Summary
Denne protokollen illustrerer viktige sammenhengende trinn kreves for å vurdere relevansen av vitalitet parameteren og DNA reparasjon prosesser i gjenopplive Bacillus subtilis spores etter behandling med lavtrykk plasma av sporing fluorescens-merket DNA reparasjon proteiner via gang-løst AC confocal mikroskopi og skanning elektronmikroskop.
Abstract
Plasmasterilisering er et lovende alternativ til konvensjonelle sterilisering metodene for industrial, kliniske, og romfart. Lavtrykk plasma (LPP) utslipp inneholder et bredt spekter av aktiv arter, som fører til rask mikrobiell inaktivering. For å studere effektiviteten og mekanismer for sterilisering av LPP, bruker vi sporer av testen organismen Bacillus subtilis på grunn av deres ekstraordinære motstand mot konvensjonelle dampsterilisering. Vi beskriver produksjon av B. subtilis spore monolayers, steriliseringsprosessen av lavtrykk plasma i en dobbel Induktivt kombinert plasma reaktoren, karakterisering av spore morfologi bruker skanning elektronmikroskop (SEM), og analyse av spiring og utvekst av sporer av levende celle mikroskopi. Et mål av plasma arter er genomisk materiale (DNA) og reparasjon av plasma-indusert DNA lesjoner på spore revival er avgjørende for overlevelse av organismen. Her studerer vi spiring kapasitet sporer og rollen av DNA reparasjon spore spiring og resultatet etter behandling med LPP ved å spore fluorescently merket DNA reparasjon proteiner (RecA) med tid-løst fluorescens AC confocal mikroskopi. Behandlet og ubehandlet spore monolayers er aktivert for spiring og visualisert med en invertert AC confocal levende celle mikroskop over tid å følge reaksjonen av personlige sporer. Våre observasjoner viser at brøkdel av spirende og outgrowing sporer er avhengig av varigheten av LPP-behandlingen nå minst etter 120 s. RecA-YFP (gul fluorescens protein) fluorescens ble funnet i noen sporer og utviklet i alle outgrowing celler med en liten høyde i LPP-behandlet sporer. Videre noen av vegetative bakterier avledet fra LPP-behandlet sporer viste en økning i cytoplasma og tendens til å lyse. Beskrevet metoder for analyse av individuelle sporer kunne eksemplarisk for studier av andre aspekter av spore spiring og resultatet.
Introduction
Et hovedmål for romutforskning er Søk etter signaturer livsformer og biomolecules på andre planeter organer og månene i solsystemet. Overføring av mikroorganismer eller biomolecules Pǔtōnghuà til kritiske områder av leting er av spesiell risiko å påvirke av utvikling og livet-gjenkjenning oppdrag på planetenes organer som Mars og Europa1. Internasjonale retningslinjene for planetenes beskyttelse, etablert av komité for Space forskning (COSPAR) i 1967, innføre strenge regler på bemannet og robot oppdrag til andre planeter, deres måner, asteroider og andre himmellegemer og regulere den rengjøring og sterilisering et romskip og kritisk maskinvarekomponenter tidligere for å starte for å eliminere forurensende terrestriske mikroorganismer og forhindre kryss-kontaminering av himmellegemene2. Det siste tiåret, har anvendelse av ikke-termisk plasmas fått bred oppmerksomhet i biomedisinsk og ernæringsmessige forskning og romfart programmer3,4,5. Plasmasterilisering er et lovende alternativ til konvensjonelle sterilisering metoder som tilbyr rask og effektiv mikrobiell inaktivering6, samtidig som mild til sensitive og varme labil materialer. Plasma utslipp inneholder en blanding av reaktive stoffer som frie radikaler, ladede partikler, nøytral/glade atomer, fotoner i ultrafiolett (UV) og vakuum ultrafiolett (VUV) spektrum som fører til rask mikrobiell inaktivering3. I denne studien bruker vi lavt trykk plasma generert av dobbel Induktivt kombinert lavt trykk plasma (DICP) kilden7,8 for å deaktivere Bacillus subtilis endospores fordelt på test glassoverflaten.
Gram-positive bakteriene av familien Bacillaceae er svært utbredt i naturlige habitater av jord sedimenter og luften også som uvanlig miljøer som rene rom og den internasjonale romstasjonen9,10 ,11. Funksjonen mest tydelig i slekten Bacillus er evnen til å danne motstandsdyktige sovende endospores (heretter referert til som sporer) for å overleve ugunstige forhold, for eksempel næringsstoffer uttømming12. Sporene er generelt langt mer motstandsdyktig enn sine vegetative celle kolleger til en rekke behandlinger og miljømessige påkjenninger, inkludert varme, UV, gamma bestråling, uttørking, mekanisk avbrudd og giftige kjemikalier, som sterke oksidanter eller pH endring agenter (omtalt i referanser13,14) og er derfor ideelt objekter for å teste effektiviteten av mikrobielle inaktivering metoder. Siden genomisk DNA er et mål av plasma behandling av bakterier15,16, reparasjon av plasma-indusert DNA lesjoner (f.eks DNA dobbel-strand bryter) på spore revival er avgjørende for overlevelse av bakterier13, 17.
Dermed vi studere spiring kapasitet sporer og rollen til DNA reparasjon spore spiring og resultatet etter behandling spores med lavtrykk argon plasma av følgende personlige spores og deres uttrykk fluorescens-merket DNA reparasjon protein RecA med tid-løst fluorescens AC confocal mikroskopi. Vi gir en trinnvis instruksjon om utarbeidelse av B. subtilis sporer i monolayers for å oppnå reproduserbar testresultater, behandling av spore monolayers med lavtrykk plasma for sterilisering, utarbeidelse av plasma behandlet sporer for ultrastructural evaluering bruker skanning elektronmikroskop (SEM) og levende celle mikroskopi analyse på nivået av individuelle sporer sammen med overvåking aktive DNA reparasjon innenfor cellen i respons på plasma behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bacillus subtilis Spore produksjon og rensing
- For spore produksjon, overføre en 5 mL natten kultur for de respektive B. subtilis belastning, supplert med aktuelle antibiotika, til 200 mL dobbel-styrke flytende Schaeffer sporulation medium (per liter 16 g næringsrik buljong, KCl 2 g, 0,5 g MgSO 4* 7 H2O, 2 mL 1 M Ca (ingen3)2, 2 mL 0.1 M MnCl2 * • 4 H2O, 2 mL 1 mM FeSO4, 2 mL 50% (w/v) glukose18) og dyrke det med energisk lufting ved 37 ° C i 72 h eller til > 95% av kulturen har sporulated. Sporer av følgende stammer brukes: B. subtilis PY79 (wild type) B. subtilis PY79ΔrecA:: neo (mangelfull DNA reparasjon protein RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp:: katten (RecA smeltet sammen med gul fluorescerende protein [YFP]19).
- Høste sporer med sentrifugering i 15 min 3000 x g i 50 mL rør og rense prøvene av gjentatte vask trinn (opptil 15 ganger) ved hjelp av sterile destillert H2O og av renhet og spiring status ved kontrast mikroskopi. Kontroller at spore suspensjoner består av fase-lyse sporer (> 99%) og er gratis vegetative celler (stenger), spirer sporer (sort / grå utseende) og celle rusk, ellers ytterligere mikroskopi eksperimenter kan bli forstyrret. Vask prøven til ønsket renhet er nådd.
- Determinate spore titer ved plating ut 50 µL av 10 ganger føljetong fortynninger på LB-agar (dvs.: Bruk 30 µL eksempel + 270 µL sterilt vann for en 1:10 fortynning. Ta 30 µL fra bestemt fortynning til 270 µL H2O for en 1: 100 fortynning og så videre) til å beregne CFU (kolonien danner enheter) og ruge platene på 37 ° C over natten. Etter CFU besluttsomhet, justere utvalget til 109 sporer per mL av konsentrasjon eller fortynning med sterilt vann.
2. prøven utarbeidelse av Aerosol avsatt Bacillus subtilis Spores
Merk: Akkumulering og overlapping av sporer kan føre til skygge effekter under behandlingen i forfalsket inaktivering kinetics. For å minimere problemet, forberede spore prøver av en aerosol-deponering teknikk20. Kort, styre høy presisjon to-stoff munnstykket med en elektrisk timer som regulerer flytende gjennomstrømningen i konsert med strømmen av trykksatt carrier gass (her N2). Spre injisert flytende utvalget gjennom munnstykket uttaket bruker gasstrømmen nitrogen.
- En eksempel operatør i form av sterilisert mikroskopiske lysbilder (for overlevelse kinetics) eller rundt 25 mm coverslips (for fluorescerende sporing av DNA-reparasjon prosesser/cLSM, AC confocal mikroskopi for laserskanning) innenfor den elektrisk drevne Aerosolbeholdere sprøyting enhet i tråd med munnstykket. Brukt spore konsentrasjonen må samsvare med en hundre ønsket endelige konsentrasjonen.
- Overføre 1 mL av spore kulturen i munnstykket væske innløpet og starte sprøyting prosessen 0,1 s ved et trykk på 1,3 bar. Sprayet spore suspensjon (1 x 107) danner en tynn film på mikroskopisk lysbildet som tørker raskt innen sekunder å danne et jevnt fordelt spore monolayer. Lagre behandlet eksempel operatører i en sterile containeren ved romtemperatur.
3. lavtrykk Plasma behandling
- Forberede plasma-systemet for behandling av biologiske prøver og drive systemet på 5 Pa med argon plasma på 500 W for 5 min. Med det er alle flater i systemet renset og varmet opp. Dette reduserer stikker av molekyler fra luften, nemlig nitrogen, oksygen og vann, når lufting systemet. Etter forbehandling av systemet, vent kammeret og plassere prøvene nøye i midten av reaktoren fartøyet med hjelp av glass rack.
- Bruk minst tre biologiske gjentak. Lukk kammeret og evakuere under 2 Pa. etterpå fylle prosessen gassen i kammeret. Regulerer trykket i systemet til 5 Pa.
- Etter definerte behandlingstiden, slå av strøm og gass forsyning og nøye vent systemet for å hindre blåser prøvene fra prøven abonnenten. Etter ventilasjon, Fjern prøvene og plasser prøvene for neste parameteren i systemet. For ikke-plasma-behandlet kontroller utsette prøver å støvsuge bare (5 Pa) i nærvær av prosessen gassen tilsvarer den lengste brukte plasma-tiden.
4. utvinning og evaluering av Spore overlevelse
- Forberede en løsning av autoklaveres 10% polyvinylacetat (PVA) og dekket eksempel bæreren med ca 500 µL og la dem air-dry for 4 h. stripe av tørket PVA laget (nå inneholder spore prøven) ved hjelp av sterile pinsett og overføre den til en 2 mL reaksjon tube. Legg 1 mL steril vann til røret og oppløse PVA laget via vortexing. Denne fremgangsmåten fører til > 95% gjenvinning av sporer og påvirker ikke sin spiring kapasitet21.
- Serielt fortynne prøven på 1:10 i sterilt vann i en 96-brønns plate (dvs. 270 µL sterilt H2O + 30 µL utvalg/tidligere fortynning). Plate ut 50 µL av hver fortynning på Lysogeny kjøttkraft næringsstoffer agar (LB), ruge platene på 37 ° C over natten og liste opp antall vokst kolonier (CFU).
5. live celle mikroskopi og sporing av DNA reparasjon prosesser i spirende Spores
- For spiring eksperimenter, forberede en 1 mm tykk 1,5% LB-agar pad, ved koking 700 µL medium og Pipetter den i et sterilt mikroskopi Petriskål. Etter 10 min, kutte ut en 8 x 8 mm x 1 mm LB-agar pute med en bakteriefri skalpell og overføre agar nøye over spore monolayers som hviler på 25 mm glass coverslips.
Merk: Dette trinnet er avgjørende for visualisering av personlige sporer og tillate etter deres reaksjon mot aktivering av spiring indusert av det næringsstoffet agar. Dermed tjener LB-agar to formål, (1) å reparere spores på overflaten, som unngår relocalization langs overflaten og optisk uskarpt, og (2) aktivere spore for spiring. - Etter dekker utvalget med agar, overføre glass dekkglassvæske raskt til en tenkelig kammer og mikroskopet prøvene med en automatisert AC confocal laserskanning mikroskopet med invertert optikk med en 63 X / 1.3 fly apochromatic oljeobjektiv nedsenking.
-
Utføre bildebehandling av fluorescens (YFP) med en excitation bølgelengde 514 nm og utslipp kan oppdages mellom 520 og 560 nm.
- Ta lyse-feltet bilder i skannemodus bruker en av foto multiplikatorer (overført lys bane).
- Registrere time-lapse serien med en laser makt av 2,6%, og angi AC confocal blenderåpning til 5 luftige enheter og en samplingfrekvens til 1 rammen per 30 s mellom 0t til 5 h, avhengig av eksperimentet. Det er spesielt merke at høye doser av monokromatisk laser lys på 514 nm helt hemme spiring (figur 1A, B).
- Hold prøvene på 37 ° C (atmosfærisk luftfuktighet) i en oppvarming scenen under hele avbildingsprosessen. Bruk minst tre biologiske gjentak for hvert vilkår. I spore aggregering, flerlags spore distribusjon eller forurensning av støvpartikler, blokkering av plasma behandling ("skygge") kan oppstå og aktiverer spiring av skygget sporer (figur 1C, D).
Figur 1: potensielle problemer observert under AC confocal levende celle fluorescens mikroskopi av plasma behandlet sporer. (A, B) Hemming av spore spiring av høye doser av monokromatisk (514 nm) laser belysning. (A) oversikt (3 x 3 sydd rammer) av B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) sporer 180 min etter initiering av spiring. Rammen i midten ble utsatt med 30 s mellomrom til høye doser av laserlys (514 nm, 70% laser makt), mens de omkringliggende regionene (= rammer) ikke var opplyst (sammenslåtte bildet av lyse-feltet kanal og RecA-YFP fluorescens; bestilt strukturer ble skyldes bruk av 35 mm imaging retter med en trykt 500 µm rutenett). (B) viser en 4 X forstørret visning av grensen mellom opplyst og ikke-opplyste regionen viser at spores, som ble utsatt for høye doser av monokromatisk laser lys ikke spire og vokse ut, mens sporer i ikke-opplyste områder igjen fullt til vegetative bakterier uttrykke lyse RecA-YFP fluorescens (grønt signal). (C, D) Sporer dekket av forurensende partikler eller flere lag av spore (piler) synes å beskytte underliggende sporer fra inaktivering av plasma behandling og la deres spiring og utvekst ("skygge effekt"). (C) sporer var plasma-behandlet for 60 s og fotografert 180 minutter etter innvielsen av spirende eller (D) for 120 s og fotografert etter 240 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. skanning elektronmikroskop (SEM)
- Bruk skanning elektronmikroskop gir ultrastructural informasjon om overflaten morfologi av plasma behandlet sporer i forhold til ubehandlet kontroller. Pels tørket spore monolayers på coverslips med gull-palladium (3 nm) ved hjelp av en frese-coater. Bruke et felt-utslipp scanning elektron mikroskop for imaging prøvene, drives på 5 kV akselerasjon spenning inkludert en i objektivet videregående electron detektor for å avdekke topografi kontrast.
7. dataanalyse
- Bestemme spore overlevelse fra kvotienten N/N0, der N er gjennomsnittlig CFU behandlet prøvene og N0 er gjennomsnittlige CFU ubehandlet vakuum kontroller. Tegne spore inaktivering av argon plasma behandling som en funksjon av tiden (i sekunder). Uttrykke alle data som gjennomsnitt og standardavvik (n = 3).
- Analysere profilen oppnådd av levende celle tenkelig ved hjelp av tenkelig programvare. Kvantifisere andelen spore spiring og outgrowing etter plasma behandling, telle spores i representant rammer i begynnelsen av eksperimentet og etter 4 h. For betydning vilje i spore overlevelse analyser, bruke enveis ANOVA-tester (variansanalyse) med statistisk programvare). P -verdier < 0,05 anses som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevelse av plasma-behandlet B. subtilis sporer
Plasma behandling av B. subtilis spores brukt i denne studien viser en nedgang i overlevelse med økende varigheten av plasma behandling (figur 2). Sporer belaste uttrykke recA-genet del YFP viste overlevelse kurver ligner sporer av vill type belastningen, som indikerer at den genetisk modifiseringen har ingen betydelig innvirkning på bakteriell vitalitet. Sporer av RecA dårlig belastningen viser en høyere følsomhet overfor plasma behandling sammenlignet sporer av vill type belastningen, demonstrere at tilstedeværelsen av RecA genet reduserer plasma-indusert tap av vitalitet. Spesielt kort plasma behandling av 15 s (P <0.003) og 30 s (P < 0.004) føre til en betydelig reduksjon i vitalitet i RecA dårlig stammer i forhold til vill type og RecA-YFP stammer. Etter 90 s plasma behandling, vitalitet av alle stammer reduseres med ca tre størrelsesordener.
Figur 2: Survival av B. subtilis sporer fra ulike stammer etter behandling med lavt trykk argon plasma. Overlevelse (mener CFU plasma behandlet sporer/betyr CFU av vakuum behandlet sporer, feilfelt representerer standardavvik) er plottet mot varigheten av plasma behandling. PY79 (wild type, lukket sirkler), LAS72 (RecA-YFP, grå sirkler) og LAS24 (ΔrecA; åpne sirkler). Statistisk analyse viste ingen betydelige forskjeller i spore overlevelsesevne mellom PY79 (uendret RecA) og LAS72 (RecA-YFP-fusion).
Ultrastructural analyse av plasma-behandlet sporer av SEM
For å få en idé om morfologiske virkningen av plasma ble behandling på spores, skanning elektronmikroskop (SEM) brukt til å analysere overflaten morfologi av plasma behandlet sporer i forhold til vakuum-behandlet sporer (kontroll). Den ytre overflaten av B. subtilis sporer avsløre karakteristiske langsgående ridge-lignende strukturer som stadig vises i alle behandlet og ubehandlet sporer (Figur 3). Plasma behandling opp til 30 s medfører ingen vesentlige endringer av spore overflaten morfologi i forhold til kontroll (Figur 3Vekselstrøm). Øke varigheten av plasma behandling (60-240 s) fører til en mer detaljert spore overflate (Figur 3D-F) og små sprekker og sprekker kan observeres i sporer behandlet for 120 eller 240 s. Videre, liten globules oppstår på spore overflater (120 s og 240 s behandlinger, Figur 3E, F), som er forårsaket av utgitt materiale fra pelsen, cortex eller fra indre kjernen22. Disse globules dekker hele spore og kan finnes på vene-formet strukturer og mellomliggende overflater.
Figur 3: SEM av B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) sporer sprayet på glass coverslips etter lavt trykk plasma behandling. Sporer utsatt for støvsuger bare og ikke å plasma (kontroll) vises i (A). (B-F) Sporer som var plasma-behandlet med økende varighet (15, 30, 60, 120 og 240). Sporer som var plasma-behandlet 60 s eller lenger vises mer detaljert på overflaten deres enn kontroll sporer eller spores som ble plasma-behandlet for 15 og 30 s. sprekker og sprekker (hvite piler) er synlig på overflaten av sporer plasma-behandlet for 120 eller 240 s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Live celle mikroskopi av plasma-behandlet B. subtilis sporer
Levende celle mikroskopi av gjenopplive sporer fra B. subtilis stammer uttrykke fluorescens-merket reparasjon protein RecA (RecA-YFP) er utført for å analysere spiring kapasitet og uttrykk for RecA-YFP av personlige sporer i respons på plasma behandling. Her bruker vi tid-løst AC confocal laser-skanning mikroskopi for å følge spiring utvekst og progresjon i vegetativ tilstand av plasma-behandlet sporer (Figur 4) med hensyn til potensielt kjente problemer f.eks skygge effekter eller Hemming av spirende av høye doser av monokromatisk laser lys (figur 1). Sporer utsatt for vakuum bare (kontroll, Figur 4Vekselstrøm), viser noen fluorescerende signaler under tidlig stater av spore revival (0 - 65 min, ikke vist). En økning i fluorescens intensitet, sannsynligvis på grunn av opphopning av RecA-YFP, er observert på ≥ 65 min når vegetative celler er dannet og første cellene begynne å dele. Alle disse cellene havn et fluorescens signal akkumulert i minst én posisjon i hver celle. Nesten alle sporene (98 ± 2%, 589 ± 14, n = 4) behandlet med vakuum som en kontroll spire og utvikle en stav-formet cellen morfologi med en ganske jevn lengde på enkeltceller (Figur 4B-C). I motsetning til sporer i vakuum kontroller, sporer behandlet for 15 s med plasma allerede viser redusert spiring kapasitet mindre enn 75 + 4% (197 ± 8 sporer, n = 3, Figur 4D-F), som indikerer at plasma behandling forårsaker skade i sovende sporer, som hindrer spiring. I tillegg er morfologi av outgrowing celler forskjellig fra morfologi av celler i kontroller. Cellene vokse enten inn mye lange stenger (lengre enn i forhold til kontroll) eller er små og stikke i spore pelsen (Figur 4G-jeg). Videre lyse mest langstrakt celler med økende Cellestørrelse (hvit pilespisser, Figur 4F). Fluorescens signalene RecA-YFP i cellene synes å være litt økt i forhold til signalene i kontroll celler (Figur 4C, F), men ingen signifikante forskjeller kan observeres (ikke vist). Sporer som var plasma behandlet for 30 s spire opptil 25 ± 6% (99 ± 4 sporer, n = 3) og vegetative celler er spesielt forsinket i vekst i forhold til kontrollen sporer og sporer etter 15 s plasma-behandling. Vegetative celler er ganske små og stav-formet men varierer i lengde (Figur 4G-jeg). Imidlertid celler i alle størrelser kan lyse tider lengre inkubasjon sett for prøver etter 15 s plasma-behandling. Etter 60 s av plasma-behandling mindre enn 2 ± 2% (8 ± 8 sporer, n = 3) spores er stand til å danne vegetative celler (Figur 4J-L). Sporer som er plasma-behandlet for 90, 120 eller 240 s kan analyseres, men de viser ingen utvekst eller endringer i fluorescens nivåer av RecA-YFP (vises ikke).
Figur 4: AC Confocal-laserskanning live celle mikroskopi av B. subtilis sporer fra en belastning uttrykke RecA-YFP etter plasma behandling og initiering av spiring. Sporer ble fulgt over tid (ett bilde per 30 s) og bilder for tidspunkt 0, 2 og 4 h vises. (A-C) Sporer behandlet med vakuum bare og ikke med plasma (kontroll) spire og vokse ut til vegetative celler (B) og angi eksponentiell vekstfase (C). (D-L) Sporer behandlet for ulike varighet med lavt trykk argon plasma viser betydelige forskjeller i deres utvekst sammenlignet sporer av kontrollen (se tekst for detaljer). (D-F) 15 s behandling (hvit pilespisser representerer vegetative celler, som nylig lysed), (G-jeg) 30 s behandling (svart pilespisser visualisere vegetative celler, som var små og stikke i spore pelsen) og (J-L) 60 s behandling etter 0t og 2t 4 h spore utvinning tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sterilisering av flater med lav temperatur, lavt trykk plasma er et lovende alternativ til heller vanlig dampsterilisering som behandling med ioniserende stråling, kjemikalier (f.eks gasser som H2O2 eller etylenoksid) eller tørr og fuktig varme23. Vanlige sterilisering metoder det meste gir en effektiv sterilisering, men de er kjent for å påvirke det behandlede materialet og representerer en potensiell risiko for operatøren. Lavt trykk plasma tilbyr en rask og homogen biologiske inaktivering bruker sammensetningen av flere komponenter som UV fotoner, frie elektroner, ioner og avsluttet atomer eller molekyler (f.eks ROS). LPP kan derfor brukes til varme- og korrosjon sensitive materialer som termoplastisk polymer implantater, elektroniske instrumenter eller komplekse 3D-strukturer. I denne utredningen vi demonstrere anvendelsen av et slikt testsystem, som monolayers av sprayet B. subtilis sporer20 blir behandlet i en spesielt lavt trykk plasma reaktoren som ble beskrevet nylig i detalj7. Mikroskopiske lyse-feltet undersøkelse av plasma-behandlet sporer kan være tilstrekkelig for å få en totale anslaget over sterilisering effektiviteten. Men er vi interessert i de underliggende mekanismene lavtrykk plasma og dens innflytelse på spore inaktivering på molekylært nivå. I kombinasjon med fluoresce-sporing mikroskopi gjør det oss å belyse detaljer om dette molekylær svaret i plasma-behandlet sporer og potensielt gi oss innsikt i grunnleggende inaktivering mekanisme lavtrykk plasma.
Her, fokuserer vi på analysen av plasma-behandling effektiv og effekter ved hjelp av levende celle mikroskopi, hvilke innrømmer etter personlige spores etter initiering av spiring. Bemerkelsesverdig, denne bestemt avslører et par nye resultater som ikke kan gis ved å måle revitalisering av hele spore befolkningen med fastsettelse av celle nummer eller CFU. Først av alt, påvirker plasma-behandling av sporer ikke bare kapasiteten til resultatet i en doseavhengig måte, som forventet fra måling av overlevelse ved fastsettelse av CFUs, men også morfologi av vegetative celler, som ofte utvikler store stenger til skjemaet septa etter riktig celledeling sammen med små celler stikker i spore (15 s plasma-behandling) eller celler på en redusert lengde (30 s plasma-behandling). Observasjoner av celler med redusert lengde viste noen utvinning til normal celle lengde på senere tidspunkt. Dessuten bor celle imaging avslører at de fleste av morphologically endrede cellene lyse ved senere stadier av observasjon. Dette betyr at skaden kjøpt av spores under plasma-behandling er bare effektiv ved senere stadier av spore revitalisering, antagelig på grunn av DNA skade og at maskineriet spiring og resultatet er mer robuste mot plasmasterilisering enn maskineriet nødvendig for vegetativ vekst. Bemerkelsesverdig, uttrykket av DNA-reparasjon RecA protein synes å være lav og nesten fraværende i sporer og utvikler under utvekst og vegetative fasen som angitt av en økning i RecA-YFP fluorescens17. Men hjelper selv en økt RecA uttrykk i outgrowing plasma-behandlet sporer, i forhold til kontrollen sporer, ikke for å redde celle vitalitet kvantitativt, fordi de fleste lyse eller briste etter utvekst, spesielt etter mer enn 3 h inkubasjon. Denne effekten kan visualiseres ved hjelp av levende celle filmer fra tid lapse bilder av spirer sporer. Vi kan ikke utelukke at denne effekten er overemphasized av bestemt dyrking tilstand der cellene blir tvunget i en monolayer med en tynn overlegg av agar.
En annen utfallet av analysen av levende celle mikroskopi er at partikler forurensing (f.eks støvpartikler, andre sporer) på spore monolayer overflaten kan skjerme underliggende spores fra de skadelige effektene av plasma. I slike tilfeller synes lenger plasma-behandling å være ineffektiv. Siden slike forurensing er vanskelig å unngå helt, bør alternativ plasma-behandling strategier testes, som bruker planetenes rotasjon under plasma behandling sammen med utvidet varigheten av behandlingen. Analysen av SEM angir at spore pelsen er perforert med økt varighet for plasma-behandling som er i tråd med teorien om plasma-mediert effekter på saken22,24. En langvarig eksponeringstid (> 240 s) plasma kan selv autoperforering skadelige partikler og dermed kan skade og deaktivere den underliggende spores.
Presentert protokollen for levende celle mikroskopi spore spiring og resultatet kan være egnet for andre studier. Dekker spores med et tynt lag av agar styrker spores i en distinkt optisk fly og begrenser sideveis bevegelse. Begge effekter garanterer at sporer og outgrowing celler holde seg innenfor den merkede tenkelig rammen. Lignende tilnærminger har blitt beskrevet før25 men gir mindre fleksibilitet enn metoden beskrevet her som tillater å velge nesten alle prøve bærebølge (f.eks et glass lysbilde, dekkglassvæske eller Petriskål). I våre hender kunne andre vegetative bakterier analyseres av levende celle mikroskopi med metoden agar dekker). I alle fall bør nøye kontroll eksperimenter utføres for å vurdere mulige effektene av foto skade under levende celle imaging, fordi vi observert at høye doser av monokromatisk laserlys helt hemme spore spiring. Bortsett fra raskere belysning tid, dvs. ved å øke observasjon intervallene, kan dette fenomenet forebygges ved å redusere laser intensiteten og/eller åpning av AC confocal blenderåpning (pinhole).
I sammendraget, blant teknikkene som brukes for å studere effektiviteten av plasma-behandling i modell av sprayet B. subtilis spore monolayers, levende celle mikroskopi gir unik innsikt i mobilnettet hendelser under spore vekkelse og tilbyr muligheten analysere dynamikken i fluorescens-merket proteiner. Videre spesiell prøve utarbeidelse, dvs dekker av sporer med et tynt lag av agar, kunne paradigmatiske for avbilding av andre mikroorganismer av levende celle mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne takker Andrea Schröder for hennes utmerket kundestøtte under deler av dette arbeidet og Nikea J. Ulrich for henne hjelp under video skyte. Vi vil også takke Lyle A. Simmons for sin generøse donasjonen av Bacillus subtilis stammene: LAS72 og LAS24. Dette arbeidet ble støttet i deler av tilskudd fra den tyske Research Foundation (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) til PA (AW 7/3-1) og RM (MO 2023/2-1) og DLR gi DLR-FuW-Projekt ISS livet, programmerbar RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, Mr og RM). F.M.F. ble støttet av en PhD-stipend i Helmholtz plass Life Sciences Research School (SpaceLife) på tysk Aerospace Center (DLR) i Köln, Tyskland, som ble finansiert av Helmholtz Association (Helmholtz-Gemeinschaft) over en periode på seks år ( Grant nr. VH-ko-300) og mottatt ytterligere midler fra DLR, inkludert luftfart styret og Institute of Aerospace Medicine. Resultatene av denne studien vil bli inkludert i doktorgrad Avhandlingen av Felix M. Fuchs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR's Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma - A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D. Ecology of Bacillaceae. Microbiol Spectr. 3, (2015).
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey's manual of systematic bacteriology. Sneath, P. A. 2, Williams and Wilkins. Baltimore, MD. 1105-1141 (1986).
- Setlow, P. Spore Resistance Properties. Microbiol Spectr. 2, (2014).
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P. Catabolic repression of bacterial sporulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 54, 704-711 (1965).
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
