Summary
선물이 vivo에서 조직에서 장 3 차원 구조의 절연에 대 한 프로토콜 및 지하실 매트릭스 생체 외에서 organoids, 및 세부 다른 정착 immuno-microtubule의 라벨에 대 한 최적화 된 프로토콜을 얼룩이 지 포함 centrosomal, 그리고 접합 단백질도로 표식 줄기 세포 단백질 Lgr5를 포함 하 여 셀.
Abstract
Vivo에서 조직 아키텍처와 morphogenesis 모방 3D 생체 외에서 organoids의 출현 크게 세포 및 개발 생물학에서 중요 한 생물 학적 질문을 공부 하는 능력을 고급 있습니다. 또한, 유전자 편집 및 바이러스 성 유전자 전달에 최근의 기술 진보와 함께 organoids 의료 연구 및 질병의 처리를 위한 새로운 약물의 개발을 약속 드립니다. Organoids에서 생체 외에서 지 매트릭스에서 성장 문제를 연구 하 고 다양 한 단백질의 기능에 대 한 강력한 모델 시스템을 제공 하 고 형광 태그 단백질의 라이브 이미징에 대 한 적합. 그러나, 설립 식 및 생 단백질의 지역화 ex vivo 조직에 생체 외에서 organoids는 태그 단백질의 동작을 확인 해야 합니다. 이 위해 우리 개발 하 고 조직 분리, 고정, 및 전 비보 장 조직 및 체 외에 장 organoids microtubules, centrosomal, 및 관련 단백질의 지역화에 대 한 면역 라벨 프로토콜 수정. 또한 항 체 antigenicity을 보존 하 고 좋은 침투 및 정착 액 및 항 체의 사용 하는 동안 organoids/조직의 3 차원 구조를 보존 하기 위해 정착 제에 대 한 목표가 이었다. 안정적인 microtubules 제외한 모든 감기에 노출 depolymerizes 그리고 다양 한 프로토콜을 수정할 때 중요 한 요소 했다. 우리는 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 농도 3 밀리미터에서 30 밀리미터에 증가 했다 villi 및 소장에 있는 지하실의 효율적인 분리 3 mM EDTA가 저 승 지하실에 대 한 충분 한 발견. 개발 된 포름알데히드/메탄올 기정 프로토콜 antigenicity microtubules, 말라와 최종 바인딩 (EB) 단백질의 효과적인 라벨에 대 한 보존 하는 동안 아주 좋은 구조 보존을 했다. 그것은 또한 centrosomal 단백질 ninein 메탄올 프로토콜 일 더 일관 되 게 비록 근무. 우리는 더 고정 및 microtubules과 관련 된 단백질의 면역 라벨 organoids에서 격리 또는 지 매트릭스 내 남아 있는과 달성 될 수 있었다 설립.
Introduction
Apico 기초 극성으로 epithelia의 형성 개발에서 기본 과정 이며 microtubules centrosomal 단백질의 극적인 개편을 포함 한다. 방사형 microtubule 배열 위치 centrosomal microtubule 센터 조직에서 나오는 (MTOC) 많은 동물 세포에서 저명한 이며 이것이 비교적 평평한 세포에 적합. 반면, 원주 상피 세포, 소장의 그들과 같은 더 나은 모양 및 이러한 셀의 특수 기능을 지 원하는 비 방사형 transcellular microtubule 배열 조립. microtubules의이 극적인 개편 transcellular microtubules1,2 의 앵커리지에 대 한 책임 되는 centrosome 꼭대기와 꼭대기 비 centrosomal MTOCs (n MTOCs) 형성, 이동에 의해 이루어집니다. , 3 , 4 , 5.
상피 분화와 관련된 microtubule 개편의 우리의 지식을 많은 2D 체 외에서 세포 층 vivo에서 조직 아키텍처를 표시 하지 않는의 조사에서 왔다. 6Clevers와 동료 의해 개척 organoid 문화, 3 차원 생체 외에서 개발 그들은 모방 vivo에서 아키텍처 및 개발 주요 기술적 진보를 나타냅니다. 상피 분화의 계층은 분명 소장; 지하실의 하단에 줄기 세포 미 숙 이동 증폭 세포를 증식 하 고 점차적으로 그들은 완전히 이전 되 고 분화 되는 작은 장 모 또는 저 승 표면에 토 굴을 마이그레이션할로 차별화를 일으키합니다 루멘7에 창. 중요 한 것은,이 장 organoids 줄기 세포 틈새에서 셀 이후에 아래와 낭종 지역으로 점차적으로 진행 하는 차별화에 줄기 세포와 토 굴 같은 싹을 생성 하는 형성 cysts을 증식에 복제 됩니다. 이 모 같은8된다. 장 organoid 따라서 microtubule 상피 분화 하지만 다른 수많은 단백질 뿐만 아니라, 의약품 및 식품의 심사에 대 한 이상적인 플랫폼을 제공 하는 동안 centrosomal 개편 뿐만 아니라 공부 하 고 강력한 모델을 나타냅니다. 화합물의 잠재적인 치료 혜택9,10.
Organoids 형광 태그 단백질의 라이브 이미징에 대 한 적합은 둘 다 노크-에서 노크 아웃 organoids11,12편집 CRISPR/Cas9 유전자를 사용 하 여 생성 될 수 있습니다. 그러나, 식 및 공부 생 단백질의 지역화 설정 태그 단백질의 동작을 확인 하기 위해 특히 중요 하다. 면역 라벨 3D organoids 지 매트릭스 또는 전 비보 고립에서 성장 조직 차원에서 문화 요리에서 성장 하는 세포 보다 더 복잡 하다. 기정 프로토콜 (즉, 항 체 바인딩을 위한 epitopes) 항 체 antigenicity 유지 하면서 organoids의 섬세 한 3D 건축을 보존 해야 합니다. 예를 들어 4 %paraformaldehyde (PFA) 일반적으로 정착 액으로 사용 하지만 상대적으로 빠른 행동 정착 액은 그것 좋은 형태 보존을 제공 하는 동안 우리의 경험에 그것 자주 antigenicity의 손실 귀착되 고 많은 적합 하지 않습니다. centrosomal 항 체입니다. 3 차원 구조와 조직에 침투 하는 정착 제와 항 체의 능력 또한 고려 되어야 한다. 이 위해, 우리 수정 하 고 조직 격리 및 간접 면역 3 차원 생체 외에서 organoids 및 전 비보 의 라벨에 대 한 개발된 프로토콜 고립 장 조직. 우리는 작은 장 지하실과 villi 조직과 저 승, 격리 하 고 해결 하 고 지하실 매트릭스 내에서 면역 라벨 대신 3D organoids의 격리에 대 한 프로토콜을 포함 하는 방법을 설명 합니다. 선물이 microtubules와 centrosomal, ninein, 등 단백질과의 microtubule 플러스-엔드 추적 단백질 (+ 팁), EB 단백질 및 클립-170 (참고 참조8, 같은 면역 라벨에 대 한 세 가지 대안 기정 프로토콜 13). 우리는 또한 각 프로토콜 관련 된 장단점 토론.
Protocol
여기서 설명 하는 모든 방법의 이스트 앵글 리아 대학의 기관 라이센스 지침에 따라 수행 했다.
1입니다. 창 자 직물의 절연
- 면역 라벨에 대 한 저 승 지하실의 격리 (참조 그림 1, 도식)
- (를 사용 하 여 CO2 질) 마우스를 안락사와 콜론 (는 caecum에서 시작 하 고 caudally 추출) 제거가 위와 핀셋14해 부와 함께.
- 고무 전구 유리 피 펫을 사용 하 여 버퍼링 인산 염 염 (PBS)와 콜론의 콘텐츠를 플러시. PBS: 염화 나트륨 (8.0 g/L), 염화 칼륨 (0.2 g/L), disodium 수소 인산 염 (1.15 g/L), 고 칼륨 디 인산 염 (0.2 g/L), pH 7.3에서.
- Using 금속 막대 (2.4 m m 직경) 또는 유리 피 펫의 끝는 상피 지금 외부에 따라서 저 승 조직 everting 막대/피 펫을 통해 조직을 부드럽게 슬라이딩 하면서 저 승 관의 한쪽 끝을 잡으십시오.
참고:이 가능 하지 않으면 다음 열 콜론이 위와 슬라이스 5mm 조각으로. - PBS의 40 mL를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 나왔으며 콜론 또는 조각을 전송.
- 몇 번을 더 제거 장 내용, 점액, 등 튜브 반전
- 3 mm EDTA PBS에서 40 mL에 콜론/조각 전송 및 15 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어.
참고: PBS 0.5 M EDTA pH 8.0 재고 희석. - 점액을 제거 하 고 3mm PBS에 EDTA의 신선한 40 mL를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 콜론/조각 전송을 흔들어. 실시간에서 35 분 동안 품 어
- 콜론/조각 50 mL 원뿔 튜브에 10 mL PBS의 전송 및 30에 대 한 적극적으로 악수 납골당 (crypt 분수)를 공개 하는 s.
- 튜브에서 콜론/조각을 제거 고 다시 3 mM EDTA 경우 추가 격리 필요 합니다. 나머지 토 굴 분수 5 분에 대 한 300 x g에서 원심
- 상쾌한의 5 mL을 제거 하 고 나머지 5 mL 볼륨에 크립 트 펠 릿 resuspend.
- 저 승 지하실의 존재에 대 한 확인을 줌 (50-100 배 확대) stereomicroscope에서 관찰.
참고: 있는 경우 현재 아무 지하실 다음 콜론/조각에 3 mM EDTA PBS에 또 다른 30 분을 품 어 고 반복 단계 1.1.8-1.1.11. - 크립 트 분수 5 분에 대 한 300 x g에서 원심
- 크립 트 펠 릿 고정 (제 3)에 즉시 진행 하 모든 상쾌한을 제거 합니다.
- 작은 장 지하실 및 면역 라벨에 대 한 villi의 격리 (그림 2)
- (를 사용 하 여 CO2 질) 마우스를 안락사 고가 위와 핀셋14해 부와 작은 창 자 (십이지 장 근 위 터미널 회장)를 제거 합니다.
참고: 다른 보기를 섹션 소장의 다음이 단계에 분리 하 고 별도로 취급. 흐름 다이어그램 및 타이밍에 대 한 그림 1 및 표 1 을 참조. - 고무 전구를 가진 유리 피 펫을 사용 하 여 PBS를 가진 소장의 내용을 플러시하십시오.
- 오픈 소장 해가 위로 잘라내어 15 mL PBS 페 트리 접시에에 놓습니다.
- 부드럽게 점 막 표면 손상 되지 동안 luminal 콘텐츠를 제거 하는 PBS에 내장을 씻어. 조직 신선한 배양 접시에 전송 하 고 PBS 세척을 반복 합니다.
- 소장 3-5mm 조각으로 잘라 100 mm 페 트리 접시 30 mM EDTA에 PBS의 15 mL를 포함 전송 및 실시간 또는에서 5 분 30 분 PBS에서 3 mM EDTA에 품 어 대 한을 품 어.
- 분수 1 (Villi 격리): 장 조각 50 mL 원뿔 튜브, 적극적으로 한 10 s, 100 mm 페 트리 접시에 부 어 쉐이크에 PBS의 10 mL로 전송. 절연된 villi는 stereomicroscope 아래에 대 한 분수를 확인 하십시오. 이 단계에서 주로 villi 존재 해야 하지만이 격리 사이 다를 수 있습니다.
참고: 격리 villi/지하실을 방지 하기 위해 플라스틱, 접시 및 컬렉션 튜브에 집착 이어야 한다 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 사전 코팅. 요리 또는 튜브에 FBS를 부 어 하 고 즉시 그것을 제거. 각 부분에 대 한 타이밍 가이드 표 1 을 참조 하십시오. - 장 조각 30 m EDTA PBS에서 m으로 다시 전송 하 고 5 분 동안 품 어. 이 잠복기 동안 15 mL 원뿔 튜브 (FBS와 도장된)에 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 분수 1을 수집 합니다.
- 분수 2: 100 mm 페 트리 접시에 PBS, 적극적으로 한 20 s, 다음 부 어 쉐이크의 10 mL를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브 장 조각을 전송. 현미경 분수를 확인 하십시오. 일반적으로이 단계 villi 및 지하실의 혼합된 문화에서 (그림 2A) 현재는.
- 장 조각 30 m EDTA PBS에서 m으로 다시 전송 하 고 추가로 5 분 동안 품 어. 이 부 화 하는 동안 작은 분수 2 (FBS와 도장된) 15 mL 원뿔 튜브에 300 x g에 5 분에 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한 분수 1 및 2에서 제거 하 고 고정 (3 단계)에 즉시 진행.
- 분수 3 (암호 격리): 장 조각 50 mL 튜브, 20 s, 및 100 mm 페 트리 접시에 부 어 쉐이크에 PBS의 10 mL로 전송. 현미경 분수를 확인 하십시오. 이 단계에서 분수 지하실 (그림 2B)를 주로 포함 됩니다.
- 분수 4: 10 mL PBS, 20 s, 및 100 mm 페 트리 접시에 부 어 쉐이크의 장 조각을 전송할. 현미경 분수를 확인 하십시오. 이 단계에서 지하실만 존재 해야 합니다.
- 5 분수: 10 mL PBS, 20 s, 및 100 mm 페 트리 접시에 부 어 쉐이크의 장 조각을 전송할. 현미경 분수를 확인 하십시오. 일반적으로,이 단계에서 거의 지하실 추출 됩니다. 다음 6번째 분수 계속 몇 지하실 추출 됩니다.
참고: 순수 토 굴 인구는 원하는 경우 (예: organoid 세대), 다음 사용 하 여 70 µ m 셀 스 트레이너 토 굴 농축 분수에서 어떤 그대로 villi 제거 하. - 별도 15 mL 원뿔 튜브에 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 분수 3-5를 수집 합니다.
- 분수 3-5의 산 탄을 확인 하 고는 펠 렛을 방해 하지 않고는 supernatants를 제거 하 고 고정 (제 3)에 즉시 진행.
- (를 사용 하 여 CO2 질) 마우스를 안락사 고가 위와 핀셋14해 부와 작은 창 자 (십이지 장 근 위 터미널 회장)를 제거 합니다.
2입니다.24-잘 접시에 지 매트릭스 돔에서 장 Organoids의 격리
참고: 지 매트릭스 돔 내에서 organoids의 형성 되었습니다12설명 되어.
- 제조업체의 지침에 따라 지 매트릭스 돔 웰 스 코트.
- 워시 우물 500 µ L의 PBS 포함 하 지 매트릭스 돔.
- 각 잘 세포 복구 솔루션 (4 ° C)의 차가운 250 µ L 추가 ( 재료의 표참조).
참고: 차가운 세포 복구 솔루션 모두 안정적인 microtubules depolymerize 것입니다. - 긁어 지 매트릭스 돔 P1000 micropipette를 사용 하 여 신중 하 게이 별을 잘 통해 아래로 플라스틱 하 고 플라스틱 으로부터 지하실 매트릭스를 제거.
- 1.5 mL 낮은 바인딩 microcentrifuge 튜브에 상쾌한을 수집 합니다.
- 반전 1.5 mL 낮은 바인딩 튜브 여러 번 하 고는 organoids 격리 되어 있으며 무료 이동 여부 및 덩어리 안에 현미경 확인 합니다. 잡고는 stereomicroscope에서 튜브와 낮은 (50 X) 확대에서 보기.
- organoids에서 실시간 5 분 1000 x g에서 원심 분리 하 여 펠 렛
- 복구 시 약을 제거 하 고 고정 (3 단계)에 즉시 진행.
3. 격리 된 장 조직 및 Organoids의 고정
- 메탄올 고정
- -20 ° c.에 10 mL에 고립 된 장 토 굴/모 분수와 메탄올의 1 mL에 organoids resuspend
- 15 분을 냉장고에-20 ° C에서 지하실/villi/organoids를 품 어 고 tube(s) 5 분 마다 반전.
- 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리 하 여 지하실/villi/organoids을 펠 렛.
- 메탄올을 제거 하 고 세척 솔루션 (organoids 및 절연된 크립/모 분수 10 mL 1 mL)을 추가 합니다. 세척 솔루션 수 중 0.1% 세제와 1% 혈 청을 1% 혈 청 또는 PBS PBS의 구성.
참고: 동일한 종에서 혈 청을 사용 하 여 보조 항 체의. 예를 들어 2 차 항 체는 염소에서 생성 된 염소 혈 청을 사용 합니다. - 즉시, 지하실/villi/organoids 5 분 작은 1000 x g에서 원심.
- 세척 솔루션을 제거 하 고 신선한 세척 솔루션에 지하실/villi/organoids resuspend.
- 20 rpm으로 설정 속도와 튜브 회전자에 놓습니다. 1 시간, 15 분 마다 원심 (1000 x g 5 분)에 의해 지하실/villi/organoids 산 및 세척 솔루션 교체의 총에 대 한 셀을 씻어.
참고: 튜브 회전자를 사용할 수 없는 경우 다음 반전 튜브 수동으로 모든 5 분 resuspend 고립 된 문화를.
- 포름알데히드/메탄올 고정
참고: fixatives 및 포름알데히드 증기 두건에서 처리 합니다.- 10 mL에 격리 된 지하실/villi 또는-20 ° C 통 솔루션 포름알데히드 솔루션의 800 µ L와 메탄올 (9.2 mL)의 1 mL에 organoids resuspend.
- 15 분을 냉장고에-20 ° C에서 지하실/villi/organoids를 해결 하 고 5 분 마다 튜브를 반전.
- 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리 하 여 지하실/villi/organoids을 펠 렛.
- 포름알데히드/메탄올을 제거 하 고 세척 솔루션 (organoids 또는 격리 된 지하실/모 분수 10 mL 1 mL)을 추가 합니다. 세척 솔루션 수 중 0.1% 세제와 1% 혈 청을 1% 염소 혈 청 또는 PBS PBS의 구성.
- 작은 지하실/villi/organoids 5 분 1000 x g에서 원심.
- 세척 솔루션을 제거 하 고 신선한 세척 솔루션에서 resuspend.
- 20 rpm으로 설정 속도와 튜브 회전자에 놓습니다. 1 시간, 15 분 마다 원심 (1000 x g 5 분)에 의해 지하실/villi/organoids 산 및 세척 솔루션 교체의 총에 대 한 셀을 씻어.
- PFA 고정
주의: PFA 분말과 해결책 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
참고: 대부분의 경우 4%에서 PFA PBS에는 사용 되지만 항 체 antigenicity의 보존에 따라 낮은 농도 사용할 수 있습니다.- 10 mL 4%에서 고립 된 수송과 지하실/villi resuspend PFA 1 h, RT에서 품 어와 격리 수송과 1 ml에서 organoids 4 %PFA 30 분 동안 품 어. 두 경우 모두 tube(s) 10 분 마다 반전.
- 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리 하 여 지하실/villi/organoids을 펠 렛.
- PFA는 제거 하 고 세척 솔루션 (1 mL organoids 및 격리 된 지하실/villi 10 mL) 추가. 세척 솔루션 PBS의 0.1% 세제와 1% 세럼으로 구성 되어 있습니다.
- 작은 지하실/villi/organoids 5 분 1000 x g에서 원심.
- 세척 솔루션을 제거 하 고 신선한 세척 솔루션에서 resuspend.
- 튜브 회전 속도 20 rpm으로 설정 놓습니다. 1 시간, 15 분 마다 원심 (1000 x g 5 분)에 의해 지하실/villi/organoids 산 및 세척 솔루션 교체의 총에 대 한 셀을 씻어.
참고: 튜브 회전자를 사용할 수 없는 경우 다음 반전 튜브 수동으로 모든 5 분 resuspend 고립 된 문화를. - 항 원 복구 (PFA 고정을 위한 권장 되는 선택 사항)
- 납골당/villi/organoids 5 분 1000 x g에서 원심 분리 하 여 펠 렛 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 10 m m 나트륨 구 연산 염 pH 6.0 (80 ° C에 미리 예 열)의 1-10 mL을 추가 하 고 20 분 동안 80 ° C에 품 어.
- 납골당/villi/organoids 5 분 1000 x g에서 원심 분리 하 여 펠 렛 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 신선한 10 m m 나트륨 구 연산 염 pH 6.0 (80 ° C에 미리 예 열)의 1-10 mL을 추가 하 고 20 분 동안 RT에서 품 어.
- 납골당/villi/organoids 5 분 1000 x g에서 원심 분리 하 여 펠 렛 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 1-10 ml PBS 1% 혈 청으로 세척 하 고는 추가 3 회 산 납골당/villi/organoids 원심 (1000 x g 5 분)에 의해 신선한 세척 솔루션을 추가 하기 전에 반복.
4. 단계 차단
- 차단 솔루션: PBS에 10% 이차 항 체 종 혈 청에 추가 (선택 사항: 0.1% 세제 추가).
- 납골당/villi/organoids 원심 (1000 x g 5 분)에 의해 작은 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 필요한 샘플의 숫자에 따라 차단 솔루션의 5-10 mL을 추가 (아래 참고 참조). 이 단계에서 다른 항 체와 얼룩에 대 한 개별 튜브 (0.2-1 mL를 포함 하는 각 튜브 1.5 mL 낮은 바인딩 microcentrifuge 튜브) 지하실/villi/organoids 솔루션을 분할.
참고: 각 격리 된 지하실/villi 분수는 펠 릿의 크기에 따라 다른 라벨 조합에 사용할 수 있는 5-10 샘플 사이 줄 것 이다. 이상적으로, 2-4 m m 사이 펠 릿 크기는 각 샘플에 대 한 필요 합니다.
5. 1 차적인 항 체 외피
- 1 차 항 체 ( 재료의 표참조) 10% 혈 청 및 0.1% 세제를 포함 하는 PBS에 희석. 100 ~ 200 µ L 사이 주 항 체 솔루션은 microcentrifuge 튜브 샘플 당 필요 합니다.
- 원심 (1000 x g 5 분)에 의해 차단 솔루션을 제거 합니다.
- 1 차적인 항 체 솔루션에 지하실/villi/organoid 펠 릿을 resuspend 하 고 하룻밤에 지하실/villi/organoids를 계속 튜브 회전 (20 RPM)를 사용 하 여 4 ° C에서 품 어.
- 다음 날: 다시 RT 튜브 회전 (20 rpm)에 1 시간에 대 한 샘플을가지고.
- 원심 (1000 x g 5 분) 하 여 샘플을 작은 고 1 차적인 항 체 솔루션을 제거 합니다.
- 세척 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 토 굴/모/organoid 펠 릿 resuspend.
- 즉시 원심 (1000 x g 5 분) 여는 솔루션을 제거 합니다.
- 1 mL 신선한 세척 솔루션을 추가 하 고 2 시간 동안 튜브 회전 (20 rpm)에 세포를 스핀. 세척 솔루션 원심 단계 5.7에서 매 30 분으로 변경 합니다.
6. 이차 항 체 외피
- 2 차 항 체 ( 재료의 표참조) PBS에 10% 혈 청 및 0.1% 세제로 희석. 이차 항 체의 약 200 µ L microcentrifuge 튜브 샘플 당 필요 하다.
참고: 높은 크로스 흡수 하는 항 체는 마우스 크립/모/organoid에 이차 항 체의 반응성을 줄이기 위해 사용 되어야 한다. - 작은 지하실/villi/organoids 및 이차 항 체 솔루션의 200 µ L에 산 탄을 resuspend 5 분 1000 x g에서 원심.
- 1 시간에 대 한 실시간에 튜브 회전 (20 rpm)에 튜브를 회전 합니다.
- 작은 지하실/villi/organoids supernatants (비 바운드 이차 항 체)을 제거 하 5 분에 대 한 1000 x g에서 원심.
- 세척 솔루션에 펠 릿을 resuspend 하 고 즉시 작은 지하실/villi/organoids 5 분 1000 x g에서 원심.
- 상쾌한을 제거 하 고 신선한 세척 솔루션의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 1.5-2 h, 이전 단계 6.3 6.6에서에서 설명한 대로 세척 솔루션 마다 20-30 분 변경에 대 한 실시간에 튜브 회전 (20 rpm)에 스핀.
7. 핵 얼룩
- DAPI 또는 Hoechst 등 세척 솔루션 (제조 업체의 프로토콜)에 의하여 핵 얼룩을 희석. 예: DAPI 재고 솔루션 (20 mg/mL) 희석된 1:10, 000입니다. 재고 솔루션-20 ° c.에 aliquots에 보관 하실 수 있습니다.
- 작은 지하실/villi/organoids 세척 솔루션을 제거 하 5 분에 대 한 1000 x g에서 원심.
- 핵 counterstain 솔루션에 펠 릿을 resuspend.
- 10 분에 대 한 실시간에 튜브 회전 (20 rpm)에 스핀.
- 작은 지하실/villi/organoids 핵 얼룩이 솔루션을 제거 하 고 세척 솔루션에 펠 릿을 resuspend 5 분 1000 x g에서 원심.
- 30-60 분, 세척 솔루션 마다 10 분 변경에 대 한 실시간에 튜브 회전 (20 rpm)에 스핀.
8. 장착 절연 지하실, Villi, 및 Organoids
- 작은 지하실/villi/organoids 모든 세척 솔루션을 제거 하 5 분에 대 한 1000 x g에서 원심.
참고: 펠 릿 분 광, 경우 다음 원심 다시. - 펠 릿을 antifade 에이전트와 함께 미디어를 장착 하는 하드 설정의 2 방울을 추가 합니다.
- P200 micropipette의 끝을 잘라 하 고 신중 하 게 설치 미디어에는 펠 릿을 resuspend. 거품을 생성 하지 마십시오.
참고: 격리 organoid 문화는 매우 끈 적; 완전히 resuspend 있는지 확인 합니다. - 납골당/villi/organoids 장착 미디어 솔루션에서의 혼합물을 전송 하 고 현미경 슬라이드의 중심을 따라 라인에 분배 하는 micropipette를 사용 합니다.
참고: 줄 수 없습니다 이상 커버 유리를 사용 하는 것입니다. 납골당/villi/organoids 슬라이드에 잘 확산 및 하지 clumped 여부는 stereomicroscope를 사용 하 여 확인 하십시오. - 조심 스럽게 위로; 커버 유리를 배치 거품을 생성 하지 마십시오.
- 유리 슬라이드를 슬라이드 책에 confocal 현미경에 분석 하기 전에 설정 하려면 설치 미디어에 대 한 하룻밤 냉장고에서 두십시오.
참고: 마우스 항 체 마우스 조직에 얼룩 사용 상업 면역 형광 검사 키트 ( 재료의 표참조). 단백질 차단 솔루션 차단 시 약 키트와 함께 제공 된 1 시간 보육 뒤 10 분 블록으로 차단 단계 (제 4)를 교체 합니다. (세척) 중간 단계 5.8에서 형광 신호 증강 시 약으로 1 h 외피를 추가 합니다. 그런 다음 키트의 시 약을 사용 하 여 형광 (다른 이차 항 체도 사용할 수 있습니다이 시와 함께에서) dilutant에. 위와 같이 품 어와 프로토콜의 나머지 6 단계에서.
9. 고정 및 지하실 매트릭스 내에서 Organoids의 면역 라벨
참고: Organoids 고정을 위한 운명 하 고 차 유리 coverslips 24-잘 접시 (한 돔 잘 당)에 위에 지 매트릭스 돔에서 생성 된 면역 라벨 지 매트릭스 내 남아 있는 동안. Organoid 지하실 매트릭스 돔 추가 및 다양 한 솔루션의 제거에 의해 24-잘 접시 내 처리 했다.
- 우물에서 매체를 제거 하 고 추가 정착 제; 1 시간 동안 둡니다.
- 정착 액을 제거 하 고 PBS 2 h에 대 한 1% 혈 청 및 0.1% 세제를 포함, 모든 30 분 변경에 씻어.
- 세척 솔루션을 제거 하 고 1 시간에 10% 혈 청 및 0.1% 세제와 PBS에서 차단.
- 1% 혈 청으로 PBS 또는 1% 혈 청 및 0.1% 세제로 PBS에 항 체 희석.
- 차단 솔루션을 제거 하 고 100-200 μ 1 차적인 항 체를 추가 (참조 테이블의 재료) 솔루션을 각 영역.
참고: 그것은 항 체 더 희석을 하지 모든 차단 솔루션을 제거 하는 것이 중요입니다. - 냉장고에 접시를 놓고 4 ° C에서 밤새 품 어
- 다음 1-2 h에 대 한 실시간 유지 합니다.
- 항 체 해결책 및 2-3 h 세척 솔루션 마다 20 분 변경에 대 한 세척을 제거 합니다.
- 모든 세척 솔루션을 제거 하 고 혈 청 1%;와 PBS에서 100-200 μ 2 차 항 체 희석된 (참조 테이블의 재료)를 추가 실시간에서 1 시간에 품 어
- 이차 항 체 솔루션 및 2 시간, 20 분 마다 변화에 대 한 세척을 제거 합니다.
- 세척 솔루션 제거 및 추가 DAPI 솔루션; 1:10, 000에서 희석 하는 실시간 사용 DAPI 재고 솔루션 (20 mg/mL)에서 10 분 동안 둡니다.
Representative Results
장 조직의 면역 라벨에 대 한 절연
보존과 microtubules과 관련 된 단백질의 면역 라벨에 대 한 하지만 줄기 세포 생존 능력 및 organoid 생성 (그림 1 및 표 1 결 장 및 작은 창 자에 대 한 설명된 조직 격리 프로토콜 최적화 되었다 ). 목표 암호를 생성 하 고로 모 파 벌 구조를 보존 하 고 유도 하는 얼음 차가운 솔루션 microtubules의 depolymerization을 방지 EDTA와 추위 노출 최소화 하면서 최대한 (없는 점액 및 다른 조직) 청소 모든 하지만 안정적인 microtubules의 depolymerization입니다. 주로 지하실 (그림 2C 포함 villi 지하실 (그림 2A, B), 분수 3 동안 둘 다의 혼합물을 포함 하는 분수 2 그림 2 에서 격리 된 작은 창 자 조직, 분수 2와 3의 이미지의 예를 보여 줍니다. D).
고정 및 절연 장 조직의 면역 라벨
개별 또는 결합 된 분수 다음 고정을 위한 처리 및 면역 표시 된 일련의 고정을 포함 하는 단계를 통해, 세제, 차단, 항 체, 그리고 다시 마지막 villi/지하실을 중단 하기 전에 솔루션을 세척 설치 미디어, 펠 렛 슬라이드, 전송 하 고 유리 coverslips 커버. Crypts과 villi 다음 confocal 현미경에는 몇 군데 있었다.
좋은 보존과 microtubules의 말라 villi와 지하실에서 라벨 다음에 의해 달성 되었다:-20 ° C에서, 반복 PBS 0.1% 세제와 1% 혈 청을 포함 하 고 PBS에 0.1% 차단에 세척 포름알데히드/메탄올 고정 조합 세제와 10% 혈 청, 야간 보육 1 차 항 체에 4 ° C 그리고 실내 온도 (그림 3)에서 2 차 항 체에 2 h에 의해 따라. 포름알데히드/메탄올 고정도 잘 라벨에 대 한 일 + EBs 등 클립-격리 된 지하실과 villi (그림 4)에서 170 팁. 안정적인 microtubules의 격자에 따라 협회 villi 샘플 (그림 4C)에서 볼 수 (혜성 라고도 함) microtubules의 플러스 끝 EB3 축적 지하실 (그림 4A)에서 분명 했다. 고유한 지역화 클립-170 및 p150Glued (dynactin의 소 단위) 격리 villi (그림 4B)에서 꼭대기 n MTOCs에서 명확 하 게 분명 했다. 포름알데히드/메탄올 프로토콜 고정 ninein 지역화 마우스 ninein에 대 한 우리의 Pep3 항 체를 사용 하 여 격리 된 장의 조직에 일관 되 게 작동 하지 않았다. 그러나,-20 ° C에서의 메탄올 고정 뒤 같은 세척 그리고 격리 된 지하실과 villi (그림 5; 참조8) 내에서 ninein의 매우 좋은 현지화 했다 포름알데히드/메탄올에 관해서는 솔루션을 차단. 흥미롭게도, ninein는 꼭대기 centrosomes에 집중 하는 동안 일부 축적 셀 기지에서 분명 했다 격리 된 지하실 (그림 5) 내의 일부 셀에. 이 일반적인 라벨 또는 격리 절차 지연의 결과 때문 인지 고정 (그리고 따라서 보존에 영향을 미치는) 필요 합니다 추가 조사. 그러나, villi (8 그림 3bi 참조)의 메탄올 고정 (-20 ° C) cryostat 섹션은 또한 그 ninein를 제안 하는 일부 셀에 기본 셀 ninein microtubules의 기저 인구와 연결할 수 있습니다 밝혔다.
고정 및 면역 지 매트릭스에서 분리 된 organoids의 라벨
작은 창 자 organoids 생성 하 고 지하실 매트릭스 3 주 이상 (그림 6A; 참조6,15)에서 성장 했다. 감기 (4 ° C) 세포 복구 솔루션 지 매트릭스에서 organoids를 분리 하는 데 사용 되었다. Organoids와 depolymerized 지 매트릭스 솔루션 튜브로 전송 되었고 정착 immuno 라벨 이전 centrifuged. 이 매우 깨끗 한 준비를 생산 하 고 다양 한 솔루션에는 organoids에 좋은 액세스할 수 있습니다. Organoid 모 도메인 내에서 차별화 된 셀 포함 안정적인 apico 기저 microtubules; 이 표시 된 대부분의 경우 (그림 6B, C) 고 EB1 microtubule 격자 (그림 6E;13참조)에 따라도 볼 수 있습니다. 그러나, 차가운 세포 복구 솔루션 발생할 수 있습니다 동적 microtubules의 depolymerization에 있는 EB1 혜성 (이 성장 microtubules의 플러스 끝에 바인딩할) 기저 암호 도메인 (그림 6 층 내에서 부족에 의해 일부 샘플에서 분명 했다 ). 다른 샘플에서 아 스 트 랄 (동적) microtubules (그림 6D) 보존 되었다. Organoid 절연 고정 이전 및 면역 라벨 또한 접합 단백질, ninein, 클립-170, 그리고 잔 셀 및 chromogranin A enteroendocrine 세포는 mucin 같은 셀 표식에 대 한 일 했습니다.
고정 및 지하실 매트릭스 내에서 organoids의 면역 라벨
그림 7 크립 트 개발 (D), 포름알데히드/메탄올에 고정 및 microtubules 및 ninein에 대 한 면역 분류의 초기 단계에는 organoid 낭종 단계 (A-C)에서 보여줍니다. 좋은 microtubule 보존 및 라벨로 꼭대기 n-MTOCs에서 ninein에 대 한 라벨 분명 했다. 그림 8A, B 하루 6 organoid 메탄올 프로토콜 고정 고 microtubules EB1 내 크립 트 도메인을 보여 줍니다. Microtubules EB1 혜성의 좋은 보존 분명 동적 microtubules의 보존을 제안 했다.
Organoids 되었고 또한 고정 면역 표시 지 매트릭스 내 남아 있는 동안. 이 절차의 단점 두 경우에서 자주 때 0.1% 세제는 포함 되어 있지만 정착 액에 정착 액의 가난한 침투 및 트래핑 지 매트릭스 (그림 8B) 내에서 항 체의 수 및 솔루션을 씻어 수 있습니다. 또한, 4 %PFA 하지 않았다 보존 지 매트릭스 잘 하지만 원인이 분해, 이것은 이렇게 더 적은 1 %PFA.메탄올 고정, 다른 한편으로, 때로는 organoid 붕괴를 유도 한다.
줄기 세포 마커 Lgr5 그리고 Paneth 세포 표식에 대 한와 같은 일부 항 체로 CD24 4 %PFA, 메탄올, 또는 포름알데히드/메탄올 프로토콜 실패 입증. 그러나, 1%는 organoids 지 매트릭스 내에서 고정 0.1% 세제 실 온에서 PBS에 PFA 않았다 결과 Lgr5 및 CD24 라벨 (그림 9).
그림 1: 작은 창 자 villi 및 지하실의 격리. 주요 단계 작은 장 모와 정착 immuno 라벨 이전 암호 격리의 흐름 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 절연 villi 및 마우스 소장 으로부터 지하실. Villi (큰 화살표) 지하실 (작은 화살표)을 보여주는 장 분수의 명시 야 현미경 이미지. (A, B) 분수 2 villi의 지하실, 혼합물 포함 하 고 모 고 토 굴에 형태학의 보존은 B에 분명 하다. (C, D) 분수 3 지하실의 고립과 villi 및 C에서 분기 토 굴을 포함 하 여 그대로 지하실의 부재를 보여준다. 스케일 바 = 500 μ (A, C); 100 μ (B, D) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 작은 장 모와 토 굴 포름알데히드/메탄올에 고정 및 microtubules와 걸에 대 한 면역 표시 된 절연. 표시 하는 다른 세포 유형으로 모와 토 굴 상피의 (A) 회로도 강조 상자 B 및 C에서 몇 군데 대표적인 영역을 나타냅니다. (B, C) 모 (B)와 기저 크립 트 (C) 30 mM EDTA를 사용 하 여 포름알데히드/메탄올에 고정, 1% 염소 혈 청 및 0.1% 세제를 포함 하는 PBS로 세척, PBS에 차단 작은 창 자에서 분리의 부분을 통해 공초점 광학 섹션 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 그리고 쥐 단일 클로 널 항 tubulin 항 체 (녹색)와 microtubules와 토끼 polyclonal 안티-β-말라 항 체 (레드)와 말라 레이블이 포함 된. 잘 apico 기저 보존 microtubule 번들 분명 모와 토 굴 셀, 그리고 말라 루멘 (화살표)를 직면 하 고 꼭대기 지역에 집중 되어 볼 수 있습니다. 스케일 바 5 μ m를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 고립 된 작은 장 토 굴과 villi 포름알데히드/메탄올에 고정 및 microtubules, EB3, p150Glued및 클립-170에 대 한 면역 분류. 토 굴과 villi 지역의 공초점 광학 섹션 30 mM EDTA를 사용 하 여 작은 창 자에서 분리 및 포름알데히드/메탄올, 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 포함 하는 PBS로 세척에서 고정 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 포함 하는 PBS에 차단 및 면역-표시. (A) 토 굴 토끼 α tubulin polyclonal 항 체 (빨간색)와 쥐 단일 클로 널 EB3KT36 항 체 (녹색) 표시와 DAPI (블루) apico 기저 microtubules EB3 혜성을 보여주는와 DNA에 대 한 스테인드. 거꾸로 단일 채널 이미지는 명확 하 게 안정적인 microtubules 뿐만 아니라 동적의 좋은 보존 제안 기저 크립 트 셀 통해 EB3 혜성을 보여줍니다. (B) 모 상피 세포 토끼 polyclonal 클립-170 항 체와 함께 표시 (빨간색 참조16참조)와 단일 클로 널 p150Glued 항 체 (녹색) 꼭대기 보여주는 공동 지역화를 마우스. 거꾸로 단일 채널 이미지는 아래와 같습니다. (C) 모 셀 토끼 α tubulin polyclonal 항 체 (빨간색)와 쥐 단일 클로 널 EB3 KT36 항 체 (녹색)으로 표시 하 고 격자 따라 EB3와 apico 기저 microtubules 보여주는 DAPI (파란색)와 DNA에 대 한 스테인드. EB3 격자 협회 거꾸로 단일 채널 이미지 EB3 혜성과 격자 협회 제안 하는 동안 확대 이미지에 강조 표시 됩니다. 스케일 바 5 μ m를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 고립 된 콜론 토 굴 메탄올, ninein 및 E-cadherin 면역 표시에 고정 및 DAPI 물. 기저의 공초점 광학 섹션 토 굴의 지역 교통 증폭 3 mM EDTA를 사용 하 여 콜론에서 고립 된 메탄올에 고정, 1% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 포함 하는 PBS로 세척 고 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제를 포함 하는 PBS에 차단. 토 굴 토끼 polyclonal ninein 항 체와 함께 분류 되었다 (Pep3, 또한 참조 참조8, 빨간색) 단일 클로 널 항 체를 (녹색) 전자 cadherin 마우스와 DAPI (파란색)으로 물. 거꾸로 단일 채널 이미지 ninein만 보여줍니다. 이미지는 ninein 꼭대기 centrosomes에 집중 하 고 개별 셀의 윤곽을 드러내는 E cadherin와 잘 보존 된 토 굴을 보여 줍니다. 그것은 좋은 침투 고정 제와 항 체, 및 antigenicity의 보존 제안. 눈금 막대 5 μ m를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: Organoid 개발, 고정, 및 면역의 라벨 절연 organoids. (A) 위상 대비 이미지 보여주는 개발의 다른 단계 organoid 셀 집계에서 버드 개시와 완전히 낭종을 형성 토 굴 및 모 도메인 organoids.(B-F) Organoids 지 매트릭스 포름알데히드/메탄올 고정, 10% 염소를 포함 하는 PBS에 차단 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, PBS에 세척 하 여 다음 4 ° C (10 분)에서 세포 복구 솔루션을 사용 하 여 격리를 통해 공초점 광학 섹션 혈 청 및 세제, 그리고 면역 microtubules, β-catenin, EB1 라벨 0.1%. (B) Organoid 낭종 microtubules (파란색)와 β-catenin (레드) 좋은 microtubule 보존 공개 하 고 대부분의 세포에서 라벨에 대 한 분류. (C) 뚜렷한 apico 기저 microtubules organoid 낭종에서 이러한 확대 상피 세포에 분명 하다. (D) 분할 셀 microtubules 보여주는 아 스 트 랄 (동적) microtubules (화살표)를 포함 하는 스핀 들에 대 한 분류. (E, F) 모 도메인 (E) 및 암호 도메인 (F) organoid 지역 일부 EB1 라벨, 모에 특히 안정적인 microtubules의 격자에 따라 거의 EB1 혜성 그 동적 제안 기저 토 굴 안에서 볼 수 있습니다 하는 동안 보여주는 microtubules 하지 보존 되었다. 바 규모 = 20 μ m (A); 2 μ m (D); 5 μ m (B, C, E-F) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 포름알데히드/메탄올에 지하실 매트릭스 내에서 고정 및 microtubules 및 ninein에 대 한 면역 분류 Organoids. Organoids의 공초점 광학 섹션 포름알데히드/메탄올에 고정, 세척 및 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 포함 하는 PBS에 차단 고 지 매트릭스에 남아 있는 하는 동안 표시. A-(C) Organoid 낭종 물 들일 DAPI A 에 병합 된 이미지를 보여주는 (파란색)와 microtubules (B) ninein (C)에 대 한 단일 채널 이미지를 거꾸로 microtubule (녹색) 및 ninein (Pep3; 참조8, 레드)에 대 한 분류. 이미지 표시 apico 기저 microtubules 꼭대기 ninein 지역화, 언바운드 항 체는 뿐만 아니라 아주 좋은 구조는 organoid의 보존과 항 체의 침투를 제안. (D, E) 크립 트 고정 하 고 위와 같이 표시 하 고 다시 보여주는 우수한 구조 보존 개발, 라벨, 그리고 항 체는 Organoid. 고유 apico 기저 microtubules 및 꼭대기 n MTOC ninein 지역화가 분명 하 고 d에서박스형 영역의 확대 이미지 (E)에서 강조 표시 된. 스케일 바 = 10 μ m (A-D); 5 μ m (E) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 메탄올에 지하실 매트릭스 내에서 고정 및 microtubules와 EB1 면역 표시 Organoids. Organoids의 공초점 광학 섹션 메탄올에 고정, 세척 및 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 포함 하는 PBS에 막히고 지 매트릭스에 남아 있는 하는 동안 표시. (A) 낭종에서 완전 개발된 organoid 도메인 표시 polyclonal α-tubulin (레드) 토끼와 단일 클로 널 EB1 (녹색) 항 체를 보여주는 apico 기저 microtubules, 마우스 두 나누어 셀과 별개 EB1 혜성에 스핀 들 (화살표). 언바운드 EB1 항 체의 일부 트랩은 분명 하다. 그러나, 좋은 구조 보전과 microtubules EB1의 라벨은 관찰 된다. EB1 혜성의 존재는 동적 microtubules 보존 제안 (A, 반전). (B) organoid 낭종 지역 주변 지 매트릭스 (화살표) 안에 갇혀 α-tubulin 상당한 항 체와 항 체 라벨 표시의 거꾸로 이미지. 스케일 바 5 μ m를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: Organoids 1%에서 지 매트릭스 내에서 고정 PFA와 Lgr5 및 CD24 면역 표시. 1%의 지 매트릭스 내에서 고정 하는 organoids의 공초점 광학 섹션 PFA 0.1% 세제를 포함 하는 PBS에 PBS에서 1% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 세척 그리고 Lgr5 및 CD24에 대하여 항 체와 분류. (A, B) 보여주는 Paneth 세포 긍정적인 CD24 (빨간색) 토 굴 도메인 내에서 줄기 세포 틈새. Confocal 및 위상 대비 이미지는 A에 병합 되었습니다. B 단일 채널 CD24 라벨을 표시합니다. (C) Lrg5 양수 줄기 세포를 보여주는 암호 도메인 내에서 줄기 세포 지역. 스케일 바 = 10 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 작은 창 자 토 굴과 villi 격리 및 정착의 타임 라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
장 조직의 절연
작은 장 지하실과 villi 저 승 지하실의 분리 막 표면, EDTA 솔루션 셀 연락처, 분류 (동요) 및 원심 분리를 완화 하는 치료를 노출 포함 됩니다. 제시 장 villi/토 굴 격리 프로토콜 Belshaw 외. 화이트 헤드 외 에서 수정 되었습니다. 17 , 18
점 막 표면 노출
우리가이 절차의 개발에 장내 관의 점 막 표면 노출 방법의 번호와 실험을 했습니다. 기존의 방식 (안쪽 바깥쪽으로 회전) evert 것 세그먼트 약 100 m m 긴, 보통 튜브 튜브19위로 미끄러져 한쪽 끝 그리고 나머지 튜브에 조직의 배에 잡은 금속 막대를 사용 하 여. 마우스 조직에 대 한 끝부분을 금속 막대 (2.4 m m 직경)는 이상적 이다. 이 방법은 PBS와 EDTA에 대 한 더 나은 액세스를 허용 하는 점 막 표면 확대의 이점이 있습니다. 우리는 처음이 접근 방식을 사용 하지만 짧은 길이 (약 5cm)으로 튜브를 절단 하 고이 쉽게 입증가 위를 해 부와 각 섹션을 열고로 이동. 이 방식은 적절 한 경우에 몇 가지 내장이 필요; 경우 더 많은 동물을 했다 그러나 사용 실험에서 다음 목적 장치 절단 열기 튜브 경도, 요네다 외 설명 14 더 효율적일 것 이다입니다.
Villi와 근육 층에서 지하실의 분리
처음 우리 느슨하게 기본 조직17,18점 막 표면에 3 mM EDTA PBS에 비교적 긴 보육 시간 최대 60 분의 사용. EDTA의이 농도에서 우리는 보육 시간 30 분의 마우스 콜론 으로부터 지하실을 풀고 충분 한 발견. 그러나, 소장 토 굴/모 격리에 대 한 효율적인 접근 입증 짧은 시간에 대 한 더 많은 집중된 EDTA를 사용 하 여 것이 보았습니다. 모든 후속 작업 생성 villi 또는 지하실에 대 한 관련 분수 30 mM EDTA 기법을 사용 하 여 추출 하는 조직으로 착수 했다. 지하실, 우리가 일반적으로 고정 하기 전에 분수 3-5을 풀링된 하지만 타이밍 창 자 위치 등 요인의 숫자, 마우스, 염증, 이전 다이어트의 나이에 따라 달라 집니다로이 적절 한 분수 지 확인 하는 것이 중요 하다 등 유사 하 게, 시간 조직 EDTA 치료 효과 따라 흔들릴 필요가 다른 조건 하에서 다를 수 있습니다. 격리 된 조직 분수 villi 지하실 또는 주로 villi 및 지하실 (그림 2)의 혼합물을 포함 하는. 콜론 없는 villi로 토 굴 추출 수 있습니다 달성 한 단계에 30에 대 한 튜브에 조직을 떨고 하 여 s. 이 분수 다음 고정 하 고 면역 라벨에 대 한 처리 수 있습니다.
지 매트릭스에서 장 organoids의 격리
절연 지 매트릭스 돔에서 organoids의 세포 복구 솔루션을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. Depolymerizing gelled 지하실 매트릭스 하지만 온도 필요 2-8 ° c.에 의해 작동 하는 솔루션 주의의 참고는 동적 microtubules 유지 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 동적 microtubules의 면역 라벨에 대 한과 + EBs 셀 등 팁, 고정 이전 지 매트릭스에서 복구 권장 하지 않습니다. 그러나, 차별화 organoid 셀에 microtubules의 대부분은 상대적으로 안정적인 고이 (그림 6)를 보존 했다. 그것은 또한 세포 마커 뿐만 아니라 centrosomal 및 접합 단백질의 면역 라벨에 대 한 잘 일했다.
기정 프로토콜
포름알데히드 (PFA에서 만든 갓) 가역 형성 하는 상대적으로 빠른 연기 정착 액 크로스 링크 이며 4 %PFA 등 면역 라벨 microtubules 및 감마-tubulin Phalloidin 얼룩 걸 필 라 멘 트를 위해 잘 작동 합니다. 더 잘 근무 등 면역 라벨 토 굴 줄기 세포 틈새 시장 내에서 줄기 세포 마커 Lgr5 및 Paneth 세포 마커 CD24와 PFA의 높은 농도 작동 하지 않았다 동안 1 %PFA 솔루션을 희석.
도의 추가 제공 microtubules 3.7 %PFA, 0.05%도 및 PHEMO 버퍼 (68 m m 파이프, 25mm HEPES, 15mm EGTA 및 3mm MgCl2)2 에서 0.5% 세제의 혼합물로 구성 된 이른바 PHEMO 고정의 더 나은 보존 antigenicity을 타협 하지 않고 microtubules의 우수한 보존을 제공 합니다. 그것은 또한 면역 라벨 감마-tubulin, β-catenin, 그리고 E-cadherin, phalloidin 착 걸 필 라 멘 트에 대 한 잘 작동합니다. 그러나, 3 차원 조직, organoid 문화 PHEMO 고정 일관성 없는 결과 생산 하 고 그러므로 사용 하지.
메탄올은 상대적으로 잘 침투를 제공 하 고 antigenicity을 보존 하는 경향이 응집 정착 액. 100% 메탄올 (-20 ° C)와 고정 어떤 수축 량을 소개 하 고 적당 한 형태 보존을 제공 microtubules, + 팁, 그리고 ninein를 포함 하 여 2 차원 세포 배양에 많은 centrosomal 항 체에 대 한 작동 합니다. 그러나, 일부 organoids이 고정 방법을 사용할 때 쓰 러 졌다. 또한, 전체 지하실, villi, 또는 organoids를 통해 항 체의 보급률은 처음에 문제가 있지만 0.1% 세제 세척 솔루션을 장기간된 세척의 추가 더 나은 결과 달성.
포름알데히드와 메탄올의 조합이 Rogers 그 외 여러분 에 의해 사용 이전 했다 20 에 면역 레이블 EB1 초파리. 포 름 알 데히드의 혼합물을 기반으로 고정 프로토콜 및 메탄올 따라서 개발 장 조직 및 organoids 3% 포름알데히드와 97% 메탄올-20 ° C에 냉장 하지만 로저스에 의해 사용 되었다 혼합물에서 탄산 나트륨 5 m m를 생략에 따라 외. 20 또한, 샘플-20 ° c.에 냉장고에서 수정 된 이 특히 면역 라벨에 대 한 잘 + 클립-170 등 EBs, 팁, 근무 하지만 또한 우수한 고정 및 면역 라벨 microtubules 및 조직 및 3D organoids 내 걸 입증 했다. 아주 좋은 구조 보존 되었다 분명 하 고 메탄올으로 더 일관 되 게 일 ninein에 대 한 라벨 비록 antigenicity 감마-tubulin 등 ninein, centrosomal 단백질 뿐만 아니라 여러 cytoskeletal와 관련 된 단백질에 대 한 보존 되었다 고정입니다.
Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
저자 폴 토마스 현미경 조언과 도움 감사합니다. 여기에 관련 된이 작품은 BBSRC에 의해 지원 되었다 (no를 부여 합니다. M.M.M. 및 T.W. BB/J009040/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
| lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
| 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
| goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
| Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
| Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
| MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences |
MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
| Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
| Sodium citrate | antigen retrieval | ||
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
| DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
| Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
| Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
| Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
| 1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
| Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
| Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
| Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
| Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
| Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
| Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
| Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
| Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
| Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
| Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
| Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |
References
- Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).
- Bellett, G., et al. Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).
- Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells. J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).
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