Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Immuno-fluorescerende mærkning af mikrotubuli og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmens væv og 3D In Vitro tarm Organoids

Published: December 13, 2017 doi: 10.3791/56662
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1School of Biological Sciences, University of East Anglia, 2Norwich Medical School, University of East Anglia

Summary

Vi præsenterer protokoller til isolation af intestinal 3D strukturer fra væv i vivo og in vitro- kælderen matrix indlejret organoids, og detaljer forskellige fiksering og farvning protokoller optimeret til immuno-mærkning af mikrotubulus, centrosomal og junctional proteiner samt som celle markører herunder stamceller protein Lgr5.

Abstract

Fremkomsten af 3D in vitro- organoids, der efterligner i vivo væv arkitektur og morfogenese har meget avanceret mulighed for at undersøge biologiske nøglespørgsmål i celle og udviklingsmæssige biologi. Derudover lover organoids sammen med de seneste tekniske fremskridt i gen redigering og virale gen levering at fremme medicinsk forskning og udvikling af nye lægemidler til behandling af sygdomme. Organoids dyrkes in vitro- i kælderen matrix giver kraftfuld modelsystemer til at studere adfærd og funktion af forskellige proteiner og er velegnet til live-imaging af mærket fluorescerende proteiner. Men om oprettelse af udtryk og lokalisering af de endogene proteiner i ex vivo væv og i in vitro- organoids er vigtigt at kontrollere funktionsmåden for de mærkede proteiner. Til dette formål har vi udviklet og ændret væv isolation, fiksering og immuno-mærkning protokoller for lokalisering af mikrotubuli, centrosomal og tilknyttede proteiner i ex vivo tarmens væv og i in vitro- tarm organoids. Målet var for fiksativ at bevare 3D arkitekturen i organoids/væv samtidig bevare antistof antigenicity og giver god penetration og clearance af fiksativ og antistoffer. Udsættelse for kulde depolymerizes alle, men stabil mikrotubuli og dette var en vigtig faktor, når du ændrer de forskellige protokoller. Vi konstaterede, at øge den ethylendiamintetra syre (EDTA) koncentration fra 3 mM til 30 mM gav effektiv udstationering af villi og Krypter i tyndtarmen, mens 3 mM EDTA var tilstrækkelig for Colon Krypter. Udviklede formaldehyd/metanol fiksering protokol gav meget god strukturel bevarelse samtidig også bevare antigenicity for effektiv mærkning af mikrotubuli, aktin og ende-bindende (EB) proteiner. Det arbejdede også for centrosomal protein ninein selv om methanol protokol arbejdede mere konsekvent. Vi etableret yderligere, at fiksering og immuno-mærkning af mikrotubuli og tilknyttede proteiner kan opnås med organoids isoleret fra eller resterende inden for matrixen kælder.

Introduction

Dannelsen af epitheler med apico-basal polaritet er en grundlæggende proces i udvikling og indebærer en dramatisk reorganisation af mikrotubuli og centrosomal proteiner. En radial mikrotubulus array fra en centralt beliggende centrosomal mikrotubulusorganiserende center (MTOC) er fremtrædende i mange animalske celler og dette er velegnet til relativt flade celler. Derimod samle kolonneformat epitel celler, som de i tarmen, ikke-radial transcellular mikrotubulus arrays, der bedre understøtter den form og specialiserede funktioner af disse celler. Denne dramatiske reorganisering af mikrotubuli er opnået ved at centrosome flytter til apex og apikale ikke-centrosomal MTOC (n-MTOC) danner, der bliver ansvarlig for forankring af transcellular mikrotubuler1,2 , 3 , 4 , 5.

Meget af vores viden om epitelial differentiering og tilknyttede mikrotubulus reorganisering er kommet fra undersøgelser af 2D i vitro cellelag, der ikke vises i vivo væv arkitektur. Udvikling af 3D in vitro- organoid kulturer, pioner af Clevers og co-arbejdere6, repræsenterer et stort teknologisk fremskridt, da de efterligner i vivo arkitektur og udvikling. Et hierarki af epitel differentiering er tydelig i tarmen; stamceller i bunden af Krypter give anledning til umodne transit forstærke celler, som formere sig og differentiere efterhånden som de vandrer op krypten ind på den lille tarm villus eller Colon overflade, hvor de bliver fuldt differentierede inden kaste ind i lumen7. Vigtigere, er dette gentaget i tarm organoids hvor celler fra stamceller niche formere danner cyster, der efterfølgende genererer krypt-lignende knopper med stamceller i bunden og differentiering gradvist fremskridt i retning af regionen cyste der bliver villus-lignende8. Den intestinale organoid udgør derfor en kraftfuld model til at studere ikke blot mikrotubulus og centrosomal reorganisering under epithelial differentiering, men mange andre proteiner samt giver en ideel platform for screening af medicin og mad forbindelser af potentielle terapeutiske fordele9,10.

Organoids er velegnet til live-imaging af fluorescerende-tagged proteiner samt både knock- og knock-out organoids kan genereres ved hjælp af CRISPR/Cas9 gen redigering11,12. Men de udtryk og lokalisering af de endogene proteiner til at blive undersøgt er vigtigt, især for at kontrollere funktionsmåden for de mærkede proteiner. Immuno-mærkning 3D organoids dyrkes i kælderen matrix eller ex vivo isoleret væv er mere komplekse end celler dyrkes i kultur retter i 2D. Fiksering protokol skal bevare den sarte 3D arkitektur af organoids samtidig stadig bevare antistof antigenicity (dvs., epitoper for bindende antistoffer). For eksempel, 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) er almindeligt anvendt som fiksativ, men mens det er relativt hurtig virkende fiksativ og giver gode morfologiske bevarelse, vores erfaring det ofte resulterer i tab af antigenicity og er ikke egnet til mange centrosomal antistoffer. Fiksativ og antistoffer evne til at trænge ind i 3D strukturer og væv bør også overvejes. Vi har ændret herpå, og udviklede protokoller for væv isolation og indirekte immuno-mærkning af 3D in vitro- organoids og ex vivo isoleret tarmens væv. Vi beskriver, hvordan du isolere lille tarm krypter og villi og Colon væv, og omfatter en protokol til isolation af 3D organoids som et alternativ til fastsættelse og immuno-mærkning inden for matrixen kælder. Vi præsenterer tre alternative fiksering protokoller for immuno-mærkning af mikrotubuli og centrosomal proteiner, såsom ninein, og mikrotubulus plus-ende tracking proteiner (+ TIPs), såsom EB proteiner og klip-170 (Se også referencer8, 13). Vi også diskutere fordele og ulemper knyttet til hver protokol.

Protocol

Alle metoder, der beskrives her blev udført ifølge University of East Anglia's institutionelle licens retningslinjer.

1. isolering af tarmens væv

  1. Isolering af Colon Krypter for immuno-mærkning (Se figur 1, skematisk)
    1. Aflive den mus (ved hjælp af CO2 kvælning) og fjerne tyktarmen (starter ved caecum og uddrager caudally) med dissekere saks og pincet14.
    2. Skyl indhold af tyktarmen med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved hjælp af et glas pipette med gummi pære. PBS: natriumchlorid (8,0 g/L), kalium chloride (0,2 g/L), dinatrium hydrogen fosfat (1,15 g/L) og kalium dihydrogen fosfat (0,2 g/L), ved pH 7.3.
    3. Bruger en metalstang (2,4 mm diameter) eller slutningen af et glas pipette, holde ene ende af Colon rør mens du forsigtigt glide vævet over stang/pipette således everting Colon vævet så at epitel er nu på ydersiden.
      Bemærk: Hvis dette ikke er muligt derefter åbne tyktarmen med saks og skive i 5 mm stykker.
    4. Overfør everted tyktarmen eller stykker til en 50 mL konisk slange der indeholder 40 mL PBS.
    5. Vend røret flere gange til yderligere Fjern tarmindhold, slim, osv.
    6. Overføre kolon/stykker til 40 mL 3 mm EDTA i PBS og inkuberes ved stuetemperatur (RT) for 15 min.
      Bemærk: Fortynd 0,5 M EDTA pH 8,0 lager med PBS.
    7. Ryste for at fjerne slim og overføre kolon/stykker til en 50 mL konisk rør indeholdende frisk 40 mL 3 mM EDTA i PBS. Inkuber i 35 min på RT.
    8. Overføre kolon/stykker til 10 mL PBS i en 50 mL konisk slange og rystes kraftigt i 30 s til at frigive Krypter (crypt brøkdel).
    9. Fjerne tyktarmen/stykker fra røret og placere tilbage i 3 mM EDTA i tilfælde af yderligere isolation er påkrævet. Der centrifugeres den resterende krypt fraktion på 300 x g i 5 min.
    10. Fjern 5 mL af supernatanten og resuspenderes krypten i de resterende 5 mL volumen.
    11. Observere under et stereomikroskop med zoom (50-100 X forstørrelse) skal kontrolleres for tilstedeværelse af Colon Krypter.
      Bemærk: Hvis der er ingen Krypter stede derefter inkuberes kolon/stykker i 3 mM EDTA i PBS for en anden 30 min og Gentag derefter trin 1.1.8 - 1.1.11.
    12. Der centrifugeres krypt brøkdel på 300 x g i 5 min.
    13. Fjerne alle supernatanten for at opnå en krypt pellet og gå straks til fiksering (afsnit 3).
  2. Isolering af lille tarm krypter og villi for immuno-mærkning (figur 2)
    1. Aflive mus (ved hjælp af CO2 kvælning) og fjerne tyndtarmen (proksimale duodenum til terminal ileum) med dissekere saks og pincet14.
      Bemærk: for at se forskellige dele af tyndtarmen og derefter på dette stadium adskille og behandle særskilt. Se figur 1 og tabel 1 for et Blokdiagram og tider.
    2. Skyl indholdet af tyndtarmen med PBS ved hjælp af et glas pipette med gummi pære.
    3. Skar tyndtarmen med dissekere saks og placere i 15 mL PBS i en petriskål.
    4. Forsigtigt vaske tarmen i PBS til at fjerne luminale indhold mens ikke ødelægger slimhinden. Overføre væv til en frisk petriskål og Gentag PBS vask.
    5. Skær tarmen i 3-5 mm udskæringer og overførsel til en 100 mm petriskål indeholder 15 mL af 30 mM EDTA i PBS og inkuberes for 5 min på RT. Alternativt Inkuber i 3 mM EDTA i PBS i 30 min.
    6. Fraktion 1 (Villi isolation): overføre de intestinale stykker i 10 mL PBS i en 50 mL konisk tube, ryst kraftigt i 10 s, og hæld i en 100 mm petriskål. Tjek fraktion for isolerede villi under et stereomikroskop. På dette tidspunkt, for det meste villi bør være til stede, men dette kan variere mellem isolering.
      Bemærk: For at forhindre isolerede villi/Krypter holder sig til plast, petriskåle og indsamling rør skal være præ-coatede med føtal bovin Serum (FBS). Hæld FBS i retter og/eller rør og straks fjerne den. Se tabel 1 for timing guider for hver fraktion.
    7. Overføre de intestinale stykker tilbage til 30 mM EDTA i PBS og inkuberes i 5 min. Under denne inkubering, indsamle fraktion 1 i en 15 mL konisk tube (præcoatede med FBS) og centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
    8. Fraktion 2: Overføre intestinal stykker til en 50 mL konisk tube med 10 mL PBS, rystes kraftigt 20 s, og derefter hældes i en 100 mm petriskål. Kontrollere brøkdel under mikroskop. Typisk på dette tidspunkt en blandingskultur af villi og Krypter er til stede (figur 2A).
    9. Overføre intestinal stykker tilbage til 30 mM EDTA i PBS og inkuberes i en yderligere 5 min. Under denne inkubering pellet fraktion 2 i en 15 mL konisk slange (præcoatede med FBS) på 300 x g for 5 min. Fjern supernatanten fra fraktioner 1 og 2 uden at forstyrre pelleten og gå straks til fiksering (trin 3).
    10. Brøkdel 3 (Crypt isolation): overføre de intestinale stykker i 10 mL PBS i 50 mL tube, rystes 20 s, og hæld i en 100 mm petriskål. Check brøkdel under mikroskop. På dette stadium, vil brøkdel indeholde overvejende Krypter (figur 2B).
    11. Fraktion 4: Overføre de intestinale stykker i 10 mL PBS, rystes 20 s, og hæld i en 100 mm petriskål. Check brøkdel under mikroskop. På nuværende tidspunkt bør kun Krypter være til stede.
    12. Del 5: Overføre de intestinale stykker i 10 mL PBS, rystes 20 s, og hæld i en 100 mm petriskål. Check brøkdel under mikroskop. Normalt, på dette tidspunkt, er meget få crypts udvundet. Hvis mere end et par crypts er udvundet, derefter fortsætte med en 6th brøkdel.
      Bemærk: Hvis en ren krypt befolkning er ønsket (f.eks. til organoid generation), derefter bruge en 70 µm celle si til at fjerne enhver intakt villi fra krypt-beriget brøkdel.
    13. Indsamle fraktioner 3-5 i separate 15 mL koniske rør og centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
    14. Kontrollere pellets af brøker 3 - 5 og fjerne analysere uden at forstyrre piller, og gå straks til fiksering (afsnit 3).

2.Isolering af tarm Organoids fra kælderen Matrix kupler i 24-godt plader

Bemærk: Dannelsen af organoids i kælderen matrix kupler har været beskrevet andetsteds12.

  1. Frakke brønde med kælder matrix dome ifølge producentens anvisninger.
  2. Vask wells indeholdende kælderen matrix kupler med 500 µL af PBS.
  3. Tilsæt koldt 250 µL af celle opsving opklaring (4 ° C) til hver brønd (Se Tabel af materialer).
    Bemærk: Den kolde celle opsving løsning vil depolymerize alle, men stabil mikrotubuli.
  4. Skrab kælderen matrix kupler ved hjælp af en P1000 mikropipette og omhyggeligt pipetteres op og ned i hele godt til opløsning og fjerne matrixen kælder fra plast.
  5. Indsamle supernatanten i 1,5 mL lave bindende microcentrifuge rør.
  6. Invertere 1,5 mL lave bindende røret flere gange og kontrollere under mikroskop, om organoids er blevet isoleret og kan frit flytte og ikke i klumper. Hold røret under et stereomikroskop og se under lav (50 X) forstørrelse.
  7. Pellet organoids ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min på RT.
  8. Fjerne opsving reagenset og gå straks til fiksering (trin 3).

3. fiksering af isolerede tarmens væv og Organoids

  1. Metanol fiksering
    1. Resuspend isolerede intestinal crypt/villus fraktion i 10 mL og organoids i 1 mL methanol ved-20 ° C.
    2. Inkuber Krypter/villi/organoids ved-20 ° C i en fryser i 15 min og vend røret hvert 5 min.
    3. Pellet Krypter/villi/organoids ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min.
    4. Fjerne methanol og tilføje vask løsning (1 mL organoids og 10 mL for isolerede crypt/villus brøker). Vask løsning kan enten bestå af PBS med 1% serum eller PBS med 0,1% vaskemiddel og 1% serum.
      Bemærk: Brug serum fra samme art som de sekundære antistoffer. For eksempel, hvis de sekundære antistoffer blev genereret i ged derefter bruge ged serum.
    5. Straks, centrifugeres Krypter/villi/organoids ved 1000 x g i 5 min til pellet.
    6. Fjerne vask løsning og resuspend Krypter/villi/organoids i frisk vask løsning.
    7. Sted på en tube rotator med hastigheden sat til 20 rpm. Vaske cellerne for ialt 1 h, pelleringsmidler Krypter/villi/organoids ved centrifugering (1.000 x g for 5 min) hver 15 min og erstatte Vaskeopløsningen.
      Bemærk: Hvis en tube rotator ikke er tilgængelig derefter invertere rør manuelt hvert 5 min for at resuspend isolerede kulturer.
  2. Formaldehyd/metanol fiksering
    Bemærk: Håndtere fikseringsmidler og formaldehyd i et stinkskab.
    1. Resuspend de isolerede Krypter/villi i 10 mL eller organoids i 1 mL-20 ° C Fikseringsvæske løsning (9,2 mL methanol med 800 µL af formaldehyd løsning).
    2. Fix Krypter/villi/organoids ved-20 ° C i en fryser i 15 min og vend røret hvert 5 min.
    3. Pellet Krypter/villi/organoids ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min.
    4. Fjerne formaldehyd/methanol og tilføje vask løsning (1 mL til organoids eller 10 mL for isolerede Krypter/villus brøker). Vask løsning kan enten bestå af PBS med 1% ged serum eller PBS med 0,1% vaskemiddel og 1% serum.
    5. Der centrifugeres ved 1.000 x g for 5 min at sammenpresse Krypter/villi/organoids.
    6. Fjerne vask løsning og resuspend i frisk vask løsning.
    7. Sted på en tube rotator med hastigheden sat til 20 rpm. Vaske cellerne for ialt 1 h, pelleringsmidler Krypter/villi/organoids ved centrifugering (1.000 x g for 5 min) hver 15 min og erstatte Vaskeopløsningen.
  3. PFA fiksation
    Forsigtig: PFA pulver og løsninger skal håndteres i et stinkskab.
    Bemærk: I de fleste tilfælde 4% PFA i PBS er brugt men afhængigt af bevarelse af antistof antigenicity, der kan anvendes lavere koncentrationer.
    1. Resuspend de isolerede pelleted Krypter/villi i 10 mL 4% PFA og inkuberes ved RT i 1 h, og de isolerede pelleted organoids i 1 mL 4% PFA og Inkuber i 30 min. I begge tilfælde invertere røret hver 10 min.
    2. Pellet Krypter/villi/organoids ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min.
    3. Fjerne PFA og tilføje vask løsning (1 mL organoids og 10 mL for isolerede Krypter/villi). Vask løsning består af PBS med 0,1% vaskemiddel og 1% serum.
    4. Der centrifugeres ved 1.000 x g for 5 min at sammenpresse Krypter/villi/organoids.
    5. Fjerne vask løsning og resuspend i frisk vask løsning.
    6. Sted på en tube rotator med hastighed sat til 20 rpm. Vaske cellerne for ialt 1 h, pelleringsmidler Krypter/villi/organoids ved centrifugering (1.000 x g for 5 min) hver 15 min og erstatte Vaskeopløsningen.
      Bemærk: Hvis en tube rotator ikke er tilgængelig derefter invertere rør manuelt hvert 5 min for at resuspend isolerede kulturer.
    7. Antigen hentning (valgfrie trin anbefales til PFA fiksering)
      1. Pellet Krypter/villi/organoids ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min og Fjern supernatanten.
      2. Tilføje 1-10 mL af 10 mM natriumcitrat pH 6.0 (pre opvarmes til 80 ° C) og inkuberes ved 80 ° C i 20 min.
      3. Pellet Krypter/villi/organoids ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min og Fjern supernatanten.
      4. Tilføje 1-10 mL frisk 10 mM natriumcitrat pH 6.0 (pre opvarmes til 80 ° C) og inkuberes ved RT i 20 min.
      5. Pellet Krypter/villi/organoids ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min og Fjern supernatanten.
      6. Vask i 1-10 mL PBS med 1% serum og gentage en yderligere 3 gange pelleringsmidler Krypter/villi/organoids ved centrifugering (1.000 x g for 5 min) før du tilføjer frisk vaskeopløsning.

4. blokerende trin

  1. Gør den blokerende løsning: Tilføj 10% sekundær antistof arter serum i PBS (valgfri: tilføje 0,1% vaskemiddel).
  2. Pellet Krypter/villi/organoids ved centrifugering (1.000 x g for 5 min) og Fjern supernatanten.
  3. Tilføj 5-10 mL af blokerende afhængigt af antallet af nødvendige prøver (Se bemærkningen nedenfor). På dette stadium, opdele Krypter/villi/organoids løsning i enkelte rør (1,5 mL lave bindende microcentrifuge rør med hver tube indeholder 0,2 - 1 mL) til farvning med forskellige antistoffer.
    Bemærk: Hver isolerede Krypter/villi brøkdel vil give mellem 5-10 prøver, der kan bruges til forskellige mærkning kombinationer afhængigt af størrelsen af toerstoffet. Ideelt, en pellet størrelse mellem 2-4 mm er påkrævet for hver prøve.
Forskellige fraktioner kan kombineres på dette tidspunkt som krypter og villi nemt kan identificeres (figur 2).
  • Inkuber i blokerende løsning på RT på en tube rotator for 1 h.

    • 5. primære antistof inkubation

    1. Fortynd de primære antistoffer (Se Tabel af materialer) i PBS, som indeholder 10% serum og 0,1% vaskemiddel. Mellem 100 til 200 µL er primære antistof løsning påkrævet per microcentrifuge tube prøve.
    2. Fjern blokering løsningen ved centrifugering (1.000 x g for 5 min).
    3. Resuspenderes Krypter/villi/organoid i den primære antistof opløsning og inkuberes ved 4 ° C natten over ved hjælp af en tube rotator (20 RPM) for at holde Krypter/villi/organoids i suspension.
    4. Næste dag: bringe prøverne tilbage til RT i 1 time på tube rotator (20 rpm).
    5. Pellet prøven ved centrifugering (1.000 x g for 5 min) og fjerne den primære antistof løsning.
    6. Der tilsættes 1 mL af vask løsning og resuspend villus-crypt-organoid træpiller.
    7. Straks at fjerne løsningen ved centrifugering (1.000 x g for 5 min).
    8. Tilsæt 1 mL frisk vaskeopløsning og spin celler på en tube rotator (20 rpm) i 2 timer. Ændre Vaskeopløsningen ved centrifugering al mulig 30 min i skridt 5.7.

    6. sekundær antistof inkubation

    1. Fortynd de sekundære antistoffer (Se Tabel af materialer) i PBS med 10% serum og 0,1% vaskemiddel. Omkring 200 µL af sekundær antistof løsning er påkrævet per microcentrifuge tube prøve.
      Bemærk: Meget cross-absorberet antistoffer bør bruges til at reducere reaktivitet af sekundære antistoffer i mus crypt/villus/organoid.
    2. Der centrifugeres ved 1.000 x g for 5 min pellet Krypter/villi/organoids og resuspend pellets i 200 µL af sekundær antistof løsning.
    3. Spin rør på en tube rotator (20 rpm) på RT for 1 h.
    4. Der centrifugeres ved 1.000 x g for 5 min pellet Krypter/villi/organoids og fjerne analysere (ikke-bundet sekundære antistoffer).
    5. Resuspenderes i vaskeopløsning og straks centrifugeres ved 1.000 x g for 5 min at sammenpresse Krypter/villi/organoids.
    6. Fjern supernatanten og resuspenderes i 1 mL frisk vaskeopløsning.
    7. Spin på en tube rotator (20 rpm) på RT for 1,5-2 h, ændre Vaskeopløsningen hver 20-30 min, som tidligere beskrevet i trin 6.3-6.6.

    7. nuklear pletten

    1. Fortynd nukleare pletten i vaskeopløsning (ifølge producentens protokol), såsom DAPI eller Hoechst. For eksempel: DAPI stamopløsning (20 mg/mL) er fortyndet 1:10, 000. Stamopløsningen kan opbevares i alikvoter ved-20 ° C.
    2. Der centrifugeres ved 1.000 x g for 5 min pellet Krypter/villi/organoids og fjerne vask løsning.
    3. Resuspenderes i nukleare kontrastfarve løsning.
    4. Spin på en tube rotator (20 rpm) på RT for 10 min.
    5. Der centrifugeres ved 1.000 x g for 5 min pellet Krypter/villi/organoids, fjerne den nukleare pletten løsning og resuspenderes i vaskeopløsning.
    6. Spin på en tube rotator (20 rpm) på RT for 30-60 min, ændre vaskeopløsning hver 10 min.

    8. montering isoleret Krypter, Villi og Organoids

    1. Der centrifugeres ved 1.000 x g for 5 min pellet Krypter/villi/organoids og fjerne alle vaskeopløsning.
      Bemærk: Hvis pelleten spreder, derefter centrifugeres igen.
    2. Tilsæt 2 dråber af hårde indstilling montering media med antifade agent pellet.
    3. Skære i slutningen af en P200 mikropipette og omhyggeligt resuspenderes i montering medier. Undgå at generere bobler.
      Bemærk: De isolerede organoid kulturer er meget klistret; Sørg for at resuspend fuldt ud.
    4. Brug mikropipette til at overføre blanding af Krypter/villi/organoids i montering media løsning, og give afkald på en linje langs midten af et objektglas.
      Bemærk: Linjen bør ikke være længere end den cover-glas, der skal bruges. Kontroller ved hjælp af et stereomikroskop om Krypter/villi/organoids er godt fordelt på dias og ikke klumpet.
    5. Omhyggeligt placere et cover-glas over toppen; undgå at generere bobler.
    6. Placer glas dias i et dias bog og opbevares i køleskab natten over for montering medierne at sætte før analysere på en Konfokal mikroskop.
      Bemærk: For muse-antistof, farvning i mus væv, bruge den kommercielle immunofluorescens kit (Se Tabel af materialer). Erstatte den blokerende trin (afsnit 4) med en 10 min blok med protein blokerende løsning efterfulgt af en 1 h inkubation med den blokerende reagens, der følger med sættet. Derefter på trin 5.8 (midt i vask) tilføje en 1 h inkubation med fluorescens signal forstærker reagens. Derefter bruge kit's reagens i fluorescerende dilutant (andre sekundære antistoffer kan også bruges i kombination med dette reagens). Inkuber som ovenfor og fortsætte fra trin 6 med resten af protokollen.

    9. fiksering og Immuno-mærkning af Organoids i kælderen Matrix

    Bemærk: Organoids bestemt til fiksering og immuno-mærkning forbliver inden for matrixen kælderen blev genereret i kælderen matrix kupler oven på runde glas coverslips i en 24-godt plade (en dome pr. brønd). Organoid kælderen matrix kupler var behandlet inden for 24-godt plade af tilføjelse og fjernelse af de forskellige løsninger.

    1. Fjern mediet fra brønde og tilføje fixativ; orlov for 1 h.
    2. Fjerne fiksativ og vask i PBS indeholdende 1% serum og 0,1% vaskemiddel til 2 h, skiftende hver 30 min.
    3. Fjerne Vaskeopløsningen og blokere i PBS med 10% serum og 0,1% vaskemiddel til 1 h.
    4. Fortynd antistoffer i PBS med 1% serum eller PBS med 1% serum og 0,1% vaskemiddel.
    5. Fjern blokering løsningen og tilføje 100-200 μl primære antistof (Se Tabel af materialer) løsning til hver brønd.
      Bemærk: det er vigtigt at fjerne alle de blokerende løsning for ikke at udvande antistoffer yderligere.
    6. Læg pladen i køleskabet og inkuberes natten over ved 4 ° C
    7. Derefter forlade på RT for 1-2 h.
    8. Fjerne antistof løsning og vask for 2-3 h skiftende vaskeopløsning hvert 20 min.
    9. Fjerne alle vaskeopløsning og tilføje 100-200 μl sekundære antistoffer fortyndet (Se Tabel af materialer) i PBS med 1% serum; Inkuber i 1 time på RT.
    10. Fjerne sekundær antistof løsning og vask i 2 timer, skiftende hver 20 min.
    11. Fjerne Vaskeopløsningen og tilføje DAPI løsning; forlade i 10 min på RT. Brug DAPI stamopløsning (20 mg/mL) fortyndet til 1:10, 000.
    Stamopløsningen kan opbevares i alikvoter ved-20 ° C.
  • Fjerne DAPI løsning og vask i 40 min, skiftende hver 10 min.
  • Brug af pincet, fjerne glas coverslip med kælder matrix dome og sted på et dias med kælder matrix dome opad; Tilsæt et par dråber af montering medier og derefter sætte et glas coverslip på toppen.
  • Placer glas-diaset i et dias bog og lad i køleskabet natten over til montering medierne til at indstille.

    • Representative Results

    Isolering af tarmens væv til immuno-mærkning
    De beskrevne væv isolation protokoller for kolon og tyndtarmen blev optimeret for bevarelse og immuno-mærkning af mikrotubuli og tilknyttede proteiner, men ikke for stamcelleforskning levedygtighed og organoid generation (figur 1 og tabel 1 ). Formålet var at generere krypt og villus fraktioner, der var som ren (slim og andre væv) som muligt, samtidig minimere eksponeringen for EDTA og kolde at bevare strukturen og forhindre depolymerization af mikrotubuli med is kold løsninger, som inducerer depolymerization af alle, men stabil mikrotubuli. Figur 2 viser eksempler på billeder af brøker 2 og 3 fra isolerede lille tarmens væv, med fraktion 2 indeholdende en blanding af både villi og Krypter (figur 2A, B), mens brøkdel 3 indeholder hovedsageligt Krypter (figur 2 c D).

    Fiksering og immuno-mærkning af isolerede tarmens væv
    De enkelte eller kombinerede fraktioner blev derefter behandlet for fiksering og immuno-mærket gennem en række foranstaltninger, herunder fiksering, vaskemiddel, blokering, antistof og vask løsninger, før re suspendere de endelige villi/Krypter pellet i montering medier, overførsel til dias, og dækker med glas coverslips. Krypter og villi blev derefter afbildet på en Konfokal mikroskop.

    God konservering og mærkning af mikrotubuli og aktin i både villi og Krypter blev opnået ved følgende: en kombination af formaldehyd/metanol fiksering ved-20 ° C, gentagen vask i PBS med 0,1% vaskemiddel og 1% serum og blokering i PBS med 0,1% vaskemiddel og 10% serum, efterfulgt af natten inkubation ved 4 ° C i primære antistoffer og derefter 2 h i sekundære antistoffer ved stuetemperatur (figur 3). Formaldehyd/metanol fiksering også fungeret godt for mærkning + TIPs som EBs og klip-170 i isolerede krypter og villi (figur 4). EB3 ophobninger plus-enden af mikrotubuli (kendt som kometer) var tydeligt i Krypter (figur 4A), mens association langs gitter af stabil mikrotubuli kunne ses i villi prøver (figur 4 c). Særskilte lokalisering af CLIP-170 og p150Glued (subunit af dynactin) var tydeligt på de apikale n-MTOC i isolerede villi (figur 4B). Fiksering med formaldehyd/methanol-protokollen arbejde ikke konsekvent for ninein lokalisering i isolerede tarmens væv ved hjælp af vores Pep3 antistof mod mus ninein. Men metanol fiksering ved-20 ° C efterfulgt af samme vask og blokerer løsninger som formaldehyd/methanol gav meget gode lokalisering af ninein inden for isolerede krypter og villi (figur 5; reference8). Interessant, mens ninein er koncentreret på de apikale centrosomes var nogle ophobning på celle base tydeligt i nogle celler i isolerede Krypter (figur 5). Hvorvidt dette er på grund af ikke-specifik mærkning eller en følge af isolation procedure at forsinke fiksering (og dermed påvirke bevarelse) vil har brug for yderligere undersøgelse. Methanol-fast (-20 ° C) frysemikrotomsnit af villi (Se figur 3bi i8) viste imidlertid også, ninein på cellen base i nogle celler, hvilket tyder på, at ninein kan også tilknyttes en basal befolkning af mikrotubuli.

    Fiksering og immuno-mærkning af organoids isoleret fra kælderen matrix
    Lille tarm organoids blev genereret og dyrket i kælderen matrix i tre uger eller længere (figur 6A, reference6,15). En kold (4 ° C) celle opsving løsning blev brugt til at isolere organoids fra matrixen kælder. Depolymeriseret kælderen matrix løsning med organoids blev overført til rør og centrifugeres inden fiksering og immuno-mærkning. Det produceres meget ren præparater og god adgang til organoids for de forskellige løsninger. Den differentierede celler i organoid villus domæner indeholder stabile apico-basal mikrotubuli; disse mærket godt i de fleste tilfælde (fig. 6B, C) og EB1 kunne også ses langs en mikrotubulus gitter (figur 6E; reference13). Men, kolde celle opsving løsning kan resultere i depolymerization af de dynamiske mikrotubuli, som var tydelig i nogle prøver af manglen på EB1 kometer (som binder til plus-slutningen af voksende mikrotubuli) i basal krypt domæner (figur 6F ). I andre prøver, blev astral (dynamisk) mikrotubuli bevaret (figur 6D). Organoid isolation forud for fiksering og immuno-mærkning også arbejdet for junctional proteiner, ninein, klip-170, og celle markører, såsom mucin goblet celler og chromogranin A for enteroendocrine celler.

    Fiksering og immuno-mærkning af organoids i kælderen matrix
    Figur 7     viser en organoid på stadiet cyste (A-C) og på et tidligt stadium af crypt udvikling (D), både fast i formaldehyd/methanol og immuno-mærket for mikrotubuli og ninein. God mikrotubulus bevarelse og mærkning samt mærkning for ninein på apikale n-MTOC var indlysende. Figur 8A, B viser en krypt domæne inden for en dag 6 organoid fast med methanol-protokollen og mærket for mikrotubuli og EB1. God bevarelse af mikrotubuli og EB1 kometer var tydeligt foreslår bevarelsen af dynamiske mikrotubuli.

    Organoids var også fast og immuno-mærket mens de resterende inden for matrixen kælder. Ulemperne ved denne fremgangsmåde kan være dårlig penetration af fiksativ og diffusering af antistoffer i kælderen matrix (fig. 8B), men i begge tilfælde mindre hyppigt når 0,1% vaskemiddel indgik i fiksativ og/eller vaske løsninger. Derudover 4% PFA gjorde ikke bevare kælderen matrix godt men ladet det opløses, selv om dette var mindre så med 1% PFA.Metanol fiksering, på den anden side induceret nogle gange organoid sammenbrud.

    Mærkning med nogle antistoffer som mod stamcelle markør Lgr5 og Paneth celle markør bevist CD24 mislykket med 4% PFA, methanol eller formaldehyd/methanol protokoller. Men, fastsættelse af organoids inden for matrixen kælder med 1% PFA i PBS med 0,1% vaskemiddel ved stuetemperatur resultere i mærkningen for både Lgr5 og CD24 (figur 9).

    Figure 1
    Figur 1: isolering af lille tarm villi og Krypter. Blokdiagram af de vigtigste skridt i lille tarm villus og krypten isolation forud for fiksering og immuno-mærkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2: isoleret villi og Krypter fra mus tyndtarmen. Brightfield mikroskop billeder af tarm fraktioner viser villi (store pile) og crypts (små pile). (A, B) Fraktion 2 indeholder en blanding af villi og Krypter, og bevarelsen af morfologi på villus og krypten er tydelig i B. (C, D) Brøkdel 3 viser isolation krypter og fravær af villi og intakt Krypter herunder en todelt krypten i C. Skalere barer = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3: isoleret lille tarm villus og krypten fast i formaldehyd/methanol og immuno-mærket for mikrotubuli og aktin. (A) skematisk af villus og krypten epitel med forskellige celletyper er angivet. De markerede felter angiver de repræsentative regioner afbildet i B og C. (B, C) Konfokal optiske dele gennem en del af en villus (B) og basal crypt (C) isoleret fra tyndtarmen ved hjælp af 30 mM EDTA og fast i formaldehyd/methanol, vasket i PBS, som indeholder 1% ged serum og 0,1% vaskemiddel, blokeret i PBS som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel, og mærket for mikrotubuli med rotte monoklonalt anti-tubulin antistof (grøn) og aktin med kanin polyklonale anti-β-actin antistof (rød). Velbevaret apico-basal mikrotubulus bundter er tydeligt i både villus og krypten celler, og aktin kan ses koncentreret i den apikale region står over for lumen (pil). Skalere barer = 5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4: Isoleret lille tarm krypt og villi fast i formaldehyd/methanol og immuno-mærket for mikrotubuli, EB3, p150Gluedog klip-170. Konfokal optiske dele af krypt og villi regioner isoleret fra tyndtarmen ved hjælp af 30 mM EDTA og fast i formaldehyd/methanol, vasket i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel, blokeret i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel, og immuno-mærket. (A) krypt mærket med kanin polyklonale α-tubulin antistof (rød) og rotte monoklonale EB3KT36 antistof (grøn) og farvet for DNA med DAPI (blå) viser apico-basal mikrotubuli og EB3 kometer. Single channel-omvendt billede viser tydeligt EB3 kometer i hele basal krypt celler tyder på god konservering af dynamisk og stabil mikrotubuli. (B) Villus epitelceller mærket med kanin polyklonale klip-170 antistof (rød, se også henvise til16) og mus monoklonale p150Glued antistof (grøn) viser apikale Co lokalisering. Inverteret enkelt kanal billeder er vist nedenfor. (C) Villus celler mærket med kanin polyklonale α-tubulin antistof (rød) og rotte monoklonale EB3-KT36 antistof (grøn) og farvet for DNA med DAPI (blå) viser apico-basal mikrotubuli med EB3 langs gitter. Foreningen EB3 gitter er fremhævet i det forstørrede billede inverteret enkelt kanal billedet antyder, at både EB3 kometer og lattice association. Skalere barer = 5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 5
    Figur 5: isolerede kolon krypt fast i methanol, immuno-mærket for ninein og E-cadherin, og farves med DAPI. Konfokal optisk sektion af den basale og uddybning af transit region i en krypt isoleret fra tyktarmen ved hjælp af 3 mM EDTA og fast i methanol, vasket i PBS, som indeholder 1% ged serum og 0,1% vaskemiddel, og blokeret i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel. Krypten blev mærket med kanin polyklonale ninein antistoffer (Pep3, se også reference8, rød) og mus monoklonale E-cadherin antistof (grøn) og farves med DAPI (blå). Single channel-omvendt billede viser ninein kun. Billedet viser en velbevaret krypt med E-cadherin afslørende omridset af de enkelte celler og ninein koncentreret på de apikale centrosomes. Det tyder på god penetration af fiksativ og antistoffer, og bevarelsen af antigenicity. Skalalinjen = 5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 6
    Figur 6: Organoid udvikling, fiksering, og immuno-mærkning af isolerede organoids. (A) fase kontrast billeder viser forskellige faser af organoid udvikling fra celle aggregater til cyste med bud indledning og fuldt dannet organoids med krypt og villus domæner.(B-F) Konfokal optiske dele gennem organoids isoleret fra kælderen matrix ved hjælp af celle opsving løsning ved 4 ° C (10 min) efterfulgt af formaldehyd/metanol fiksering, vask i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel, blokering i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel, og immuno-mærkning for mikrotubuli, β-catenin og EB1. (B) Organoid cyste mærket for mikrotubuli (blå) og β-catenin (rød) afslører god mikrotubulus bevarelse og mærkning i de fleste celler. (C) forskellige apico-basal mikrotubuli er tydelige i disse udvidede epitelceller fra en organoid cyste. (D) dividere celler mærket for mikrotubuli viser spindler herunder astral (dynamisk) mikrotubuli (pil). (E, F) Villus domæne (E) og krypten domæne (F) organoid regioner viser nogle EB1 mærkning langs gitter af stabil mikrotubuli, især i villus, mens meget få EB1 kometer ses selv inden for basal krypten tyder på, at dynamic Mikrotubuli ikke er blevet bevaret. Skalere barer = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E-F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 7
    Figur 7: Organoids fast i matrixen kælder i formaldehyd/methanol og immuno-mærket for mikrotubuli og ninein. Konfokal optiske dele af organoids fast i formaldehyd/methanol, vasket og blokeret i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel og mærket mens de resterende i matrixen kælder. (En-C) Organoid cyste mærket for mikrotubulus (grøn) og ninein (Pep3; reference8, red) og farves med DAPI (blå) viser det flettede billede i A og omvendt enkelt kanal billeder for mikrotubuli (B) og ninein (C). Billederne viser apico-basal mikrotubuli og apikale ninein lokalisering, tyder på meget god strukturel bevarelse af organoid og penetration af antistoffer samt rydning af ubundne antistoffer. (D, E) Organoid med udvikling af crypt fast og mærket som ovenfor og igen viser god strukturel bevarelse, mærkning og clearing af antistoffer. Forskellige apico-basal mikrotubuli og apikale n-MTOC ninein lokalisering er tydeligt og fremhævet i det forstørrede billede (E) af boxed regionen i D. Skalere barer = 10 μm (A-D); 5 μm (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 8
    Figur 8: Organoids fast i matrixen kælder i methanol og immuno-mærket for mikrotubuli og EB1. Konfokal optiske dele af organoids fast i methanol, vasket og blokeret i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel og mærket, mens de resterende i matrixen kælder. (A) cyste domæne fra en fuldt udviklet organoid mærket med kanin polyklonale α-tubulin (rød) og mus monoklonale EB1 (grøn) antistoffer viser apico-basal mikrotubuli, spindler (pil) i to delende celler og særskilte EB1 kometer. Nogle diffusering af ubundne EB1 antistoffer er indlysende. Dog er god strukturel bevarelse og mærkning af mikrotubuli og EB1 observeret. Tilstedeværelsen af EB1 kometer tyder på, at dynamic mikrotubuli er bevaret (A, inverter). (B) Inverted billede af organoid cyste region viser α-tubulin antistof mærkning med betydelig antistoffer fanget inden for det omkringliggende kælderen matrix (pil). Skalere barer = 5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 9
    Figur 9: Organoids fast i matrixen kælder i 1% PFA og immuno-mærket for Lgr5 og CD24. Konfokal optiske dele af organoids fast i matrixen kælder i 1% PFA i PBS, som indeholder 0,1% vaskemiddel, vasket i PBS med 1% ged serum og 0,1% vaskemiddel, og mærket med antistoffer mod Lgr5 og CD24. (A, B) Stem cell niche i en krypt domæne viser Paneth cellerne positiv for CD24 (rød). Konfokal og fase kontrast billeder er blevet slået sammen i A. B viser enkelt kanal CD24 mærkning. (C) stamceller region inden for en krypt domæne viser en Lrg5 positive stamceller. Skalere barer = 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Table 1
    Tabel 1: tidslinje for lille tarm krypt og villi isolation og fiksering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Discussion

    Isolering af tarmens væv
    Isolering af lille tarm krypter og villi og Colon Krypter indebærer udsætter slimhinden, behandling med EDTA-oploesning til at løsne celle kontakter, fraktionering (ryste) og centrifugering. Præsenteres intestinal villi/krypt isolation protokol er blevet ændret fra Belshaw et al. og Whitehead et al. 17 , 18

    Udsætter slimhinden
    Vi har eksperimenteret med en række tilgange til at eksponere slimhinden i tarmkanalen i udviklingen af denne procedure. En klassisk metode er at evert (turn indefra og ud) rør, normalt i segmenter cirka 100 mm lange, ved hjælp af en metalstang, der er fanget i en fold af væv på ene ende og derefter de resterende rør gled over tube19. Beliggenheden er perfekt til musen væv, en metalstang (2,4 mm i diameter) med afrundede ender. Denne fremgangsmåde har fordelen at udvide slimhinden giver bedre adgang til PBS og EDTA. Vi oprindeligt anvendt denne fremgangsmåde men flyttede til skæring af rør i korte længder (ca. 5 cm) og åbne hver sektion med dissekere saks, da dette viste sig lettere. Denne tilgang er passende, hvis kun et par tarmene er påkrævet; men hvis flere dyr skulle være brugt i et eksperiment derefter en specialbyggede enhed til skære åbne røret på langs, som beskrevet af Yoneda et al. 14 ville være mere effektiv.

    Udstationering af villi og Krypter fra muskel lag
    I begyndelsen brugte vi 3 mM EDTA i PBS og forholdsvis lang inkubationstid gange på op til 60 min. for at løsne slimhinden fra det underliggende væv17,18. Ved denne koncentration af EDTA fandt vi en inkubationstiden på 30 min. var tilstrækkelig til at løsne Krypter fra mus kolon. Dog til tyndtarmen crypt/villus isolering prøvet vi at bruge mere koncentreret EDTA i kortere tid, som viste sig for at være en effektiv fremgangsmåde. Alle efterfølgende arbejde blev udført med væv udvundet ved hjælp af 30 mM EDTA teknik generere relevante fraktioner til villi eller Krypter. For Krypter, vi samles normalt fraktioner 3-5 før fastsættelse af men det er vigtigt at kontrollere, om disse er de passende fraktioner, som tider vil afhænge af en række faktorer såsom placering langs tarmkanalen, alder af musen, betændelse, tidligere kost , etc. ligeledes længden af tid, vævet skal blive rystet efter EDTA behandlingen være effektiv kan variere under forskellige betingelser. Resultatet er isoleret væv fraktioner der indeholder en blanding af villi og Krypter eller hovedsagelig enten villi eller crypts (figur 2). Da der er ingen villi i tyktarmen, krypt udvinding kan være opnåelige i ét trin ved at ryste væv i røret til 30 s. Disse fraktioner kan derefter fast og forarbejdet til immuno-mærkning.

    Isolering af tarm organoids fra kælderen matrix
    Isolering af organoids fra kælderen matrix kupler kan opnås ved hjælp af celle opsving løsning. Løsningen virker ved depolymerizing geléagtig kælderen matrix, men temperaturen skal være 2-8 ° C. Et notat af forsigtighed er, at dynamiske mikrotubuli ikke kan bevares. Således, for immuno-mærkning af dynamiske mikrotubuli og + TIPs som cellen EBs, recovery fra kælderen matrix før fiksering anbefales ikke. Men de fleste af mikrotubuli i differentiering organoid cellerne er relativt stabile og disse blev bevaret (figur 6). Det fungerede også godt for immuno-mærkning af centrosomal og junctional proteiner samt celle markører.

    Fiksering protokoller
    Formaldehyd (frisklavet fra PFA) er en relativt hurtig virkende fiksativ, der danner reversible cross-links og 4% PFA fungerer godt for eksempel i immuno-mærkning mikrotubuli og gamma-tubulin og farvning actin filamenter med Phalloidin. Mere fortyndes PFA løsninger såsom 1% fungeret godt for immuno-mærkning for eksempel med stamcelle markører Lgr5 og Paneth celle markør CD24 i krypten stamcelle niche, mens højere koncentrationer af PFA ikke virkede.

    Tilsætning af glutaraldehyd giver bedre bevarelse af mikrotubuli og den såkaldte PHEMO fiksering, som består af en blanding af 3,7% PFA, 0,05% glutaraldehyd og 0,5% vaskemiddel i PHEMO buffer (68 mM rør, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA og 3 mM MgCl2)2 giver fremragende bevarelse af mikrotubuli uden at kompromittere antigenicity. Det virker også godt for immuno-mærkning gamma-tubulin, β-catenin, og E-cadherin og farvning actin filamenter med phalloidin. Dog i 3D væv og organoid kulturer, PHEMO fiksering produceret inkonsistente resultater og derfor ikke blev anvendt.

    Methanol er en koaguleringsmiddel fiksativ, der giver relativt gode penetration og tendens til at bevare antigenicity. Fiksering med 100% methanol (-20 ° C) introducerer nogle krympning, giver moderat morfologi bevarelse og virker for mikrotubuli, + TIPs og mange centrosomal antistoffer, herunder ninein i 2D cellekulturer. Men nogle organoids kollapsede når du bruger denne fiksering metode. Derudover penetration af antistoffer gennem hele Krypter, villi, eller organoids var oprindeligt et problem men tilsætning af 0,1% vaskemiddel til vaskeopløsning og langvarig vask opnåede bedre resultater.

    En kombination af formaldehyd og methanol havde tidligere været brugt af Rogers et al. 20 at immuno-label EB1 i Drosophila. En fiksering protokol baseret på en blanding af formaldehyd og methanol er derfor udviklet til tarmens væv og organoids baseret på 3% formaldehyd og 97% methanol nedkøles til-20 ° C, men udelade natriumcarbonat 5 mM fra den blanding, der blev brugt af Rogers mfl. 20 desuden prøver blev fastsat i fryser ved-20 ° C. Dette fungerede særdeles godt for immuno-mærkning + TIPs, såsom klip-170 og EBs, men også viste sig fremragende til fastsættelse og immuno-mærkning mikrotubuli og aktin inden for væv og 3D organoids. Meget god strukturel bevarelse var tydelig og antigenicity blev bevaret for flere cytoskeletal og tilknyttede proteiner samt centrosomal proteiner som gamma-tubulin og ninein, selv om mærkning for ninein arbejdede mere konsekvent med methanol fiksering.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Forfatterne vil gerne takke Paul Thomas for mikroskopet rådgivning og bistand. Dette arbejde involveret her blev støttet af BBSRC (give nr. BB/J009040/1 M.M.M. og T.W.).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537-500ML washing and PFA
    Cell Recovery Solution Corning 354253 isolate organoids
    lobind microcentrifuge tubes Eppendorf 30108116 prevent cells sticking
    0.5 M EDTA solution, pH 8.0 Sigma 03690-100ML Crypt isolation
    70 μm cell strainer Fisher Scientific 11517532 Isolate crypts from villi
    Triton X-100 Sigma T8787 detergent
    goat serum Sigma G6767 blocking agent
    Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma used as non-stick agent
    Paraformaldehyde, 4% in PBS Alfa Aesar J61899 fixative
    Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) Sigma F8775 used as fixative
    Methanol 99.9% Analytical grade Fisher M/4000/17 used as fixative
    MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit Maxvision
    Biosciences    		 MF01-S commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling
    Rotator SB2 or SB3 Stuart microcentrifuge tube rotator
    Sodium citrate antigen retrieval
    Hydromount National Diagnostics HS-106 mountant
    DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802 anti-fade agent
    Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges Clarity N/C366 slides
    Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm Clarity NQS13/2250 coverslips
    Matrigel Corning 356231 Basement matrix for 3D organoid culture
    50 mL conical tubes Sarstedt 62.547.254 for processing tissue/organoids
    15 mL conical tubes Sarstedt 62.554.502 for processing tissue/organoids
    1.5 mL LoBind tubes Eppendorf 30108051 for isolated organoids
    Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181 primary antibody 1:500
    Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody Abcam ab6160 primary antibody 1:100
    Rabbit alpha-tubulin antibody Abcam ab15246 primary antibody 1:100
    Rabbit anti-beta-actin antibody Abcam ab8227 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal anti-p150Glued antibody BD Bioscience 610473/4 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal EB3KT36 antibody Abcam ab53360 primary antibody 1:200
    Mouse monoclonal EB1 antibody BD Bioscience 610535 primary antibody 1:200
    Rabbit anti-Lgr5 antibody Abgent AP2745d primary antibody 1:100
    Dylight anti-rat 488 Jackson 112545167 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-mouse 488 Jackson ST115545166 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-rabbit 647 Jackson 111605144 seconday antibody 1:400

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).
    2. Bellett, G., et al. Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).
    3. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells. J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).
    4. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila. J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).
    5. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Curr Opin Cell Biol. , (2016).
    6. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
    7. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
    8. Goldspink, D. A., et al. Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres. Open Biol. 7 (2), (2017).
    9. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. Elife. 5, (2016).
    10. Young, M., Reed, K. R. Organoids as a Model for Colorectal Cancer. Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).
    11. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
    12. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
    13. Goldspink, D. A., et al. The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation. Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).
    14. Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J Vis Exp. (105), e53042 (2015).
    15. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
    16. Coquelle, F. M., et al. LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway. Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).
    17. Belshaw, N. J., et al. Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa. Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).
    18. Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
    19. Hamilton, K. L., Butt, A. G. Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice. Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).
    20. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).

    Tags

    Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 130 Organoid tarmen cytoskeleton mikrotubuli EB1 klip-170 ninein centrosome Lgr5 epitheler
    Immuno-fluorescerende mærkning af mikrotubuli og Centrosomal proteiner i <em>Ex Vivo</em> tarmens væv og 3D <em>In Vitro</em> tarm Organoids
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Goldspink, D. A., Matthews, Z. J.,… More

    Goldspink, D. A., Matthews, Z. J., Lund, E. K., Wileman, T., Mogensen, M. M. Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56662, doi:10.3791/56662 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter