Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Immuno-fluorescerande märkning av mikrotubuli och Centrosomal proteiner i Ex Vivo Tarmvävnaden och 3D In Vitro Intestinal Organoids

Published: December 13, 2017 doi: 10.3791/56662
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1School of Biological Sciences, University of East Anglia, 2Norwich Medical School, University of East Anglia

Summary

Vi presenterar protokoll för isolering av intestinal 3D-strukturer från i vivo vävnad och in vitro- källaren matrix inbäddade organoids, och detalj olika fixering och färgprotokoll optimerad för immuno-märkning av mikrotubuli, centrosomal och Junktional proteiner samt som cell markörer inklusive stamceller proteinet Lgr5.

Abstract

Tillkomsten av 3D i vitro organoids som efterliknar i vivo vävnad arkitektur och morfogenes har mycket avancerade förmågan att studera biologiska nyckelfrågor i cell- och utvecklingsbiologi. Organoids tillsammans med senaste tekniska framsteg i gen redigering och viral genen leverans lovar dessutom att främja medicinsk forskning och utveckling av nya läkemedel för behandling av sjukdomar. Organoids odlas i vitro i källaren matris ger kraftfull modellsystem för att studera beteende och funktion av olika proteiner och är väl lämpade för live-imaging av lysrör-märkta proteiner. Om inrättande av uttryck och lokalisering av endogena proteiner i ex vivo vävnad och i in vitro- är organoids dock viktigt att kontrollera beteendet hos de märkta proteinerna. För detta ändamål har vi utvecklat och ändrade vävnad isolering, fixering och immuno-märkning protokoll för lokalisering av mikrotubuli, centrosomal och associerade proteiner i Tarmvävnaden ex vivo och in vitro- intestinal organoids. Syftet var för fixeringsvätskan att bevara 3D arkitekturen av organoids/vävnad samtidigt bevara antikropp antigenicitet och möjliggör god inträngning och clearance av fixativ och antikroppar. Exponering för kyla depolymerizes alla utom stabil mikrotubuli och detta var en viktig faktor när du ändrar de olika protokollen. Vi hittade att öka den etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syrakoncentration från 3 mM till 30 mM gav effektiv avlossning av villi och kryptor i tunntarmen medan 3 mM EDTA räckte för kolon kryptor. Utvecklade formaldehyd/metanol fixering protokollet gav mycket bra strukturella bevarande samtidigt bevara antigenicitet för effektiv märkning av mikrotubuli, aktin och slutet-bindande (EB) proteinerna. Det fungerade också för den centrosomal protein ninein även om protokollet metanol arbetat mer konsekvent. Vi etablerat ytterligare att fixering och immuno-märkning av mikrotubuli och associerade proteiner skulle kunna uppnås med organoids isoleras från eller återstående inom matrisen källare.

Introduction

Bildandet av epitel med apico-basal polariteten är en grundläggande process i utvecklingen och innebär en dramatisk omorganisation av mikrotubuli och centrosomal proteiner. En radiell mikrotubulära matris som härrör från ett centralt centrosomal mikrotubuli organisera center (MTOC) är framträdande i många djurceller och detta är väl lämpad för relativt platt celler. Däremot montera columnar epitelceller, som de i tarmen, icke-radiell transcellular mikrotubuli matriser som bättre stöder form och specialiserade funktioner av dessa celler. Denna dramatiska omorganisering av mikrotubuli uppnås genom den centrosome flyttar till apex och apikala icke-centrosomal MTOCs (n-MTOCs) bildar, som blir ansvarig för förankring av transcellular mikrotubuli1,2 , 3 , 4 , 5.

Mycket av vår kunskap om epitelial differentiering och associerade mikrotubulära omorganiseringen har kommit från utredningar av 2D i vitro cell lager som inte visas i vivo vävnad arkitekturen. Utveckling av 3D i vitro organoid kulturer, uppfunnen av Clevers och medarbetare6, representerar en stora tekniska framsteg som de härmar i vivo arkitektur och utveckling. En hierarki av epitelial differentiering är uppenbart i tarmen; stamceller längst ned i kryptor ge upphov till omogna transit förstärkande cellerna att föröka sig och differentiera gradvis när de vandrar upp kryptan till små intestinal villus eller kolon yta, där de blivit fullt differentierade innan kasta in i lumen7. Allt replikeras detta i intestinal organoids där celler från stamcellsnischen föröka bildar cystor som därefter genererar crypt-liknande knoppar med stamceller i botten och differentiering gradvis utvecklas mot regionen cysta, som blir villus-liknande8. Den intestinala organoid utgör därför en kraftfull modell för att studera inte bara mikrotubuli och centrosomal omorganisation under epitelial differentiering men ett flertal andra proteiner, samt att ge en idealisk plattform för screening av läkemedel och livsmedel föreningar av potentiella terapeutiska fördelar9,10.

Organoids är väl lämpade för live-imaging av lysrör-märkta proteiner och båda inpressning och knock-out organoids kan genereras med hjälp av CRISPR/Cas9 gen redigering11,12. Det är dock viktigt, särskilt för att kontrollera beteendet hos de märkta proteinerna om upprättandet av uttryck och lokalisering av endogena proteiner studeras. Immuno-märkning 3D organoids odlas i källaren matris eller ex vivo isolerade vävnad är mer komplex än celler odlade i kultur rätter i 2D. Fixering protokollet behöver bevara ömtåliga 3D arkitekturen av organoids men ändå bevara antikropp antigenicitet (dvs, epitoper för bindande antikroppar). Exempelvis 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) används ofta som ett fixativ men samtidigt som det är en relativt snabb agerar fixativ och ger bra morfologiska bevarande, i vår erfarenhet det ofta resulterar i förlust av antigenicitet och lämpar sig inte för många centrosomal antikroppar. De fixativ och antikroppar förmåga att penetrera 3D-strukturer och vävnader bör också övervägas. I detta syfte vi har ändrat och utvecklat protokoll för vävnad isolering och indirekta immuno-märkning av 3D in vitro- organoids och ex vivo isolerad Tarmvävnaden. Vi beskriver hur man isolera små intestinal kryptor och villi och colonic vävnad, och inkluderar ett protokoll för isoleringen av 3D organoids som ett alternativ till fastställande och immuno-märkning inom matrisen källare. Vi presenterar tre alternativa fixering protokoll för immuno-märkning av mikrotubuli och centrosomal proteiner, såsom ninein, och mikrotubuli plus-end spårning proteiner (+ TIPs), såsom EB proteiner och klipp-170 (se även referenser8, 13). Vi diskuterar också för- och nackdelar som är associerad med varje protokoll.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här utfördes enligt University of East Anglia's institutionella licens riktlinjer.

1. isolering av Tarmvävnaden

  1. Isolering av kolon kryptor för immuno-märkning (se figur 1, schematisk)
    1. Avliva musen (med CO2 kvävning) och ta bort tjocktarmen (början av blindtarmen och utvinna caudally) med dissekera sax och pincett14.
    2. Spola innehållet i tjocktarmen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med glas pipett med gummi lampa. PBS: natriumklorid (8,0 g/L), kaliumklorid (0,2 g/L), dinatriumvätefosfat (1,15 g/L) och kaliumdivätefosfat (0,2 g/L), vid pH 7,3.
    3. Använder en metallstav (2,4 mm diameter) eller slutet av glas pipett, håll ena änden av kolon röret medan du försiktigt dra vävnaden över rod/pipetten således everting colonic vävnaden så att epitelet är nu på utsidan.
      Obs: Om detta inte är möjligt sedan öppna tjocktarmen med sax och skiva i 5 mm bitar.
    4. Överföra everted kolon eller bitar till en 50 mL konisk tub som innehåller 40 mL PBS.
    5. Vänd röret flera gånger att ytterligare ta bort tarminnehållet, slem, etc.
    6. Överföra kolon/bitar till 40 mL 3 mM EDTA i PBS och inkubera vid rumstemperatur (RT) i 15 min.
      Obs: Späd 0,5 M EDTA pH 8,0 lager med PBS.
    7. Skaka för att avlägsna slem och överföra kolon/bitar till en 50 mL konisk tub innehållande färska 40 mL 3 mM EDTA i PBS. Inkubera i 35 min på RT.
    8. Överföra kolon/bitar till 10 mL PBS i en 50 mL konisk tub och skaka kraftigt för 30 s att släppa kryptor (crypt fraktion).
    9. Ta bort colon/bitar från röret och placera tillbaka i 3 mM EDTA om det krävs ytterligare isolering. Centrifugera det återstående crypt bråket vid 300 x g i 5 min.
    10. Ta bort 5 mL av supernatanten och återsuspendera pelleten crypt återstående 5 mL volym.
    11. Iaktta under ett stereomikroskop med zoom (50-100 X förstoring) att kontrollera förekomst av kolon kryptor.
      Obs: Om det finns inga kryptor närvarande sedan Inkubera kolon/bitarna i 3 mM EDTA i PBS för en annan 30 min och upprepar sedan steg 1.1.8 - 1.1.11.
    12. Centrifugera det crypt bråket vid 300 x g i 5 min.
    13. Ta bort alla supernatanten för att få en krypta pellet och omedelbart gå vidare till fixering (avsnitt 3).
  2. Isolering av små intestinal kryptor och villi för immuno-märkning (figur 2)
    1. Avliva musen (med CO2 kvävning) och ta bort tunntarmen (proximala tolvfingertarmen till terminal ileum) med dissekera sax och pincett14.
      Obs: att visa olika delar av tunntarmen då på detta stadium separata och behandla separat. Se figur 1 och tabell 1 för ett flödesdiagram och tider.
    2. Spola innehållet i tunntarmen med PBS med glas pipett med gummi lampa.
    3. Skar upp tunntarmen med dissekera saxen och placera i 15 mL PBS i en petriskål.
    4. Försiktigt tvätta tarmen i PBS ta bort luminala innehåll medan inte skadar slemhinneepitel. Överföra vävnad till en färsk petriskål och upprepa PBS tvätta.
    5. Skär tarmen i 3-5 mm bitar och överföra till en 100 mm petriskål innehållande 15 mL 30 mM EDTA i PBS och inkubera för 5 min vid RT. Alternativt Inkubera i 3 mM EDTA i PBS i 30 min.
    6. Del 1 (Villi isolering): överför intestinal bitar till 10 mL PBS i en 50 mL konisk tub, skaka kraftigt i 10 s, och häll i en 100 mm petriskål. Kontrollera fraktionen för isolerade villi under ett stereomikroskop. I detta skede, mestadels villi bör vara närvarande men detta kan variera mellan isoleringar.
      Obs: För att förhindra isolerade villi/kryptor sticker till plast, petriskålar och samling rören bör före belagda med fetalt bovint Serum (FBS). Häll rätter eller rör FBS och omedelbart ta bort den. Se tabell 1 för timing guider för respektive fraktion.
    7. Överför den intestinala bitar tillbaka i 30 mM EDTA i PBS och inkubera i 5 min. Under denna inkubation, samla bråkdel 1 i en 15 mL koniska rör (förbelagts med FBS) och centrifugera vid 300 x g under 5 minuter.
    8. Del 2: Överför intestinal bitar till en 50 mL konisk tub innehållande 10 mL PBS, skaka kraftigt i 20 s, och häll sedan i en 100 mm petriskål. Kontrollera fraktionen under mikroskopet. Normalt i detta skede en blandad kultur av villi och kryptor är närvarande (figur 2A).
    9. Överföra intestinal bitar tillbaka i 30 mM EDTA i PBS och inkubera i ytterligare 5 minuter. Under denna inkubation, pellet bråkdel 2 i en 15 mL koniska rör (förbelagts med FBS) på 300 x g för 5 min. ta bort supernatanten från bråk 1 och 2 utan att störa pelleten och omedelbart gå vidare till fixering (steg 3).
    10. Del 3 (Crypt isolering): överför intestinal bitar till 10 mL PBS i 50 mL tub, skaka om under 20 s, och häll i en 100 mm petriskål. Kontrollera bråkdel under mikroskopet. I detta skede innehåller fraktionen huvudsakligen kryptor (figur 2B).
    11. Del 4: Över intestinal bitar till 10 mL PBS, shake för 20 s, och häll i en 100 mm petriskål. Kontrollera bråkdel under mikroskopet. I detta skede bör det finnas endast kryptor.
    12. Del 5: Över intestinal bitar till 10 mL PBS, shake för 20 s, och häll i en 100 mm petriskål. Kontrollera bråkdel under mikroskopet. Vanligtvis, detta skede extraheras mycket få kryptor. Om mer än några kryptor extraheras, Fortsätt sedan med en 6th -fraktion.
      Obs: Om en ren crypt befolkning önskas (t.ex. för organoid generation), sedan använda en 70 µm cell SIL att ta bort eventuella intakt villi från crypt-berikad fraktionen.
    13. Samla in fraktioner 3-5 i separat 15 mL koniska rör och centrifugera vid 300 x g under 5 minuter.
    14. Kontrollera pellets av fraktioner 3 - 5 och ta bort supernatanterna utan att störa pellets, och omedelbart gå vidare till fixering (avsnitt 3).

2.Isolering av Intestinal Organoids från källaren Matrix kupoler i 24 brunnar

Obs: Bildandet av organoids inom källaren matrix kupoler har varit beskrivs på annan plats12.

  1. Coat brunnar med källaren matrix kupol enligt tillverkarens anvisningar.
  2. Tvätta brunnarna som innehåller källaren matrix kupoler med 500 µL av PBS.
  3. Tillsätt kall 250 µL av cell återställningslösning (4 ° C) till varje brunn (se Tabell för material).
    Obs: Kall cell återhämtning lösningen kommer depolymerize alla men stabil mikrotubuli.
  4. Skrapa källaren matrix kupoler med en P1000 mikropipett och noggrant Pipettera upp och ner i hela brunnen för att uppbrottet och avlägsna matrisen källaren från plast.
  5. Samla in supernatanten i 1,5 mL låg bindande mikrocentrifugrör.
  6. Invertera 1,5 mL låg bindande röret flera gånger och kontrollera under mikroskopet om organoids har varit isolerade och är gratis flytta och inte i klumpar. Håll röret under ett stereomikroskop och vyn under låg (50 X) förstoring.
  7. Pellets av organoids genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 min på RT.
  8. Ta bort återhämtning reagens och omedelbart gå vidare till fixering (steg 3).

3. fixering av isolerade Tarmvävnaden och Organoids

  1. Metanol fixering
    1. Återsuspendera den isolera intestinal crypt/villus fraktionen i 10 mL och organoids i 1 mL metanol vid-20 ° C.
    2. Inkubera i kryptor/villi/organoids vid-20 ° C i frysen i 15 min och Invertera rör var 5 minut.
    3. Pellet de kryptor/villi/organoids genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 min.
    4. Ta bort metanol och Lägg tvättlösningen (1 mL för organoids och 10 mL för isolerade crypt/villus fraktioner). Tvättlösningen kan antingen bestå av PBS med 1% serum eller PBS med 0,1% tvättmedel och 1% serum.
      Obs: Använd serum från samma art som de sekundära antikropparna. Till exempel om de sekundära antikropparna genererades i get sedan använda Get serum.
    5. Omedelbart, Centrifugera de kryptor/villi/organoids vid 1 000 x g i 5 min till pellet.
    6. Avlägsna tvättlösningen och återsuspendera de kryptor/villi/organoids i fräsch tvättlösningen.
    7. Placera på en tube rotator med hastigheten satt till 20 rpm. Tvätta cellerna för sammanlagt 1 h, pelletering de kryptor/villi/organoids genom centrifugering (1 000 x g för 5 min) varje 15 min och ersätta tvättlösningen.
      Obs: Om en tube rotator inte finns sedan Invertera rören manuellt varje 5 min för att resuspendera isolerade kulturerna.
  2. Formaldehyd/metanol fixering
    Obs: Hantera fixativ och formaldehyd i dragskåp.
    1. Återsuspendera de isolerade kryptor/villina i 10 mL eller organoids i 1 mL-20 ° C fixativ lösning (9,2 mL metanol med 800 μl formaldehydlösning).
    2. Fixa de kryptor/villi/organoids vid-20 ° C i frysen i 15 min och vänd tuben var 5 minut.
    3. Pellet de kryptor/villi/organoids genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 min.
    4. Ta bort formaldehyd/metanol och Lägg tvättlösningen (1 mL för organoids eller 10 mL för isolerade kryptor/villus fraktioner). Tvättlösningen kan antingen bestå av PBS med 1% get serum eller PBS med 0,1% tvättmedel och 1% serum.
    5. Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min till pellet de kryptor/villi/organoids.
    6. Avlägsna tvättlösningen och återsuspendera i färska tvättlösningen.
    7. Placera på en tube rotator med hastigheten satt till 20 rpm. Tvätta cellerna för sammanlagt 1 h, pelletering de kryptor/villi/organoids genom centrifugering (1 000 x g för 5 min) varje 15 min och ersätta tvättlösningen.
  3. PFA fixering
    FÖRSIKTIGHET: PFA pulver och lösningar bör hanteras i dragskåp.
    Obs: I de flesta fall 4% PFA i PBS används men beroende på bevarandet av antikropp antigenicitet, lägre koncentrationer kan användas.
    1. Återsuspendera de isolerade pelleterat kryptor/villina i 10 mL 4% PFA och inkubera vid RT i 1 h och den isolerade pelleterat organoids i 1 mL 4% PFA och inkubera i 30 min. I båda fallen Invertera rör varje 10 min.
    2. Pellet de kryptor/villi/organoids genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 min.
    3. Ta bort PFA och Lägg tvättlösningen (1 mL för organoids och 10 mL för isolerade kryptor/villi). Tvättlösningen består av PBS med 0,1% tvättmedel och 1% serum.
    4. Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min till pellet kryptor/villi/organoids.
    5. Avlägsna tvättlösningen och återsuspendera i färska tvättlösningen.
    6. Placera på en tube rotator med hastighet satt till 20 rpm. Tvätta cellerna för sammanlagt 1 h, pelletering de kryptor/villi/organoids genom centrifugering (1 000 x g för 5 min) varje 15 min och ersätta tvättlösningen.
      Obs: Om en tube rotator inte finns sedan Invertera rör manuellt varje 5 min för att resuspendera isolerade kulturerna.
    7. Antigen Retrieval (valfritt steg rekommenderas för PFA fixering)
      1. Pellet de kryptor/villi/organoids genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 min och avlägsna supernatanten.
      2. Tillsätt 1-10 mL 10 mM natriumcitrat pH 6.0 (pre värmas till 80 ° C) och inkubera vid 80 ° C i 20 min.
      3. Pellet de kryptor/villi/organoids genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 min och avlägsna supernatanten.
      4. Tillsätt 1-10 mL färsk 10 mM natriumcitrat pH 6.0 (pre värmas till 80 ° C) och inkubera vid RT i 20 min.
      5. Pellet de kryptor/villi/organoids genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 min och avlägsna supernatanten.
      6. Tvätta i 1-10 mL PBS med 1% serum och upprepa en ytterligare 3 gånger pelletering de kryptor/villi/organoids genom centrifugering (1 000 x g för 5 min) innan du lägger till fräsch tvättlösningen.

4. blockera steg

  1. Gör den blockerande lösningen: lägga till 10% sekundära antikroppar arter serum i PBS (tillval: Lägg 0,1% tvättmedel).
  2. Pellet de kryptor/villi/organoids genom centrifugering (1 000 x g för 5 min) och ta bort supernatanten.
  3. Tillsätt 5-10 mL av blockerande lösningen beroende på antalet prover som krävs (se nedan). I detta skede splittrades kryptor/villi/organoids lösningen till enskilda rör (1,5 mL låg bindande mikrocentrifugrör med varje tub som innehåller 0,2 - 1 mL) för färgning med de olika antikropparna.
    Obs: Varje isolerad kryptor/villi bråkdel ger mellan 5-10 prover som kan användas för märkning olika kombinationer beroende på storleken av pelleten. Helst krävs en pellet storlek mellan 2-4 mm för varje prov.
Olika fraktioner kan kombineras i detta skede som kryptor och villi lätt kan identifieras (figur 2).
  • Inkubera i blockering lösning på RT på en tube rotator för 1 h.

    • 5. primär antikropp inkubation

    1. Späd de primära antikroppar (se Tabell för material) i PBS som innehåller 10% serum och 0,1% tvättmedel. Mellan 100 till 200 µL krävs primär antikropp lösning per mikrocentrifug rör prov.
    2. Ta bort blockering lösningen genom centrifugering (1 000 x g för 5 min).
    3. Återsuspendera pelleten kryptor/villi/organoid i primär antikropp lösningen och inkubera vid 4 ° C över natten med en tube rotator (20 RPM) för att hålla de kryptor/villi/organoids i suspension.
    4. Nästa dag: ta proverna tillbaka till RT för 1 h på tube rotator (20 rpm).
    5. Pellet provet genom centrifugering (1 000 x g för 5 min) och ta bort primär antikropp lösningen.
    6. Tillsätt 1 mL tvättlösningen och resuspendera crypt/villus/organoid pellets.
    7. Avlägsna omedelbart lösningen genom centrifugering (1 000 x g för 5 min).
    8. Tillsätt 1 mL fräsch tvättlösningen och snurra cellerna på en tube rotator (20 rpm) i 2 timmar. Ändra tvättlösningen genom centrifugering varje 30 min som i steg 5,7.

    6. sekundär antikropp inkubation

    1. Späd de sekundära antikroppar (se Tabell för material) i PBS med 10% serum och 0,1% tvättmedel. Cirka 200 µL sekundär antikropp lösning krävs per mikrocentrifug rör provet.
      Obs: Mycket cross-absorberade antikroppar bör användas för att minska reaktiviteten av sekundära antikroppar i mus crypt/villus/organoid.
    2. Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min till pellet de kryptor/villi/organoids och återsuspendera pellets i 200 µL sekundär antikropp lösning.
    3. Snurra rören på en tube rotator (20 rpm) på RT för 1 h.
    4. Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min till pellet de kryptor/villi/organoids och ta bort supernatanterna (icke-bundna sekundära antikroppar).
    5. Återsuspendera pelleten i tvättlösningen och omedelbart Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min till pellet de kryptor/villi/organoids.
    6. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL färsk tvättlösning.
    7. Snurra på en tube rotator (20 rpm) på RT för 1,5-2 h, ändra tvättlösningen varje 20-30 min som tidigare beskrivits i steg 6,3-6.6.

    7. nuclear fläcken

    1. Späd den nukleära fläcken i tvättlösningen (enligt tillverkarens protokoll), såsom DAPI eller Hoechst. Till exempel: DAPI stamlösning (20 mg/mL) är utspätt 1:10 000. Stamlösningen kan hållas i alikvoter vid-20 ° C.
    2. Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min till pellet de kryptor/villi/organoids och avlägsna tvättlösningen.
    3. Återsuspendera pelleten i nukleära motfärg lösning.
    4. Snurra på en tube rotator (20 rpm) på RT i 10 min.
    5. Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min till pellet de kryptor/villi/organoids, ta bort den nukleära fläck lösningen och återsuspendera pelleten i tvättlösningen.
    6. Snurra på en tube rotator (20 rpm) på RT för 30-60 min, ändra tvättlösningen varje 10 min.

    8. montering isolerade kryptor, Villi och Organoids

    1. Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min till pellet de kryptor/villi/organoids och ta bort alla tvättlösningen.
      Obs: Om pelleten skingrar, sedan Centrifugera igen.
    2. Tillsätt 2 droppar av hårda inställning montering media med antifade agent att pelleten.
    3. Skär i slutet av en P200 mikropipett och noggrant återsuspendera pelleten i montering media. Undvika att bubblor.
      Obs: Den isolera organoid kulturer är mycket klibbiga; Kontrollera att resuspendera fullt.
    4. Använd en mikropipett för att överföra blandningen av crypts/villi/organoids i montering media lösningen och fördela i en linje längs mitten av ett objektglas.
      Obs: Raden bör inte vara längre än täckglaset som ska användas. Kontrollera med ett stereomikroskop oavsett om de kryptor/villi/organoids är väl spritt på bild och inte klumpgranulat.
    5. Placera försiktigt en cover-glas över toppen; undvika att bubblor.
    6. Placera glasskiva i en bild bok och förvaras i kylskåp över natten för montering media att ställa innan du analysera på confocal Mikroskop.
      Obs: För mus-antikropp färgning i mus vävnad, använda den kommersiella immunofluorescens kit (se Tabell för material). Ersätta det blockerande steget (avsnitt 4) med en 10 min block med protein blockerande lösning följt av en 1 h inkubation med blockerande reagens som medföljer kitet. Lägg sedan till en 1 h inkubation med fluorescens signalreagens enhancer vid steg 5,8 (i mitten tvätt). Sedan använda kit's reagens i fluorescerande dilutant (andra sekundära antikroppar kan också användas i kombination med detta reagens). Inkubera som ovan och fortsätt från steg 6 med resten av protokollet.

    9. fixering och Immuno-märkning av Organoids i källaren matris

    Obs: Organoids är avsett för fixering och immuno-märkning medan återstående inom matrisen källaren genererades i källaren matrix kupoler ovanpå runda glas coverslips i en 24-well platta (en dome per brunn). Organoid källaren matrix kupoler bearbetades inom 24-väl plattan av tillägg och borttagning av de olika lösningarna.

    1. Ta bort mediet från brunnar och Lägg fixeringsvätskan; Låt verka i 1 h.
    2. Ta bort fixeringsvätskan och tvätta i PBS som innehåller 1% serum och 0,1% tvättmedel för 2 h, ändra varje 30 min.
    3. Avlägsna tvättlösningen och blockera i PBS med 10% serum och 0,1% tvättmedel för 1 h.
    4. Späd antikropparna i PBS med 1% serum eller PBS med 1% serum och 0,1% tvättmedel.
    5. Ta bort blockering lösningen och tillsätt 100-200 μL primär antikropp (se Tabell för material) lösning till varje brunn.
      Obs: det är viktigt att ta bort alla blockerande lösningen så att inte späda ut antikroppar ytterligare.
    6. Placera plattan i kylen och inkubera över natten vid 4 ° C
    7. Sedan lämna på RT för 1-2 h.
    8. Ta bort den antikropp lösningen och tvätta för 2-3 h ändra tvättlösningen varje 20 min.
    9. Ta bort alla tvättlösning och tillsätt 100-200 μL sekundära antikroppar utspädda (se Tabell för material) i PBS med 1% serum; Inkubera i 1 h på RT.
    10. Ta bort sekundär antikropp lösningen och tvätta för 2 h, ändra varje 20 min.
    11. Avlägsna tvättlösningen och tillsätt DAPI lösning; Låt verka i 10 min vid RT. användning DAPI stamlösning (20 mg/mL) spädd 1:10, 000.
    Stamlösningen kan hållas i alikvoter vid-20 ° C.
  • Ta bort DAPI lösningen och tvätta i 40 min, ändra varje 10 min.
  • Med pincett, bort täckglaset med källaren matrix kupolen och placera på en bild med källaren matrix kupolen uppåt; Tillsätt några droppar av montering av media och sedan lägga ett täckglas på toppen.
  • Placera i glas-bilden i en bild bok och lämna i kylskåp över natten för montering media att ställa.

    • Representative Results

    Isolering av Tarmvävnaden för immuno-märkning
    De beskrivna vävnad isolering protokoll för tjocktarmen och tunntarmen var optimerad för bevarande och immuno-märkning av mikrotubuli och associerade proteiner, men inte för stamceller livskraft och organoid generation (figur 1 och tabell 1 ). Syftet var att generera kryptan och villus fraktioner som var som rena (saknar slem och annan vävnad) som möjligt, samtidigt minimera exponering för EDTA och kyla för att bevara strukturen och förhindra depolymerization av mikrotubuli med is kallt lösningar, som inducerar depolymerization av alla men stabil mikrotubuli. Figur 2 visar exempel på bilder av fraktioner 2 och 3 från isolerade små Tarmvävnaden, med fraktion 2 innehållande en blandning av både villi och kryptor (figur 2A, B), medan bråkdel 3 innehåller främst kryptor (figur 2 c D).

    Fixering och immuno-märkning av isolerade Tarmvävnaden
    Enskilda eller sammanlagda fraktioner bearbetades sedan för fixering och immuno-märkt genom en serie steg inklusive fixering, tvättmedel, blockering, antikropp och tvätta lösningar, innan vi åter avbryter slutliga villi/kryptor pellet i montering media, överföra bilder och täcka med glas coverslips. De kryptor och villi var sedan avbildas på en confocal Mikroskop.

    Bra förvaring och märkning av mikrotubuli och aktin i både villi och kryptor uppnåddes genom följande: en kombination av formaldehyd/metanol fixering vid-20 ° C, upprepad tvättning i PBS som innehåller 0,1% tvättmedel och 1% serum och blockering i PBS med 0,1% tvättmedel och 10% serum, följt av natten inkubation vid 4 ° C i primära antikroppar och sedan 2 h i sekundära antikroppar vid rumstemperatur (figur 3). Formaldehyd/metanol fixering också fungerat bra för märkning + TIPs som EBs och klipp-170 i isolerade kryptor och villi (figur 4). EB3 ansamlingar i plus-slutet av mikrotubuli (känd som kometer) var tydligt i kryptor (figur 4A), medan föreningen längs gallret av stabil mikrotubuli kunde ses i villi prover (figur 4 c). Distinkta lokalisering av CLIP-170 och p150Glued (subuniten av dynactin) var tydligt på de apikala n-MTOCs i isolerade villi (figur 4B). Fixering med protokollet formaldehyd/metanol fungerade inte konsekvent för ninein lokalisering i isolerade Tarmvävnaden med hjälp av vår Pep3 antikropp mot mus ninein. Dock metanol fixering vid-20 ° C följt av samma tvätt och blockerar lösningar när det gäller formaldehyd/metanol gav mycket bra lokalisering av ninein inom isolerade kryptor och villi (figur 5; referens8). Intressant, medan ninein är koncentrerad på de apikala centrosomes var vissa ackumulering vid cell basen uppenbart i vissa celler inom isolerade kryptor (figur 5). Huruvida detta är på grund av icke-specifik märkning eller en konsekvens av den isolering förfarande försena fixering (och därmed påverka bevarandet) kommer att behöva ytterligare utredning. Metanol-fast (-20 ° C) kryostaten delar av villi (se figur 3bi i8) visade emellertid också ninein på cellen bas i vissa celler tyder på att ninein kan också associera med en basal befolkning av mikrotubuli.

    Fixering och immuno-märkning av organoids isolerade från källaren matris
    Liten intestinal organoids var genereras och odlas i källaren matris i tre veckor eller längre (figur 6A; referens6,15). En kall (4 ° C) cell återställningslösning användes för att isolera organoids från källaren matris. Depolymerized källaren modellösning med organoids överfördes till rören och centrifugeras före fixering och immuno-märkning. Detta produceras mycket rent preparat och tillät bra tillgång till organoids för de olika lösningarna. De differentierade cellerna inom organoid villus domäner innehåller stabila apico-basal mikrotubuli; dessa heter väl i de flesta fall (figur 6B, C) och EB1 kunde också ses längs mikrotubuli gallret (figur 6E; referens13). Men, den kalla cell återställningslösningen kan resultera i depolymerization av de dynamiska mikrotubuli, som var uppenbart i vissa prover av bristen på EB1 kometer (som binder till plus-slutet av växande mikrotubuli) inom de basala crypt domänerna (figur 6F ). I andra prover bevarades astral (dynamisk) mikrotubuli (figur 6 d). Organoid isolering före fixering och immuno-märkning arbetade Junktional proteiner, ninein, klipp-170 och cell markörer, såsom mucin för bägarceller och chromogranin A för enteroendokrina celler.

    Fixering och immuno-märkning av organoids i källaren matris
    Figur 7     visar en organoid skede cysta (A–C) och på ett tidigt utvecklingsstadium crypt (D), både fast i formaldehyd/metanol och immuno-märkt för mikrotubuli och ninein. Bra mikrotubulära bevarande och märkning samt märkning för ninein på apikala n-MTOCs var uppenbara. Figur 8A, B visar en krypta domän inom en dag 6 organoid fast med protokollet metanol och märkt för mikrotubuli och EB1. Bra bevarandet av mikrotubuli och EB1 kometer var tydligt tyder på bevarandet av dynamiska mikrotubuli.

    Organoids var också fasta och immuno-märkt medan återstående inom matrisen källare. Nackdelarna med detta förfarande kan vara dålig penetration av fixativ och svällning av antikroppar inom matrisen källaren (figur 8B), men i båda fallen mindre ofta när 0,1% tvättmedel ingick i fixativ eller tvätta lösningar. Dessutom 4% PFA gjorde inte bevara källaren matrisen väl men orsakade det att upplösa, även om detta var mindre så med 1% PFA.Metanol fixering, däremot, inducerad ibland organoid kollaps.

    Märkning med vissa antikroppar såsom mot stamcells markör Lgr5 och Paneth cell markören CD24 visat sig framgångsrik med 4% PFA, metanol eller formaldehyd/metanol protokollen. Dock infästning av organoids inom matrisen källaren med 1% PFA i PBS med 0,1% tvättmedel vid rumstemperatur resulterade i märkning för både Lgr5 och CD24 (figur 9).

    Figure 1
    Figur 1: isolering av små tarmens villi och kryptor. Flödesdiagram för de viktigaste stegen i små intestinal villus och crypt isolering före fixering och immuno-märkning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 2
    Figur 2: isolerad villi och kryptor från mus tunntarmen. Brightfield mikroskopbilder av intestinal fraktioner visar villi (stora pilar) och kryptor (små pilar). (A, B) Del 2 innehåller en blandning av villi och kryptor, och bevarandet av morfologi på villus och crypt är uppenbart i B. (C, D) Fraktion 3 visar isolering i kryptor och avsaknad av villi och intakt kryptor inklusive en tvåspetsnitar krypta i C. Skala barer = 500 μm (A, C). 100 μm (B, D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 3
    Figur 3: isolerad liten intestinal villus och crypt fast i formaldehyd/metanol och immuno-märkt för mikrotubuli och aktin. (A) Schematisk av villus och krypta epitel med olika celltyper som anges. Rutorna markerade ange de representativa regioner som avbildas i B och C. (B, C) Confocal optiska delar genom en del av en villus (B) och basal crypt (C) isolerade från tunntarmen med hjälp av 30 mM EDTA och fasta i formaldehyd/metanol, tvättas i PBS med 1% get serum och 0,1% tvättmedel, blockerade i PBS som innehåller 10% get serum och 0,1% tvättmedel och märkta för mikrotubuli med råtta monoklonal anti tubulin-antikropp (grön) och aktin med kanin polyklonala anti-β-aktin-antikropp (röd). Väl bevarade apico-basal mikrotubulära buntar är tydligt i både villus och crypt celler och aktin kan ses koncentrerade i apikala regionen inför lumen (pil). Skala barer = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 4
    Figur 4: Isolerade små intestinal kryptan och villi fast i formaldehyd/metanol och immuno-märkt för mikrotubuli, EB3, p150Gluedoch klipp-170. Confocal optiska delar av kryptan och villi regioner isoleras från tunntarmen med hjälp av 30 mM EDTA och fast i formaldehyd/metanol, tvättas i PBS som innehåller 10% get serum och 0,1% tvättmedel, blockerade i PBS som innehåller 10% get serum och 0,1% tvättmedel, och Immuno-märkt. (A) Crypt märkt med kanin polyklonala α-tubulin antikropp (röd) och råtta monoklonal EB3KT36-antikropp (grön) och färgas för DNA med DAPI (blå) visar apico-basal mikrotubuli och EB3 kometer. Inverterad enda kanal bilden visar tydligt EB3 kometer i hela de basala crypt celler tyder på bra bevarandet av dynamisk samt stabil mikrotubuli. (B) Villus epitelceller märkt med kanin polyklonala CLIP-170-antikropp (röd, se också referera16) och mus monoklonal p150Glued antikropp (grön) visar apikala samtidig lokalisering. Inverterad enda kanal bilder visas nedan. (C) Villus celler märkt med kanin polyklonala α-tubulin antikropp (röd) och råtta monoklonal EB3-KT36-antikropp (grön) och färgas för DNA med DAPI (blå) visar apico-basal mikrotubuli med EB3 längs gallret. Föreningen EB3 väven markeras i den förstorade bilden medan den inverterade enda kanal bilden antyder både EB3 kometer och galler association. Skala barer = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 5
    Figur 5: isolerade kolon crypt fixeras i metanol, immuno-märkt för ninein och E-cadherin, och färgas med DAPI. Confocal optiska avsnitt av den basala och transit-förstärka regionen i en krypta isolerade från tjocktarmen med 3 mM EDTA och fast i metanol, tvättas i PBS med 1% get serum och 0,1% tvättmedel och blockerade i PBS som innehåller 10% get serum och 0,1% tvättmedel. Kryptan var märkt med kanin polyklonala ninein antikroppar (Pep3, se även referens8, röd) och mus monoklonal E-cadherin-antikropp (grön) och fläckade DAPI (blå). Inverterad enda kanal bilden visar ninein endast. Bilden visar en välbevarad krypta med E-cadherin avslöjar konturen av enskilda celler och ninein koncentrerade på de apikala centrosomes. Det tyder på god penetration av fixativ och antikroppar, och bevarandet av antigenicitet. Skalstapeln = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 6
    Figur 6: Organoid utveckling, fixering och immuno-märkning av isolerade organoids. (A) fas kontrast bilder visar olika stadier av organoid utveckling från cell aggregat till cysta med knopp initiering och fullt bildade organoids med crypt och villus domäner.(B–F) Confocal optiska delar genom organoids isolerade från källaren matris använder cell återställningslösning vid 4 ° C (10 min) följt av formaldehyd/metanol fixering, tvättning i PBS som innehåller 10% get serum och 0,1% tvättmedel, blockering i PBS som innehåller 10% get serum och 0,1% tvättmedel och immuno-märkning för mikrotubuli, β-catenin och EB1. (B) Organoid cysta märkt för mikrotubuli (blå) och β-catenin (röd) avslöjar bra mikrotubulära bevarande och märkning i de flesta celler. (C) distinkta apico-basal mikrotubuli är tydligt i dessa utvidgade epitelceller från en organoid cysta. (D) att dela celler märkta för mikrotubuli visar spindlar inklusive astral (dynamisk) mikrotubuli (pil). (E, F) Villus domän (E) och crypt domän (F) organoid regioner visar vissa EB1 märkning längs gallret av stabil mikrotubuli, särskilt i villus, medan mycket få EB1 kometer syns även inom basal kryptan tyder på att dynamiska mikrotubuli har inte bevarats. Skala barer = 20 μm (A). 2 μm (D); 5 μm (B, C, E-F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 7
    Figur 7: Organoids fast i källaren matrisen i formaldehyd/metanol och immuno-märkt för mikrotubuli och ninein. Confocal optiska delar av organoids fast i formaldehyd/metanol, tvättas och blockerade i PBS som innehåller 10% get serum och 0,1% tvättmedel och märkt medan återstående i matrisen källare. (A–C) Organoid cysta märkt för mikrotubuli (grön) och ninein (Pep3; referens8, röd) och fläckade DAPI (blå) visar den sammanlagda bilden i A och inverterad enda kanal bilder för mikrotubuli (B) och ninein (C). Bilderna visar apico-basal mikrotubuli och apikala ninein lokalisering, vilket tyder på mycket bra strukturella bevarandet av organoid och penetration av antikroppar samt clearing av obundna antikroppar. (D, E) Organoid med utveckla crypt fast och märkt enligt ovan och igen visar utmärkt strukturella bevarande, märkning och clearing av antikroppar. Distinkt apico-basal mikrotubuli och apikala n-MTOC ninein lokalisering är uppenbart och markeras med den förstorade bilden (E) av boxed regionen i D. Skala barer = 10 μm (A-D); 5 μm (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 8
    Figur 8: Organoids fast inom matrisen källaren i metanol och immuno-märkt för mikrotubuli och EB1. Confocal optiska delar av organoids fast i metanol, tvättas och blockerade i PBS som innehåller 10% get serum och 0,1% tvättmedel och märkt, medan återstående i matrisen källare. (A) cysta domän från en fullt utvecklad organoid märkt med kanin polyklonala α-tubulin (röd) och mus monoklonal EB1 (grön) antikroppar visar apico-basal mikrotubuli, spindlar (pil) i två delande celler och distinkta EB1 kometer. Vissa svällning av obundna EB1 antikroppar är uppenbart. Dock observeras bra strukturella bevarande och märkning av mikrotubuli och EB1. Förekomsten av EB1 kometer antyder att dynamiska mikrotubuli har bevarats (A, Invertera). (B) Inverterad bild av organoid cysta region visar α-tubulin antikropp märkning med betydande antikroppar instängd inom de omgivande källare matrisen (pil). Skala barer = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 9
    Figur 9: Organoids fast i källaren matrisen i 1% PFA och immuno-märkt för Lgr5 och CD24. Confocal optiska delar av organoids fast i källaren matrisen i 1% PFA i PBS som innehåller 0,1% tvättmedel, tvättas i PBS med 1% get serum och 0,1% tvättmedel och märkt med antikroppar mot Lgr5 och CD24. (A, B) Stamcellsnischen i en krypta domän visar Paneth celler positiva för CD24 (röd). Confocal och fas kontrast bilderna har slagits samman i A. B visar den enda kanal av CD24 märkning. (C) stamceller region inom en krypta domän visar en Lrg5 positiva stamceller. Skala barer = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Table 1
    Tabell 1: tidslinje av små intestinal kryptan och villi isolering och fixering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Discussion

    Isolering av Tarmvävnaden
    Isolering av små intestinal kryptor och villi och colonic kryptor innebär att utsätta slemhinneepitel, behandling med EDTA-lösningen att lossa Cellkontakter, fraktionering (skakningar) och centrifugering. Presenterade tarmens villi/crypt isolering protokoll har ändrats från Belshaw et al. och Whitehead o.a. 17 , 18

    Utsätta slemhinneepitel
    Vi har experimenterat med ett antal metoder att exponera slemhinneepitel av tarmkanalen i utvecklingen av detta förfarande. En klassisk metod är att evert (vänd avig) röret, vanligen i segment ca 100 mm lång, med en metallstav som fångas i ett veck av vävnad i ena änden och sedan återstående röret gled över tube19. För musen vävnad är en metallstav (2,4 mm diameter) med rundade ändar perfekt. Denna metod har fördelen att utvidga slemhinneepitel ger bättre tillgång till PBS och EDTA. Vi använde denna metod inledningsvis men flyttade till skär röret i korta längder (ca 5 cm) och öppna varje avsnitt med dissekera saxen som detta visade sig vara lättare. Detta tillvägagångssätt är lämpligt om bara några tarmar är obligatoriskt. men om fler djur skulle vara används i ett experiment då en specialbyggda enhet för styckning öppna röret längdriktningen, som beskrivs av Yoneda o.a. 14 skulle vara effektivare.

    Avlossning av villi och kryptor från muskellagrar
    Inledningsvis använde vi 3 mM EDTA i PBS och relativt långa inkubationstider upp till 60 min för att lossa slemhinneepitel från underliggande vävnad17,18. Vid denna koncentration av EDTA hittade vi en inkubationstid av 30 min var tillräcklig för att lossa kryptor från musen kolon. Dock för tunntarmen crypt/villus isolering provat vi att använda mer koncentrerad EDTA under en kortare tid, vilket visade sig vara en effektiv strategi. Alla efterföljande arbete genomfördes med vävnad som utvinns med hjälp av 30 mM EDTA tekniken genererar relevanta fraktioner för villi eller kryptor. För kryptor, vi poolade normalt fraktionerna 3-5 innan fastställande men det är viktigt att kontrollera om dessa är lämpliga fraktioner eftersom tiderna beror på ett antal faktorer såsom position längs tarmkanalen, ålder mus, inflammation, tidigare kost , etc. på samma sätt hur länge vävnaden behöver skakas efter EDTA behandling vara effektivt kan variera under olika förhållanden. Resultatet är isolerade vävnad fraktioner innehållande en blandning av villi och kryptor eller huvudsakligen antingen villi eller kryptor (figur 2). Eftersom det finns ingen villi i kolon, crypt utvinning kan vara genomförbara i ett steg genom att skaka vävnaden i röret för 30 s. Dessa fraktioner kan sedan fastställas och bearbetas för immuno-märkning.

    Isolering av intestinal organoids från källaren matris
    Isolering av organoids från källaren matrix kupoler kan uppnås med hjälp av cell återställningslösning. Lösningen fungerar av depolymerizing matrisen geléartad källaren men den temperatur måste vara 2-8 ° C. Ett varningens är att dynamiska mikrotubuli inte kan bevaras. Således, för immuno-märkning av dynamiska mikrotubuli och + TIPs såsom cellen EBs, återhämtning från källaren matris före fixering rekommenderas inte. Men de flesta av mikrotubuli i särskiljande organoid cellerna är relativt stabil och dessa bevarades (figur 6). Det fungerade också bra för immuno-märkning av centrosomal och Junktional proteiner som cellen markörer.

    Fixering-protokoll
    Formaldehyd (nygjorda från PFA) är en relativt snabbverkande fixativ som bildar vändbar cross-links och 4% PFA fungerar bra för exempelvis immuno-märkning mikrotubuli och gamma-tubulin och färgning aktin filament med Phalloidin. Mer späd PFA lösningar såsom 1% fungerade bra för immuno-märkning till exempel med stamceller markörer Lgr5 och Paneth cell markören CD24 inom crypt stamcellsnischen, medan högre koncentrationer av PFA inte fungerade.

    Tillsats av glutaraldehyd ger bättre bevarande av mikrotubuli och den så kallade PHEMO fixering som består av en blandning av 3,7% PFA, 0,05% glutaraldehyd och 0,5% tvättmedel i PHEMO buffert (68 mM rör, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA och 3 mM MgCl2)2 ger utmärkt bevarandet av mikrotubuli utan att kompromissa med antigenicitet. Det fungerar också bra för immuno-märkning gamma-tubulin, β-catenin, och E-cadherin och färgning aktin filament med phalloidin. Dock i 3D vävnad och organoid kulturer, PHEMO fixering produceras inkonsekventa resultat och användes därför inte.

    Metanol är ett koaguleringsmedel fixativ som ger relativt bra penetration och tenderar att bevara antigenicitet. Fixering med 100% metanol (-20 ° C) införs vissa krympning, ger måttlig morfologi bevarande och fungerar för mikrotubuli, + TIPs och många centrosomal antikroppar inklusive ninein i 2D cellkulturer. Dock vissa organoids kollapsade när du använder denna metod för fixering. Dessutom penetration av antikroppar genom hela kryptor, villi eller organoids var från början ett problem utan tillsats av 0,1% tvättmedel till tvättlösning och långvarig tvättning uppnått bättre resultat.

    En kombination av formaldehyd och metanol hade tidigare använts av Rogers et al. 20 till immuno-etikett EB1 i Drosophila. En fixering protokollet baserat på en blandning av formaldehyd och metanol har därför utvecklats för Tarmvävnaden och organoids baserat på 3% formaldehyd och 97% metanol kylas ned till-20 ° C, men utelämna 5 mM natriumkarbonat från blandningen som användes av Rogers et al. 20 dessutom prover var fast i frysen vid-20 ° C. Detta fungerat särskilt väl för immuno-märkning + TIPs, såsom klipp-170 och EBs, men också visat sig vara utmärkt för fastställande och immuno-märkning mikrotubuli och aktin inom vävnad och 3D organoids. Mycket bra strukturella konservering var uppenbar och antigenicitet bevarades för flera cytoskeletal och associerade proteiner samt centrosomal proteiner såsom gamma-tubulin och ninein, även om märkning för ninein arbetade mer konsekvent med metanol fixering.

    Disclosures

    Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

    Acknowledgments

    Författarna vill tacka Paul Thomas om Mikroskop råd och stöd. Detta arbete inblandade här stöddes av BBSRC (bevilja nr. BB/J009040/1 till M.M.M. och T.W.).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537-500ML washing and PFA
    Cell Recovery Solution Corning 354253 isolate organoids
    lobind microcentrifuge tubes Eppendorf 30108116 prevent cells sticking
    0.5 M EDTA solution, pH 8.0 Sigma 03690-100ML Crypt isolation
    70 μm cell strainer Fisher Scientific 11517532 Isolate crypts from villi
    Triton X-100 Sigma T8787 detergent
    goat serum Sigma G6767 blocking agent
    Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma used as non-stick agent
    Paraformaldehyde, 4% in PBS Alfa Aesar J61899 fixative
    Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) Sigma F8775 used as fixative
    Methanol 99.9% Analytical grade Fisher M/4000/17 used as fixative
    MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit Maxvision
    Biosciences    		 MF01-S commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling
    Rotator SB2 or SB3 Stuart microcentrifuge tube rotator
    Sodium citrate antigen retrieval
    Hydromount National Diagnostics HS-106 mountant
    DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802 anti-fade agent
    Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges Clarity N/C366 slides
    Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm Clarity NQS13/2250 coverslips
    Matrigel Corning 356231 Basement matrix for 3D organoid culture
    50 mL conical tubes Sarstedt 62.547.254 for processing tissue/organoids
    15 mL conical tubes Sarstedt 62.554.502 for processing tissue/organoids
    1.5 mL LoBind tubes Eppendorf 30108051 for isolated organoids
    Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181 primary antibody 1:500
    Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody Abcam ab6160 primary antibody 1:100
    Rabbit alpha-tubulin antibody Abcam ab15246 primary antibody 1:100
    Rabbit anti-beta-actin antibody Abcam ab8227 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal anti-p150Glued antibody BD Bioscience 610473/4 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal EB3KT36 antibody Abcam ab53360 primary antibody 1:200
    Mouse monoclonal EB1 antibody BD Bioscience 610535 primary antibody 1:200
    Rabbit anti-Lgr5 antibody Abgent AP2745d primary antibody 1:100
    Dylight anti-rat 488 Jackson 112545167 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-mouse 488 Jackson ST115545166 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-rabbit 647 Jackson 111605144 seconday antibody 1:400

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).
    2. Bellett, G., et al. Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).
    3. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells. J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).
    4. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila. J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).
    5. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Curr Opin Cell Biol. , (2016).
    6. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
    7. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
    8. Goldspink, D. A., et al. Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres. Open Biol. 7 (2), (2017).
    9. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. Elife. 5, (2016).
    10. Young, M., Reed, K. R. Organoids as a Model for Colorectal Cancer. Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).
    11. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
    12. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
    13. Goldspink, D. A., et al. The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation. Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).
    14. Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J Vis Exp. (105), e53042 (2015).
    15. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
    16. Coquelle, F. M., et al. LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway. Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).
    17. Belshaw, N. J., et al. Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa. Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).
    18. Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
    19. Hamilton, K. L., Butt, A. G. Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice. Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).
    20. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).

    Tags

    Utvecklingsbiologi fråga 130 Organoid tarmen cytoskelettet mikrotubuli EB1 klipp-170 ninein centrosome Lgr5 epitel
    Immuno-fluorescerande märkning av mikrotubuli och Centrosomal proteiner i <em>Ex Vivo</em> Tarmvävnaden och 3D <em>In Vitro</em> Intestinal Organoids
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Goldspink, D. A., Matthews, Z. J.,… More

    Goldspink, D. A., Matthews, Z. J., Lund, E. K., Wileman, T., Mogensen, M. M. Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56662, doi:10.3791/56662 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter