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Developmental Biology

Immuno-fluorescence étiquetage des Microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux Ex Vivo et 3D In Vitro intestinale organoïdes

Published: December 13, 2017 doi: 10.3791/56662
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1School of Biological Sciences, University of East Anglia, 2Norwich Medical School, University of East Anglia

Summary

Nous présentons des protocoles pour l’isolation de bâtiments 3D intestinales in vivo des tissus du et matrice de sous-sol en vitro intégrée organoïdes et différentes de fixation détail et souillant des protocoles optimisés pour l’immuno-marquage des microtubules, les protéines centrosomes et jonctionnelles ainsi que cell marqueurs dont la protéine des cellules souches Lgr5.

Abstract

L’avènement de la 3D en vitro organoïdes qui imitent le in vivo l’architecture tissulaire et la morphogenèse a grandement contribué à améliorer la capacité d’étudier des questions biologiques clés en biologie cellulaire et du développement. En outre, organoïdes ainsi que les progrès techniques récents dans l’édition de gène et de livraison de gènes viraux promet de faire avancer la recherche médicale et le développement de nouveaux médicaments pour le traitement des maladies. Organoïdes cultivés in vitro dans la matrice de sous-sol fournissent des systèmes puissants modèles pour étudier le comportement et la fonction des protéines différentes et sont bien adaptés pour vivre-l’imagerie des protéines fluorescentes-étiquetées. Toutefois, établir l’expression et la localisation des protéines endogènes dans le tissu ex vivo et in vitro organoïdes est important de vérifier le comportement des protéines étiquetés. À cette fin, nous avons développé et modifié les tissus isolation, fixation et immuno-marquage des protocoles pour la localisation des microtubules, protéines centrosomes et associés en tissu intestinal ex vivo et in vitro intestinale organoïdes. L’objectif était pour le fixateur préserver l’architecture 3D du organoïdes/tissu tout en préservant l’antigénicité des anticorps et qui permet la bonne pénétration et dégagement de fixateur et d’anticorps. Exposition au froid depolymerizes tous sauf les microtubules stables et c’était un facteur clé lors de la modification des protocoles différents. Nous avons constaté qu’augmentant la tétraacétique (EDTA) concentration de l’acide de 3 mM à 30 mM a détachement efficace des villosités et les cryptes de l’intestin grêle tandis que 3 mM EDTA ne suffisait pas pour les cryptes du côlon. Le protocole de fixation développés formaldéhyde/méthanol a donné très bonne préservation structurelle tout en préservant l’antigénicité pour un étiquetage efficace des microtubules, actine et des protéines (EB) fin. Il a également travaillé pour la protéine centrosomal ninein, bien que le protocole de méthanol a travaillé plus de Constance. Plus loin, nous avons établi que la fixation et l’immuno-marquage de microtubules et de protéines associées pourraient être atteints avec organoïdes isolé ou restant dans la matrice du sous-sol.

Introduction

Formation de l’épithélium avec polarité apico-basal est un processus fondamental dans le développement et implique une réorganisation dramatique des microtubules et des centrosomes protéines. Un tableau de microtubules radial émanant d’un microtubule centrosomes situé centre organisateur (MTOC) est importante dans plusieurs cellules animales et c’est bien adapté pour les piles relativement plates. En revanche, les cellules épithéliales prismatiques, telles que celles de l’intestin, assemblent les tableaux de microtubules non radiaux transcellulaire supportant mieux la forme et des fonctions spécialisées de ces cellules. Cette réorganisation dramatique des microtubules est obtenue par le centrosome vers l’apex et apicales MTOCs non-centrosomal (n-MTOCs) formant, qui devient responsable de l’ancrage des microtubules transcellulaire1,2 , 3 , 4 , 5.

Une grande partie de nos connaissances de la différenciation épithéliale et la réorganisation des microtubules associés vient des enquêtes de 2D en vitro couches de cellules qui n’affichent pas l’architecture de tissu in vivo . Développement des cultures 3D in vitro organoïde, mis au point par6Clevers et collègues de travail, représente une avancée technologique majeure car ils imitent en vivo de l’architecture et de développement. Une hiérarchie de différenciation épithéliale est évidente dans l’intestin ; les cellules souches au fond des cryptes donnent lieu au transit immature amplifier les cellules qui prolifèrent et se différencient progressivement alors qu’ils migrent vers le haut de la crypte sur le petites villosités intestinales ou de la surface du côlon, où ils deviennent complètement différenciés avant d’être hangar dans le lumen7. Ce qui est important, c’est reproduit dans organoïdes intestinal où les cellules de la niche de cellules souches prolifèrent formant kystes qui génèrent ensuite des bourgeons au fond et progresse graduellement vers la région du kyste, la différenciation des cellules souches ressemblant à des cryptes qui devient villosités type8. L’organoïde intestinal représente donc un modèle puissant d’étudier non seulement des microtubules et des centrosomes réorganisation au cours de la différenciation épithéliale mais plusieurs autres protéines, ainsi que fournir une plate-forme idéale pour le dépistage des drogues et de l’alimentation composés du potentiel thérapeutique bénéficie de9,10.

Organoïdes sont bien adaptés pour vivre-l’imagerie des protéines fluorescentes et les deux knock-in et knock out organoïdes peut être généré à l’aide de gène CRISPR/Cas9 édition11,12. Toutefois, établir l’expression et la localisation des protéines endogènes à étudier est important, en particulier de vérifier le comportement des protéines étiquetés. Immuno-marquage 3D organoïdes cultivés dans la matrice de sous-sol ou ex vivo isolée des tissus sont plus complexe que les cellules cultivées dans des récipients de culture en 2D. Le protocole de fixation doit préserver l’architecture 3D délicat d’organoïdes tout en conservant l’antigénicité des anticorps (c.-à-d., les épitopes permettant de lier les anticorps). Par exemple, 4 % de paraformaldéhyde (PFA) est couramment utilisé comme fixateur mais alors que c’est un fixateur d’action relativement rapide et donne bonne préservation morphologique, dans notre expérience il souvent résulte en une perte d’antigénicité et ne convient pas pour un grand nombre anticorps centrosomes. On envisagera également la capacité de l’anticorps et fixateur de pénétrer dans les tissus et les structures 3D. À cette fin, nous avons modifié et protocoles développés pour isolation de tissu et immuno-marquage indirecte de 3D en vitro organoïdes et ex vivo isolement de tissu intestinal. Nous décrivons comment isoler les petites cryptes intestinales et les villosités et les tissus du côlon et inclure un protocole pour l’isolement d’organoïdes 3D comme une alternative à la fixation et immuno-marquage inclus dans le sous-sol. Nous présentons trois protocoles alternatifs de fixation pour l’immuno-marquage des microtubules et des centrosomes protéines, tels que ninein et des protéines microtubulaires suivi plus-bout (+ conseils), tels que les protéines EB et CLIP-170 (voir aussi les références8, 13). Nous discuterons les avantages et les inconvénients associés à chaque protocole.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été effectuées conformément aux lignes directrices de l’Université d’East Anglia de licence institutionnelle.

1. isolement de tissu Intestinal

  1. Isolement des cryptes du côlon pour immuno-marquage (voir la Figure 1, schématique)
    1. Euthanasier la souris (à l’aide de CO2 asphyxie) et enlever le côlon (commençant au caecum et extraction en direction caudale) avec pinces et ciseaux14de dissection.
    2. Vider le contenu du côlon avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une pipette en verre avec poire en caoutchouc. PBS : chlorure de sodium (8,0 g/L), chlorure de potassium (0,2 g/L), phosphate disodique (1,15 g/L) et dihydrogénophosphate de potassium (0,2 g/L), à un pH de 7,3.
    3. À l’aide d’une tige métallique (diamètre 2,4 mm) ou la fin d’une pipette en verre, tenez une extrémité du tube du côlon faisant glisser doucement le tissu sur la tige/pipette ainsi inverser les tissus du côlon ainsi que l’épithélium est maintenant à l’extérieur.
      Remarque : Si ce n’est pas possible puis ouvrez le côlon avec des ciseaux et couper en morceaux de 5 mm.
    4. Transfert des deux-points ou pièces dans un tube conique de 50 mL contenant 40 mL de PBS.
    5. Inverser le tube plusieurs fois pour retirer davantage de contenu intestinal, mucus, etc.
    6. Transférer les côlon/morceaux à 40 mL d’EDTA dans du PBS de 3 mM et incuber à température ambiante (RT) pendant 15 min.
      NOTE : Diluer 0,5 M EDTA pH 8.0 stock avec du PBS.
    7. Secouer pour enlever le mucus et transférer le côlon de pièces dans un tube conique de 50 mL contenant frais 40 mL d’EDTA dans du PBS de 3 mM. Incuber pendant 35 min à température ambiante.
    8. Transférer les côlon/morceaux dans 10 mL de PBS dans un tube conique de 50 mL et agiter vigoureusement pendant 30 s pour libérer des cryptes (fraction de la crypte).
    9. Retirer le côlon de pièces du tube et remettre en place sur 3 mM EDTA, au cas où davantage l’isolement est nécessaire. Centrifuger la fraction restante de la crypte à 300 x g pendant 5 min.
    10. Prélever 5 mL du surnageant et Resuspendre le culot de crypte dans le volume restant de 5 mL.
    11. Observer sous un stéréomicroscope avec zoom (agrandissement X de 50-100) pour vérifier la présence des cryptes du côlon.
      Remarque : Si il n’y a aucun cryptes présentes puis incuber les côlon/morceaux en 3 mM EDTA dans du PBS pendant 30 min et répétez les étapes 1.1.8 - 1.1.11.
    12. Centrifuger la fraction de la crypte à 300 x g pendant 5 min.
    13. Retirez tous les surnageant pour obtenir une boulette de la crypte et de procéder immédiatement à la fixation (article 3).
  2. Isolement des petites cryptes intestinales et villosités pour immuno-marquage (Figure 2)
    1. Euthanasier la souris (à l’aide de CO2 asphyxie) et retirez l’intestin grêle (duodénum proximal et l’iléon terminal) avec dissection des ciseaux et pinces à épiler,14.
      Remarque : pour visualiser différente sections de l’intestin grêle, puis à ce stade, séparer et traiter séparément. Voir Figure 1 et tableau 1 pour un diagramme de flux et du minutage.
    2. Vider le contenu de l’intestin grêle avec PBS à l’aide d’une pipette en verre avec poire en caoutchouc.
    3. Fend l’intestin grêle avec des ciseaux de dissection et placer dans 15 mL de STP dans une boîte de Pétri.
    4. Laver délicatement l’intestin dans du PBS de supprimer du contenu luminal tandis que ne pas endommager la surface de la muqueuse. Transférer le tissu à une nouvelle boîte de Pétri et répéter le lavage de PBS.
    5. Couper l’intestin en morceaux de 3 à 5 mm et transférer à un 100 mm boîte de Pétri contenant 15 mL de 30 mM EDTA dans du PBS et incuber pendant 5 min à RT. alternativement incuber 30 min à 3 mM EDTA dans du PBS.
    6. Fraction 1 (isolation des villosités) : transférer les morceaux intestinales dans 10 mL de PBS dans un tube conique de 50 mL, agiter vigoureusement pendant 10 s et les verser dans un plat de Pétri de 100 mm. Vérifier la fraction des villosités isolées sous un stéréomicroscope. À ce stade, pour la plupart des villosités devraient être présentes, mais cela peut varier entre des isolations.
      Remarque : Pour éviter les villosités isolés/cryptes collent au plastique, boîtes de Pétri et tubes de prélèvement devrait être revêtu avec sérum bovin fœtal (SVF). Versez FBS dans plats et/ou des tubes et le retirer immédiatement. Voir le tableau 1 pour les guides de chronométrage pour chaque fraction.
    7. Transférer les morceaux intestinales dans 30 mM EDTA dans du PBS et incuber pendant 5 min. Durant cette incubation, collecter 1 Fraction dans un tube conique de 15 mL (recouvertes de FBS) et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
    8. Fraction 2 : Transfert intestinal morceaux à un tube conique de 50 mL contenant 10 mL de PBS, agiter vigoureusement pendant 20 s et puis versez dans un plat de Pétri de 100 mm. Vérifier la fraction sous le microscope. En général, à ce stade une culture mixte de villosités et les cryptes sont présents (Figure 2 a).
    9. Transfert de morceaux intestinale dans 30 mM EDTA dans du PBS et incuber pendant 5 minutes supplémentaire. Durant cette incubation, pellet Fraction 2 dans un tube conique de 15 mL (recouvertes de FBS) à 300 g pour 5 min. Retirez le surnageant de Fractions 1 et 2 sans déranger le culot et procéder immédiatement à la fixation (étape 3).
    10. Fraction 3 (isolement de la crypte) : transférer les morceaux intestinales dans 10 mL de PBS dans le tube de 50 mL, agiter pendant 20 s et les verser dans un plat de Pétri de 100 mm. Vérifier la fraction sous le microscope. À ce stade, la fraction contiendra principalement des cryptes (Figure 2 b).
    11. Passage 4 : Transférer les morceaux intestinales dans 10 mL de PBS, agiter pendant 20 s et les verser dans un plat de Pétri de 100 mm. Vérifier la fraction sous le microscope. À ce stade seulement de cryptes devraient être présents.
    12. Fraction 5 : Transférer les morceaux intestinales dans 10 mL de PBS, agiter pendant 20 s et les verser dans un plat de Pétri de 100 mm. Vérifier la fraction sous le microscope. Généralement, à ce stade, très peu des cryptes sont extraites. Si plusieurs cryptes sont extraits, puis continuer avec une fraction deth 6.
      Remarque : Si une population pure crypte est souhaitée (par exemple, pour la génération organoïde), puis utilisez une passoire de cellule 70 µm à supprimer toute villosités intactes de la fraction enrichie en crypte.
    13. Fractions 3-5 s’accumuler dans les tubes coniques distinct de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
    14. Vérifier les pellets de Fractions 3 - 5 et retirer le surnageant sans déranger les pellets et procéder immédiatement à la fixation (article 3).

2.Isolement des organoïdes intestinales de dômes de matrice du sous-sol en plaques 24 puits

Remarque : La formation d’organoïdes dans les dômes de matrice de sous-sol a été décrit ailleurs12.

  1. Recouvrir les puits avec dôme matrice sous-sol selon les instructions du fabricant.
  2. Puits de lavage contenant des dômes de matrice de sous-sol avec 500 µL de PBS.
  3. Ajouter froid 250 µL de solution de récupération de cellules (4 ° C) dans chaque puits (voir Table des matières).
    Remarque : La solution de récupération cellule glaciale se dépolymériser microtubules pratiquement stables.
  4. Gratter les dômes de matrice du sous-sol à l’aide d’une micropipette P1000 et soigneusement Pipetter monter et descendre dans le puits de rupture et enlever la matrice de socle en plastique.
  5. Recueillir le liquide surnageant dans les tubes de microcentrifuge de liaison faible 1,5 mL.
  6. Renverser le tube de liaison faible 1,5 mL plusieurs fois et vérifier au microscope si les organoïdes ont été isolés et sont libres d’aller et pas en touffes. Tenez le tube sous un stéréomicroscope et vue sous un grossissement faible (50 X).
  7. L’organoïdes a granulé par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
  8. Supprimer le réactif de récupération et de procéder immédiatement à la fixation (étape 3).

3. fixation de tissu Intestinal isolé et organoïdes

  1. Fixation de méthanol
    1. Resuspendre la fraction isolée crypte/villosités intestinales dans 10 mL et organoïdes dans 1 mL de méthanol à-20 ° C.
    2. Incuber les cryptes/villosités/organoïdes à-20 ° C dans un congélateur pendant 15 minutes puis retournez les tubes toutes les 5 min.
    3. Les cryptes/villosités/organoïdes à pellets par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min.
    4. Supprimez le méthanol et la solution de lavage (1 mL pour organoïdes et 10 mL pour les fractions isolées crypte/villosités). La solution de lavage peut consister soit PBS avec 1 % de sérum ou de PBS avec 0,1 % de sérum de détergent et de 1 %.
      Remarque : Utilisez le sérum de la même espèce que celle des anticorps secondaires. Par exemple, si les anticorps secondaires ont été générés en chèvre puis utilisez le sérum de chèvre.
    5. Immédiatement, centrifuger les cryptes/villosités/organoïdes à 1 000 x g pendant 5 min granuler.
    6. Enlever la solution de lavage et remettre en suspension les cryptes/villosités/organoïdes dans la solution de lavage douce.
    7. Placer sur un agitateur de tube avec la vitesse réglée à 20 tr/min. Laver les cellules pour un total de 1 h, les cryptes/villosités/organoïdes la granulation par centrifugation (1 000 x g pendant 5 min) toutes les 15 min et le remplacement de la solution de lavage.
      Remarque : Si un rotateur de tube n’est pas disponible alors il faut inverser les tubes manuellement toutes les 5 min pour remettre en suspension les cultures isolées.
  2. Fixation de formaldéhyde/méthanol
    Nota : Manipule les fixatifs et formaldéhyde sous une hotte.
    1. Remettre en suspension les cryptes/villosités isolées dans 10 mL ou organoïdes dans 1 mL de solution de fixation de-20 ° C (9,2 mL de méthanol par 800 µL de solution de formaldéhyde).
    2. Difficulté les cryptes/villosités/organoïdes à-20 ° C dans un congélateur pendant 15 min puis retournez le tube toutes les 5 min.
    3. Les cryptes/villosités/organoïdes à pellets par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min.
    4. Retirer le formaldéhyde/méthanol et ajouter la solution de lavage (1 mL pour organoïdes ou 10 mL pour les fractions isolées cryptes/villosités). La solution de lavage peut consister soit PBS avec 1 % de sérum de chèvre ou de PBS avec 0,1 % de sérum de détergent et de 1 %.
    5. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min granuler les cryptes/villosités/organoïdes.
    6. Enlever la solution de lavage et remettre en suspension dans une solution nettoyante douce.
    7. Placer sur un agitateur de tube avec la vitesse réglée à 20 tr/min. Laver les cellules pour un total de 1 h, les cryptes/villosités/organoïdes la granulation par centrifugation (1 000 x g pendant 5 min) toutes les 15 min et le remplacement de la solution de lavage.
  3. Fixation de la PFA
    ATTENTION : Les solutions et PFA poudre doivent être manipulées sous une hotte.
    Remarque : Dans la plupart des cas 4 % PFA dans du PBS est utilisé, mais selon la préservation de l’antigénicité des anticorps, des concentrations plus faibles peuvent être utilisées.
    1. Remettre en suspension les cryptes/villosités granulées isolées dans 10 mL 4 % PFA et incuber à RT pendant 1 h, et isolées granulés organoïdes dans 1 mL 4 % PFA et incuber pendant 30 minutes. Dans les deux cas il faut inverser les tubes toutes les 10 min.
    2. Les cryptes/villosités/organoïdes à pellets par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min.
    3. Supprimez la PFA et solution de lavage (1 mL pour organoïdes et 10 mL pour les cryptes/villosités isolées). La solution de lavage se compose de PBS avec 0,1 % de sérum de détergent et de 1 %.
    4. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min granuler cryptes/villosités/organoïdes.
    5. Enlever la solution de lavage et remettre en suspension dans une solution nettoyante douce.
    6. Placer sur un agitateur de tube avec vitesse fixée à 20 tr/min. Laver les cellules pour un total de 1 h, les cryptes/villosités/organoïdes la granulation par centrifugation (1 000 x g pendant 5 min) toutes les 15 min et le remplacement de la solution de lavage.
      Remarque : Si un rotateur de tube n’est pas disponible alors il faut inverser tubes manuellement toutes les 5 min pour remettre en suspension les cultures isolées.
    7. Recherche d’antigène (étape facultative recommandée pour la fixation de l’IFP)
      1. Les cryptes/villosités/organoïdes à pellets par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
      2. Ajouter 1-10 mL de 10 mM du citrate de sodium pH 6.0 (préchauffée à 80 ° C) et laisser incuber à 80 ° C pendant 20 min.
      3. Les cryptes/villosités/organoïdes à pellets par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
      4. Ajouter mL de 1-10 de frais 10 mM du citrate de sodium pH 6.0 (préchauffé à 80 ° C) et incuber à RT pendant 20 min.
      5. Les cryptes/villosités/organoïdes à pellets par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
      6. Laver à 1-10 mL de PBS contenant 1 % de sérum et répéter un plus 3 fois la granulation les cryptes/villosités/organoïdes par centrifugation (1 000 x g pendant 5 min) avant d’ajouter la solution de lavage douce.

4. blocage étape

  1. Faire la solution de saturation : ajouter 10 % de sérum d’espèces anticorps secondaire dans du PBS (facultatif : ajouter 0,1 % de détergent).
  2. Les cryptes/villosités/organoïdes à pellets par centrifugation (1 000 x g pendant 5 min) et éliminer le surnageant.
  3. Ajouter 5 à 10 mL de la solution de saturation selon le nombre d’échantillons requis (voir note ci-dessous). À ce stade, diviser la solution cryptes/villosités/organoïdes dans des tubes individuels (tubes de microcentrifuge faible liaison 1,5 mL avec chaque tube contenant 0,2 - 1 mL) pour une coloration avec les anticorps différents.
    Remarque : Chaque fraction isolée cryptes/villosités donnera entre 5-10 échantillons qui peuvent être utilisés pour différentes combinaisons étiquetage selon la taille de la pastille. Idéalement, il faut une taille de granule entre 2 à 4 mm pour chaque échantillon.
Différentes fractions peuvent être associées à ce stade comme les cryptes et de villosités peuvent facilement être identifiés (Figure 2).
  • Incuber en bloquant la solution à ta sur un rotateur de tube pendant 1 h.

    • 5. Incubation des anticorps primaire

    1. Diluer l’anticorps primaires (voir Table des matières) dans du PBS contenant 10 % de sérum et 0,1 % de détergent. Entre 100 et 200 µL solution anticorps primaire est nécessaire par échantillon de tubes de microcentrifuge.
    2. Enlever la solution de saturation par centrifugation (1 000 x g pendant 5 min).
    3. Resuspendre le culot de cryptes/villosités/organoïde dans la solution d’anticorps primaire et incuber à 4 ° C durant la nuit en utilisant un rotateur de tube (20 tr/min) pour garder les cryptes/villosités/organoïdes en suspension.
    4. Lendemain : ramener les échantillons sur RT pendant 1 h sur rotateur de tube (20 tr/min).
    5. L’échantillon de granule par centrifugation (1 000 x g pendant 5 min) et enlever la solution de l’anticorps primaire.
    6. Ajouter 1 mL de solution de lavage et remettre en suspension les pellets crypte/villosités/organoïde.
    7. Retirer immédiatement la solution par centrifugation (1 000 x g pendant 5 min).
    8. Ajouter 1 mL de solution de lavage douce et tournez les cellules sur un rotateur de tube (20 tr/min) pendant 2 heures. Changer la solution de lavage par centrifugation toutes les 30 minutes comme au point 5.7.

    6. secondaires anticorps Incubation

    1. Diluer l’anticorps secondaires (voir Table des matières) dans du PBS avec 10 % de sérum et 0,1 % de détergent. Il faut environ 200 µL de solution d’anticorps secondaire par échantillon de tubes de microcentrifuge.
      NOTE : Anticorps très Croix-absorbé devraient servir à réduire la réactivité des anticorps secondaires en souris crypte/villosités/organoïde.
    2. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min pour les cryptes/villosités/organoïdes de granule et remettre en suspension les pellets dans 200 µL de solution d’anticorps secondaire.
    3. Faites tourner les tubes sur un rotateur de tube (20 tr/min) à la droite pendant 1 h.
    4. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min pour les cryptes/villosités/organoïdes de granule et supprimer les surnageants (non liées aux anticorps secondaires).
    5. Resuspendre le culot dans la solution de lavage et Centrifuger immédiatement à 1 000 x g pendant 5 min granuler les cryptes/villosités/organoïdes.
    6. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de solution de lavage douce.
    7. Tourner sur un rotateur de tube (20 tr/min) à ta pour 1,5 à 2 h, en changeant la solution de lavage à chaque 20-30 min comme décrit précédemment aux points 6.3 à 6,6.

    7. nucléaire tache

    1. Diluer la tache nucléaire dans la solution de lavage (conformément au protocole du fabricant), tels que le DAPI ou Hoechst. Par exemple : solution mère DAPI (20 mg/mL) est dilué 01:10, 000. La solution peut être gardée en aliquotes à-20 ° C.
    2. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min pour les cryptes/villosités/organoïdes de granule et enlever la solution de lavage.
    3. Resuspendre le culot dans la solution nucléaire contre-colorant.
    4. Tourner sur un rotateur de tube (20 tr/min) à la droite pendant 10 min.
    5. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min pour les cryptes/villosités/organoïdes à pellets, enlever la solution de coloration nucléaire et Resuspendre le culot dans la solution de lavage.
    6. Tourner sur un rotateur de tube (20 tr/min) à ta pendant 30 à 60 min, changeant la solution de lavage toutes les 10 min.

    8. montage isolé de cryptes et villosités organoïdes

    1. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min pour les cryptes/villosités/organoïdes de granule et enlever toute la solution de lavage.
      Remarque : Si le culot se disperse, puis centrifuger à nouveau.
    2. Ajouter 2 gouttes de réglage dur support de montage avec agent antifade au culot.
    3. Coupez l’extrémité d’une micropipette P200 et soigneusement Resuspendre le culot dans les supports de montage. Éviter de générer des bulles.
      Remarque : Les cultures organoïde isolées sont très collants ; Assurez-vous de remettre en suspension entièrement.
    4. Utiliser une micropipette pour transférer le mélange des cryptes/villosités/organoïdes dans la solution de support de montage et distribuer en une ligne le long du centre d’une lame de microscope.
      Remarque : La ligne ne doit pas être plus longue que le verre qui doit être utilisé. Vérifiez à l’aide d’un stéréomicroscope si les cryptes/villosités/organoïdes sont bien étalées sur lame et pas agglutinés.
    5. Placer soigneusement un verre sur le dessus ; éviter de générer des bulles.
    6. Placer la lame de verre dans un livre de diapositive et un magasin dans un réfrigérateur pendant la nuit pour les supports de montage définir avant d’analyser sur un microscope confocal.
      Remarque : Pour les anticorps de souris coloration dans les tissus de souris, utilisez l’immunofluorescence commercial nécessaire (voir la Table des matières). Remplacer l’étape de blocage (Section 4) avec un bloc de 10 min et protéine solution de saturation suivie d’une incubation de 1 h avec le réactif de blocage qui est livré avec le kit. Une incubation de 1 h avec le réactif de fluorescence signal enhancer ajoutez ensuite à l’étape 5.8 (au milieu de lavage). Utilisez alors les réactifs du kit fluorescent dilution (autres anticorps secondaires également utilisable en combinaison avec ce réactif). Incuber comme ci-dessus et passez à l’étape 6 avec le reste du protocole.

    9. fixation et Immuno-marquage des organoïdes au sein de la matrice de sous-sol

    Remarque : Organoïdes destinés à la fixation et l’immuno-marquage tout en restant dans la matrice du sous-sol ont été générés dans les dômes de matrice du sous-sol sur le dessus de lamelles de verre rond dans une assiette de 24 puits (un dôme / puits). Les dômes de matrice organoïde sous-sol ont été traitées dans la plaque 24 puits par l’ajout et la suppression des différentes solutions.

    1. Retirer le support du puits et ajouter le fixateur ; laisser pendant 1 h.
    2. Enlever le fixateur et laver dans du PBS contenant 1 % de sérum et 0,1 % de détergent pendant 2 h, changeant toutes les 30 minutes.
    3. Enlever la solution de lavage et bloquer dans du PBS avec 10 % de sérum et 0,1 % de détergent pendant 1 h.
    4. Diluer les anticorps dans le PBS contenant 1 % de sérum ou de PBS avec 1 % de sérum et 0,1 % de détergent.
    5. Enlever la solution de blocage et ajoutez l’anticorps primaire 100-200 μL solution (voir Table des matières) dans chaque puits.
      Remarque : il est important d’enlever toute la solution de blocage pour ne pas diluer les anticorps plus loin.
    6. Placer la plaque dans le réfrigérateur et incuber une nuit à 4 ° C
    7. Laissez ensuite à ta pendant 1 à 2 h.
    8. Enlever la solution de l’anticorps et la laver pendant 2-3 h changer la solution de lavage toutes les 20 min.
    9. Retirer toutes les solution de lavage et ajouter 100-200 μL Anticorps secondaires dilués (voir Table des matières) dans du PBS 1 % sérum ; Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
    10. Enlever la solution de l’anticorps secondaire et lavage pendant 2 h, changer toutes les 20 min.
    11. Enlever la solution de lavage et ajouter la solution au DAPI ; Laissez pendant 10 min à la solution-mère RT. utilisation DAPI (20 mg/mL) dilué à 01:10, 000.
    La solution peut être gardée en aliquotes à-20 ° C.
  • Retirer la solution DAPI et lavage pendant 40 min, changer toutes les 10 min.
  • À l’aide de pinces, retirer la lamelle de verre avec le dôme de matrice de sous-sol et déposer sur une lame avec le dôme de matrice du sous-sol vers le haut ; ajouter quelques gouttes de supports de montage et ensuite mettre une lamelle de verre sur le dessus.
  • Placer la lame de verre dans un livre de diapositive et laisser au réfrigérateur toute la nuit pour les supports de montage définir.

    • Representative Results

    Isolement de tissu intestinal pour immuno-marquage
    Les protocoles d’isolement décrit les tissus du côlon et intestin grêle ont été optimisées pour la préservation et l’immuno-marquage de microtubules et de protéines associées, mais pas pour la viabilité des cellules souches et organoïde génération (Figure 1 et tableau 1 ). L’objectif était de générer des cryptes et des factions de villosités qui étaient comme nettoyer (dépourvue de mucus et autres tissus) que possible, tout en minimisant l’exposition à l’EDTA et froide pour préserver la structure et de prévenir la dépolymérisation des microtubules grâce aux solutions froid glace, qui induisent dépolymérisation des microtubules pratiquement stables. La figure 2 montre des exemples d’images des Fractions 2 et 3 d’isolé petit tissu intestinal, avec 2 Fraction contenant un mélange de villosités et de cryptes (Figure 2 a, B), alors que 3 Fraction contient principalement des cryptes (Figure 2 D).

    Fixation et immuno-marquage des tissus intestinaux isolés
    Les fractions individuelles ou combinées sont ensuite traitées pour fixation et immuno-marquée par une série de mesures, dont la fixation, détergent, blocage, anticorps et solutions, de lavage avant de re-suspendre les villosités/cryptes finales-pellet dans les supports de montage, transfert de diapositives et couvrir avec les lamelles de verre. Les cryptes et les villosités ont été ensuite projetées sur un microscope confocal.

    Bonne conservation en les étiquetant de microtubules et de l’actine dans les villosités et les cryptes a été atteint par ce qui suit : une combinaison de la fixation de formaldéhyde/méthanol à-20 ° C, répété lavage en PBS contenant 0,1 % de détergent et 1 % de sérum et de blocage dans du PBS avec 0,1 % détergent et 10 % de sérum, suivie d’une nuit d’incubation à 4 ° C à l’anticorps primaires et ensuite 2 h à Anticorps secondaires à température ambiante (Figure 3). Fixation de formaldéhyde/méthanol aussi bien fonctionné pour étiquetage + conseils tels que l’EBs et CLIP-170 en isolé de cryptes et de villosités (Figure 4). EB3 accumulations plus-fin des microtubules (appelés comètes) étaient évidentes dans les cryptes (Figure 4 a), tandis que l’association le long du réseau de microtubules stables pouvait être observée dans des échantillons de villosités (Figure 4). Localisation distincte de CLIP-170 et p150collé (sous-unité de DCTN5) étaient très évidentes aux n-MTOCs apicales dans les villosités isolées (Figure 4 b). Fixation avec le protocole de formaldéhyde/méthanol ne fonctionnait pas systématiquement pour la localisation de ninein dans les tissus intestinaux isolés à l’aide de nos anticorps Pep3 contre souris ninein. Cependant, fixation de méthanol à-20 ° C suivie par le lavage même, et le blocage des solutions en ce qui concerne le formaldéhyde/méthanol conduit très bonne localisation de ninein dans les cryptes isolés et des villosités (Figure 5; référence8). Fait intéressant, bien que ninein est concentrée dans les centrosomes apicales certaine accumulation à la base de la cellule était évidente dans certaines cellules dans les cryptes isolés (Figure 5). Si cela est dû à la non spécifiques d’étiquetage ou une conséquence de la procédure d’isolement retarder la fixation (et affectant ainsi la conservation) devront encore enquête. Toutefois, sections cryostat méthanol-fixe (-20 ° C) des villosités (voir Figure 3bi dans8) a également révèlent ninein à la cellule de base dans certaines cellules, ce qui laisse supposer que ninein peut aussi associer à une population basale des microtubules.

    Fixation et immuno-marquage des organoïdes isolées de matrice de sous-sol
    Petites organoïdes intestinales ont été générés et cultivés dans la matrice de sous-sol pendant trois semaines ou plus (Figure 6 a,6,de référence15). Un froid (4 ° C) solution de récupération de cellule a permis d’isoler les organoids de la matrice du sous-sol. La solution de matrice dépolymérisée sous-sol avec organoïdes a été transférée à tubes et centrifugée avant la fixation et l’immuno-marquage. Cela produit des préparations très propres et bon accès à l’organoids pour les différentes solutions a permis. Les cellules différenciées dans les domaines de villosités organoïde contiennent des microtubules apico-basal stables ; Ces étiqueté ainsi dans la plupart des cas (Figure 6 b, C) et EB1 pourrait aussi être vu sur le réseau de microtubules (Figure 6E; référence13). Toutefois, la solution de récupération cellule froide peut-être entraîner la dépolymérisation des microtubules dynamiques, qui était évidente dans certains échantillons par le manque de EB1 comètes (qui se lient à l’extrémité plus de microtubules croissants) dans les domaines de la crypte basale (Figure 6F ). Dans les autres échantillons, astral microtubules (dynamiques) ont été conservées (Figure 6). Organoïde isolement avant la fixation et l’immuno-marquage a également travaillé pour les protéines jonctionnelles, ninein, CLIP-170 et des marqueurs de cellules, telles que la mucine des cellules caliciformes et chromogranine A pour cellules entéroendocrines.

    Fixation et immuno-marquage des organoïdes au sein de la matrice de sous-sol
    La figure 7     montre un organoïde au stade kysteA–(C) et à un stade précoce du développement de la crypte (D), fixe dans le formaldéhyde/méthanol et immuno-étiqueté pour les microtubules et ninein. Microtubule bonne préservation et étiquetage ainsi que l’étiquetage à ninein à MTOCs-n apicales était évident. Figure 8 aa B montre un domaine de la crypte en une journée organoïde 6 fixe avec le protocole de méthanol et étiquetés pour les microtubules et les EB1. Bonne conservation des microtubules et EB1 comètes était évidente suggérant la préservation des microtubules dynamiques.

    Organoïdes ont été également fixes et immuno-étiqueté tout en restant dans la matrice du sous-sol. Les inconvénients de cette procédure peuvent être faible pénétration du fixateur et le piégeage des anticorps dans la matrice du sous-sol (Figure 8 b), bien que dans les deux cas moins fréquemment lorsque 0,1 % de détergent a été incluse dans le fixateur et/ou des solutions de lavage. En outre, 4 % PFA n’a pas préserver la matrice sous-sol bien causé mais il se dissout, bien qu’il s’agissait moins donc, avec 1 % PFA.Fixation de méthanol, d’autre part, parfois induits organoïde effondrement.

    Marquage avec certains anticorps tels que le marqueur de cellules souches marqueur Lgr5 et Paneth cellule CD24 se sont révélés infructueux avec les protocoles PFA, le méthanol ou formaldéhyde/méthanol de 4 %. Toutefois, l’organoïdes de fixation inclus dans le sous-sol avec 1 % PFA dans du PBS avec 0,1 % de détergent à la température ambiante entraînait d’étiquetage pour les Lgr5 et CD24 (Figure 9).

    Figure 1
    Figure 1 : isolement des petites villosités intestinales et cryptes. Diagramme de flux des étapes clés dans petites villosités intestinales et l’isolement de la crypte avant la fixation et l’immuno-marquage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2 : isolées des villosités et les cryptes de l’intestin grêle souris. Images de microscope fond clair des fractions intestinales montrant des villosités (grandes flèches) et les cryptes (petites flèches). (A, B) Fraction 2 contient un mélange de villosités et de cryptes, et conservation de la morphologie sur les villosités et de cryptes est évidente dans B. (C, D) Fraction 3 montre l’isolement des cryptes et absence de villosités et les cryptes intacts, y compris une crypte bifurquée en C. Barreaux de l’échelle = 500 μm (A, C) ; 100 μm (B, D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3 : isolé petites villosités intestinales et crypte fixe en formaldéhyde/méthanol et immuno-étiqueté pour actine et les microtubules. (A) schéma de l’épithélium des villosités et de cryptes avec différents types de cellules indiqué. Les cases en surbrillance indiquent les régions représentatives photographiées sur B et C. (B, C) Sections optiques confocale par partie de des villosités (B) et la crypte basale (C) isolées de l’intestin grêle à l’aide de 30 mM EDTA et fixe du formaldéhyde/méthanol, lavées dans du PBS contenant 1 % chèvre sérum et 0,1 % de détergent, bloqué dans du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre et de 0,1 % de détergent et marqué des microtubules avec anticorps anti-tubuline monoclonal de rat (vert) et pour l’actine avec anticorps anti-β-actine polyclonal de lapin (rouge). Bien préservée apico-basal faisceaux de microtubules est évidents dans les cellules des villosités et de cryptes, et on peut considérer l’actine concentrées dans la région apicale, face à la lumière (flèche). Barreaux de l’échelle = 5 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4 : Isolé petites cryptes intestinales et villosités fixes en formaldéhyde/méthanol et immuno-étiqueté pour les microtubules, EB3, p150colléet CLIP-170. Confocale sections optiques de cryptes et villosités des régions isolées de l’intestin grêle à l’aide de 30 mM EDTA et fixe du formaldéhyde/méthanol, lavé dans du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre et de 0,1 % de détergent, bloqué dans du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre et de 0,1 % de détergent, et immuno-étiqueté. (A) crypte marquées avec des anticorps polyclonaux α-tubuline de lapin (rouge) et les anticorps monoclonaux d’EB3KT36 de rat (vert) et colorés pour ADN au DAPI (bleu) montrant des microtubules apico-basal et comètes EB3. L’image inversée monocanal montre clairement EB3 comètes dans toute les cellules basales crypte suggérant la bonne préservation des dynamiques ainsi que de microtubules stables. (B) les villosités épithéliales cellules marquées avec des anticorps polyclonaux de lapin contre la CLIP-170 (voir rouge, font aussi référence au16) et à la souris monoclonal p150 co-localisation des anticorps (vert) montrant apicale decollé . Images inversées monocanal sont indiqués ci-dessous. (C) cellules des villosités marquées avec des anticorps polyclonaux α-tubuline de lapin (rouge) et les anticorps monoclonaux d’EB3-KT36 rat (vert) et colorés pour ADN au DAPI (bleu) montrant des microtubules apico-basal avec EB3 le long de la grille. L’association de treillis EB3 est mis en évidence dans l’image agrandie tandis que l’image inversée monocanal suggère les comètes EB3 et association de treillis. Barreaux de l’échelle = 5 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5 : isolé du côlon crypte fixe dans le méthanol, immuno-étiqueté pour ninein et E-cadhérine et colorées au DAPI. Coupe optique confocal de la basale et amplifier les transport en commun région d’une crypte isolé du colon à l’aide de 3 mM EDTA fixe dans le méthanol, lavées dans du PBS contenant du sérum de chèvre 1 % et 0,1 % de détergent et bloqué dans du PBS contenant 10 % chèvre sérum et 0,1 % de détergent. La crypte a été étiquetée avec des anticorps polyclonaux ninein lapin (Pep3, voir aussi référence8, rouge) et l’anticorps monoclonal de E-cadhérine (vert) de la souris et colorées au DAPI (bleu). L’image inversée monocanal montre ninein seulement. L’image montre une crypte bien préservée avec la E-cadhérine révélant les grandes lignes des cellules individuelles et ninein concentré les centrosomes apicales. Il suggère la bonne pénétration de fixateur et d’anticorps et la préservation de l’antigénicité. Echelle = 5 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 6
    Figure 6 : organoïde développement, fixation et immuno-marquage d’isolent organoïdes. (A) Phase contraste des images montrant différents stades de développement organoïde d’agrégats cellulaires à kyste avec l’initiation des bourgeons et entièrement formé organoïdes avec des domaines de cryptes et de villosités.(B–F) Sections optiques confocale par organoïdes isolée de matrice de sous-sol à l’aide de solution de récupération de cellule à 4 ° C (10 min), suivie de la fixation de formaldéhyde/méthanol, lavage en PBS contenant 10 % de sérum de chèvre et de 0,1 % de détergent, bloquant dans du PBS contenant 10 % chèvre sérum et 0,1 % de détergent et immuno-marquage des microtubules, β-caténine et EB1. (B) kyste organoïde étiqueté pour les microtubules (bleus) et β-caténine (rouge) révélant la préservation des microtubules bonne et l’étiquetage dans la plupart des cellules. (C) les microtubules apico-basal distincts sont présents dans ces cellules épithéliales élargies un kyste organoïde. (D) divisant les cellules marquées pour les microtubules montrant des axes, y compris les microtubules (dynamiques) astral (flèche). (E, F) Domaine de villosités (E) et crypte domaine (F) organoïde régions montrant certains EB1 marquage le long du réseau de microtubules stables, en particulier dans les villosités, bien que très peu EB1 comètes sont vus au sein même de la crypte basale suggérant cette dynamique les microtubules n’ont pas été conservées. Barreaux de l’échelle = 20 μm (A) ; 2 μm (D) ; 5 μm (B, C, E-F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 7
    Figure 7 : organoïdes fixe au sein de la matrice de sous-sol dans le formaldéhyde/méthanol et immuno-étiqueté pour les microtubules et ninein. Confocale sections optiques d’organoïdes fixe du formaldéhyde/méthanol, lavé et bloqué dans du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre et de 0,1 % de détergent et étiqueté tout en restant dans la matrice du sous-sol. A–(C) Organoïde kyste étiqueté pour les microtubules (vert) et ninein (Pep3 ; référence8, rouge) et colorées au DAPI (bleu) montrant l’image fusionnée a inversé les images monocanal pour les microtubules (B) et ninein (C). Les images montrent des microtubules apico-basal et apical ninein localisation, suggérant la très bonne préservation structurelle de l’organoïde et pénétration des anticorps aussi bien que des anticorps non fixés. (D, E) Organoïde avec développement crypte fixe et étiquetés comme ci-dessus, puis affichage excellente conservation structurale, étiquetage et compensation des anticorps. Distincts microtubules apico-basal et apical n-MTOC ninein localisation est évidente et mis en évidence dans l’image agrandie (E) de la région en boîte en ré. Barreaux de l’échelle = 10 μm (A-D) ; 5 μm (E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 8
    Figure 8 : organoïdes fixe au sein de la matrice de sous-sol dans le méthanol et immuno-étiqueté pour les microtubules et les EB1. Confocale sections optiques d’organoïdes fixé dans le méthanol, lavé et bloqué dans du PBS contenant du sérum de chèvre de 10 % et 0,1 % de détergent et étiquetés, tout en restant dans la matrice du sous-sol. Kyste (A) domaine d’une décélération organoïde étiqueté avec lapin polyclonale α-tubuline (rouge) et souris des anticorps monoclonaux de EB1 (vert) montrant des microtubules apico-basal, fuseaux (flèche) à deux cellules en division et distinctes EB1 comètes. Un piégeage des anticorps EB1 non fixés est évident. Toutefois, bonne conservation structurale et l’étiquetage des microtubules et les EB1 est observé. La présence de comètes EB1 suggère que les microtubules dynamiques ont été conservés (A, inverti). (B) Inverted image de région de kyste organoïde montrant α-tubuline anticorps marquage avec des anticorps considérables pris au piège dans la matrice du sous-sol environnant (flèche). Barreaux de l’échelle = 5 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 9
    Figure 9 : organoïdes fixé au sein de la matrice de sous-sol dans 1 % PFA et immuno-étiqueté pour Lgr5 et CD24. Confocale sections optiques d’organoïdes fixe au sein de la matrice de sous-sol dans 1 % PFA dans du PBS contenant 0,1 % de détergent, lavées dans du PBS avec sérum de chèvre 1 % et 0,1 % de détergent et marquées avec des anticorps anti-Lgr5 et CD24. (A, B) Niche de cellules souches au sein d’un domaine de crypte montrant des cellules de Paneth positif pour CD24 (rouge). Les images de contraste confocale et phase ont été fusionnés à l’A. B montre unique canal de CD24 l'étiquetage. (C) région de cellules souches dans un domaine de crypte montrant une cellule souche positive de Lrg5. Barreaux de l’échelle = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Table 1
    Tableau 1 : chronologie de petit isolement de cryptes et de villosités intestinal et fixation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Discussion

    Isolement de tissu intestinal
    Isolement des petites cryptes intestinales et les villosités et les cryptes du côlon consiste à exposer la surface des muqueuses, traitement avec une solution d’EDTA pour desserrer la centrifugation, le fractionnement (secousses) et contacts de la cellule. Le protocole présenté villosités/cryptes intestinales a été modifié par Belshaw et coll. et Whitehead et al. 17 , 18

    Exposer la surface de la muqueuse
    Nous avons expérimenté avec un certain nombre d’approches pour exposer la surface muqueuse du tractus intestinal dans le développement de cette procédure. Une approche classique consiste à evert (tourner à l’envers) le tube, généralement dans les segments environ 100 mm de longueur, à l’aide d’une tige métallique qui est prise dans un pli du tissu à une extrémité, puis le tube restant a glissé au-dessus du tube19. Pour les tissus de souris, une tige de métal (2,4 mm de diamètre) avec les extrémités arrondies est idéale. Cette approche a l’avantage d’élargir la surface des muqueuses permettant un accès meilleur à PBS et d’EDTA. Nous avons initialement utilisé cette approche mais s’installe à découper le tube en petites longueurs (environ 5 cm) et l’ouverture de chaque section avec ciseaux de dissection, comme cela s’est avéré plus facile. Cette approche est appropriée si seulement quelques intestins sont obligatoires ; mais si plus d’animaux devaient être utilisés lors d’une expérience puis un dispositif spécialement conçu pour coupe ouvert le tube longitudinalement, tel que décrit par Yoneda et al. 14 serait plus efficace.

    Détachement des villosités et les cryptes de la couche musculaire
    Au départ, nous avons utilisé 3 mM EDTA dans du PBS et temps d’incubation relativement longue de plus de 60 min pour desserrer la surface muqueuse de tissus sous-jacents17,18. À cette concentration d’EDTA, nous avons constaté qu'une durée d’incubation de 30 min ne suffisait pas à desserrer les cryptes du colon de la souris. Toutefois, pour l’isolement de crypte/villosités de l’intestin, nous avons essayé sur EDTA plus concentré pour un temps plus court, qui s’est avéré pour être une approche efficace. Tous les travaux ultérieurs a été entrepris avec tissu extrait à l’aide de la technique de 30 mM EDTA générant des fractions pertinentes pour les villosités ou cryptes. Pour les cryptes, nous avons mis en commun normalement fractions 3-5 avant de fixer mais il est important de vérifier si ce sont les fractions appropriées comme les timings dépendra d’un certain nombre de facteurs tels que la position le long du tractus intestinal, l’âge de la souris, l’inflammation, régime précédent , etc. de la même façon, la longueur de temps, le tissu doit être ébranlé après le traitement à l’EDTA soit efficace peut varier dans des conditions différentes. Il en résulte des fractions isolées de tissus contenant un mélange de villosités et de cryptes ou principalement les villosités ou cryptes (Figure 2). Comme il ne sont a aucun villosités dans le côlon, l’extraction de la crypte peut-être être obtenue en une seule étape en secouant le tissu dans le tube pendant 30 s. Ces fractions peuvent alors être fixées et traitées pour immuno-marquage.

    Isolement des organoïdes intestinal de la matrice de sous-sol
    Isolement des organoïdes de dômes de matrice de sous-sol est possible en utilisant la solution de récupération des cellules. La solution fonctionne par dépolymérisation de la matrice gélifiée sous-sol mais la température doit être 2-8 ° C. Une note de prudence, c’est que les microtubules dynamiques ne peuvent pas être conservés. Ainsi, par immuno-marquage des microtubules dynamiques et + conseils tels que la cellule de l’EBs, récupération de la matrice du sous-sol avant de fixation n’est pas recommandée. Cependant, la plupart des microtubules dans les cellules organoïde différenciation est relativement stable et ceux-ci ont été préservés (Figure 6). Il a travaillé aussi bien pour l’immuno-marquage des protéines centrosomes et jonctionnelles, mais aussi des marqueurs de cellules.

    Protocoles de fixation
    Formaldéhyde (fraîchement faite de PFA) est un action relativement rapide fixateur qui forme réversible cross-links et 4 % PFA fonctionne bien par exemple, dans l’immuno-marquage des microtubules et gamma-tubuline et des filaments d’actine coloration avec la phalloïdine. Plus de solutions PFA par exemple 1 % a bien fonctionné pour immuno-marquage par exemple, avec le marqueur de cellules de marqueurs Lgr5 et Paneth CD24 cellules souches dans la niche de cellules souches crypte, tandis que des concentrations plus élevées de l’IFP ne fonctionnaient pas diluent.

    L’addition de glutaraldéhyde, meilleure conservation des microtubules et la fixation de PHEMO dite, qui se compose d’un mélange de 3,7 % PFA, glutaraldéhyde à 0,05 % et 0,5 % de détergent dans le tampon (tuyaux de 68 mM, 25 mM HEPES, EGTA 15 mM et 3 mM MgCl2) PHEMO2 donne excellente conservation des microtubules sans compromettre l’antigénicité. Il fonctionne aussi bien pour les immuno-marquage gamma-tubuline β-caténine et E-cadhérine et des filaments d’actine coloration avec la phalloïdine. Toutefois, dans le tissu 3D et organoïde cultures, la fixation de PHEMO produit des résultats incohérents et n’était donc pas utilisée.

    Le méthanol est un fixateur coagulant qui donne relativement bonne pénétration et tend à préserver l’antigénicité. Fixation avec 100 % de méthanol (-20 ° C) présente un rétrécissement, donne préservation de morphologie modérée et travaille pour les microtubules, + de conseils et de nombreux anticorps centrosomes, dont ninein dans les cultures cellulaires 2D. Toutefois, certains organoïdes se sont effondrés lors de l’utilisation de cette méthode de fixation. En outre, la pénétration des anticorps à travers tout cryptes, villosités ou organoïdes a d’abord été un problème mais l’ajout de détergent, 0,1 % pour la solution de lavage et un lavage prolongé atteint de meilleurs résultats.

    Une combinaison de méthanol et de formaldéhyde avait été précédemment utilisée par Rogers et al. 20 à immuno-étiquette EB1 dans Drosophila. Un protocole de fixation basé sur un mélange de formaldéhyde et de méthanol a donc été développé pour le tissu intestinal et organoïdes basé sur 3 % formaldéhyde et 97 % de méthanol réfrigérée à-20 ° C, mais en omettant le carbonate de sodium 5 mM du mélange qui a été utilisé par Rogers et al. 20 en outre, les échantillons ont été fixés dans le congélateur à-20 ° C. Cela a travaillé particulièrement bien pour l’immuno-marquage + conseils, tels que le CLIP-170 et l’EBs, mais aussi s’est avéré excellent pour fixation et immuno-marquage des microtubules et l’actine dans les tissus et 3D organoïdes. Très bonne conservation structurale était évidente et antigénicité a été préservée pour plusieurs protéines du cytosquelette et associés ainsi que des protéines centrosomes comme gamma-tubuline et ninein, bien que l’étiquetage à des ninein plus systématiquement travaillé avec du méthanol fixation.

    Disclosures

    Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

    Acknowledgments

    Les auteurs remercient Paul Thomas pour aide et conseils de microscope. Ce travail ici en cause a été soutenu par le BBSRC (subvention no. BB/J009040/1 à M.M.M. et T.W.).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537-500ML washing and PFA
    Cell Recovery Solution Corning 354253 isolate organoids
    lobind microcentrifuge tubes Eppendorf 30108116 prevent cells sticking
    0.5 M EDTA solution, pH 8.0 Sigma 03690-100ML Crypt isolation
    70 μm cell strainer Fisher Scientific 11517532 Isolate crypts from villi
    Triton X-100 Sigma T8787 detergent
    goat serum Sigma G6767 blocking agent
    Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma used as non-stick agent
    Paraformaldehyde, 4% in PBS Alfa Aesar J61899 fixative
    Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) Sigma F8775 used as fixative
    Methanol 99.9% Analytical grade Fisher M/4000/17 used as fixative
    MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit Maxvision
    Biosciences    		 MF01-S commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling
    Rotator SB2 or SB3 Stuart microcentrifuge tube rotator
    Sodium citrate antigen retrieval
    Hydromount National Diagnostics HS-106 mountant
    DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802 anti-fade agent
    Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges Clarity N/C366 slides
    Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm Clarity NQS13/2250 coverslips
    Matrigel Corning 356231 Basement matrix for 3D organoid culture
    50 mL conical tubes Sarstedt 62.547.254 for processing tissue/organoids
    15 mL conical tubes Sarstedt 62.554.502 for processing tissue/organoids
    1.5 mL LoBind tubes Eppendorf 30108051 for isolated organoids
    Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181 primary antibody 1:500
    Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody Abcam ab6160 primary antibody 1:100
    Rabbit alpha-tubulin antibody Abcam ab15246 primary antibody 1:100
    Rabbit anti-beta-actin antibody Abcam ab8227 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal anti-p150Glued antibody BD Bioscience 610473/4 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal EB3KT36 antibody Abcam ab53360 primary antibody 1:200
    Mouse monoclonal EB1 antibody BD Bioscience 610535 primary antibody 1:200
    Rabbit anti-Lgr5 antibody Abgent AP2745d primary antibody 1:100
    Dylight anti-rat 488 Jackson 112545167 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-mouse 488 Jackson ST115545166 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-rabbit 647 Jackson 111605144 seconday antibody 1:400

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).
    2. Bellett, G., et al. Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).
    3. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells. J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).
    4. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila. J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).
    5. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Curr Opin Cell Biol. , (2016).
    6. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
    7. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
    8. Goldspink, D. A., et al. Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres. Open Biol. 7 (2), (2017).
    9. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. Elife. 5, (2016).
    10. Young, M., Reed, K. R. Organoids as a Model for Colorectal Cancer. Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).
    11. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
    12. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
    13. Goldspink, D. A., et al. The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation. Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).
    14. Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J Vis Exp. (105), e53042 (2015).
    15. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
    16. Coquelle, F. M., et al. LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway. Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).
    17. Belshaw, N. J., et al. Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa. Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).
    18. Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
    19. Hamilton, K. L., Butt, A. G. Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice. Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).
    20. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).

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    Biologie du développement numéro 130 organoïde intestin cytosquelette microtubules EB1 CLIP-170 ninein centrosome Lgr5 épithélium
    Immuno-fluorescence étiquetage des Microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux <em>Ex Vivo</em> et 3D <em>In Vitro</em> intestinale organoïdes
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    Goldspink, D. A., Matthews, Z. J.,… More

    Goldspink, D. A., Matthews, Z. J., Lund, E. K., Wileman, T., Mogensen, M. M. Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56662, doi:10.3791/56662 (2017).

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