Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

Published: December 13, 2017 doi: 10.3791/56662
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1School of Biological Sciences, University of East Anglia, 2Norwich Medical School, University of East Anglia

Summary

אנו מציגים פרוטוקולים עבור בידוד של מעיים 3D מבנים מרקמות ויוו ומוטבעים במבחנה המרתף מטריקס organoids, ואת קיבוע שונות פרט מכתים פרוטוקולים אופטימיזציה עבור תיוג חיסונית של microtubule, חלבונים centrosomal, מהחיבור באותה מידה כמו תא סמני כולל החלבון בתאי גזע Lgr5.

Abstract

כניסתו של organoids 3D במבחנה המחקים את ויוו רקמות ואדריכלות מורפוגנזה התקדמה באופן משמעותי את היכולת ללמוד שאלות מפתח ביולוגית התא וביולוגיה התפתחותית. בנוסף, organoids יחד עם ההתקדמות הטכנית המסירה הגן ויראלי ועריכה ג'ין מבטיח לקדם מחקר רפואי ופיתוח של תרופות חדשות לטיפול במחלות. Organoids גדלו במבחנה במטריצת המרתף לספק מערכות מודל חזק ללמוד את ההתנהגות והתפקוד של חלבונים שונים, גם מתאים עבור live-הדמיה של חלבונים מתויג פלורסנט. עם זאת, הקמת את הביטוי ואת לוקליזציה של החלבונים אנדוגני ברקמת לשעבר vivo ו- in vitro organoids חשוב לוודא את אופן הפעולה של החלבונים מתויגות. למטרה זו יש שפותחה ואנו ששינה רקמות בידוד, קיבוע, תיוג חיסונית פרוטוקולים עבור לוקליזציה של microtubules, חלבונים centrosomal, ומשויך ברקמת המעי vivo לשעבר , במבחנה organoids מעיים. המטרה הייתה מקבע לשמר את הארכיטקטורה תלת-ממד של הרקמה/organoids תוך שמירה על antigenicity נוגדנים והפיכה גם חדירה ואישור של מקבע, נוגדנים. חשיפה לקור depolymerizes והכל אבל microtubules יציבה וזה היה גורם מפתח בעת שינוי הפרוטוקולים השונים. מצאנו כי הגדלת ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) הריכוז של 3 מ מ עד 30 מ"מ נתן ניתוק יעיל villi, כוכים במעי הדק בזמן EDTA 3 מ מ היה מספיק עבור כוכים חוקן. פרוטוקול קיבוע פורמלדהיד מפותחת/מתנול נתן טוב מאוד לשימור מבניים תוך גם שמירה על antigenicity של תיוג יעיל של microtubules, אקטין את החלבונים (EB) סוף מחייב. זה גם עבדה ninein חלבון centrosomal למרות פרוטוקול מתנול עבד עקבי יותר. בהמשך הקמנו כי קיבוע, חיסונית-תיוג של microtubules וחלבונים הקשורים ניתן להשיג עם organoids מבודד או שנותרו בתוך המטריצה במרתף.

Introduction

היווצרות של epithelia עם קוטביות apico-הבסיס הוא תהליך מהותי בהתפתחות כולל ארגון מחדש דרמטי של microtubules, חלבונים centrosomal. מערך microtubule רדיאליים שמקורם microtubule centrosomal במיקום מרכזי ארגון מרכז (MTOC) בולטת בתאים בעלי חיים רבים וזה גם מתאים תאים שטוחה יחסית. לעומת זאת, תאי אפיתל טורי, כגון אלה של המעי, להרכיב הלא-רדיאלי transcellular microtubule מערכים תומכים יותר את הצורה ואת פונקציות מיוחדות של תאים אלה. הארגון מחדש דרמטי של microtubules מושגת על ידי centrosome לעבור איפקס ואת הפסגה MTOCs centrosomal (n-MTOCs) ויוצרים, אשר הופכת אחראית anchorage של transcellular microtubules1,2 , 3 , 4 , 5.

רוב הידע שלנו על בידול אפיתל וארגון microtubule המשויך הגיע מחקירות 2D במבחנה שכבות תאים שאינם מציגים את האדריכלות רקמות ויוו . פיתוח של תלת-ממד במבחנה תא צורב תרבויות, חלוץ ידי Clevers ועמיתים6, מייצג את ההתקדמות הטכנולוגית הגדולות כמו מחקים ויוו אדריכלות ופיתוח. היררכיה של בידול אפיתל מתבטא במעי; תאי גזע בחלק התחתון של כוכים להצמיח לא בוגר טרנזיט הגברה התאים להתרבות ובהבחנה בהדרגה ככל הם נודדים למעלה התת-קרקעי לתוך קטן סיסי מעיים או משטח חוקן, איפה הם הופכים באופן מלא הבדיל לפני לשפוך לתוך לומן7. חשוב, זה משוכפל במעיים organoids שבו להתרבות תאים גומחת תאי גזע ויוצרים ציסטות לאחר מכן לייצר קריפטה כמו ניצנים עם תאי גזע בחלק התחתון בידול מתקדם בהדרגה לעבר האזור ציסטה, אשר הופך את סיסי דמוי8. תא צורב במעיים ולכן מייצג במודל רב עוצמה כדי ללמוד לא רק microtubule וארגון centrosomal במהלך התמיינות אפיתל אבל רבים חלבונים אחרים, כמו גם מתן לפלטפורמה אידיאלית להקרנה של תרופות ומזון תרכובות של הפוטנציאל הטיפולי הטבות9,10.

Organoids מתאימים גם עבור live-הדמיה של חלבונים מתויג פלורסנט, שניהם טוק-, organoids הנוק-אאוט יכול להיווצר באמצעות שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה11,12. עם זאת, הקמת את הביטוי ולוקליזציה של החלבונים אנדוגני שילמדו חשוב, במיוחד לאמת את אופן הפעולה של החלבונים מתויגות. תיוג חיסונית organoids 3D גדל מטריקס במרתף או לשעבר vivo מבודד רקמה מורכבת יותר תאים גדלו ב תרבות מנות ב- 2D. פרוטוקול קיבוע צריך לשמר את הארכיטקטורה 3D עדין של organoids תוך שימור עדיין נוגדן antigenicity (קרי, את epitopes עבור קישור נוגדנים). לדוגמה, 4% paraformaldehyde (PFA) משמש בדרך – כלל מקבע אך בזמן זה הוא מקבע המשחק מהירה יחסית ונותן טוב שימור מורפולוגי, מניסיוננו לעתים קרובות התוצאה היא אובדן של antigenicity אינה מתאימה עבור רבים נוגדנים centrosomal. יש גם לשקול את היכולת של מקבע, נוגדנים לחדור 3D מבנים ורקמה. למטרה זו, יש לשנות, פרוטוקולים שפותחו עבור בידוד הרקמות עקיף חיסונית-תיוג והצהרה של תלת-ממד במבחנה organoids, לשעבר vivo לבודד רקמת המעי. אנחנו מתארים כיצד לבודד כוכים קטנים במעיים ואת villi רקמת המעי הגס, כולל פרוטוקול עבור בידוד של organoids תלת-ממד כחלופה לתיקון ולקרוא חיסונית בתוך המטריצה במרתף. אנו מציגים שלושה פרוטוקולים קיבוע חלופי עבור חיסונית-תיוג של microtubules, חלבונים centrosomal, כגון ninein, וחלבונים microtubule מעקב סוף-פלוס (+ טיפים), כגון חלבונים EB ו קליפ-170 (ראה גם הפניות8, 13). נדון גם את היתרונות והחסרונות הקשורים לכל פרוטוקול.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן בוצעו לפי הקווים המנחים אוניברסיטת מזרח אנגליה של רשיון מוסדיים.

1. בידוד של רקמת המעי

  1. בידוד של כוכים חוקן של תיוג חיסונית (ראה איור 1, סכמטי)
    1. המתת חסד העכבר (באמצעות חנק2 CO) ולהסיר את המעי הגס (החל caecum ואת חילוץ הקליפה) עם פינצטה ומספריים14לנתח.
    2. לרוקן את תוכן המעי הגס עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) באמצעות פיפטה מזכוכית עם הנורה גומי. PBS: נתרן כלורי (8.0 g/L), אשלגן כלורי (0.2 g/L), ניתרן פוספט (1.15 g/L), אשלגן dihydrogen פוספט (0.2 g/L), ב- pH 7.3.
    3. באמצעות מוט מתכת (2.4 מ מ קוטר) או סוף פיפטה מזכוכית, החזק קצה אחד של הצינור חוקן בעת בעדינות מחליק את הרקמה על המוט/פיפטה ובכך everting את רקמת מעי כך האפיתל היא עכשיו מבחוץ.
      הערה: אם זה לא אפשרי אז פתח המעי הגס עם מספריים, פרוסה לחתיכות 5 מ מ.
    4. העברה המעי הגס everted או חתיכות צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 40 מ"ל ל- PBS.
    5. היפוך צינור מספר פעמים כדי להסיר תוכן מעיים נוספות, ריר, וכו '
    6. להעביר את המעי הגס/החתיכות 40 מ של 3 מ מ EDTA ב- PBS, דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות.
      הערה: לדלל 0.5 M EDTA pH 8.0 המניה עם PBS.
    7. מנערים כדי להסיר את הליחה ולהעביר את המעי הגס/החתיכות צינור חרוטי 50 מ ל המכיל טריים 40 מ"ל של 3 מ מ EDTA ב- PBS. תקופת דגירה של 35 דקות ב- RT.
    8. להעביר את המעי הגס/החתיכות 10 מ"ל של PBS צינור חרוטי 50 מ ל ומנערים נמרצות במשך 30 s לשחרר כוכים (קריפטה שבר).
    9. הסר את המעי הגס/חלקים מהצינור ומניחים בחזרה לתוך 3 מ מ EDTA למקרה נוסף נדרש בידוד. Centrifuge השבר קריפטה הנותרים ב g x 300 במשך 5 דקות.
    10. הסר 5 מיליליטר תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר קריפטה באמצעי האחסון מ ל הנותרים.
    11. להתבונן תחת stereomicroscope עם זום (50-100 X הגדלה) כדי לבדוק נוכחות של כוכים חוקן.
      הערה: אם אין כוכים נוכח ואז דגירה החלקים/קולון ב- 3 מ מ EDTA ב- PBS למשך 30 דקות אחר ולאחר מכן חזור על שלבים 1.1.8 - 1.1.11.
    12. Centrifuge השבר קריפטה ב g x 300 במשך 5 דקות.
    13. הסר כל תגובת שיקוע כדי להשיג גלולה קריפטה ואת המשך מיד קיבעון (סעיף 3).
  2. בידוד של כוכים קטנים במעיים, villi של תיוג חיסונית (איור 2)
    1. המתת חסד העכבר (באמצעות חנק2 CO) ולהסיר את המעי הדק (proximal התריסריון כדי ileum מסוף) עם לנתח פינצטה14ומספריים.
      הערה: על תצוגה שונים מקטעים של המעי הדק ואז בשלב זה להפריד, להתייחס בנפרד. ראה איור 1 טבלה 1 עבור דיאגרמת זרימת ואת לוח הזמנים.
    2. לרוקן את תוכן המעי הדק עם PBS באמצעות פיפטה מזכוכית עם הנורה גומי.
    3. חתך פתוח המעי הדק עם מספריים ויבתר ולמקם 15 מ"ל PBS בצלחת פטרי.
    4. לשטוף בעדינות את המעי ב- PBS להסיר את התוכן luminal בעוד לא מזיק השטח הרירית. להעביר את הרקמה צלחת פטרי טריים וחזור PBS לשטוף.
    5. לחתוך את המעי לחתיכות 3-5 מ מ להעביר 100 מ מ פטרי המכילות 15 מ"ל של 30 מ מ EDTA ב- PBS, דגירה עבור 5 דקות ב RT. לחילופין דגירה של EDTA 3 מ מ ב- PBS למשך 30 דקות.
    6. חלק 1 (Villi בידוד): להעביר את החלקים במעיים לתוך 10 מ"ל של PBS צינור חרוטי 50 מ ל, טלטול נמרצות עבור 10 s ו לשפוך לתוך 100 מ מ פטרי. בדוק את השבר עבור villi מבודד תחת stereomicroscope. בשלב זה, בעיקר villi צריך להיות נוכח, אבל זה יכול להשתנות בין ומשום.
      הערה: כדי למנוע villi מבודד/כוכים דבק פלסטי, צלחות פטרי, צינורות איסוף צריך להיות מצופים מראש עם עוברי שור סרום (FBS). שופכים FBS לתוך מנות ו/או צינורות, להסיר לאלתר את זה. ראה טבלה 1 מדריכים התזמון עבור כל שבר.
    7. להעביר את חתיכות מעיים בחזרה לתוך 30 מ מ EDTA ב- PBS, תקופת דגירה של 5 דקות. במהלך הדגירה הזה, לאסוף את השבר 1 צינור חרוטי 15מל (precoated עם FBS), צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
    8. חלק 2: העברת מעיים חתיכות צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 10 מ"ל ל- PBS, טלטול נמרצות במשך 20 s ולאחר מכן לשפוך לתוך 100 מ מ פטרי. בדוק את השבר מתחת למיקרוסקופ. בדרך כלל, בשלב זה תרבות מעורבת של villi, כוכים הם מציגים (איור 2 א).
    9. להעביר את חתיכות מעיים בחזרה לתוך 30 מ מ EDTA ב- PBS, תקופת דגירה של 5 דקות נוספות. במהלך זה דגירה, גלולה שבר 2 צינור חרוטי 15מל (precoated עם FBS) ב g 300 x 5 דק להסיר תגובת שיקוע של שברים 1 ו- 2 מבלי להפריע בגדר, תגיע מיד. קיבוע (שלב 3).
    10. שבר 3 (קריפטה בידוד): להעביר את החלקים במעיים לתוך 10 מ"ל של PBS ב שפופרת 50 מ ל, טלטול 20 s, לשפוך לתוך 100 מ מ פטרי. בדוק שבר תחת המיקרוסקופ. בשלב זה, השבר יכיל ברובו כוכים (איור 2B).
    11. חלק 4: להעביר את החלקים במעיים 10 מ"ל ל- PBS, טלטול 20 s, לשפוך לתוך 100 מ מ פטרי. בדוק שבר תחת המיקרוסקופ. בשלב זה רק כוכים צריך להיות נוכח.
    12. חלק 5: להעביר את החלקים במעיים 10 מ"ל ל- PBS, טלטול 20 s, לשפוך לתוך 100 מ מ פטרי. בדוק שבר תחת המיקרוסקופ. בדרך כלל, בשלב זה, מחולצים כוכים מעט מאוד. אם יותר מכמה כוכים חולצו, ואז להמשיך עם שברה 6.
      הערה: אם אוכלוסיה קריפטה טהורה היא הרצויה (לדוגמה, עבור הדור תא צורב), השתמש מסננת תא מיקרומטר 70 כדי להסיר כל villi שלם השבר מועשרת הקריפטה.
    13. לאסוף את השברים 3-5 צינורות חרוט נפרד 15 מ"ל, צנטריפוגה ב g 300 x במשך 5 דקות.
    14. בדוק את החבילות של שברים 3 - 5, להסיר את supernatants מבלי להפריע את כדורי, והמשך מיד קיבעון (סעיף 3).

2.בידוד של המעי Organoids מן המרתף כיפות מטריצה ב- 24-ובכן צלחות

הערה: היווצרות של organoids בתוך המרתף מטריקס כיפות כבר תיאר במקום12.

  1. המעיל וולס עם מרתף כיפת מטריקס בהתאם להוראות היצרן.
  2. שטיפת בארות המכילה כיפות מטריקס במרתף עם µL 500 ל- PBS.
  3. להוסיף µL 250 קר של פתרון שחזור התא (4 ° C) מכל קידוח (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: פתרון שחזור תא קר depolymerize microtubules אך יציב.
  4. לגרד את הכיפות מטריקס המרתף באמצעות micropipette P1000, בזהירות פיפטה למעלה ולמטה ברחבי הבאר כדי הפרידה ולהסיר המטריקס המרתף פלסטיק.
  5. לאסוף את תגובת שיקוע 1.5 mL מחייב נמוך microcentrifuge צינורות.
  6. היפוך הצינור קשירה נמוכה 1.5 mL מספר פעמים ולבדוק במיקרוסקופ אם organoids היה מבודד, חופשיים לנוע, לא במקבצים. להחזיק את הצינור מתחת stereomicroscope התצוגה תחת הגדלה נמוכה (50 X).
  7. גלולה של organoids על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות ב- RT.
  8. הסר הכימית התאוששות והמשך מיד קיבעון (שלב 3).

3. קיבוע של רקמת המעי מבודד Organoids

  1. קיבוע מתנול
    1. Resuspend השבר קריפטה/סיסי מעיים מבודדים ב 10 מ"ל ו organoids ב 1 מ"ל של מתנול ב-20 ° C.
    2. דגירה כוכים/villi/organoids ב-20 ° C במקפיא למשך 15 דקות, להפוך את צינור כל 5 דקות.
    3. גלולה כוכים/villi/organoids על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות.
    4. להסיר את מתנול ולהוסיף כביסה פתרון (1 מ"ל עבור organoids ו- 10 מ"ל לשברים קריפטה מבודד/סיסי). הפתרון כביסה עשויה גם להיות מורכבת PBS עם סרום 1% או PBS עם סרום דטרגנט ו 1% 0.1%.
      הערה: להשתמש בסרום של בני אותו מין כמו זה של נוגדנים משניים. לדוגמה, אם הנוגדנים משני נוצרו בעז אז להשתמש בסרום עז.
    5. . מיד, centrifuge כוכים/villi/organoids-1000 g x עבור 5 דקות כדי גלולה.
    6. הסר את הפתרון כביסה, resuspend villi/כוכים/organoids בתמיסה כביסה טריים.
    7. מניחים על rotator צינור עם מהירות מוגדר סל ד 20. לשטוף את התאים עבור סכום כולל של h 1, pelleting villi/כוכים/organoids על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם במשך 5 דקות) כל 15 דקות והחלפה של הפתרון לשטוף.
      הערה: אם מסובב שפופרת אינה זמינה ואז היפוך הצינורות באופן ידני כל 5 דקות כדי resuspend התרבויות מבודד.
  2. קיבוע פורמלדהיד/מתנול
    הערה: להתמודד עם כתות ומייצבים של פורמלדהיד בשכונה fume.
    1. Resuspend כוכים מבודד/villi ב 10 מ"ל או organoids ב 1 מ"ל של פתרון מקבע-20 ° C (9.2 מ"ל של מתנול עם 800 µL של פורמלדהיד פתרון).
    2. לתקן את כוכים/villi/organoids ב-20 ° C במקפיא למשך 15 דקות, להפוך את הצינור כל 5 דקות.
    3. גלולה כוכים/villi/organoids על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות.
    4. להסיר את הפורמלדהיד/מתנול ולהוסיף כביסה פתרון (1 מ"ל organoids או 10 מ"ל לשברים כוכים מבודד/סיסי). הפתרון כביסה עשויה גם להיות מורכבת PBS עם סרום עז 1% או PBS עם סרום דטרגנט ו 1% 0.1%.
    5. צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות כדי הצניפה כוכים/villi/organoids.
    6. הסר את הפתרון כביסה, resuspend בתמיסה כביסה טריים.
    7. מניחים על rotator צינור עם מהירות מוגדר סל ד 20. לשטוף את התאים עבור סכום כולל של h 1, pelleting villi/כוכים/organoids על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם במשך 5 דקות) כל 15 דקות והחלפה של הפתרון לשטוף.
  3. קיבוע PFA
    התראה: PFA אבקת ופתרונות וצריך לטפל בשכונה fume.
    הערה: ברוב המקרים 4% מחברים ב- PBS משמש אלא שימור נוגדן antigenicity, ריכוז נמוך יותר עשוי לשמש בהתאם.
    1. Resuspend את מבודד pelleted כוכים/villi 10 מ ל 4% מחברים, ואת תקופת דגירה-RT של 1 h. מבודד מגורען organoids ב 1 מ"ל 4% PFA דגירה למשך 30 דקות. בשני המקרים היפוך של צינור כל 10 דקות.
    2. גלולה כוכים/villi/organoids על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות.
    3. להסיר את כדורגלן ולהוסיף כביסה פתרון (1 מ"ל עבור organoids ו- 10 מ"ל עבור כוכים מבודד/villi). הפתרון כביסה מורכבת PBS עם סרום דטרגנט ו 1% 0.1%.
    4. צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות כדי הצניפה כוכים/villi/organoids.
    5. הסר את הפתרון כביסה, resuspend בתמיסה כביסה טריים.
    6. מניחים על rotator צינור עם מהירות מוגדר סל ד 20. לשטוף את התאים עבור סכום כולל של h 1, pelleting villi/כוכים/organoids על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם במשך 5 דקות) כל 15 דקות והחלפה של הפתרון לשטוף.
      הערה: אם מסובב שפופרת אינה זמינה ואז היפוך צינורות באופן ידני כל 5 דקות כדי resuspend התרבויות מבודד.
    7. אחזור אנטיגן (שלב אופציונלי מומלצת קיבוע PFA)
      1. גלולה כוכים/villi/organoids על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
      2. להוסיף 1-10 מ ל 10 מ מ סודיום ציטרט pH 6.0 (טרום התחמם עד 80 ° C), דגירה ב 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      3. גלולה כוכים/villi/organoids על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
      4. להוסיף 1-10 מ ל 10 מ מ טרי סודיום ציטרט pH 6.0 (טרום התחמם עד 80 ° C), תקופת דגירה-RT של 20 דקות.
      5. גלולה כוכים/villi/organoids על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
      6. לכבס במים 1-10 מ ל PBS עם סרום 1% וחזור עוד 3 פעמים pelleting villi/כוכים/organoids על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם במשך 5 דקות) לפני הוספת פתרון שטיפת טריים.

4. חסימת שלב

  1. להפוך את הפתרון חסימה: להוסיף 10% נוגדנים משני מינים סרום ב- PBS (אופציונלי: להוסיף אבקת 0.1%).
  2. גלולה כוכים/villi/organoids על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם במשך 5 דקות) ולהסיר את תגובת שיקוע.
  3. להוסיף 5-10 מ"ל של הפתרון חסימה תלוי במספר הדגימות הנדרשות (ראה הערה להלן). בשלב זה, פצל את הפתרון כוכים/villi/organoids צינורות בודדים (1.5 מ ל איגוד נמוך microcentrifuge צינורות עם כל שפופרת המכילה 0.2 - 1 מ"ל) עבור צביעת עם נוגדנים שונים.
    הערה: כל שבר כוכים מבודד/villi ייתן בין 5-10 דוגמאות שיכול לשמש עבור צירופים תיוג שונים בהתאם לגודל של בגדר. באופן אידיאלי, בגודל גלולה בין 2-4 מ מ נדרש עבור כל דגימה.
שברים שונים יכול להיות משולב בשלב זה כמו כוכים, villi ניתן בקלות לזהות (איור 2).
  • דגירה בחסימה פתרון ב RT על מסובב צינור לשעה.

    • 5. ראשי נוגדן דגירה

    1. לדלל את הנוגדנים הראשית (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS המכיל חומרי ניקוי, סרום ו- 0.1%, 10%. בין 100-200 µL נוגדן ראשוני פתרון נדרש עבור דגימה צינור microcentrifuge.
    2. הסר את הפתרון חסימה על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם במשך 5 דקות).
    3. Resuspend בגדר כוכים/villi/תא צורב בפתרון נוגדן ראשוני, דגירה ב 4 ° C תוך שימוש מסובב צינור (20 סל ד) כדי לשמור את כוכים/villi/organoids ההשעיה.
    4. למחרת: להחזיר את הדגימות RT עבור 1 h בשפופרת מסובב (20 סל ד).
    5. גלולה המדגם על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם במשך 5 דקות) ולהסיר את הפתרון נוגדן ראשוני.
    6. להוסיף 1 מ"ל לרחוץ את הפתרון, resuspend כדורי קריפטה/סיסי/תא צורב.
    7. להסיר לאלתר את הפתרון על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם במשך 5 דקות).
    8. להוסיף 1 מ"ל שטיפת טריים פתרון, ספין התאים על מסובב צינור (20 סל ד) 2 שעות. לשנות את הפתרון לשטוף באמצעות צנטריפוגה כל 30 דקות כמו שלב 5.7.

    6. משני נוגדן דגירה

    1. לדלל משני הנוגדנים (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS עם חומר ניקוי, סרום ו- 0.1%, 10%. כ-200 µL של נוגדנים משניים פתרון נדרש עבור דגימה צינור microcentrifuge.
      הערה: נוגדנים מאוד נספג הצלב אמור לשמש כדי להפחית תגובתיות של נוגדנים משניים ב קריפטה העכבר/סיסי/תא צורב.
    2. צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות כדי הצניפה כוכים/villi/organoids ו- resuspend כדורי ב- 200 µL של פתרון נוגדנים משניים.
    3. לסובב את הצינורות על שפופרת מסובב (20 סל ד) ב RT לשעה.
    4. צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות הצניפה כוכים/villi/organoids ולהסיר את supernatants (שאינו מאוגד נוגדנים משניים).
    5. Resuspend בגדר בפתרון לשטוף, מיד צנטריפוגה-g x 1000 עבור 5 דקות כדי הצניפה כוכים/villi/organoids.
    6. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב 1 מ"ל של פתרון שטיפת טריים.
    7. סיבוב שפופרת מסובב (20 סל ד) ב RT עבור h-1.5-2, שינוי הפתרון לשטוף כל 20-30 דקות, כפי שתואר לעיל צעדים 6.3-6.6.

    7. גרעיני כתם

    1. לדלל את הכתם גרעיני בפתרון לשטוף (לפי הפרוטוקול של היצרן), כגון דאפי או Hoechst. לדוגמה: פתרון מניות דאפי (20 מ"ג/מ"ל) הוא מדולל לאינטרנט 1:10, 000. הפתרון מניות ניתן לשמור ב- aliquots ב-20 ° C.
    2. צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות כדי הצניפה כוכים/villi/organoids ולהסיר את הפתרון כביסה.
    3. Resuspend בגדר בפתרון counterstain גרעינית.
    4. סיבוב שפופרת מסובב (20 סל ד) ב RT למשך 10 דקות.
    5. צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות כדי הצניפה כוכים/villi/organoids, להסיר את הפתרון הכתם גרעינית ו resuspend בגדר בפתרון לשטוף.
    6. סיבוב שפופרת מסובב (20 סל ד) ב RT למשך 30-60 דקות, שינוי הפתרון לשטוף כל 10 דקות.

    8. הרכבה מבודד כוכים Villi, Organoids

    1. צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות הצניפה כוכים/villi/organoids ולהסיר כל הפתרון לשטוף.
      הערה: אם בגדר מפזר, ואז צנטריפוגה שוב.
    2. להוסיף 2 טיפות של הגדרה קשה הרכבה מדיה עם הסוכן antifade אל בגדר.
    3. בסוף micropipette P200 גזורה בקפידה resuspend בגדר בתקשורת הרכבה. למנוע יצירת בועות.
      הערה: התרבויות תא צורב מבודדים הם מאוד דביקה; ודא resuspend באופן מלא.
    4. השתמש את micropipette כדי להעביר את התערובת של כוכים/villi/organoids בפתרון תקשורת הרכבה ולאחר לוותר על קו לאורך מרכז שקופית מיקרוסקופ.
      הערה: כדאי הקו לא תהיה יותר מאשר הכיסוי-הזכוכית יש להשתמש. בדוק באמצעות stereomicroscope בין אם כוכים/villi/organoids להתפשט בשקופית, לא התגבש.
    5. בזהירות המקום כיסוי-זכוכית מעל; למנוע יצירת בועות.
    6. מקום השקופית זכוכית שקופית ספרים ומפות חנות במקרר ללילה עבור המדיה הרכבה לקביעת לפני ניתוח-מיקרוסקופ קונפוקלי.
      הערה: עבור העכבר נוגדן מכתים ברקמת העכבר, להשתמש immunofluorescence המסחרי של קיט (ראה טבלה של חומרים). החלף את הצעד חסימה (סעיף 4) בלוק 10 דקות עם חלבון פתרון חסימה ואחריו דגירה 1 h עם חסימה הכימית שמגיע עם הקיט. לאחר מכן שלב 5.8 (באמצע הכביסה) להוסיף על דגירה 1 h עם פלורסצנטיות אות משפר ריאגנט. לאחר מכן להשתמש ריאגנט של הקיט פלורסנט dilutant (נוגדנים משניים אחרים יכול לשמש גם בשילוב עם ריאגנט הזה). דגירה לעיל והמשך משלב 6 עם השאר בפרוטוקול.

    9. קיבוע ולקרוא חיסונית-של Organoids בתוך המרתף מטריקס

    הערה: Organoids מיועד עבור קיבעון, חיסונית-תיוג תוך שמירה בתוך המטריצה המרתף נוצרו בתוך המרתף כיפות מטריקס על coverslips זכוכית עגול דקה לתוך צלחת 24-טוב (אחד כיפת לכל טוב). תא צורב המרתף מטריקס צריחי עובדו בתוך הצלחת 24-ובכן על ידי הוספה הסרה של הפתרונות השונים.

    1. להסיר את המדיום מבארות ולהוסיף מקבע; יוצאים 1 h.
    2. הסרת מקבע את ולשטוף ב- PBS המכילים אבקת סרום ו- 0.1% 1% עבור 2 h, שינוי כל 30 דקות.
    3. הסר את הפתרון שטיפת וחסום ב- PBS עם סבון סרום ו- 0.1% 10% לשעה.
    4. לדלל את הנוגדנים PBS עם סרום 1% או PBS עם חומר ניקוי, סרום ו- 0.1%, 1%.
    5. להסיר את הפתרון חסימה ולהוסיף נוגדן ראשוני של 100-200 μL (ראה טבלה של חומרים) לפתרון כל טוב.
      הערה: חשוב להסיר את כל הפתרון חסימה כדי לא לדלל נוגדנים עוד יותר.
    6. מניחים צלחת במקרר, דגירה בין לילה ב 4 ° C
    7. ואז יוצאים RT h 1-2.
    8. להסיר את הנוגדן פתרון בשביל 2-3 h שינוי הפתרון לשטוף כל 20 דקות.
    9. להסיר כל פתרון שטיפת ולהוסיף 100-200 μL נוגדנים משניים מדולל (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS עם סרום 1%; תקופת דגירה של h 1-RT.
    10. להסיר את הפתרון נוגדנים משניים בשביל 2 h, שינוי כל 20 דקות.
    11. להסיר את הפתרון שטיפת ולהוסיף דאפי פתרון; יוצאים 10 דקות-פתרון מניות RT. שימוש דאפי (20 מ"ג/מ"ל) מדולל-1:10, 000.
    הפתרון מניות ניתן לשמור ב- aliquots ב-20 ° C.
  • הסר את דאפי פתרון ואת שטיפת למשך 40 דקות, משתנה כל 10 דקות.
  • באמצעות מלקחיים, להסיר את coverslip זכוכית עם הכיפה מטריקס המרתף ומניחים על שקופית עם הכיפה מטריקס המרתף כלפי מעלה; הוסף מספר טיפות של הרכבה מדיה ושמים coverslip זכוכית על העליונה.
  • במקום הזכוכית-השקופית בספר שקופית ולהשאיר במקרר ללילה עבור המדיה הרכבה להגדיר.

    • Representative Results

    בידוד של רקמת המעי עבור תיוג חיסונית
    הפרוטוקולים בידוד רקמות המתואר של המעי הגס והמעי הדק אופטימציה שימור, חיסונית-תיוג של microtubules וחלבונים הקשורים, אך לא עבור הכדאיות תאי גזע ויצירת תא צורב (איור 1 ו לטבלה 1 ). מטרתם הייתה לייצר הקריפטה ו פלגים סיסי שהיו כמו נקי (ללא ליחה ורקמות אחרות) ככל האפשר, תוך מזעור חשיפה EDTA וקרה כדי לשמר את מבנה ולמנוע depolymerization של microtubules עם פתרונות קר קרח, אשר זירוז depolymerization של microtubules אך יציב. איור 2 מציג דוגמאות של תמונות של שברים 2 ו- 3 מתוך רקמת המעי קטן מבודד, עם 2 שבר המכיל תערובת של villi והן כוכים (איור 2 א, ב'), בעוד שבר 3 מכיל בעיקר כוכים (איור 2C ד).

    קיבוע ולקרוא חיסונית-רקמת המעי מבודד
    שברים בודדים או משולב עובדו ואז עבור קיבעון, חיסונית עם התווית דרך סדרה של שלבים לרבות קיבוע, דטרגנט, חסימה, נוגדנים, ושטיפת פתרונות, לפני השעיית מחדש את הסופי villi/כוכים הצניפה בתקשורת הרכבה, העברת שקופיות, כיסוי עם coverslips זכוכית דקה. כוכים ואת villi היו אז עם תמונה במיקרוסקופ קונפוקלי.

    שימור טובה ולקרוא microtubules, אקטין villi והן כוכים הושגה על ידי הבאות: שילוב של פורמלדהיד/מתנול קיבוע ב-20 ° C, חזר על כביסה ב- PBS המכיל סרום דטרגנט ו 1% 0.1% וחסימת ב- PBS עם 0.1% דטרגנט ו-10% סרום, ואחריו הדגירה לילה-4 מעלות צלזיוס נוגדנים הראשי ולאחר מכן 2 h בנוגדנים משניים בטמפרטורת החדר (איור 3). פורמלדהיד/מתנול קיבוע גם פעלה היטב תיוג + טיפים כגון EBs קליפ-170 באולמות מבודד villi (איור 4). הצטברויות EB3 בקצה הפלוס של microtubules (המכונה שביטים) ניכרו באולמות (איור 4A), בעוד האגודה לאורך השבכה microtubules יציבה ניתן היה לראות villi דגימות (איור 4C). לוקליזציה ברורים של קליפ-170 ו p150Glued (יחידת משנה של dynactin) היה בבירור ב n-MTOCs הפסגה ב- villi מבודד (איור 4B). קיבוע עם פרוטוקול פורמלדהיד/מתנול לא פעלה באופן עקבי בלוקאליזציה ninein ברקמת המעי מבודדים באמצעות נוגדן Pep3 שלנו נגד ninein העכבר. עם זאת, מתנול קיבוע ב-20 ° C ואחריו הכביסה אותו ונתן חסימת פתרונות באשר פורמלדהיד/מתנול לוקליזציה טובה מאוד של ninein בתוך כוכים מבודד villi (איור 5; הפניה8). מעניין, בעוד ninein היא מרוכזת בשעה centrosomes הפסגה יש הצטברות בבסיס תא היה ניכר כמה תאים בתוך כוכים מבודד (איור 5). בין אם זה בגלל שאינם ספציפיים תיוג או תוצאה של לעכב הליך הבידוד קיבעון (, ובכך משפיע על שימור) עליך בהמשך החקירה. עם זאת, מתנול-קבועה (-20 ° C) cryostat מקטעי villi (ראה איור 3bi ב8) התגלה גם ninein מהתא הבסיס בתאים מסוימים רומז ninein הזה אפשר גם לשייך אוכלוסיה הבזליים של microtubules.

    קיבעון, חיסונית-תיוג של organoids מבודד מן המרתף מטריקס
    Organoids במעיים קטן שנוצר, גדל במטריצת במרתף במשך שלושה שבועות או יותר (איור 6A; ההפניה6,15). הצטננות (4 ° C) פתרון שחזור תא שימש כדי לבודד organoids מתוך מטריצת במרתף. הפתרון מטריצה depolymerized המרתף עם organoids היה להעביר צינורות, centrifuged לפני קיבוע ולקרוא חיסונית. זה מיוצר ההכנות נקי מאוד ולא גישה טובה organoids הפתרונות השונים. התאים הבדיל ששרים סיסי תא צורב מכילים microtubules apico-הבזליים יציב; אלה הנקרא טוב ברוב המקרים (איור 6B, ג), EB1 יכול גם לראות לאורך השבכה microtubule (איור 6E; הפניה13). עם זאת, הפתרון שחזור תא קר עלול לגרום depolymerization של microtubules דינאמי, אשר היה ברור כמה דגימות היעדרה של שביטים EB1 (אשר לאגד הפלוס-סוף microtubules גדל) ששרים קריפטה הבזליים (איור 6F ). בדגימות אחרים, אסטרל microtubules (דינאמי) נשתמרו (6D איור). תא צורב בידוד לפני קיבוע ולקרוא חיסונית עבד גם חלבונים מהחיבור, ninein, סרטון-170 של סמנים התא, כגון mucin עבור תאי גביע ו- chromogranin A עבור תאים enteroendocrine.

    קיבעון, חיסונית-תיוג של organoids בתוך המרתף מטריקס
    איור 7     מראה של תא צורב בשלב ציסטה (A–C) בשלב מוקדם של קריפטה פיתוח (D), קבוע בפורמלדהיד/מתנול והן עם התווית חיסונית microtubules, ninein. שימור microtubule טוב תיוג וכן תיוג עבור ninein-n-MTOCs הפסגה ניכרו. איור 8A, B מציג תחום קריפטה תוך יום 6 תא צורב קבוע עם פרוטוקול מתנול ומתויגים microtubules, EB1. טוב שימור microtubules וכוכבי -שביט EB1 היה ניכר רומז שימור microtubules דינמי.

    Organoids היו גם קבוע התווית על-ידי חיסונית תוך שמירה בתוך המטריצה במרתף. החסרונות של הליך זה עשוי להיות המסכן חדירת מקבע והשמנה של נוגדנים בתוך המטריצה המרתף (איור 8 ב'), אם כי בשני המקרים פחות לעתים קרובות כאשר 0.1% דטרגנט נכלל מקבע ו/או לשטוף פתרונות. בנוסף, 4% מחברים לא שמר המטריקס המרתף טוב אבל גרם לזה להתמוסס, למרות שזה היה פחות אז עם 1% מחברים.קיבוע מתנול, מצד שני, לפעמים המושרה תא צורב התמוטטות.

    תיוג עם כמה נוגדנים כגון תאי גזע סמן Lgr5 ו- Paneth תא בסמן CD24 בתוהו עם הפרוטוקולים, מתנול, ו/או פורמלדהיד/מתנול 4%. עם זאת, לתקן את organoids בתוך המטריצה במרתף עם 1% מחברים ב- PBS עם חומר ניקוי 0.1% בטמפרטורת החדר לגרום תיוג הן Lgr5 והן CD24 (איור 9).

    Figure 1
    איור 1: בידוד של villi קטן המעי, כוכים. תזרים של המפתח נכנס סיסי מעיים קטן ובידוד קריפטה לפני קיבוע ולקרוא חיסונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 2
    איור 2: מבודד villi, כוכים מן המעי הדק העכבר. Brightfield תמונות מיקרוסקופ של שברים מעיים מציג villi (חצים גדולים), כוכים (חיצים קטנים). (A, B) שבר 2 מכילה תערובת של villi כוכים, שימור המבנה על סיסי ו קריפטה מתבטא, B. (C, D) שבר 3 מראה בידוד של כוכים היעדר villi, כוכים שלם כולל קריפטה מתפצל לשניים ב- C. גודל ברים = 500 μm (א, ג); 100 μm (B, D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 3
    איור 3: מבודד סיסי מעיים קטן וה קריפטה קבוע בפורמלדהיד/מתנול ומתויגים חיסונית-microtubules, אקטין. תיאור סכמטי של האפיתל סיסי וה קריפטה עם סוגי תאים שונים המצוין (A). בתיבות המסומן מציינים את האזורים נציג עם תמונה ב B ו- C. (ב, ג) קונאפוקלית מקטעים אופטי דרך החלק של סיסי (B) וכן קריפטה הבזליים (C) מבודד מן המעי הדק באמצעות 30 מ מ EDTA, קבוע פורמלדהיד/מתנול, שטף ב- PBS המכיל 1% עז סרום ו- 0.1% דטרגנט, חסום ב- PBS מכיל סרום עז 10% ו- 0.1% דטרגנט, שכותרתו microtubules עם נוגדן אנטי-טובולין monoclonal עכברוש (ירוק) ועבור אקטין עם נוגדן anti-β-אקטין polyclonal הארנב (אדום). שמור apico-הבזליים microtubule חבילות ניכרות בתאים סיסי והן קריפטה ולאחר אקטין ניתן לראות מרוכזים באזור הפסגה מול לומן (חץ). גודל ברים = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 4
    איור 4: לבודד התת-קרקעי קטן המעי ו villi קבוע בפורמלדהיד/מתנול ומתויגים חיסונית-microtubules, EB3, p150Gluedשל קליפ-170. סעיפים אופטי קונאפוקלית של קריפטה ואזורים villi מבודד מן המעי הדק באמצעות 30 מ מ EDTA ו קבוע פורמלדהיד/מתנול, שטף ב- PBS המכיל סרום עז 10% ו- 0.1% דטרגנט, חסום ב- PBS המכיל סרום עז 10% ו- 0.1% דטרגנט, ו מתויג חיסונית. קריפטה (A) עם נוגדנים polyclonal α-טובולין הארנב (אדום) ועכברוש monoclonal נוגדן EB3KT36 (ירוק) תוויות והמוכתמות לדנ א עם דאפי (כחול) מציג microtubules apico-הבזליים וכוכבי -שביט EB3. התמונה הפוכה ערוץ אחד מראה בבירור EB3 שביטים לאורך כל התאים הבזליים קריפטה רומז טוב שימור דינאמי וכן microtubules יציב. סיסי (B) עם ארנב polyclonal קליפ-170 נוגדנים לתאי האפיתל תוויות (ראה אדום, גם התייחסות16) ועכבר monoclonal p150Glued נוגדנים (ירוק) מציג הפסגה שיתוף לוקליזציה. תמונות הפוכות ערוץ אחד מוצגים להלן. (ג) סיסי תאים עם נוגדנים polyclonal α-טובולין הארנב (אדום) ועכברוש monoclonal EB3-KT36 נוגדנים (ירוק) תוויות, מוכתם DNA עם דאפי (כחול) מציג microtubules apico-הבסיס עם EB3 לאורך השבכה. האגודה סריג EB3 מסומן בתמונה מוגדלת בעוד התמונה הפוכה ערוץ אחד מציע גם שביטים EB3 וגם סריג האגודה. גודל ברים = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 5
    איור 5: מבודד התת-קרקעי של המעי הגס קבוע, מתנול, שכותרתו חיסונית עבור ninein ו- E-קדהרין, והמוכתמות עם דאפי. סעיף אופטי קונאפוקלית של הבסיס, אזור המעבר-הגברה של קריפטה מבודד מן המעי הגס באמצעות 3 מ מ EDTA, קבוע מתנול שטף ב- PBS המכיל 1% עז סרום ו- 0.1% דטרגנט, חסום ב- PBS המכיל 10% עז סרום ו- 0.1% דטרגנט. הקריפטה סומן עם נוגדנים polyclonal ninein הארנב (Pep3, ראה גם התייחסות8, אדום), עכבר E-קדהרין monoclonal נוגדנים (ירוק), מוכתם דאפי (כחול). התמונה הפוכה ערוץ אחד מציגה ninein בלבד. התמונה מציגה אולם תת-קרקעי שהשתמר היטב עם E-קדהרין חושף את קווי המתאר של תאים בודדים, ninein מרוכזת בשעה centrosomes הפסגה. זה מרמז על חדירה של מקבע, נוגדנים, ושימור antigenicity. סרגל קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 6
    איור 6: תא צורב, קיבוע ופיתוח חיסונית-תיוג של מבודדים organoids. (א) שלב בסה כ מציג בשלבים שונים של פיתוח תא צורב של אגרגטים תא כדי ציסטה עם באד חניכה, מלא תמונות חדות הקימו organoids עם תחומים התת-קרקעי, סיסי.(B–F) קונאפוקלית מקטעים אופטי דרך organoids מבודד מן המרתף מטריצה באמצעות פתרון שחזור התא ב 4 ° C (10 דקות) ואחריו יציבות פורמלדהיד/מתנול, כביסה ב- PBS המכיל סרום עז 10% ו- 0.1% דטרגנט, חסימה ב- PBS המכיל 10% עיזים סרום, 0.1% דטרגנט, ולקרוא חיסונית-microtubules, β-catenin של EB1. (B) תא צורב ציסטה עם תוויות עבור microtubules (כחול) וβ-catenin (אדום) חשיפת microtubule טוב שימור ולקרוא בתאים רוב. (ג) apico-הבזליים microtubules ברורים ניכרות בתאי אפיתל מוגדלת אלה מן ציסטה תא צורב. (ד) חלוקת תאים עם תוויות עבור microtubules מציג הצירים כולל microtubules האסטרלי (דינאמי) (חץ). (E, F) תחום סיסי (E) ואזורים קריפטה תחום (F) תא צורב מציג כמה EB1 תיוג לאורך השבכה של יציבה microtubules, ובמיוחד סיסי, בעוד מעט מאוד שביטים EB1 נראים אפילו בתוך הקריפטה הבזליים רומז הדינמיקה microtubules לא נשמרו. גודל ברים = μm 20 (א); Μm 2 (ד); 5 μm (B, C, E-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 7
    איור 7: Organoids קבוע בתוך המטריצה במרתף של פורמלדהיד/מתנול ומתויגים חיסונית-microtubules, ninein. קטעים אופטי קונאפוקלית של organoids קבוע פורמלדהיד/מתנול, שטף חסום ב- PBS המכיל סרום עז 10% ו- 0.1% דטרגנט ו תווית תוך שמירה על המטריצה במרתף. (A–C) תא צורב ציסטה עם התווית microtubule (ירוק), ninein (Pep3; הפניה8, אדום) צבעונית עם דאפי (כחול) מציג את התמונה הממוזגת א' ו הפוך תמונות ערוץ אחד עבור microtubules (B), ninein (ג). התמונות להראות microtubules apico-הבזליים ולוקליזציה ninein הפסגה, רומז שימור מבני טוב מאוד תא צורב, חדירה של נוגדנים, כמו גם ניקוי של נוגדנים לא מאוגד. (D, E) תא צורב עם פיתוח קריפטה קבוע ומתויגים לעיל ושימור שוב מראה מצוין מבניים, תיוג ניקוי של נוגדנים. ברורים microtubules הבזליים-apico ו- n הפסגה-MTOC לוקליזציה ninein הוא ניכר המסומן בתמונה מוגדלת (E) של האזור מסגרת ברה. גודל ברים = 10 μm (י-ם); 5 μm (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 8
    איור 8: Organoids קבוע בתוך המטריצה במרתף ב מתנול ומתויגים חיסונית-microtubules, EB1. קטעים אופטי קונאפוקלית של organoids קבוע מתנול, שטף חסום ב- PBS המכיל סרום עז 10% ו- 0.1% דטרגנט ו שכותרתו, תוך שמירה על המטריצה במרתף. ציסטה (א) תחום מ תא צורב מפותחת עם תוויות ארנב polyclonal α-טובולין (אדום) ועכבר monoclonal נוגדנים EB1 (ירוק) מציג apico-הבזליים microtubules, הצירים (חץ) שני תאים החלוקה, שביטים EB1 נפרדים. במלכודות של נוגדנים EB1 לא מאוגד ניכרת. עם זאת, שימור מבנים טובה ולקרוא microtubules, EB1 הוא ציין. הנוכחות של שביטים EB1 מרמז כי microtubules דינמי נשתמרו (, ' היפוך '). (B) Inverted תמונה של תא צורב ציסטה region מציג את α-טובולין נוגדן תיוג עם נוגדנים ניכר לכוד בתוך המטריצה המרתף שמסביב (חץ). גודל ברים = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 9
    איור 9: Organoids קבוע בתוך המטריצה מרתף 1% PFA ומתויגים חיסונית-Lgr5 ו CD24. קטעים אופטי קונאפוקלית של organoids קבוע בתוך המטריצה מרתף 1% מחברים ב- PBS המכילה אבקת 0.1%, לרחוץ ב- PBS עם סרום עז 1% ו- 0.1% דטרגנט, ומוענקת נוגדנים נגד Lgr5 CD24. (A, B) גומחת תאי גזע בתוך קבוצת מחשבים קריפטה מציג תאי Paneth חיובי עבור CD24 (אדום). התמונות חדות קונאפוקלית ושלב מוזגו א'. B מראה ערוץ יחיד של CD24 תיוג. (ג) אזור תאי הגזע בתוך תחום קריפטה מציג תא גזע Lrg5 חיובי. גודל ברים = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Table 1
    טבלה 1: ציר הזמן של בידוד הקריפטה ו villi במעיים קטן, קיבעון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Discussion

    בידוד של רקמת המעי
    בידוד של כוכים קטנים במעיים, villi כוכים שטיפת המעי הגס כרוך חשיפת פני השטח הרירית, טיפול עם EDTA פתרון כדי לשחרר תא, fractionation (רועד) אנשי צנטריפוגה. פרוטוקול בידוד הציג מעיים villi/קריפטה שונתה. Belshaw et al. , וייטהד. et al. 17 , 18

    חשיפת השטח הרירית
    אנחנו ניסויים עם מספר גישות לחשוף את השטח הרירית של מערכת העיכול בפיתוח של הליך זה. בגישה הקלאסית היא אוורט (להפוך מבפנים החוצה) ברכבת התחתית, בדרך כלל בקטעים כ-100 מ מ ארוך, באמצעות מוט מתכת שנלכדו בקיפול של הרקמה על קצה אחד ואז רכבת הנותרים החליקה על צינור19. עבור העכבר רקמות, אידיאלי מוט מתכת (2.4 מ מ קוטר) עם קצוות מעוגלים. גישה זו יש את היתרון של הרחבת השטח הרירית המאפשר גישה טובה יותר PBS ו- EDTA. אנו בתחילה נעשה שימוש בגישה זו אך עבר ל חיתוך הצינור לתוך אורכים קצרים (כ 5 ס מ) ופתיחת כל מקטע עם נקרע מספריים. בזמן זה הוכיח יותר קל. גישה זו מתאימה רק אם המעיים כמה נדרשים; אבל אם בעלי החיים היו להיות בשימוש ניסוי ואז התקן בנוי למטרה עבור חיתוך פתח הצינור longitudinally, כפי שתואר על ידי. Yoneda et al. 14 יהיה יעיל יותר.

    ניתוק villi, כוכים משכבת שרירים
    בתחילה השתמשנו 3 מ מ EDTA ב- PBS ושעות ארוכות יחסית דגירה של עד 60 דקות לשחרר את השטח הרירית מ שבבסיס הרקמות17,18. בריכוז זה של EDTA מצאנו שזמן הדגירה של 30 דקות היה מספיק לשחרר כוכים מן המעי הגס העכבר. עם זאת, עבור הבידוד קריפטה/סיסי המעי הדק ניסינו באמצעות EDTA מרוכז יותר למשך זמן קצר יותר, שהוכחו גישה יעילה. כל העבודה שלאחר מכן נערך עם רקמת חילוץ באמצעות הטכניקה EDTA 30 מ מ, יצירת שברים הרלוונטיים villi או כוכים. עבור כוכים, נשקיע בדרך כלל שברים 3-5 לפני תיקון אך חשוב לבדוק אם הם שברים המתאים גם התזמונים יהיה תלוי במספר גורמים כגון מיקום לאורך צינור העיכול, הגיל של העכבר, דלקת, דיאטה הקודם , ועוד באופן דומה, משך הזמן הרקמה צריך להיות מזועזע בעקבות הטיפול EDTA יעיל עשוי להשתנות בתנאים שונים. התוצאה היא רקמה מבודדת שברים המכיל תערובת של villi כוכים או בעיקר villi או כוכים (איור 2). מאחר שאין שום villi במעי הגס, החילוץ קריפטה ייתכן השגה בצעד אחד ע י ניעור הרקמה בצינור ב-30 s. השברים האלה ואז ניתן לתקן ולעבד עבור תיוג חיסונית.

    בידוד של המעי organoids חברת מטריקס במרתף
    בידוד של organoids מן המרתף מטריקס כיפות יכולה להיות מושגת באמצעות פתרון שחזור התא. הפתרון עובד על-ידי depolymerizing המטריקס המרתף וג'ל אבל את הטמפרטורה שצריך 2-8 ° C. הערה של זהירות היא כי microtubules דינמי ייתכן לא יישמרו. לפיכך, עבור תיוג חיסונית של microtubules דינמי ו + טיפים כגון התא EBs, ההתאוששות מן המרתף מטריקס לפני קיבוע לא מומלץ. עם זאת, רוב microtubules בתאים תא צורב המבדילים יציבים יחסית, אלה נשתמרו (איור 6). זה גם פעלה היטב חיסונית-תיוג של חלבונים centrosomal, מהחיבור, כמו גם סמנים התא.

    קיבוע פרוטוקולים
    פורמלדהיד (טרי זני PFA) הוא cross-links מקבע יחסית מהירה אקטינג צורות הפיך ועובד 4% כדורגלן טוב לדוגמה, תיוג חיסונית microtubules, גמא-טובולין, צביעת חוטים אקטין עם Phalloidin. לדלל יותר מחברים פתרונות כגון % 1 פעלה היטב חיסונית-תיוג לדוגמה, עם תאי גזע סמנים Lgr5 ו- Paneth תא הסמן CD24 בתוך גומחת תאי גזע התת-קרקעי, בעוד ריכוז גבוה של מחברים לא פעלה.

    התוספת של גלוטראלדהיד נותן יותר שימור microtubules את הקיבעון שנקרא PHEMO, אשר מורכב של תערובת של 3.7% מחברים, גלוטראלדהיד 0.05% ו- 0.5% אבקת PHEMO מאגר (צינורות 68 מ מ, 25 מ מ HEPES, 15 מ מ EGTA ו- 3 מ מ MgCl2)2 נותן מעולה לשימור microtubules מבלי להתפשר על antigenicity. זה עובד גם טוב עבור תיוג חיסונית גמא-טובולין, β-catenin, ו- E-קדהרין צביעת חוטים אקטין עם phalloidin. עם זאת, הרקמה 3D ובתרבויות תא צורב, הקיבעון PHEMO הפיק תוצאות לא עקביות, ולכן לא נעשה שימוש.

    מתנול הוא מקבע קרישה נותן חדירה טובה יחסית, נוטה לשמר את antigenicity. קיבוע עם 100% מתנול (-20 ° C) מציג כמה הצטמקות, נותן שימור מורפולוגיה מתון, ועובד microtubules, + טיפים, נוגדנים centrosomal רבים כולל ninein תרביות תאים 2D. עם זאת, כמה organoids התמוטט כאשר משתמשים בשיטה זו קיבעון. בנוסף, חדירה של נוגדנים דרך כל כוכים, villi או organoids היה בתחילה בעיה אך התוספת של 0.1% סבון שטיפת פתרון, כביסה ממושך השיגו תוצאות טובות יותר.

    שילוב של פורמלדהיד מתנול היה בשימוש בעבר על ידי רוג'רס. et al. 20 EB1 חיסונית תווית ב דרוזופילה. פרוטוקול קיבוע המבוססת על תערובת של פורמלדהיד, מתנול לכן פותחה עבור רקמת המעי ו- organoids מבוסס על 3% מתנול פורמלדהיד ו- 97% מקורר ל-20 ° C, אך משמיט את 5 מ מ סודיום קרבונט מעירוב ששימש רוג'רס ואח. 20 . בנוסף, דגימות היו קבועות במקפיא ב-20 ° C. זה עבד במיוחד בשביל חיסונית-תיוג + טיפים, כגון קליפ-170 ואת EBs, אבל גם הוכיחו מעולה עבור תיקון ולקרוא על-ידי חיסונית microtubules ואני אקטין בתוך רקמת ו 3D organoids. ברור היה טוב מאוד לשימור מבנים, antigenicity השתמר מספר חלבונים cytoskeletal ומשויך, כמו גם חלבונים centrosomal גמא-טובולין ו ninein, למרות תיוג עבור ninein עבד עקבי יותר עם מתנול קיבוע.

    Disclosures

    המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

    Acknowledgments

    המחברים תודה פול תומאס מיקרוסקופ ייעוץ וסיוע. עבודה זו מעורב כאן נתמכה על ידי BBSRC (מענק. לא. BB/J009040/1 M.M.M., T.W.).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537-500ML washing and PFA
    Cell Recovery Solution Corning 354253 isolate organoids
    lobind microcentrifuge tubes Eppendorf 30108116 prevent cells sticking
    0.5 M EDTA solution, pH 8.0 Sigma 03690-100ML Crypt isolation
    70 μm cell strainer Fisher Scientific 11517532 Isolate crypts from villi
    Triton X-100 Sigma T8787 detergent
    goat serum Sigma G6767 blocking agent
    Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma used as non-stick agent
    Paraformaldehyde, 4% in PBS Alfa Aesar J61899 fixative
    Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) Sigma F8775 used as fixative
    Methanol 99.9% Analytical grade Fisher M/4000/17 used as fixative
    MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit Maxvision
    Biosciences    		 MF01-S commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling
    Rotator SB2 or SB3 Stuart microcentrifuge tube rotator
    Sodium citrate antigen retrieval
    Hydromount National Diagnostics HS-106 mountant
    DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802 anti-fade agent
    Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges Clarity N/C366 slides
    Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm Clarity NQS13/2250 coverslips
    Matrigel Corning 356231 Basement matrix for 3D organoid culture
    50 mL conical tubes Sarstedt 62.547.254 for processing tissue/organoids
    15 mL conical tubes Sarstedt 62.554.502 for processing tissue/organoids
    1.5 mL LoBind tubes Eppendorf 30108051 for isolated organoids
    Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181 primary antibody 1:500
    Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody Abcam ab6160 primary antibody 1:100
    Rabbit alpha-tubulin antibody Abcam ab15246 primary antibody 1:100
    Rabbit anti-beta-actin antibody Abcam ab8227 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal anti-p150Glued antibody BD Bioscience 610473/4 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal EB3KT36 antibody Abcam ab53360 primary antibody 1:200
    Mouse monoclonal EB1 antibody BD Bioscience 610535 primary antibody 1:200
    Rabbit anti-Lgr5 antibody Abgent AP2745d primary antibody 1:100
    Dylight anti-rat 488 Jackson 112545167 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-mouse 488 Jackson ST115545166 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-rabbit 647 Jackson 111605144 seconday antibody 1:400

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).
    2. Bellett, G., et al. Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).
    3. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells. J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).
    4. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila. J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).
    5. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Curr Opin Cell Biol. , (2016).
    6. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
    7. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
    8. Goldspink, D. A., et al. Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres. Open Biol. 7 (2), (2017).
    9. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. Elife. 5, (2016).
    10. Young, M., Reed, K. R. Organoids as a Model for Colorectal Cancer. Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).
    11. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
    12. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
    13. Goldspink, D. A., et al. The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation. Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).
    14. Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J Vis Exp. (105), e53042 (2015).
    15. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
    16. Coquelle, F. M., et al. LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway. Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).
    17. Belshaw, N. J., et al. Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa. Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).
    18. Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
    19. Hamilton, K. L., Butt, A. G. Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice. Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).
    20. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).

    Tags

    ביולוגיה התפתחותית גיליון 130 תא צורב המעי שלד התא microtubules EB1 סרטון-170 ninein centrosome Lgr5 epithelia
    חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal <em>Vivo לשעבר</em> רקמת המעי ו 3D <em>במבחנה</em> Organoids מעיים
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Goldspink, D. A., Matthews, Z. J.,… More

    Goldspink, D. A., Matthews, Z. J., Lund, E. K., Wileman, T., Mogensen, M. M. Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56662, doi:10.3791/56662 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter