adicione que aproximadamente 15-25 µ l (dependendo do rendimento) de DEPC água tratada para a pelota do RNA. Misture bem.
- Medir a concentração de RNA isolado medindo a D.O. a 260 nm, utilizando um espectrofotômetro.
4. síntese de cDNA
- Combinar os seguintes componentes em um tubo de reação de PCR: até 5 µ g RNA total, 1 µ l Oligo dT (50 µM) ou mistura aleatória de Primer (60 µM), 1 µ l 10mm dNTP e água nuclease livre para um volume total de 14 µ l.
- Misture e centrifugar brevemente os componentes utilizando uma centrífuga de bancada pequena (~ 5 s). Desnaturar a amostra de RNA/primer por 5 min a 65 ° C. Girar brevemente (~ 5 s) usando uma pequena bancada centrifugue e colocar a amostra prontamente no gelo pelo menos 1 min.
- Adicione os seguintes componentes: 4 µ l 5 x buffer de transcrição reversa, 1 µ l Transcriptase reversa (200 U / µ l), 1 µ l inibidor de RNase (40 U / µ l).
Nota: Exemplos de kits comercialmente disponíveis são mostrados na Tabela de materiais - Tampa do tubo, misture e brevemente centrifugar o conteúdo utilizando uma centrífuga de bancada pequena (~ 5 s). Incube a mistura de reação combinada a 50-55 ° C por 10 min.
- Inativar a reação incubando a 80 ° C por 10 min.
5. medida da expressão do Gene ácido-responsivo usando PCR em tempo real
- Combinar os seguintes componentes em uma placa de reação 384-bem: 1 µ l modelo do cDNA, 0,75 µ l 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µ l 50 µM para a frente primeira demão, 0,3 µ l 50 µM reverso da primeira demão, polymerase de Taq 1 µ l, 2,5 µ l 10 x buffer do polymerase de Taq, 2,5 µ l 20 mM dNTP, 16.65 µ l água.
Nota: O exemplo dos kits comercialmente disponíveis são mostrados na Tabela de materiais. Uma lista das primeiras demão é mostrada na tabela 1. Uma placa de 96 poços de reação também pode ser usada nesta etapa. Outras sondas (por exemplo, sonda Taqman) também podem ser usadas. - Configurar a experiência e o seguinte programa PCR em um sistema de PCR em tempo real: 50 ° C por 2 min, 1 ciclo; 95 ° C por 10 min, 1 ciclo; 95 ° C por 15 s e 60 ° C por 1 min, 40 ciclos; 95 ° C por 15 s, 1 ciclo; 60 ° C durante 15 s, 1 ciclo; 95 ° C por 15 s, 1 ciclo.
- Coloque a placa no instrumento qPCR. Inicie o programa.
Nota: Upregulation dos genes responsivos pH MSMO1, INSIG1e IDI1 podem ser medido pelos níveis de proteína.
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Representative Results
Para determinar a concentração de bicarbonato apropriado, estamos preparados DMEM no intervalo de 0 - 8 mM NaHCO3 (concentração final do meio de cultura) e teve sucesso na preparação de meios de cultura com pH variando de 6,4-7,4 (Figura 1). Estamos preparados DMEM com 8mm NaHCO3 (pH 7,4) como um meio de controle e 2mm NaHCO3 (pH 6,8) como um meio com pH ácido de acordo com um relatório anterior, afirmando que o pH extracelular atinge pH 6,8 para tumores sólidos4,5. O pH do meio ácido foi sustentado por 24 h e gradualmente diminuiu para aproximadamente pH 6.6 para 72 h durante a cultura de PANC-1 e células AsPC-1 (Figura 2). Em seguida, para determinar a quantidade de lactato ou HCl necessária para ajustar o meio de controle (pH 7,4) a pH 6,8, adicionamos várias quantidades de lactato ou HCl para o meio de controle e medido o pH do meio e constatou que o pH do meio de controle com um final concentratio n de 22,5 µM lactato e 6,25 mM HCl alcançou um valor de 6,8 (Figura 3).
O efeito de acidificação extracelular usando um meio com pH baixo pode ser facilmente avaliado baseado em upregulation de genes pH-responsivo ácidos tais como MSMO1, IDI1e INSIG1. Expressão destes genes altamente foi aumentada sob pH baixo comparado à sua expressão sob hipoxia ou fome de nutrientes (Figura 4). Além disso, o upregulation destes genes não foi específico para um meio em que o pH ácido foi causado por níveis reduzidos de bicarbonato, e eles também foram upregulated por um médium em que pH ácido foi causado pela adição de lactato e/ou HCl (Figura 5). Comparação de respostas celulares a mídia em que o pH ácido é derivado de níveis reduzidos de bicarbonato ou a adição de lactato ou HCl nos permite determinar se as respostas celulares são específicas para determinados tipos de acidificação. Upregulation de genes responsável pH ácido como IDI1, MSMO1e INSIG1 sob extracelular baixo pH também ocorre em células normais (Figura 6), então o nosso método pode ser aplicado não só células tumorais, mas também as células normais. Sob a condição de pH elevado, o nível de expressão de genes responsáveis-pH não era upregulated em PANC-1 e células AsPC-1 (Figura 7), que podem ser usadas como controlo negativo.
Figura 1. Correlação entre NaHCO3 concentração e pH médio Eixo horizontal mostra a concentração de NaHCO3 e o eixo vertical mostra pH médio a 37 ° C abaixo dos 5% CO2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Mudança de pH médio baixo pH (pH 6,8) meio de cultura durante 72 h-cultura. PH médio foi sustentado por 24 h e gradualmente diminuiu para 72 h durante a cultura de células PANC-1 e 1-AsPC. 5.0 x 105 células estava semeado de um prato de 10 cm em 10 mL de meio, incubadas durante 24 h e mudou-se para o meio de cultura com pH baixo. Os dados são apresentados como a média ± SEM pelo menos três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Correlação entre o lactato ou concentrações de HCl e pH do meio. O meio de controle (pH 7,4) foi tamponado com várias concentrações de lactato ou HCl. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Upregulation transcricional de genes pH-responsivo ácidos em resposta ao baixo pH Nível de expressão de MSMO1, IDI1e INSIG1 foi maior no PANC-1 e células AsPC-1 no contexto do baixo pH (pH) do que sob hipóxia (H) ou condições de fome de nutrientes (NS) depois de 24 h. dados são apresentados como a média ± SEM pelo menos três experimentos independentes. Student t-testes foram realizados para as comparações indicadas. p < 0.005. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Upregulation transcricional de genes pH-responsivo ácidos em resposta à acidose láctica e acidose mediada por HCl. Expressão de IDI1, MSMO1e INSIG1 mRNAs no PANC-1 células e células AsPC-1 foi determinado pela análise de reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa sob controle (Con; pH 7,4), baixo pH (pH; quantidade de pH 6,8, reduzido de NaHCO3 ), acidose láctica (lactato; quantidade de pH 6,8, aumento do lactato) e as condições de acidose mediada por HCl (HCl; quantidade de pH 6,8, aumentou de HCl) por 24 h. os dados são apresentados como a média ± SEM pelo menos três experimentos independentes. Student t-testes foram realizados para as comparações indicadas. p < 0.005. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Transcriptional upregulation de ácida pH-responsivo genes em resposta ao baixo pH em células normais. Nível de expressão de MSMO1, IDI1e INSIG1 foi upregulated em fibroblástica KMS-6, TIG, e as células MRC9 e células endoteliais de HUVEC após 24 h. dados são apresentadas como a média ± SEM pelo menos três experimentos independentes. Student t-testes foram realizados para as comparações indicadas. p < 0.005. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Nível de expressão de genes responsáveis-pH ácidos sob a condição de pH elevado (pH 7,6 a 8,0) em comparação com baixo pH (pH 6,8). O nível de expressão de genes responsáveis-pH como IDI1, MSMO1e INSIG1 permanece inalterado em condições de alto pH (pH 7,6 a 8,0) no PANC-1 e células AsPC-1 após 24 h. dados são apresentadas como a média ± SEM pelo menos três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Primeira demão | Encaminhar a sequência da primeira demão | Primeira demão | Sequência inversa pimer | ||
| ACTB | 5'-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3' | ACTB | 5'-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3' | ||
| MSMO1 | 5'-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3' | MSMO1 | 5'-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3' | ||
| INSIG1 | 5'-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3' | INSIG1 | 5'-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3 ' | ||
| IDI1 | 5'-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3' | IDI1 | 5'-CAACATCCGGCATAACTGTG-3' | ||
Tabela 1. Lista de primers usados na análise PCR quantitativo em tempo real.
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Discussion
Aqui, descrevemos um sistema de cultura simples pH ácido e seu processo de avaliação. A combinação de três métodos de acidificação média, ou seja, concentração de bicarbonato reduzido, adição de lactato e adição de HCl, permitiu-nos investigar o mecanismo de pH-resposta completamente e comparar a resposta celular a outro tumor Microenvironmental condições tais como a fome de hipóxia ou nutriente.
A chave deste método é para determinar as concentrações adequadas de bicarbonato, lactato e HCl em meio de cultura. Medir o pH médio com diferentes concentrações de bicarbonato ao executar este método pela primeira vez é importante para determinar a quantidade adequada de NaHCO3 no meio. Durante este processo, é necessário medir o pH médio após 24h de incubação a 37 ° C abaixo de 5% de CO2, como status médio de temperatura e equilíbrio de CO2 afetam grandemente o pH médio. Autoclave de bicarbonato é frequentemente recomendado, como bicarbonato facilmente se torna plano. Densidade celular e confluência de célula são fatores cruciais, porque um grande número de células de câncer de crescimento facilmente acidificar o meio de cultura, mesmo em amostras de controle. Além disso, respostas ao pH ácido extracelular dependem a condição das células e podem desvanecer-se como células são passadas, para que as células com menos de 10 passagens foram utilizadas para os experimentos.
Nosso método significativamente tem demonstrado a estabilidade do pH médio para 24h e comparado a vários meios de comunicação de pH ácido. Neste protocolo, o pH médio de 6,8 foi usado como uma condição de baixo pH, mas serial pH ácido entre pH 6,4 e 6,9, além de mídia série básica de pH entre pH 7,4 e 8.0, foram usado para investigar a resposta celular contra a acidificação do extracelular.
Focamos principalmente em células de câncer, mas esse método pode ser usado para outros tipos de células dentro do microambiente do tumor, incluindo células do estroma, células do sistema imunológico e vascular em células endoteliais. Nós e os outros relataram que pelo menos alguns mecanismos sensíveis de pH nas células cancerígenas são comuns em células normais7. Também é possível aplicar esse método para a análise de outras células primárias, bem como células-tronco embrionárias e induzida por células-tronco pluripotentes. Uma limitação deste sistema de cultura poderia ser a dificuldade de manter a condição de pH ácido em experiências a longo prazo.
Acidose é associado com vários tipos de doenças. Esse método pode ser aplicável não só na pesquisa do câncer mas também em estudar distúrbios ácidos como cetoacidose diabética, acidose tubular renal e acidose respiratória.
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Disclosures
O autor Ayano Kondo é um empregado da Kyowa Hakko Kirin co., Ltd.
Acknowledgments
Agradecemos os membros da divisão de ciência do genoma e laboratório de sistemas de biologia e medicina, RCAST, a Universidade de Tóquio. Agradecemos especialmente Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, a Universidade de Tóquio), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida e Dr. A.
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin, Ltd.) para suporte e discussões úteis. Este trabalho foi parcialmente suportado pelo subsídio para jovem cientista (A) (26710005, T.O.), subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (26116711 e 16 H 01567, T.O.) e subsídio para desafiador
Pesquisa exploratória (16K 14605, T.O.) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão, a Fundação de ciência Takeda (T.O.), Fundação de pesquisa do câncer (T.O.) Kobayashi e o projeto para pesquisa do câncer e Evolução terapêutica (P-criar) e a pesquisa de prática de controle do câncer inovadoras da Agência Japonesa para a pesquisa médica e desenvolvimento, AMED (T.O.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
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