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Developmental Biology

bliss-फ्लोरोसेंट लेबलिंग के Microtubules और Centrosomal प्रोटीन में पूर्व Vivo आंत्र ऊतक और 3 डी इन विट्रो आंत्र Organoids

Published: December 13, 2017 doi: 10.3791/56662
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1School of Biological Sciences, University of East Anglia, 2Norwich Medical School, University of East Anglia

Summary

हम vivo ऊतक में से आंतों 3d संरचनाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान और इन विट्रो तहखाने मैट्रिक्स एंबेडेड organoids, और विस्तार से अलग निर्धारण और दाग प्रोटोकॉल microtubule के bliss-लेबलिंग के लिए अनुकूलित, centrosomal, और जंक्शन प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्टेम सेल प्रोटीन Lgr5 सहित सेल मार्करों ।

Abstract

इन विट्रो organoids में 3 डी के आगमन कि vivo ऊतक वास्तुकला और morphogenesis में नकल बहुत सेल और विकास जीव विज्ञान में प्रमुख जैविक प्रश्नों का अध्ययन करने की क्षमता को उंनत किया है । इसके अलावा, जीन संपादन और वायरल जीन वितरण में हाल ही में तकनीकी प्रगति के साथ एक साथ organoids को चिकित्सा अनुसंधान और रोगों के उपचार के लिए नई दवाओं के विकास के अग्रिम वादों । Organoids तहखाने मैट्रिक्स में इन विट्रो में उगाया व्यवहार और विभिंन प्रोटीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली मॉडल सिस्टम प्रदान करते है और अच्छी तरह से रहने के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट के इमेजिंग-टैग प्रोटीन । हालांकि, अभिव्यक्ति और पूर्व vivo ऊतक में अंतर्जात प्रोटीन की स्थानीयकरण की स्थापना और इन विट्रो organoids में टैग प्रोटीन के व्यवहार को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस अंत करने के लिए हम विकसित और संशोधित ऊतक अलगाव, निर्धारण, और bliss-लेबलिंग प्रोटोकॉल microtubules, centrosomal के स्थानीयकरण के लिए, और पूर्व vivo आंत्र ऊतक में और में जुड़े प्रोटीन इन विट्रो आंत्र organoids. उद्देश्य निर्धारण के लिए था organoids/ऊतक के 3 डी वास्तुकला के संरक्षण जबकि यह भी एंटीबॉडी antigenicity के संरक्षण और अच्छी पैठ और निर्धारण और एंटीबॉडी की मंजूरी सक्षम करने के लिए । सभी लेकिन स्थिर microtubules ठंड depolymerizes के संपर्क में है और यह एक महत्वपूर्ण कारक था जब विभिंन प्रोटोकॉल को संशोधित । हमने पाया है कि ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) एकाग्रता 3 मिमी से 30 मिमी की वृद्धि की छोटी आंत में विल्ली और तहखाने की कुशल टुकड़ी दी जबकि 3 मिमी EDTA बृहदांत्र तहखाने के लिए पर्याप्त था । विकसित formaldehyde/मेथनॉल निर्धारण प्रोटोकॉल ने बहुत अच्छा संरचनात्मक संरक्षण दिया जबकि microtubules, actin, और एंड-बाइंडिंग (EB) प्रोटीन के प्रभावी लेबलिंग के लिए antigenicity का संरक्षण भी किया । यह भी centrosomal प्रोटीन ninein के लिए काम किया हालांकि मेथनॉल प्रोटोकॉल अधिक लगातार काम किया । हम आगे की स्थापना की है कि निर्धारण और bliss-microtubules के लेबल और संबंधित प्रोटीन से अलग organoids के साथ प्राप्त किया जा सकता है या तहखाने मैट्रिक्स के भीतर शेष ।

Introduction

apico के साथ epithelia के गठन-बेसल ध्रुवीयता विकास में एक मौलिक प्रक्रिया है और microtubules और centrosomal प्रोटीन के एक नाटकीय पुनर्गठन शामिल है । एक रेडियल microtubule सरणी एक केंद्र स्थित centrosomal microtubule आयोजन केंद्र (MTOC) से उत्पंन कई पशु कोशिकाओं में प्रमुख है और यह अच्छी तरह से अपेक्षाकृत सपाट कोशिकाओं के लिए अनुकूल है । इसके विपरीत, ऐसी आंत के उन के रूप में स्तंभ उपकला कोशिकाओं, गैर रेडियल transcellular microtubule arrays कि बेहतर आकार और इन कोशिकाओं के विशेष कार्यों का समर्थन इकट्ठा । microtubules के इस नाटकीय पुनर्गठन एपेक्स और शिखर गैर centrosomal MTOCs (n-MTOCs) के गठन, जो anchorage transcellular के microtubules के लिए जिंमेदार हो जाता है के लिए जा centrosome द्वारा हासिल की है1,2 , 3 , 4 , 5.

उपकला भेदभाव और संबद्ध microtubule पुनर्गठन के हमारे ज्ञान की बहुत 2d की जांच से आ गया है इन विट्रो सेल परतों है कि vivo ऊतक वास्तुकला में प्रदर्शित नहीं करते । इन विट्रो organoid संस्कृतियों में 3 डी का विकास, चालाक और सह कार्यकर्ता द्वारा बीड़ा उठाया है6, एक प्रमुख तकनीकी उंनति का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में वे vivo वास्तुकला और विकास में नकल । उपकला विभेद का एक पदानुक्रम आंत में स्पष्ट है; तहखाने के तल पर स्टेम कोशिकाओं अपरिपक्व पारगमन बढ़ाना कोशिकाओं है कि पैदा और धीरे अलग अंतर के रूप में वे छोटे आंत्र अंकुर या बृहदांत्र सतह, जहां वे पूरी तरह से किया जा रहा से पहले विभेदित पर तहखाने प्रवास को जंम दे लुमेन7में बहाया । महत्वपूर्ण बात, इस आंत्र organoids में दोहराया है, जहां स्टेम सेल आला से कोशिकाओं पैदा बनाने अल्सर है कि बाद में स्टेम सेल के साथ नीचे और विभेदन धीरे पुटी क्षेत्र की दिशा में प्रगति में तहखाने की तरह पैदा होता है, जो8तरह अंकुर बन जाता है । आंतों organoid इसलिए का प्रतिनिधित्व करता है एक शक्तिशाली मॉडल का अध्ययन करने के लिए न केवल microtubule और centrosomal पुनर्गठन के दौरान उपकला भेदभाव लेकिन कई अन्य प्रोटीन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में दवाओं और भोजन की स्क्रीनिंग के लिए एक आदर्श मंच प्रदान संभावित चिकित्सीय लाभ के यौगिकों9,10.

Organoids अच्छी तरह से रहने के लिए अनुकूल है फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन की इमेजिंग और दोनों दस्तक में और नॉक आउट Organoids CRISPR/Cas9 जीन संपादन11,12का उपयोग कर उत्पंन किया जा सकता है । हालांकि, अंतर्जात प्रोटीन की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण की स्थापना के लिए अध्ययन किया जा करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से टैग प्रोटीन के व्यवहार को सत्यापित करने के लिए । bliss-लेबलिंग 3d organoids तहखाने मैट्रिक्स या पूर्व vivo में उगाया पृथक ऊतक 2 डी में संस्कृति व्यंजन में उगाई कोशिकाओं से अधिक जटिल है । निर्धारण प्रोटोकॉल organoids के नाजुक 3d वास्तुकला के संरक्षण जबकि अभी भी एंटीबॉडी antigenicity (यानी, बाध्यकारी एंटीबॉडी के लिए epitopes) संरक्षण की जरूरत है । उदाहरण के लिए, 4% paraformaldehyde (पीएफए) आमतौर पर एक निर्धारण के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन जब यह एक अपेक्षाकृत तेजी से अभिनय निर्धारण है और अच्छा रूपात्मक संरक्षण देता है, हमारे अनुभव में यह antigenicity के नुकसान में अक्सर परिणाम है और कई के लिए उपयुक्त नहीं है centrosomal एंटीबॉडी. 3d संरचनाओं और ऊतक घुसना करने के लिए निर्धारण और एंटीबॉडी की क्षमता पर भी विचार किया जाना चाहिए । इस अंत करने के लिए, हम संशोधित किया है और ऊतक अलगाव और अप्रत्यक्ष bliss-3 डी के लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल का विकास इन विट्रो organoids और पूर्व vivo अलग आंत्र ऊतक । हम वर्णन कैसे छोटे आंत्र तहखाना और विल्ली और बृहदांत्र ऊतक अलग करने के लिए, और एक विकल्प के रूप में 3d organoids के अलगाव के लिए फिक्सिंग और bliss के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल-लेबलिंग तहखाने मैट्रिक्स के भीतर । हम microtubules और centrosomal प्रोटीन के bliss-लेबलिंग के लिए तीन वैकल्पिक निर्धारण प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जैसे ninein, और microtubule प्लस-एंड ट्रैकिंग प्रोटीन्स (+ टिप्स), जैसे EB प्रोटीन्स और क्लिप-१७० (देखें भी8संदर्भ, 13). हम भी पेशेवरों और प्रत्येक प्रोटोकॉल के साथ जुड़े विपक्ष पर चर्चा ।

Protocol

सभी विधियां यहां वर्णित पूर्व एंग्लिया के संस्थागत लाइसेंस दिशानिर्देश विश्वविद्यालय के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. आंत्र ऊतक के अलगाव

  1. bliss के लिए कालोनी तहखाना के अलगाव-लेबलिंग ( चित्र 1देखें, योजनाबद्ध)
    1. माउस को Euthanize (कं2 asphyxiation का प्रयोग करके) और कोलन कैंची और चिमटी14के साथ (caecum और निकालने caudally पर शुरुआत) को हटा दें ।
    2. पिपेट रबर बल्ब के साथ एक गिलास का उपयोग कर फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ बृहदांत्र की सामग्री फ्लश । पंजाब: सोडियम क्लोराइड (८.० ग्राम/एल), पोटेशियम क्लोराइड (०.२ ग्राम/एल), disodium हाइड्रोजन फॉस्फेट (१.१५ जी/एल), और पोटेशियम dihydrogen फॉस्फेट (०.२ g/एल), पीएच ७.३ पर ।
    3. एक धातु रॉड का प्रयोग (२.४ mm व्यास) या एक गिलास पिपेट के अंत में, बृहदांत्र ट्यूब के एक छोर पकड़ जबकि धीरे रॉड पर ऊतक फिसलने/पिपेट इस प्रकार बृहदांत्र ऊतक everting ताकि उपकला बाहर पर अब है ।
      नोट: यदि यह संभव नहीं है तो 5 मिमी टुकड़ों में कैंची और टुकड़ा के साथ बृहदांत्र खोलें ।
    4. umbilicus बृहदांत्र या टुकड़े एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए पंजाब के ४० मिलीलीटर युक्त हस्तांतरण ।
    5. ट्यूब उलटा कई बार आगे आंत्र सामग्री, बलगम को हटाने के लिए, आदि.
    6. पंजाब में 3 मिमी EDTA के ४० मिलीलीटर के लिए बृहदांत्र/टुकड़े स्थानांतरण और कमरे के तापमान (आरटी) में 15 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: पतला ०.५ मीटर EDTA पीएच ८.० शेयर पंजाबियों के साथ ।
    7. हिला बलगम को हटाने के लिए और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब पंजाबियों में 3 मिमी EDTA के ताजा ४० मिलीलीटर युक्त के लिए बृहदांत्र/ आरटी पर ३५ मिनट के लिए मशीन ।
    8. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पंजाब के 10 मिलीलीटर के लिए बृहदांत्र/टुकड़े हस्तांतरण और 30 एस के लिए तेजी से हिला तहखाने (तहखाना अंश) जारी करने के लिए ।
    9. ट्यूब से बृहदांत्र/टुकड़ों को निकालें और 3 मिमी EDTA में वापस जगह के मामले में और अलगाव की आवश्यकता है । 5 मिनट के लिए ३०० x g पर शेष तहखाना अंश केंद्रापसारक ।
    10. supernatant के 5 मिलीलीटर निकालें और शेष 5 मिलीलीटर मात्रा में तहखाना गोली reसस्पेंड ।
    11. एक stereomicroscope के तहत ज़ूम के साथ निरीक्षण (५०-100X आवर्धन) बृहदांत्र तहखाने की उपस्थिति के लिए जांच करने के लिए ।
      नोट: यदि कोई तहखाना मौजूद है तो एक और 30 मिनट के लिए पंजाब में 3 मिमी EDTA में बृहदांत्र मशीन/फिर दोहराएं कदम 1.1.8-1.1.11 ।
    12. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर तहखाना अंश केंद्रापसारक ।
    13. एक तहखाना गोली प्राप्त करने के लिए सभी supernatant निकालें और (धारा 3) निर्धारण करने के लिए तुरंत आगे बढ़ना ।
  2. bliss-लेबलिंग के लिए छोटे आंत्र तहखाना और विल्ली का अलगाव (चित्र 2)
    1. Euthanize माउस (सह2 asphyxiation का उपयोग करके) और छोटी आंत (समीपस्थ ग्रहणी को टर्मिनल लघ्वान्त्र) को हटाने के साथ-साथ कैंची और चिमटी14।
      नोट: छोटी आंत के विभिंन वर्गों को देखने के लिए तो इस स्तर पर अलग और इलाज अलग से । किसी प्रवाह आरेख और समयावधि के लिए चित्र 1 और तालिका 1 देखें ।
    2. रबर बल्ब के साथ एक गिलास पिपेट का उपयोग कर पंजाब के साथ छोटी आंत की सामग्री फ्लश ।
    3. छोटी आंत को एक पेट्री डिश में 15 मिलीलीटर पंजाबियों में काट-छाँट कर काटें ।
    4. श्लैष्मिक सतह को नुकसान न पहुंचाते हुए चमकदार सामग्री को हटाने के लिए पंजाब में आंत को धीरे से धोएं । एक ताजा पेट्री पकवान और दोहराने पंजाबियों धोने के लिए ऊतक स्थानांतरण ।
    5. 3-5 mm टुकड़ों में आंत में कटौती और एक १०० mm पेट्री डिश में 30 mm EDTA के 15 मिलीलीटर और आरटी में 5 मिनट के लिए मशीन से युक्त के लिए स्थानांतरण । वैकल्पिक रूप से 30 मिनट के लिए पंजाब में 3 मिमी EDTA में मशीन ।
    6. अंश 1 (विल्ली अलगाव): एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पंजाब के 10 मिलीलीटर में आंत्र टुकड़े हस्तांतरण, 10 एस के लिए जोरदार हिला, और एक १०० मिमी पेट्री डिश में डालना । एक stereomicroscope के तहत पृथक विल्ली के लिए भिंन की जांच करें । इस स्तर पर, ज्यादातर विल्ली मौजूद होना चाहिए, लेकिन यह अलगाव के बीच भिंन हो सकते हैं ।
      नोट: प्लास्टिक से चिपके हुए अलग विल्ली/तहखाने को रोकने के लिए, पेट्री व्यंजन और संग्रह ट्यूबों भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूर्व-लेपित होना चाहिए । बर्तन और/या ट्यूबों में FBS डालो और तुरंत इसे हटा दें । प्रत्येक अंश के लिए समय मार्गदर्शिकाओं के लिए तालिका 1 देखें ।
    7. वापस आंतों टुकड़ों में 30 mM EDTA में स्थानांतरण और 5 मिन के लिए मशीन । इस मशीन के दौरान, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अंश 1 इकट्ठा (FBS के साथ कोट) और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    8. अंश 2: एक ५० एमएल शंकु ट्यूब पंजाब के 10 मिलीलीटर युक्त, 20 एस के लिए जोरदार हिला, और फिर एक १०० mm पेट्री डिश में डालने के लिए आंत्र टुकड़े स्थानांतरण । माइक्रोस्कोप के तहत अंश की जाँच करें । आमतौर पर, इस स्तर पर विल्ली और तहखाने की एक मिश्रित संस्कृति मौजूद है (चित्र 2a) ।
    9. एक और 5 मिनट के लिए पंजाब में 30 मिमी EDTA में आंत्र टुकड़े वापस स्थानांतरण और मशीन । इस मशीन के दौरान, गोली एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अंश 2 (FBS के साथ कोट) 5 मिनट के लिए ३०० x जी में । गोली परेशान बिना और (चरण 3) के लिए तुरंत आगे बढ़ना-भागों से supernatant निकालें 1 और 2 ।
    10. 3 अंश (तहखाना अलगाव): ५० मिलीलीटर ट्यूब में पंजाब के 10 मिलीलीटर में आंत्र टुकड़े हस्तांतरण, 20 एस के लिए शेक, और एक १०० mm पेट्री डिश में डालना । माइक्रोस्कोप के तहत अंश की जाँच करें । इस स्तर पर, अंश मुख्य रूप से तहखाना (चित्र बी) शामिल होंगे ।
    11. 4 अंश: पंजाब के 10 मिलीलीटर में आंत्र टुकड़े हस्तांतरण, 20 एस के लिए शेक, और एक १०० mm पेट्री डिश में डालना । माइक्रोस्कोप के तहत अंश की जाँच करें । इस स्तर पर केवल तहखाने मौजूद होना चाहिए ।
    12. 5 अंश: पंजाब के 10 मिलीलीटर में आंत्र टुकड़े हस्तांतरण, 20 एस के लिए शेक, और एक १०० mm पेट्री डिश में डालना । माइक्रोस्कोप के तहत अंश की जाँच करें । आमतौर पर, इस स्तर पर, बहुत कुछ तहखाने निकाले जाते हैं । कुछ तहखाने से अधिक निकाले जाते हैं, तो एक 6गु अंश के साथ जारी रखें ।
      नोट: यदि एक शुद्ध तहखाना जनसंख्या (उदाहरण के लिए, organoid पीढ़ी के लिए) वांछित है, तो एक ७० µm सेल छलनी का उपयोग करने के लिए तहखाना-समृद्ध अंश से किसी भी बरकरार विल्ली को दूर ।
    13. अलग 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में 3-5 भागों लीजिए और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    14. 3-5 भागों के छर्रों की जाँच करें और छर्रों परेशान बिना supernatants हटाने के लिए, और (धारा 3) निर्धारण करने के लिए तुरंत आगे बढ़ना.

2.24-well प्लेट्स में तहखाने मैट्रिक्स गुंबदों से आंत्र Organoids का अलगाव

नोट: तहखाने मैट्रिक्स गुंबदों के भीतर organoids के गठन में12कहीं वर्णित किया गया है ।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार तहखाने मैट्रिक्स गुंबद के साथ कोट कुओं ।
  2. पंजाब के ५०० µ के साथ तहखाने मैट्रिक्स गुंबदों युक्त कुओं धो लो ।
  3. जोड़ें ठंड २५० µ एल सेल वसूली समाधान (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए एक अच्छी तरह से ( सामग्री की तालिकादेखें).
    नोट: शीत कोशिका वसूली समाधान सभी लेकिन स्थिर microtubules depolymerize होगा ।
  4. स्क्रैप तहखाने मैट्रिक्स एक P1000 micropipette का उपयोग गुंबदों और ध्यान से पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से गोलमाल करने के लिए और प्लास्टिक से तहखाने मैट्रिक्स को हटा दें ।
  5. १.५ मिलीलीटर कम बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूबों में supernatant लीजिए ।
  6. उलटा १.५ मिलीलीटर कम बाध्यकारी ट्यूब कई बार और माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें कि क्या organoids अलग किया गया है और मुक्त चलती है और नहीं झुरमुट में । एक stereomicroscope के तहत ट्यूब पकड़ो और कम (50X) आवर्धन के तहत देखें ।
  7. आर टी पर 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा organoids गोली ।
  8. वसूली रिएजेंट निकालें और तुरंत निर्धारण (चरण 3) के लिए आगे बढ़ना ।

3. पृथक आंत्र ऊतक और Organoids के निर्धारण

  1. मेथनॉल निर्धारण
    1. अलग आंत्र तहखाना/अंकुर अंश में 10 मिलीलीटर और organoids में मेथनॉल के 1 मिलीलीटर-20 डिग्री सेल्सियस में reसस्पेंड ।
    2. तहखाने विल्ली/organoids में-20 ° c 15 मिनट के लिए एक फ्रीजर में और ट्यूब (ओं) हर 5 मिनट पलटना ।
    3. तहखाने विल्ली/organoids द्वारा 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली ।
    4. मेथनॉल निकालें और धोने समाधान जोड़ें (organoids के लिए 1 मिलीलीटर और अलग तहखाना/अंकुर अंश के लिए 10 मिलीलीटर) । धुलाई समाधान या तो 1% सीरम या ०.१% डिटर्जेंट और 1% सीरम के साथ पंजाब के साथ पंजाबियों से मिलकर हो सकता है ।
      नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही प्रजाति से सीरम का उपयोग करें. उदाहरण के लिए, यदि माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी में उत्पन्न किया गया तो बकरी सीरम का उपयोग करें.
    5. तुरंत, तहखाने/विल्ली/organoids १,००० x g पर 5 गोली के लिए मिनट के लिए ।
    6. धोने समाधान निकालें और नए सिरे से धोने समाधान में तहखाने/विल्ली/organoids reसस्पेंड ।
    7. 20 rpm को सेट गति के साथ एक ट्यूब रोटेटर पर रखें । 1 एच की कुल के लिए कोशिकाओं को धोने, तहखाने/विल्ली/organoids द्वारा (5 मिनट के लिए १,००० x g) हर 15 मिनट और धोने के समाधान की जगह गोली ।
      नोट: यदि एक ट्यूब रोटेटर उपलब्ध नहीं है तो अलग संस्कृतियों reसस्पेंड करने के लिए हर 5 मिनट मैंयुअल रूप से ट्यूबों पलटना ।
  2. Formaldehyde/मेथनॉल निर्धारण
    नोट: एक धुएं डाकू में fixatives और formaldehyde संभाल ।
    1. अलग तहखाना/विल्ली में 10 मिलीलीटर या organoids में 1 मिलीलीटर के-20 ° c निर्धारण समाधान (९.२ एमएल के ८०० µ एल के साथ formaldehyde समाधान) reसस्पेंड ।
    2. तहखाने को ठीक करें/विल्ली/organoids पर-20 ° c 15 मिनट के लिए एक फ्रीजर में और ट्यूब हर 5 मिनट पलटना ।
    3. तहखाने विल्ली/organoids द्वारा 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली ।
    4. formaldehyde/मेथनॉल निकालें और धोने समाधान जोड़ें (organoids के लिए 1 मिलीलीटर या अलग तहखाने के लिए 10 मिलीलीटर/अंकुर अंश) । धुलाई समाधान या तो 1% बकरी सीरम या पंजाब के साथ ०.१% डिटर्जेंट और 1% सीरम के साथ पंजाबियों से मिलकर हो सकता है ।
    5. 5 मिनट के लिए तहखाने विल्ली/organoids गोली करने के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. धोने समाधान निकालें और ताजा धुलाई समाधान में reसस्पेंड ।
    7. 20 rpm को सेट गति के साथ एक ट्यूब रोटेटर पर रखें । 1 एच की कुल के लिए कोशिकाओं को धोने, तहखाने/विल्ली/organoids द्वारा (5 मिनट के लिए १,००० x g) हर 15 मिनट और धोने के समाधान की जगह गोली ।
  3. पीएफए निर्धारण
    चेतावनी: पीएफए पाउडर और समाधान एक धुएं डाकू में नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    नोट: सबसे अधिक मामलों में 4% पीएफए पंजाब में प्रयोग किया जाता है लेकिन एंटीबॉडी antigenicity के संरक्षण पर निर्भर करता है, कम सांद्रता इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. अलग गोली तहखाना/विल्ली में 10 मिलीलीटर 4% पीएफए और आरटी पर 1 एच के लिए, और 1 मिलीलीटर 4% पीएफए में अलग छर्रों organoids और 30 मिनट के लिए मशीन को स्थगित । दोनों ही मामलों में ट्यूब (ओं) हर 10 मिनट पलटना ।
    2. तहखाने विल्ली/organoids द्वारा 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली ।
    3. पीएफए निकालें और धोने समाधान जोड़ें (organoids के लिए 1 मिलीलीटर और अलग तहखाने के लिए 10 मिलीलीटर/विल्ली) । धुलाई समाधान ०.१% डिटर्जेंट और 1% सीरम के साथ पंजाब के होते हैं ।
    4. १,००० पर 5 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक गोली तहखाना/विल्ली/organoids ।
    5. धोने समाधान निकालें और ताजा धुलाई समाधान में reसस्पेंड ।
    6. गति के साथ एक ट्यूब रोटेटर पर प्लेस 20 rpm के लिए सेट । 1 एच की कुल के लिए कोशिकाओं को धोने, तहखाने/विल्ली/organoids द्वारा (5 मिनट के लिए १,००० x g) हर 15 मिनट और धोने के समाधान की जगह गोली ।
      नोट: यदि एक ट्यूब रोटेटर उपलब्ध नहीं है तो अलग संस्कृतियों reसस्पेंड करने के लिए मैंयुअल रूप से हर 5 मिनट ट्यूब पलटना ।
    7. Antigen पुनर्प्राप्ति (वैकल्पिक चरण पीएफए निर्धारण के लिए अनुशंसित)
      1. तहखाने विल्ली/organoids द्वारा १,००० x g पर 5 मिनट के लिए और supernatant को दूर करने के लिए गोली ।
      2. 10 मिमी सोडियम साइट्रेट पीएच ६.० के 1-10 मिलीलीटर जोड़ें (८० ° c करने के लिए पूर्व गर्म) और 20 मिनट के लिए ८० ° c पर मशीन ।
      3. तहखाने विल्ली/organoids द्वारा १,००० x g पर 5 मिनट के लिए और supernatant को दूर करने के लिए गोली ।
      4. ताजा 10 मिमी सोडियम साइट्रेट पीएच ६.० के 1-10 मिलीलीटर जोड़ें (८० ° c करने के लिए पूर्व गर्म) और आर टी पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
      5. तहखाने विल्ली/organoids द्वारा १,००० x g पर 5 मिनट के लिए और supernatant को दूर करने के लिए गोली ।
      6. 1% सीरम के साथ 1-10 मिलीलीटर पंजाबियों में धो लें और एक और 3 बार तहखाने विल्ली/organoids द्वारा (5 मिनट के लिए १,००० x g) नए सिरे से धोएं समाधान जोड़ने से पहले गोली को दोहराने ।

4. कदम अवरुद्ध

  1. ब्लॉकिंग समाधान करें: पंजाब में 10% द्वितीयक एंटीबॉडी प्रजाति सीरम जोड़ें (वैकल्पिक: ०.१% डिटर्जेंट जोड़ें) ।
  2. तहखाने विल्ली/organoids द्वारा (5 मिनट के लिए १,००० x g) और supernatant को हटाने के लिए गोली ।
  3. आवश्यक नमूनों की संख्या के आधार पर ब्लॉकिंग समाधान की 5-10 मिलीलीटर जोड़ें (नीचे नोट देखें) । इस स्तर पर, तहखाना/विल्ली/organoids समाधान अलग-अलग ट्यूबों में विभाजित (१.५ मिलीलीटर कम प्रत्येक ट्यूब के साथ बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूबों ०.२-1 एमएल) विभिंन एंटीबॉडी के साथ धुंधला के लिए ।
    नोट: प्रत्येक पृथक तहखाना/विल्ली अंश 5-10 नमूने है कि गोली के आकार के आधार पर अलग लेबलिंग संयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता के बीच दे देंगे । आदर्श रूप में, 2-4 mm के बीच एक गोली का आकार प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक है ।
विभिन्न भागों तहखाने और विल्ली आसानी से पहचाना जा सकता है (चित्रा 2) के रूप में इस स्तर पर जोड़ा जा सकता है.
  • 1 एच के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर आरटी पर समाधान अवरुद्ध में मशीन ।

    • 5. प्राथमिक एंटीबॉडी मशीन

    1. प्राथमिक एंटीबॉडी पतला ( सामग्री की तालिकादेखें) में 10% सीरम और ०.१% डिटर्जेंट युक्त पंजाबियों । १०० के बीच २०० µ एल प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान microcentrifuge ट्यूब नमूना प्रति आवश्यक है ।
    2. हटाने (5 मिनट के लिए १,००० x g) द्वारा अवरोध समाधान निकालें ।
    3. तहखाने/विल्ली/organoid गोली प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में reसस्पेंड और 4 ° c में रात भर गर्मी एक ट्यूब रोटेटर (20 RPM) का उपयोग करने के लिए तहखाने/विल्ली/organoids निलंबन में रखने के लिए ।
    4. अगले दिन: नमूनों को वापस लाने के लिए आरटी पर 1 एच के लिए ट्यूब रोटेटर (20 rpm) ।
    5. (5 मिनट के लिए १,००० x g) द्वारा नमूना गोली और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें ।
    6. धोने समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और तहखाने/अंकुर/organoid छर्रों reसस्पेंड ।
    7. तुरंत (5 मिनट के लिए १,००० x g) द्वारा समाधान निकालें ।
    8. 1 मिलीलीटर ताजा धोने समाधान जोड़ें और 2 घंटे के लिए एक ट्यूब रोटेटर (20 rpm) पर कोशिकाओं स्पिन । के रूप में ५.७ चरण में हर 30 मिनट के द्वारा धो समाधान बदलें ।

    6. माध्यमिक एंटीबॉडी की मशीन

    1. माध्यमिक एंटीबॉडी पतला ( सामग्री की मेज) में 10% सीरम और ०.१% डिटर्जेंट के साथ पंजाबियों में देखें । माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के बारे में २०० µ एल microcentrifuge ट्यूब नमूना प्रति आवश्यक है ।
      नोट: अत्यधिक पार अवशोषित एंटीबॉडी माउस तहखाने/अंकुर/organoid में माध्यमिक एंटीबॉडी की प्रतिक्रिया को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    2. 5 मिनट के लिए तहखाने विल्ली/organoids गोली के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक और २०० माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के µ एल में छर्रों reसस्पेंड ।
    3. 1 एच के लिए आरटी पर एक ट्यूब रोटेटर (20 rpm) पर ट्यूबों स्पिन
    4. 5 मिनट के लिए तहखाने विल्ली/organoids गोली करने के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatants (गैर माध्यमिक एंटीबॉडी बाध्य) हटा दें ।
    5. धो समाधान में गोली reसस्पेंड और तुरंत 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक को तहखाने विल्ली/organoids गोली ।
    6. supernatant निकालें और ताजा धोने के समाधान के 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
    7. १.५-2 एच के लिए आरटी पर एक ट्यूब रोटेटर (20 rpm) पर स्पिन, धो समाधान हर 20-30 मिनट में पहले चरण ६.३-६.६ में वर्णित के रूप में बदल रहा है ।

    7. न्यूक्लियर दाग

    1. धो समाधान (निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार), जैसे DAPI या Hoechst में परमाणु दाग पतला । उदाहरण के लिए: DAPI स्टॉक समाधान (20 मिलीग्राम/एमएल) 1:10000 पतला है । स्टॉक समाधान aliquots में-20 डिग्री सेल्सियस रखा जा सकता है ।
    2. 5 मिनट के लिए तहखाने विल्ली/organoids गोली करने के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक और धोने समाधान निकालें ।
    3. परमाणु counterstain समाधान में गोली reसस्पेंड ।
    4. 10 मिनट के लिए आर टी पर एक ट्यूब रोटेटर (20 rpm) पर स्पिन ।
    5. 5 मिनट के लिए १,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक को तहखाने विल्ली/organoids गोली, परमाणु दाग समाधान निकालें, और धो समाधान में गोली reसस्पेंड ।
    6. 30-60 मिनट के लिए आर टी पर एक ट्यूब रोटेटर (20 rpm) पर स्पिन, धोने समाधान हर 10 मिनट बदल रहा है ।

    8. अलग तहखाने बढ़ते, विल्ली, और Organoids

    1. १,००० में 5 मिनट के लिए तहखाने विल्ली/organoids गोली और सभी धोने समाधान निकालने के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक ।
      नोट: यदि गोली फैलाता है, तो फिर से केंद्रापसारक ।
    2. हार्ड सेटिंग के 2 बूंदें गोली को antifade एजेंट के साथ बढ़ते मीडिया जोड़ें ।
    3. एक P200 micropipette के अंत में कटौती और ध्यान से बढ़ते मीडिया में गोली reसस्पेंड । बुलबुले पैदा करने से बचें ।
      नोट: पृथक organoid संस्कृतियों बहुत चिपचिपा रहे हैं; पूरी तरह से पुनर्स्थगित करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    4. micropipette का उपयोग करने के लिए बढ़ते मीडिया समाधान में तहखाना/विल्ली/organoids के मिश्रण हस्तांतरण, और एक खुर्दबीन स्लाइड के केंद्र के साथ एक पंक्ति में बांटना ।
      नोट: लाइन का उपयोग किया जा करने के लिए है कि कवर-ग्लास से अधिक समय नहीं होना चाहिए । एक stereomicroscope का उपयोग कर जांचें कि क्या तहखाने/विल्ली/organoids स्लाइड पर अच्छी तरह से फैले हुए है और नहीं झुरमुट ।
    5. ध्यान से शीर्ष पर एक आवरण गिलास जगह; बुलबुले पैदा करने से बचें ।
    6. एक स्लाइड पुस्तक में कांच स्लाइड प्लेस और बढ़ते मीडिया के लिए एक रात फ्रिज में स्टोर एक फोकल माइक्रोस्कोप पर विश्लेषण से पहले स्थापित करने के लिए ।
      नोट: माउस ऊतक में धुंधला एंटीबॉडी के लिए, वाणिज्यिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस किट का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) । ब्लॉकिंग चरण (खंड 4) के साथ एक 10 मिनट ब्लॉक के साथ एक 1 एच की मशीन के साथ प्रोटीन को रोकने के समाधान के साथ बदलें कि किट के साथ आता है अवरुद्ध एजेंट । फिर कदम पर ५.८ (धोने के बीच में) प्रतिदीप्ति संकेत बढ़ाने के साथ एक 1 एच की मशीन जोड़ें एजेंट । फिर फ्लोरोसेंट dilutant में किट के एजेंट का उपयोग करें (अन्य माध्यमिक एंटीबॉडी भी इस एजेंट के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है). ऊपर के रूप में मशीन और प्रोटोकॉल के बाकी के साथ 6 कदम से आगे बढ़ना ।

    9. निर्धारण और bliss-Organoids के बेसमेंट मैट्रिक्स के भीतर लेबलिंग

    नोट: Organoids निर्धारण और bliss-लेबलिंग के लिए किस्मत में जबकि तहखाने मैट्रिक्स के भीतर शेष एक 24 में गोल ग्लास coverslips के शीर्ष पर तहखाने मैट्रिक्स गुंबदों में उत्पंन थे अच्छी तरह से थाली (प्रति अच्छी तरह से एक गुंबद) । organoid तहखाने मैट्रिक्स गुंबदों के भीतर कार्रवाई की गई 24-खैर प्लेट के अलावा और विभिंन समाधानों को हटाने के द्वारा ।

    1. कुओं से मध्यम निकालें और निर्धारण जोड़ें; 1 ज के लिए छोड़ दें ।
    2. हटाने के निर्धारण और 1% सीरम और 2 घंटे के लिए ०.१% डिटर्जेंट युक्त पंजाब में धोने, हर 30 मिनट बदल रहा है ।
    3. धो समाधान और 1 एच के लिए 10% सीरम और ०.१% डिटर्जेंट के साथ पंजाब में ब्लॉक निकालें ।
    4. 1% सीरम और ०.१% डिटर्जेंट के साथ एक% सीरम या पंजाबियों के साथ पंजाब में एंटीबॉडी पतला ।
    5. ब्लॉकिंग समाधान निकालें और जोड़ें १००-२०० μL प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें) समाधान के लिए एक अच्छी तरह से ।
      नोट: यह और अधिक एंटीबॉडी को पतला करने के लिए नहीं के रूप में सभी अवरुद्ध समाधान को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    6. फ्रिज में प्लेस प्लेट और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी
    7. तो 1-2 एच के लिए आर टी पर छोड़ दें ।
    8. निकालें एंटीबॉडी समाधान और धोने के लिए 2-3 एच धोने समाधान हर 20 मिनट बदल रहा है ।
    9. सभी धो समाधान निकालें और जोड़ें १००-२०० μL माध्यमिक एंटीबॉडी पतला ( सामग्री की तालिकादेखें) 1% सीरम के साथ पंजाब में; आरटी पर 1 एच के लिए मशीन ।
    10. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 2 घंटे के लिए धो, हर 20 मिनट बदल रहा है ।
    11. वाश समाधान निकालें और DAPI समाधान जोड़ें; आरटी पर 10 मिनट के लिए छोड़ दें DAPI स्टॉक समाधान का उपयोग करें (20 मिलीग्राम/एमएल) 1:10000 पर पतला ।
    स्टॉक समाधान aliquots में-20 डिग्री सेल्सियस रखा जा सकता है ।
  • DAPI समाधान निकालें और ४० मिनट के लिए धोने, हर 10 मिनट बदल रहा है ।
  • संदंश का प्रयोग, तहखाने मैट्रिक्स गुंबद के साथ कांच coverslip और जगह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ तहखाने मैट्रिक्स गुंबद के साथ एक स्लाइड पर निकालें; बढ़ते मीडिया की कुछ बूँदें डालें और फिर ऊपर एक गिलास coverslip डाल दें.
  • एक स्लाइड बुक में ग्लास स्लाइड प्लेस और बढ़ते मीडिया के लिए सेट करने के लिए रात भर फ्रिज में छोड़ दें ।

    • Representative Results

    bliss-लेबलिंग के लिए आंतों के ऊतकों का अलगाव
    बृहदांत्र और छोटी आंत के लिए वर्णित ऊतक अलगाव प्रोटोकॉल microtubules और संबंधित प्रोटीन के संरक्षण और bliss लेबलिंग के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन स्टेम सेल व्यवहार्यता और organoid पीढ़ी के लिए नहीं (चित्रा 1 और तालिका 1 ). उद्देश्य तहखाना और अंकुर गुटों के रूप में संभव के रूप में स्वच्छ (बलगम और अंय ऊतक के रहित) थे उत्पंन, जबकि EDTA और ठंड के लिए जोखिम को कम करने के लिए संरचना को बनाए रखने और बर्फ ठंडा समाधान है, जो प्रेरित के साथ microtubules के depolymerization को रोकने के सभी की depolymerization लेकिन स्थिर microtubules । चित्रा 2 दोनों विल्ली और तहखाने (चित्रा 2a, बी) का एक मिश्रण युक्त 2 अंश के साथ अलग छोटे आंत्र ऊतक से 2 और 3 भिन्न की छवियों के उदाहरण से पता चलता है, जबकि अंश 3 मुख्य रूप से तहखाना शामिल हैं (चित्रा 2c , घ).

    पृथक आंत्र ऊतक के निर्धारण और bliss-लेबलिंग
    व्यक्तिगत या संयुक्त अंश तो निर्धारण और bliss-निर्धारण, डिटर्जेंट, अवरुद्ध, एंटीबॉडी, और धोने समाधान सहित कदम की एक श्रृंखला के माध्यम से लेबल के लिए कार्रवाई की गई, फिर से पहले बढ़ते मीडिया में अंतिम विल्ली/ स्लाइड में स्थानांतरित कर रहा है, और ग्लास coverslips के साथ कवर । तहखाने और विल्ली तो एक फोकल माइक्रोस्कोप पर छवि थे ।

    विल्ली और तहखाना दोनों में microtubules और actin का अच्छा संरक्षण और लेबलिंग निम्न द्वारा प्राप्त किया गया था: formaldehyde/मेथनॉल निर्धारण का एक संयोजन-20 डिग्री सेल्सियस, ०.१% डिटर्जेंट और 1% सीरम युक्त पंजाब में दोहराया धोने और ०.१% के साथ पंजाब में अवरुद्ध डिटर्जेंट और 10% सीरम, प्राथमिक एंटीबॉडी में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की मशीन के बाद और फिर कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी में 2 एच (चित्रा 3). Formaldehyde/मेथनॉल निर्धारण भी अलग तहखाना और विल्ली में EBs और क्लिप-१७० के रूप में लेबल + सुझावों के लिए अच्छी तरह से काम किया (चित्रा 4) । प्लस-microtubules के अंत में EB3 गर्द (धूमकेतु के रूप में जाना) तहखाना में स्पष्ट थे (चित्र 4a), जबकि स्थिर microtubules की जाली के साथ संघ विल्ली नमूनों में देखा जा सकता है (चित्रा 4c). क्लिप के अलग स्थानीयकरण-१७० और p150चिपक े (dynactin के उपइकाई) स्पष्ट रूप से अलग विल्ली (चित्रा 4B) में शिखर एन MTOCs में स्पष्ट था । formaldehyde/मेथनॉल प्रोटोकॉल के साथ निर्धारण लगातार अलग आंत्र ऊतक में ninein स्थानीयकरण के लिए काम नहीं किया माउस एंटीबॉडी के खिलाफ हमारे Pep3 ninein का उपयोग । हालांकि, मेथनॉल निर्धारण पर-20 ° c एक ही कपड़े धोने और समाधान के लिए के रूप में formaldehyde/मेथनॉल के लिए के रूप में अलग तहखाने और विल्ली के भीतर ninein का बहुत अच्छा स्थानीयकरण दिया (चित्रा 5; संदर्भ8) । दिलचस्प है, जबकि ninein शिखर पर केंद्रित है centrosomes सेल के आधार पर कुछ संचय अलग तहखाने के भीतर कुछ कोशिकाओं में स्पष्ट था (चित्रा 5) । क्या यह गैर-विशिष्ट लेबलिंग या अलगाव प्रक्रिया में देरी (और इस प्रकार संरक्षण को प्रभावित करने) के परिणाम के कारण है आगे की जांच की आवश्यकता होगी । हालांकि, मेथनॉल-फिक्स्ड (-20 डिग्री सेल्सियस) विल्ली के cryostat वर्गों (8में चित्रा 3bi देखें) भी ninein की एक बेसल आबादी के साथ सहयोगी हो सकता है कि सुझाव है कि कुछ कोशिकाओं में सेल आधार पर ninein से पता चला.

    निर्धारण और bliss-organoids के लेबलिंग तहखाने मैट्रिक्स से पृथक
    छोटे आंत्र organoids जनरेट किया गया और तीन सप्ताह या अधिक समय के लिए तहखाने मैट्रिक्स में उगाया (चित्रा 6A; संदर्भ6,15). सर्दी (4 डिग्री सेल्सियस) सेल वसूली समाधान तहखाने मैट्रिक्स से organoids को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । organoids के साथ पॉलिमर तहखाने मैट्रिक्स समाधान ट्यूबों के लिए हस्तांतरित किया गया था और निर्धारण और bliss लेबलिंग से पहले केंद्रापसारक । यह बहुत साफ तैयारी का उत्पादन किया और विभिंन समाधानों के लिए organoids के लिए अच्छी पहुंच की अनुमति दी । organoid अंकुर डोमेन के भीतर विभेदित कोशिकाओं स्थिर apico-बेसल microtubules होते हैं; इन ज्यादातर मामलों में अच्छी तरह से लेबल (चित्रा घमण्ड, सी) और EB1 भी microtubule जाली (चित्रा 6E; संदर्भ13) के साथ देखा जा सकता है । हालांकि, शीत कोशिका वसूली समाधान गतिशील microtubules के depolymerization में परिणाम हो सकता है, जो EB1 धूमकेतु की कमी के द्वारा कुछ नमूनों में स्पष्ट किया गया था (जो microtubules बढ़ते के अंत के साथ बांध) बेसल तहखाना डोमेन के भीतर (चित्रा 6F ). अंय नमूनों में, सूक्ष्म (गतिशील) microtubules (चित्रा 6D) संरक्षित किया गया । निर्धारण से पहले Organoid अलगाव और bliss-लेबलिंग ने भी जंक्शनीय प्रोटीन्स, ninein, क्लिप-१७०, और सेल मार्कर के लिए काम किया, जैसे प्याला कोशिकाओं के लिए mucin और chromogranin कोशिकाओं के लिए enteroendocrine ।

    निर्धारण और bliss-organoids के बेसमेंट मैट्रिक्स के भीतर लेबलिंग
    चित्रा 7     पुटी चरण (ए-सी) में एक organoid से पता चलता है और तहखाना विकास के एक प्रारंभिक चरण में (डी), दोनों formaldehyde में तय/मेथनॉल और bliss-microtubules और ninein के लिए लेबल । अच्छा microtubule संरक्षण और लेबलिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शिखर एन MTOCs पर ninein के लिए लेबलिंग स्पष्ट थे । चित्रा ८अ, बी एक दिन के भीतर एक तहखाना डोमेन से पता चलता है 6 organoid मेथनॉल प्रोटोकॉल के साथ तय की और microtubules और EB1 के लिए लेबल. microtubules और EB1 धूमकेतु का अच्छा संरक्षण स्पष्ट गतिशील microtubules के संरक्षण का सुझाव था ।

    Organoids भी तय कर रहे थे और bliss-जबकि तहखाने मैट्रिक्स के भीतर शेष लेबल । इस प्रक्रिया का नुकसान निर्धारण और तहखाने मैट्रिक्स (चित्रा 8B) के भीतर एंटीबॉडी के फँसाने के गरीब प्रवेश हो सकता है, हालांकि दोनों ही मामलों में कम बार जब ०.१% डिटर्जेंट निर्धारण और/या धोने के समाधान में शामिल किया गया था । इसके अलावा, 4% पीएफए तहखाने मैट्रिक्स अच्छी तरह से संरक्षित नहीं था, लेकिन यह भंग करने के लिए कारण है, हालांकि यह 1% पीएफए के साथ कम था ।मेथनॉल निर्धारण, दूसरी ओर, कभी organoid पतन प्रेरित ।

    ऐसे स्टेम सेल मार्कर Lgr5 और Paneth सेल मार्कर CD24 के खिलाफ के रूप में कुछ एंटीबॉडी के साथ लेबल 4% पीएफए, मेथनॉल, या formaldehyde/मेथनॉल प्रोटोकॉल के साथ असफल साबित हुआ । हालांकि, कमरे के तापमान पर ०.१% डिटर्जेंट के साथ पंजाब में 1% पीएफए के साथ तहखाने मैट्रिक्स के भीतर organoids फिक्सिंग दोनों Lgr5 और CD24 (चित्रा 9) के लिए लेबलिंग में परिणाम था ।

    Figure 1
    चित्रा 1: छोटे आंत्र विल्ली और तहखाने के अलगाव. छोटे आंत्र अंकुर और तहखाने अलगाव निर्धारण और bliss-लेबलिंग से पहले में महत्वपूर्ण कदम के प्रवाह आरेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्रा 2: अलग विल्ली और माउस छोटी आंत से तहखाने. विल्ली (बड़े तीर) और तहखाने (छोटे तीर) दिखा आंत्र भिन्न की Brightfield माइक्रोस्कोप छवियों. (A, B) अंश 2 में विल्ली और तहखाना का मिश्रण होता है, और अंकुर और तहखाना पर आकृति विज्ञान का संरक्षण Bमें स्पष्ट होता है । (C, D) अंश 3 तहखाना और Cमें एक बंटवारा तहखाना सहित विल्ली और बरकरार तहखाना के अभाव के अलगाव से पता चलता है । स्केल बार्स = ५०० माइक्रोन (ए, सी); १०० माइक्रोन (बी, डी). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्रा 3: अलग छोटे आंत्र अंकुर और formaldehyde/मेथनॉल और bliss में तय तहखाना-microtubules और actin के लिए लेबल । (एक) अंकुर और विभिंन प्रकार के सेल के साथ तहखाना उपकला की योजनाबद्ध संकेत दिया । हाइलाइट किए गए बक्से B और Cमें छवि वाले प्रतिनिधि क्षेत्रों का संकेत देते हैं । (B, C) एक अंकुर के भाग के माध्यम से फोकल ऑप्टिकल वर्गों (ख) और बेसल तहखाना (सी) 30 मिमी EDTA का उपयोग कर छोटी आंत से अलग है और formaldehyde/मेथनॉल में तय, 1% बकरी सीरम और ०.१% से युक्त पंजाबियों में धोया डिटर्जेंट, पंजाब में अवरुद्ध 10% बकरी सीरम और ०.१% डिटर्जेंट युक्त, और चूहे मोनोक्लोनल विरोधी tubulin एंटीबॉडी के साथ microtubules के लिए लेबल (हरा) और खरगोश actin विरोधी के साथ polyclonal के लिए-β-actin एंटीबॉडी (लाल). अच्छी तरह से संरक्षित apico-बेसल microtubule बंडलों दोनों अंकुर और तहखाना कोशिकाओं में स्पष्ट कर रहे हैं, और actin लुमेन (तीर) का सामना शिखर क्षेत्र में केंद्रित देखा जा सकता है । स्केल बार्स = 5 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्रा 4: पृथक छोटे आंत्र तहखाना और formaldehyde/मेथनॉल और bliss में तय विल्ली-microtubules के लिए लेबल, EB3, p150चिपके हुए, और क्लिप-१७० । छोटे आंत से अलग तहखाना और विल्ली क्षेत्रों के फोकल ऑप्टिकल वर्गों 30 मिमी EDTA का उपयोग कर और formaldehyde/मेथनॉल में तय, 10% बकरी सीरम और ०.१% डिटर्जेंट युक्त पंजाब में धोया, 10% बकरी सीरम और ०.१% डिटर्जेंट युक्त पंजाबियों में अवरुद्ध, और bliss-त्यसपछि । (क) खरगोश polyclonal α के साथ लेबल तहखाना-tubulin एंटीबॉडी (लाल) और चूहे मोनोक्लोनल EB3KT36 एंटीबॉडी (हरा) और DAPI के साथ डीएनए के लिए दाग (नीला) दिखा apico-बेसल microtubules और EB3 धूमकेतु. उल्टे एक चैनल छवि स्पष्ट रूप से बेसल तहखाना कोशिकाओं गतिशील के रूप में अच्छी तरह से स्थिर microtubules के अच्छे संरक्षण का सुझाव भर में EB3 धूमकेतु से पता चलता है । (ख) खरगोश polyclonal क्लिप के साथ लेबल अंकुर उपकला कोशिकाओं-१७० एंटीबॉडी (लाल, देखें भी संदर्भ16) और माउस मोनोक्लोनल p150चिपक े एंटीबॉडी (हरा) दिखा शिखर सह स्थानीयकरण. उल्टे एकल चैनल चित्र नीचे दिखाए जाते हैं. (ग) अंकुर खरगोश polyclonal α के साथ लेबल कोशिकाओं-tubulin एंटीबॉडी (लाल) और चूहे मोनोक्लोनल EB3-KT36 एंटीबॉडी (हरा) और DAPI के साथ डीएनए के लिए दाग (नीला) apico साथ microtubules के साथ दिखाई जाली । EB3 जाली एसोसिएशन बढ़े हुए छवि में प्रकाश डाला है, जबकि उल्टे एक चैनल छवि दोनों EB3 धूमकेतु और जाली एसोसिएशन से पता चलता है । स्केल बार्स = 5 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्रा 5: पृथक बृहदांत्र मेथनॉल में तय तहखाना, bliss-ninein और ई cadherin के लिए लेबल, और DAPI के साथ दाग । एक 3 मिमी EDTA का उपयोग कर बृहदांत्र से अलग तहखाना के बेसल और पारगमन बढ़ाना क्षेत्र के फोकल ऑप्टिकल खंड और मेथनॉल में तय, 1% बकरी सीरम और ०.१% डिटर्जेंट युक्त पंजाबियों में धोया, और 10% बकरी सीरम और ०.१% डिटर्जेंट युक्त पंजाब में अवरुद्ध. तहखाना खरगोश polyclonal ninein एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था (Pep3, देखें भी संदर्भ8, लाल) और माउस मोनोक्लोनल ई-cadherin एंटीबॉडी (हरा) और DAPI (नीला) के साथ सना हुआ । उल्टे एकल चैनल छवि केवल ninein से पता चलता है । छवि ई के साथ एक अच्छी तरह से संरक्षित तहखाना से पता चलता है-cadherin व्यक्तिगत कोशिकाओं और ninein शिखर centrosomes पर ध्यान केंद्रित की रूपरेखा खुलासा । यह निर्धारण और एंटीबॉडी के अच्छी पैठ का पता चलता है, और antigenicity के संरक्षण । स्केल बार = 5 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 6
    चित्रा 6: Organoid विकास, निर्धारण, और अलग organoids के bliss-लेबलिंग । (A) चरण कंट्रास्ट छवियां कक्ष समुच्चय से organoid विकास की कली दीक्षा और पूरी तरह से तहखाना और अंकुर डोमेन के साथ organoids का गठन के साथ पुटी के लिए विभिंन चरणों में दिखा ।(ख-च) organoids के माध्यम से फोकल ऑप्टिकल वर्गों 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल वसूली समाधान का उपयोग कर तहखाने मैट्रिक्स से अलग (10 मिनट) formaldehyde/मेथनॉल निर्धारण, 10% बकरी सीरम और ०.१% से युक्त पंजाबियों में धोने के द्वारा पीछा किया, 10% बकरी युक्त पंजाब में अवरुद्ध सीरम और ०.१% डिटर्जेंट, और microtubules के लिए bliss-लेबलिंग, β-catenin, and EB1. (ख) Organoid microtubules (नीला) और β-catenin (लाल) के लिए लेबल किया गया अच्छा microtubule संरक्षण और अधिकांश कक्षों में लेबलिंग का खुलासा । (ग) अलग apico-बेसल microtubules एक organoid पुटी से इन बढ़े हुए उपकला कोशिकाओं में स्पष्ट कर रहे हैं । (D) सूक्ष्म (डायनामिक) microtubules (तीर) सहित microtubules के लिए लेबल किए गए कक्षों को विभाजित कर रहा है । (E, F) अंकुर डोमेन (ई) और तहखाना डोमेन (एफ) organoid क्षेत्रों स्थिर microtubules की जाली के साथ कुछ EB1 लेबलिंग दिखा रहा है, विशेष रूप से अंकुर में, जबकि बहुत कुछ EB1 धूमकेतु भी बेसल तहखाना के भीतर देखा जाता है कि गतिशील सुझाव microtubules को संरक्षित नहीं किया गया है । स्केल पट्टियां = 20 माइक्रोन (ए); 2 माइक्रोन (डी); 5 माइक्रोन (बी, सी, ई एफ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 7
    चित्रा 7: formaldehyde/मेथनॉल और bliss में तहखाने मैट्रिक्स के भीतर तय Organoids-microtubules और ninein के लिए लेबल । formaldehyde/मेथनॉल में तय organoids के फोकल ऑप्टिकल वर्गों धोया और 10% बकरी सीरम और ०.१% डिटर्जेंट युक्त पंजाबियों में अवरुद्ध है, और जबकि तहखाने मैट्रिक्स में शेष लेबल । (क-ग) Organoid पुटी microtubule के लिए लेबल (हरा) और ninein (Pep3; संदर्भ8, लाल) और DAPI के साथ सना हुआ (नीला) एक और औंधा एकल चैनल छवियों में microtubules (B) और ninein (C) के लिए छवि दिखा । छवियों apico-बेसल microtubules और शिखर ninein स्थानीयकरण दिखाने के लिए, organoid और एंटीबॉडी के प्रवेश के बहुत अच्छे संरचनात्मक संरक्षण के साथ ही असीम एंटीबॉडी के समाशोधन का सुझाव । (D, E) Organoid के साथ तय तहखाना विकासशील और इसके बाद के संस्करण के रूप में और फिर उत्कृष्ट संरचनात्मक संरक्षण दिखा लेबल, लेबल, और एंटीबॉडी के समाशोधन । विशिष्ट apico-बेसल microtubules और शिखर एन-MTOC ninein स्थानीयकरण स्पष्ट है और डीमें बॉक्सिंग क्षेत्र के बढ़े हुए छवि (ई) में प्रकाश डाला. स्केल पट्टियां = 10 माइक्रोन (A-D); 5 माइक्रोन (ई) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 8
    चित्रा 8: Organoids मेथनॉल और bliss में तहखाने मैट्रिक्स के भीतर तय-microtubules और EB1 के लिए लेबल । organoids के फोकल ऑप्टिकल वर्गों मेथनॉल में तय की, धोया और 10% बकरी सीरम और ०.१% डिटर्जेंट युक्त पंजाब में अवरुद्ध, और लेबल, जबकि तहखाने मैट्रिक्स में शेष । (a) एक पूरी तरह से विकसित organoid से पुटी डोमेन खरगोश polyclonal α के साथ लेबल-tubulin (लाल) और माउस मोनोक्लोनल EB1 (हरा) एंटीबॉडी दो विभाजन कोशिकाओं और विशिष्ट apico धूमकेतु में microtubules-बेसल EB1, धुरी (तीर) दिखा । असीम EB1 एंटीबॉडी के कुछ फँसाना स्पष्ट है. हालांकि, microtubules और EB1 के अच्छे संरचनात्मक संरक्षण और लेबलिंग मनाया जाता है । EB1 धूमकेतु की उपस्थिति से पता चलता है कि गतिशील microtubules (A, औंधा) संरक्षित किया गया है । (ख) organoid पुटी क्षेत्र के उल्टे छवि α-tubulin एंटीबॉडी आसपास के तहखाने मैट्रिक्स (तीर) के भीतर फंस काफी एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग दिखा । स्केल बार्स = 5 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 9
    चित्र 9: Organoids 1% पीएफए और bliss में तहखाने मैट्रिक्स के भीतर तय-Lgr5 और CD24 के लिए लेबल । organoids के फोकल ऑप्टिकल वर्गों ०.१% डिटर्जेंट युक्त पंजाब में 1% पीएफए में तहखाने मैट्रिक्स के भीतर तय, 1% बकरी सीरम और ०.१% डिटर्जेंट के साथ पंजाब में धोया, और Lgr5 और CD24 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल । (A, B) एक तहखाना डोमेन Paneth CD24 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं (लाल) दिखा के भीतर स्टेम सेल आला । फोकल और चरण कंट्रास्ट छवियां Aमें मर्ज किए गए हैं । B CD24 लेबलिंग का एकल चैनल दिखाता है । (ग) एक तहखाना डोमेन के भीतर स्टेम सेल क्षेत्र एक Lrg5 सकारात्मक स्टेम सेल दिखा रहा है । स्केल बार्स = 10 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Table 1
    तालिका 1: लघु आंत्र तहखाना और विल्ली अलगाव और निर्धारण की समयरेखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Discussion

    आंत्र ऊतक के अलगाव
    छोटे आंत्र तहखाने और विल्ली और बृहदांत्र तहखाने के अलगाव श्लैष्मिक सतह को उजागर शामिल है, EDTA समाधान के साथ उपचार के लिए सेल संपर्क, आंशिकता ढीला (मिलाते हुए), और केंद्रापसारक । प्रस्तुत आंत्र विल्ली/तहखाना आइसोलेशन प्रोटोकॉल को Belshaw एट अल. और व्हाइटहेड एट अल से संशोधित किया गया है । 17 , 18

    श्लैष्मिक सतह को उजागर
    हम इस प्रक्रिया के विकास में आंत्र पथ के श्लैष्मिक सतह का पर्दाफाश करने के लिए दृष्टिकोण के एक नंबर के साथ प्रयोग किया है । एक क्लासिक दृष्टिकोण एवर्ट के लिए है (अंदर बाहर बारी) ट्यूब, आमतौर पर क्षेत्रों के बारे में १०० mm लंबे समय में, एक धातु की छड़ है कि एक छोर पर ऊतक के एक गुना में पकड़ा और फिर शेष ट्यूब ट्यूब पर गिरावट का उपयोग कर रहा है19। माउस के ऊतकों के लिए, एक धातु रॉड (२.४ मिमी व्यास) गोल सिरों के साथ आदर्श है । इस दृष्टिकोण श्लैष्मिक और EDTA के लिए बेहतर पहुंच की अनुमति सतह के विस्तार का लाभ है । हम शुरू में इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया, लेकिन कम लंबाई में ट्यूब काटने के लिए ले जाया गया (के बारे में 5 सेमी) और इस आसान साबित के रूप में कैंची विदारक के साथ प्रत्येक अनुभाग खोलने. यदि केवल कुछ आंतों की आवश्यकता हो तो यह दृष्टिकोण उचित है; लेकिन अगर और अधिक जानवरों के लिए एक प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा था तो एक उद्देश्य के लिए बनाया डिवाइस खोलने के लिए ट्यूब longitudinally, के रूप में Yoneda एट अल द्वारा वर्णित. 14 अधिक कुशल होगा ।

    मांसपेशी परत से विल्ली और तहखाने की टुकड़ी
    शुरू में हम पंजाब में 3 मिमी EDTA का इस्तेमाल किया और ६० मिनट तक की अपेक्षाकृत लंबे समय की मशीन समय अंतर्निहित ऊतक17,18से श्लैष्मिक सतह ढीला । EDTA की इस एकाग्रता में हम 30 मिनट की एक मशीन समय पाया माउस बृहदांत्र से तहखाना ढीला करने के लिए पर्याप्त था । हालांकि, छोटी आंत के लिए तहखाना/अंकुर अलगाव हम एक छोटे समय के लिए और अधिक केंद्रित EDTA का उपयोग करने की कोशिश की, जो एक कुशल दृष्टिकोण साबित हुआ । बाद में सभी काम 30 मिमी EDTA विल्ली या तहखाने के लिए प्रासंगिक अंशों पैदा तकनीक का उपयोग कर निकाले ऊतक के साथ शुरू किया गया था । तहखाने के लिए, हम सामान्य रूप से फिक्सिंग से पहले अंशों 3-5, लेकिन यह जांचना महत्वपूर्ण है कि क्या इन समय के रूप में उपयुक्त अंश है आंत्र पथ के साथ स्थिति के रूप में कारकों की एक संख्या पर निर्भर करेगा, माउस की आयु, सूजन, पिछले आहार , आदि इसी प्रकार, समय की लंबाई ऊतक EDTA उपचार के बाद हिल करने के लिए प्रभावी होने की जरूरत है विभिन्न परिस्थितियों में भिन्न हो सकते हैं. परिणाम अलग ऊतक विल्ली और तहखाने या मुख्य रूप से या तो विल्ली या तहखाना (चित्रा 2) का एक मिश्रण युक्त भिन्न है. के रूप में वहां बृहदांत्र में कोई विल्ली हैं, तहखाना निष्कर्षण एक कदम में ट्यूब में ऊतक झटकों से प्राप्त करने के लिए हो सकता है 30 एस । इन अंशों को फिर bliss-लेबलिंग के लिए स्थिर और संसाधित किया जा सकता है.

    आंत्र organoids के तहखाने मैट्रिक्स से अलगाव
    organoids के तहखाने मैट्रिक्स गुंबदों से अलगाव सेल वसूली समाधान का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है । समाधान gelled तहखाने मैट्रिक्स depolymerizing द्वारा काम करता है, लेकिन तापमान 2-8 डिग्री सेल्सियस होने की जरूरत है । सावधानी का एक नोट है कि गतिशील microtubules संरक्षित नहीं किया जा सकता है । इस प्रकार, bliss के लिए-गतिशील microtubules की लेबलिंग और + EBs सेल के रूप में सुझाव, तहखाने मैट्रिक्स से निर्धारण से पहले वसूली की सिफारिश नहीं है । हालांकि, अंतर organoid कोशिकाओं में microtubules के अधिकांश अपेक्षाकृत स्थिर रहे है और ये (चित्रा 6) संरक्षित किया गया । यह भी centrosomal और जंक्शनीय प्रोटीन के bliss लेबलिंग के लिए अच्छी तरह से काम किया है और साथ ही सेल मार्करों ।

    निर्धारण चलत
    Formaldehyde (हौसले से पीएफए से बने) एक अपेक्षाकृत तेजी से अभिनय निर्धारण है कि प्रतिवर्ती पार-लिंक रूपों और 4% पीएफए उदाहरण के लिए अच्छी तरह से काम करता है, bliss-लेबलिंग microtubules और गामा tubulin और actin के साथ धुंधला Phalloidin रेशा में । अधिक पतला पीएफए समाधान जैसे 1% bliss के लिए अच्छी तरह से काम किया-उदाहरण के लिए लेबलिंग, स्टेम सेल मार्करों Lgr5 और Paneth सेल मार्कर CD24 के साथ तहखाना स्टेम सेल आला के भीतर, जबकि पीएफए के उच्च सांद्रता काम नहीं किया.

    glutaraldehyde के अलावा microtubules के बेहतर संरक्षण और तथाकथित PHEMO निर्धारण जो ३.७% पीएफए, ०.०५% glutaraldehyde और PHEMO बफर में ०.५% डिटर्जेंट (६८ मिमी पाइप, 25 मिमी HEPES, 15 मिमी EGTA और 3 मिमी MgCl2)2 का एक मिश्रण के होते है देता है antigenicity समझौता किए बिना microtubules के उत्कृष्ट संरक्षण देता है । यह भी bliss-लेबलिंग गामा-tubulin, β-catenin, और ई-cadherin, और actin के साथ धुंधला phalloidin रेशा के लिए अच्छी तरह से काम करता है । हालांकि, 3d ऊतक और organoid संस्कृतियों में, PHEMO निर्धारण असंगत परिणाम उत्पादित और इसलिए इस्तेमाल नहीं किया गया था ।

    मेथनॉल एक कौयगुलांट निर्धारण है कि अपेक्षाकृत अच्छी पैठ देता है और antigenicity के संरक्षण के लिए आत्ममंथन करता है । १००% मेथनॉल के साथ निर्धारण (-20 डिग्री सेल्सियस) कुछ संकोचन परिचय, मध्यम आकृति विज्ञान संरक्षण देता है, और microtubules के लिए काम करता है, + युक्तियाँ, और 2d सेल संस्कृतियों में ninein सहित कई centrosomal एंटीबॉडी. हालांकि, इस निर्धारण विधि का उपयोग करते समय कुछ organoids ढह गई । इसके अलावा, पूरे तहखाने, विल्ली, या organoids के माध्यम से एंटीबॉडी के प्रवेश शुरू में एक समस्या थी, लेकिन धोने समाधान और लंबे समय तक धोने के लिए ०.१% डिटर्जेंट के अलावा बेहतर परिणाम हासिल किया ।

    formaldehyde और मेथनॉल का एक संयोजन पहले रोजर्स एट अल द्वारा इस्तेमाल किया गया था । २० ते bliss-लैबल EB1 मे Drosophila. formaldehyde और मेथनॉल के मिश्रण पर आधारित एक निर्धारण प्रोटोकॉल इसलिए आंतों के ऊतकों और organoids 3% formaldehyde और ९७% मेथनॉल ठंडा करने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर आधारित के लिए विकसित किया गया था, लेकिन मिश्रण है कि रोजर्स द्वारा इस्तेमाल किया गया था से 5 मिमी सोडियम कार्बोनेट का लोप एट अल. 20 इसके अलावा, नमूनों को फ्रीजर में-20 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित किया गया था । यह bliss-लेबलिंग के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम किया + युक्तियां, क्लिप के रूप में-१७० और EBs, लेकिन यह भी फिक्सिंग और bliss लेबलिंग microtubules और ऊतक और 3 डी actin के भीतर organoids के लिए उत्कृष्ट साबित कर दिया । बहुत अच्छा संरचनात्मक संरक्षण स्पष्ट था और antigenicity कई cytoskeletal और जुड़े प्रोटीन के लिए संरक्षित किया गया था और साथ ही centrosomal प्रोटीन गामा के रूप में-tubulin और ninein, हालांकि ninein के लिए लेबल और मेथनॉल के साथ लगातार काम किया निर्धारण.

    Disclosures

    लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

    Acknowledgments

    लेखक माइक्रोस्कोप सलाह और सहायता के लिए पॉल थॉमस धंयवाद । यह काम यहां शामिल BBSRC द्वारा समर्थित (अनुदान सं था । BB/J009040/1 से M.M.M. और T.W.).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537-500ML washing and PFA
    Cell Recovery Solution Corning 354253 isolate organoids
    lobind microcentrifuge tubes Eppendorf 30108116 prevent cells sticking
    0.5 M EDTA solution, pH 8.0 Sigma 03690-100ML Crypt isolation
    70 μm cell strainer Fisher Scientific 11517532 Isolate crypts from villi
    Triton X-100 Sigma T8787 detergent
    goat serum Sigma G6767 blocking agent
    Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma used as non-stick agent
    Paraformaldehyde, 4% in PBS Alfa Aesar J61899 fixative
    Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) Sigma F8775 used as fixative
    Methanol 99.9% Analytical grade Fisher M/4000/17 used as fixative
    MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit Maxvision
    Biosciences    		 MF01-S commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling
    Rotator SB2 or SB3 Stuart microcentrifuge tube rotator
    Sodium citrate antigen retrieval
    Hydromount National Diagnostics HS-106 mountant
    DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802 anti-fade agent
    Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges Clarity N/C366 slides
    Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm Clarity NQS13/2250 coverslips
    Matrigel Corning 356231 Basement matrix for 3D organoid culture
    50 mL conical tubes Sarstedt 62.547.254 for processing tissue/organoids
    15 mL conical tubes Sarstedt 62.554.502 for processing tissue/organoids
    1.5 mL LoBind tubes Eppendorf 30108051 for isolated organoids
    Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181 primary antibody 1:500
    Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody Abcam ab6160 primary antibody 1:100
    Rabbit alpha-tubulin antibody Abcam ab15246 primary antibody 1:100
    Rabbit anti-beta-actin antibody Abcam ab8227 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal anti-p150Glued antibody BD Bioscience 610473/4 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal EB3KT36 antibody Abcam ab53360 primary antibody 1:200
    Mouse monoclonal EB1 antibody BD Bioscience 610535 primary antibody 1:200
    Rabbit anti-Lgr5 antibody Abgent AP2745d primary antibody 1:100
    Dylight anti-rat 488 Jackson 112545167 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-mouse 488 Jackson ST115545166 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-rabbit 647 Jackson 111605144 seconday antibody 1:400

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    References

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    विकास जीव विज्ञान अंक १३० Organoid आंत cytoskeleton microtubules EB1 क्लिप-१७० ninein centrosome Lgr5 epithelia
    bliss-फ्लोरोसेंट लेबलिंग के Microtubules और Centrosomal प्रोटीन में <em>पूर्व Vivo</em> आंत्र ऊतक और 3 डी इन <em>विट्रो</em> आंत्र Organoids
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    Goldspink, D. A., Matthews, Z. J.,… More

    Goldspink, D. A., Matthews, Z. J., Lund, E. K., Wileman, T., Mogensen, M. M. Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56662, doi:10.3791/56662 (2017).

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